KR20210014109A - 질환의 예후와 관리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 근 위축성 측삭 경화증(ALS)의 예후 및 관리 방법뿐만 아니라 관련 조성물, 키트, 고체 지지체 및 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 근 위축성 측삭 경화증(ALS)의 예후 및 관리 방법뿐만 아니라 관련 조성물, 키트, 고체 지지체 및 용도에 관한 것이다.
루게릭 병으로도 알려진 근 위축성 측삭 경화증(ALS)은 상부 및 하부 운동 뉴런을 선택적으로 파괴하는 가장 흔하고 치명적이 며 변함없이 치명적인 성인 퇴행성 운동 뉴런 질환이다. ALS 환자의 약 10%는 일반적으로 우성 형질로 유전되는 질환이 있는 양성 가족력을 가지고 있는 반면, 90%는 유전적 감수성과 환경 사이의 복잡한 상호작용을 반영하는 가족력이 없는 산발성이다. ALS "증후군"은 임상적으로 이질적인 표현과 과정을 가지고 있으며, 생존 기간은 몇 개월에서 수십 년이지만, 일반적으로 질환 증상의 개시로부터 3년 내지 5년이다. 생존은 임상 표현형, 발병 연령, 성별, 호흡 부전의 조기 존재 및 체중 감소와 같은 여러 요인과 관련이 있다(Lunetta C. et al., JAMA Neurol. 2017;74(6):660-667). ALS의 병리학적 과정은 이제 운동 체계를 넘어서 확장되는 것으로 인식되고 있으며, 인지 장애뿐만 아니라 비통제 중추 및 말초 면역 체계를 포함된다. 불행히도, 현재 이 질환의 병리 생물학을 완화하기 위해 최소한의 효과적인 치료가 가능하고; 완화 치료와 증상 치료는 이러한 환자의 관리에 필수적인 요소이다.
ALS는 발병 영역, 진행 속도, 질환 확산 패턴, 상부 운동 신경 세포(UMN), 하부 운동 신경 세포(LMN) 및 인지 병리의 상대적 부담의 이질성을 특징으로 한다. ALS의 이러한 표현형 가변성은 질환 진행의 측정을 복잡하게 한다. ALS에서 표적 치료제의 시대가 도래하면서, 질환 부담과 진행 속도의 정확한 측정은 효율적인 임상 시험 설계를 촉진하고 ALS 치료제 개발을 위한 질환 발병에 대한 추가 통찰력을 가능하게 하는 중요한 우선 순위로 남아 있다.
피험자의 ALS 진행 속도를 이해하면 적절한 관리 또는 치료 계획을 개발하는 데 도움이 될 수 있으며, 삶의 다른 측면을 계획하는 데 더 일반적으로 유용할 수 있다. 대부분의 질환에서, 더 빠른 진행 속도는 물리 치료 또는 영양 지원에 비해 약물을 이용한 보다 공격적인 치료; 더 강력한 약물; 또는 더 높은 용량으로 또는 투여 주기 사이의 더 짧은 간격으로 전달된 동일한 약물에 대한 요구를 나타낸다. 일부 경우에, 특정 치료법이 느리게 진행하는 질환에 비해 빠르게 진행하는 질환에 더 효과적일 수 있다. 따라서 샘플링 시점에 진행 속도를 예측하는 예후의 부재는 개별 환자의 결과를 최적화하기 위한 ALS/MND 치료 요법의 개인화에 장애가 된다.
따라서, ALS를 앓는 피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 갖는지 여부와 같이 피험자의 진행 속도를 정확하게 예측하거나 결정하기 위한 방법을 식별할 필요가 남아 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 피험자에서 ALS의 진행 속도와 관련된 ALS 진행 바이오마커의 식별에 근거한다. 본 발명에서 입증된 바와 같이, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준은 일반적으로 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 생물학적 시료에서 동일한 바이오 마커의 수준 및 건강한 피험자와 비교하여 증가(또는 상승)된다. 반대로, 느린 진행 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오 마커의 수준은 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 동일한 바이오 마커의 수준과 비교하여 감소(또는 축소)된다. 따라서, ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준을 결정하는 것은 ALS의 진행 속도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준을 결정하는 것은 피험자가 느리게 진행하는 ALS 또는 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하는 데 사용된다. 이러한 ALS 진행 바이오마커의 예는 가용성 CD14(sCD14) 및 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다.
ALS를 가진 피험자가 질환 진행이 빠르거나 느린지 여부에 대한 조기 이해는 본 발명이 수행할 수단을 제공하며 분명한 이점과 이점을 가지고 있다. ALS 진단을받은 피험자의 경우, 질환 진행이 빠르거나 느린지 여부를 아는 것이 적절한 생활 방식과 재정적 결정을 내리는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 질환 진행 속도를 이해하는 것은 치료 요법에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 호흡 기능은 생존을 결정하는 주요 요인 중 하나이며 빠른 진행의 마커가 있으면 비 침습적 인공 호흡(NIV)을 더 일찍 사용할 수 있다. 호흡 기능과 마찬가지로 공급 튜브 삽입 시기가 중요하며 기대 수명에 영향을 미치는 요소이다. ALS를 가진 피험자가 호흡 기능이 현저하게 악화된 지점까지 진행되면 마취과 의사는 수술을 지원하기를 꺼릴 수 있다. 결과적으로, 피험자들은 질환의 진행을 이해하여 급격한 진행에 대한 우려가 있는 경우 급식 관을 조기에 삽입할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 다른 예에서, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 새로운 치료법의 효능을 평가하는 임상 시험에 포함되도록 식별되고 선택될 수 있다. 이러한 피험자를 임상 시험에 포함시키는 것은 질환 진행에 대한 짧은 기간이 치료의 효능에 대한 더 빠른 증거를 산출할 수 있기 때문에 바람직하다.
따라서, 한 양태에서, 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: (a) ALS를 갖는 피험자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 여기서 바이오마커는 가용성 CD14(sCD14) 또는 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다; 및 (b) 예를 들어, 적절한 참조 수준에 비해 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자에서 ALS의 가능한 진행 속도를 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, ALS 진행 속도의 결정은 ALS가 있는 피험자가 ALS 진행 속도가 빠르거나 느린지 여부를 결정하는 것을 용이하게 한다. 이러한 경우, 상기 방법은 (a) ALS를 갖는 피험자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 여기서 바이오마커는 가용성 CD14(sCD14) 또는 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다; 및 (b) 적절한 참조 수준에 비해 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
따라서, ALS를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행되는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: (a) ALS를 가진 피험자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 여기서 바이오마커는 가용성 CD14(sCD14) 또는 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다; 및 (b) 적절한 참조 수준에 비해 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 참조 수준이 건강한 피험자 및/또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준에 비해 바이오마커 수준의 증가는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 또 다른 예에서, 참조 수준이 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준에 비해 유사한 수준의 바이오마커는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 추가 예에서, 참조 수준이 건강한 피험자 및/또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준에 비해 유사한 수준의 바이오마커는 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 추가의 예에서, 참조 수준이 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준에 비해 바이오마커 수준의 감소는 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 특정 실시태양에서, 참조 수준은 임계 수준이고 그 초과에서 피험자는 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있으며, 그 미만에서 피험자는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다.
상기 및 본 발명에 기술된 방법의 특정 예에서, 상기 방법은 sCD14 및 LBP 모두의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 뇌척수액(CSF)으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 다른 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 한 예에서, 적어도 하나의 다른 바이오마커는 CRP, MIF, sTNFRI 및/또는 sTNFRII로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 건강한 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자를 나타내는 참조 수준에 비해 CRP, sTNFRI 및/또는 sTNFRII 수준의 증가는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가짐을 나타낼 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시태양에서, 바이오마커의 수준을 측정하기 전에 생물학적 샘플을 획득하는 추가 단계가 수행된다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 ALS를 치료하기 위한 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 포함한다.
또한, ALS를 갖는 피험자에서 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 키트가 제공되며, 여기서 키트는 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 측정할 수 있는 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하며, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다. 일부 실시태양에서, 키트는 생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준을 측정하게 하는 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함한다. 추가 실시태양에서, 키트는 또한 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및 miR-374b-5p 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 포함한다. 키트는 또한 바이오마커(들)의 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 검출제 및/또는 지시 자료를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하는 고체 지지체를 제공하며, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다. 일부 예에서, 지지체는 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함한다. 추가 예에서, 고체 지지체는 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p 및/또는 miR-374b-5p 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 고체 지지체는 멀티웰 플레이트, 슬라이드, 칩 또는 복수의 비드 중에서 선택된다.
추가 양태에서, ALS에 대한 치료에 대해 피험자를 계층화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 상기 및 본 발명에 기술된 방법에 따라 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하거나, 피험자의 ALS의 진행 속도를 평가하는 단계; 및 (b) 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행 ALS를 가질 가능성이 있는지, 또는 피험자에서 ALS의 진행 속도에 기초하여 피험자에 적합한 최적화된 치료 요법을 결정하는 단계를 포함한다. 피험자를 계층화하기 위한 이러한 방법은 또한 피험자를 최적화된 치료 요법에 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 피험자의 생물학적 샘플의 수준을 기초로 하여 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다; 및 (b) 빠르게 진행하는 ALS를 치료하기에 최적화된 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 CSF일 수 있다. 일부 실시태양에서, 단계 (a)는 피험자의 생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준에 기초하여 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계를 포함한다. 이 치료 방법의 추가 실시태양에서, 피험자를 선택하기 전에, 상기 방법은 피험자가 상기 및 본 발명에 기술된 방법에 따라 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 치료 요법은 항-신경퇴행성제, 예를 들어, 릴루졸, 에다라본, CD14 길항제, GM604, 마시티닙, 보체 경로 억제제(예를 들어, PMX205 또는 에쿨리주맙과 같은 C5a 억제제), 또는 CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제(예를 들어, AT-1502 항체와 같은 CD40 및/또는 CD40 리간드에 특이적으로 결합하는 항체)의 투여를 포함한다. 특정 실시태양에서, CD14 길항제는 다음으로부터 선택된 것과 같이 CD14 길항제 항체이다:
(1) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ [SEQ ID NO: 1] (3C10 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 2] (3C10 VH);
(2) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 3] (28C5 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID NO: 4] (28C5 VH); 및
(3) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5] (18E12 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 6] (18E12 VH).
추가 실시태양에서, 치료 요법은 피험자를 평균 체적 보장 압력 지원장치(AVAPS), 지속 기도 양압기(CPAP) 및/또는 이중 기도 양압기(BiPAP)와 같은 비 침습성 인공호흡 장치에 노출시키는 단계를 포함한다. 특정 예에서, 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자는 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 경우 보다 더 일찍 비 침습성 인공호흡 장치에 노출된다.
본 발명은 또한 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 피험자의 생물학적 샘플의 수준을 기초로 하여 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다; 및 (b) 느리게 진행하는 ALS를 치료하기에 최적화된 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 포함한다. 생물학적 샘플은 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 CSF일 수 있다. 일부 실시태양에서, 단계 (a)는 피험자의 생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준에 기초하여 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계를 포함한다. 이 치료 방법의 추가 실시태양에서, 피험자를 선택하기 전에, 상기 방법은 피험자가 상기 및 본 발명에 기술된 방법에 따라 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 치료 요법은 항-신경퇴행성제의 투여를 포함하지 않는 반면, 다른 예에서, 치료 요법은 항-신경퇴행성제, 예를 들어, 릴루졸, 에다라본, CD14 길항제, GM604, 마시티닙, 보체 경로 억제제(예를 들어, PMX205 또는 에쿨리주맙과 같은 C5a 억제제), 또는 CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제(예를 들어, AT-1502 항체와 같은 CD40 및/또는 CD40 리간드에 특이적으로 결합하는 항체)의 투여를 포함한다. 특정 실시태양에서, CD14 길항제는 다음으로부터 선택된 것과 같이 CD14 길항제 항체이다:
(1) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ [SEQ ID NO: 1] (3C10 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 2] (3C10 VH);
(2) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 3] (28C5 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID NO: 4] (28C5 VH); 및
(3) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5] (18E12 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 6] (18E12 VH).
또한, ALS를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하기 위한 키트의 제조에서 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자의 사용이 고려되며, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다. 일부 예에서, 사용은 ALS를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하기 위한 키트의 제조에서 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자와 LBP에 특이적인 항원 결합 분자의 조합이다. 추가 실시태양에서, 적어도 하나의 다른 바이오마커(예를 들어, CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 또는 miR-374b-5p)에 특이적인 항원 결합 분자는 키트의 제조에도 사용된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 ALS(빠르고 및 느리게 진행하는 ALS로 분리)를 가진 피험자와 건강한 지원자(대조군 또는 NC)로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 분리된 팬 단핵구의 유세포 분석 결과를 도시한다. 세포는 항-인간 CD14-V450 항체 및 항-인간 CD16-FITC로 염색되었고 유세포 분석을 실시하여 단핵구 집단을 평가하였다. 다음 그래픽 표현에서, 흰색 막대는 CD14+/CD16- 단핵구이며; 회색 막대는 CD14+/CD16+ 단핵구이며; 검은색 막대는 CD14low/CD16+ 단핵구이다. (A) PBMC에서 단핵구 하위 집단; (B) 분리된 팬 단핵구에서 단핵구 하위 집단; (C) PBMC에서 단핵구 하위 집단에 대한 CD14 발현; 및 (D) 단리된 팬 단핵구에서 단핵구 하위 집단에 대한 CD14 발현.
도 2는 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 백분율 및 (A) 질환 부담 또는 (B) 질환 진행 사이의 상관 관계를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 3은 ALS(빠르게 및 느리게 진행하는 ALS로 분리)를 가진 피험자와 건강한 지원자(NC)를 가진 피험자로부터 말초 PBMC와 분리된 팬 단핵구의 유세포 분석 결과를 도시한다. 세포는 항-인간 CD14-V450 항체, 항-인간 CD16-FITC 및 항-인간 TIM3-PE로 염색되었고 유세포 분석을 실시하여 단핵구 집단을 평가하였다. (A) PBMC에서 단핵구 하위 집단; (B) 분리된 팬 단핵구에서 단핵구 하위 집단; (C) CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구와 질환 진행 속도 간의 상관 관계; 및 (D) CD14-/low/ CD16+/TIM-3+ 단핵구와 질환 진행 속도 간의 상관 관계.
도 4는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 ELISA로 측정한 sCD14의 수준을 제공한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 혈청 sCD14 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자에서 혈청 sCD14 수준; (C) 건강한 지원자 및 ALS 환자의 CSF에서 sCD14; (D) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자의 CSF에서 sCD14; (E) 혈청과 CSF sCD14 수준 사이의 상관 관계; (F) 건강한 대조군 및 ALS 환자의 소변에서 sCD14; (G) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자의 소변에서 sCD14.
도 5는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS를 가진 피험자에서 PBMC로부터 분리된 mRNA의 qRT-PCR에 의해 측정된 CD14 mRNA의 수준을 제공한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자의 PBMC에서 CD14 mRNA; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자의 PBMC에서 CD14 mRNA.
도 6은 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군), ALS를 가진 피험자 및 다른 신경학적 질환을 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 ELISA로 측정된 sCD14의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군, 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 환자 및 치매 환자의 환자의 혈청 sCD14 수준; (B) 건강한 대조군, 경증 알츠하이머병 환자(경증 AD; n=10), 진행성 알츠하이머병 환자(Adv AD) 및 전두엽 치매(FTD) 환자의 혈청 sCD14 수준; (C) 건강한 대조군 및 만성 염증성 탈수 초성 다발 신경 병증(CIDP) 환자에서 혈청 sCD14 수준; 및 (D) 건강한 대조군, 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자 및 CIDP 환자에서 혈청 sCD14 수준.
도 7은 ALS 환자에서 혈청 sCD14와 질환 부담 또는 질환 진행 마커 사이의 상관 관계를 도시한다. (A) ALS 환자에서 혈청 sCD14와 AALS 점수 사이의 상관 관계; (B) 혈청 sCD14와 ALS Tregs의 억제 능력 사이의 상관 관계; 및 (C) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 질환의 느린 대 빠른 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선.
도 8은 2.73μg/ml의 혈청 sCD14의 ROC 점수 컷오프를 사용하여 ALS 환자의 혈청 sCD14 수준과 임상 결과 간의 상관 관계를 도시한다. (A) 사망했거나 생존한 2.73μg/ml 초과의 sCD14 수준을 가진 ALS 환자의 비율; (B) 2.73μg/ml 초과 또는 미만의 sCD14 수준을 갖는 ALS 환자에 대한 진단에서 100점의 AALS 점수까지의 시간; (C) sCD14 수준이 2.73㎍/ml 초과 또는 미만인 ALS 환자의 진단에서 사망까지의 시간; (D) 혈청 sCD14와 개별 ALS 환자의 진단으로부터 100점의 AALS 점수에 도달하는 시간 사이의 상관 관계; (E) 개별 ALS 환자에서 혈청 sCD14와 진단에서 사망까지의 시간 사이의 상관 관계.
도 9는 건강한 지원자(대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 지질 다당류 결합 단백질 (LBP)의 수준과 질병 부담과의 상관 관계를 보여줍니다. (A) 대조군 및 ALS 환자에서 LBP의 혈청 수준; (B) 느리거나 빠르게 진행되는 질병을 가진 대조군 및 ALS 환자의 LBP의 혈청 수준. (C) LBP의 혈청 수준과 AALS 점수 간의 상관 관계; 및 (D) LBP의 혈청 수준과 sCD14의 혈청 수준 간의 상관 관계.
도 10은 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 C-반응성 단백질(CRP)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 CRP의 혈청 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 CRP의 혈청 수준.
도 11은 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 MIF의 혈청 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 MIF의 혈청 수준.
도 12는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 가용성 종양 괴사 인자 수용체 I 및 II(sTNFRI 및 sTNFRII)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 sTNFRI의 혈청 수준; (B) HV 및 ALS 환자에서 sTNFRII의 혈청 수준; (C) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자에서 TNFRI의 혈청 수준; (D) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 TNFRII의 혈청 수준; 및 (E) ALS 환자에서 TNFRI 및 TNFRII의 혈청 수준 간의 상관 관계.
도 13은 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군(C)) 및 ALS를 가진 피험자(두 번째 연구)의 혈청 샘플에서 sCD14의 수준을 제공한다. (A) 첫 번째 또는 두 번째 연구에서 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 sCD14 수준. (B) 첫 번째 및 두 번째 연구의 코호트를 비교하는 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가진 환자 또는 건강한 대조군의 혈청 sCD14 수준. (C) 두 번째 연구에서 ALS 환자의 혈청 sCD14와 질환 진행 속도 간의 상관 관계. (D) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.767; 특이성: 0.710). (E) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 대 느린 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.942; 특이성: 0.958). (F) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.950; 특이성: 0.958). (G) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.633; 특이성: 0.654).
도 14는 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군(C)) 및 ALS를 가진 피험자(두 번째 연구)의 혈청 샘플에서 LBP 수준을 제공한다. (A) 첫 번째 또는 두 번째 연구에서 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 LBP 수준. (B) 첫 번째 및 두 번째 연구의 코호트를 비교하는 느리거나 빠르게 진행하는 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 LBP 수준. (C) 두 번째 연구에서 ALS 환자의 혈청 LBP와 질환 진행 속도 간의 상관 관계. (D) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.817; 특이성: 0.920). (E) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 대 느린 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.923; 특이성: 0.938). (F) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.967; 특이성: 1). (G) 혈청 LBP 수준을 사용하여 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.783; 특이성: 0.865)
도 15는 느리고 빠르게 진행하는 ALS 환자의 혈청에서 sCD14와 LBP 사이의 상관 관계를 도시한다.
도 16은 혈청 sCD14와 혈청 LBP의 조합을 사용하여 질환의 진행을 예측하기위한 ROC 곡선을 도시한다. (A) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린(S) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선. (B) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 대 느린(S) 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선. (C) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선. (D) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선. (E) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 또는 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.783; 특이성: 0.950). (F) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 대 느린(S) 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.942; 특이성: 0.958). (G) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 1; 특이성: 1). (H) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.800; 특이성: 0.808).
도 2는 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 백분율 및 (A) 질환 부담 또는 (B) 질환 진행 사이의 상관 관계를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 3은 ALS(빠르게 및 느리게 진행하는 ALS로 분리)를 가진 피험자와 건강한 지원자(NC)를 가진 피험자로부터 말초 PBMC와 분리된 팬 단핵구의 유세포 분석 결과를 도시한다. 세포는 항-인간 CD14-V450 항체, 항-인간 CD16-FITC 및 항-인간 TIM3-PE로 염색되었고 유세포 분석을 실시하여 단핵구 집단을 평가하였다. (A) PBMC에서 단핵구 하위 집단; (B) 분리된 팬 단핵구에서 단핵구 하위 집단; (C) CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구와 질환 진행 속도 간의 상관 관계; 및 (D) CD14-/low/ CD16+/TIM-3+ 단핵구와 질환 진행 속도 간의 상관 관계.
도 4는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 ELISA로 측정한 sCD14의 수준을 제공한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 혈청 sCD14 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자에서 혈청 sCD14 수준; (C) 건강한 지원자 및 ALS 환자의 CSF에서 sCD14; (D) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자의 CSF에서 sCD14; (E) 혈청과 CSF sCD14 수준 사이의 상관 관계; (F) 건강한 대조군 및 ALS 환자의 소변에서 sCD14; (G) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자의 소변에서 sCD14.
도 5는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS를 가진 피험자에서 PBMC로부터 분리된 mRNA의 qRT-PCR에 의해 측정된 CD14 mRNA의 수준을 제공한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자의 PBMC에서 CD14 mRNA; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자의 PBMC에서 CD14 mRNA.
도 6은 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군), ALS를 가진 피험자 및 다른 신경학적 질환을 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 ELISA로 측정된 sCD14의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군, 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 환자 및 치매 환자의 환자의 혈청 sCD14 수준; (B) 건강한 대조군, 경증 알츠하이머병 환자(경증 AD; n=10), 진행성 알츠하이머병 환자(Adv AD) 및 전두엽 치매(FTD) 환자의 혈청 sCD14 수준; (C) 건강한 대조군 및 만성 염증성 탈수 초성 다발 신경 병증(CIDP) 환자에서 혈청 sCD14 수준; 및 (D) 건강한 대조군, 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자 및 CIDP 환자에서 혈청 sCD14 수준.
도 7은 ALS 환자에서 혈청 sCD14와 질환 부담 또는 질환 진행 마커 사이의 상관 관계를 도시한다. (A) ALS 환자에서 혈청 sCD14와 AALS 점수 사이의 상관 관계; (B) 혈청 sCD14와 ALS Tregs의 억제 능력 사이의 상관 관계; 및 (C) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 질환의 느린 대 빠른 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선.
도 8은 2.73μg/ml의 혈청 sCD14의 ROC 점수 컷오프를 사용하여 ALS 환자의 혈청 sCD14 수준과 임상 결과 간의 상관 관계를 도시한다. (A) 사망했거나 생존한 2.73μg/ml 초과의 sCD14 수준을 가진 ALS 환자의 비율; (B) 2.73μg/ml 초과 또는 미만의 sCD14 수준을 갖는 ALS 환자에 대한 진단에서 100점의 AALS 점수까지의 시간; (C) sCD14 수준이 2.73㎍/ml 초과 또는 미만인 ALS 환자의 진단에서 사망까지의 시간; (D) 혈청 sCD14와 개별 ALS 환자의 진단으로부터 100점의 AALS 점수에 도달하는 시간 사이의 상관 관계; (E) 개별 ALS 환자에서 혈청 sCD14와 진단에서 사망까지의 시간 사이의 상관 관계.
도 9는 건강한 지원자(대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 지질 다당류 결합 단백질 (LBP)의 수준과 질병 부담과의 상관 관계를 보여줍니다. (A) 대조군 및 ALS 환자에서 LBP의 혈청 수준; (B) 느리거나 빠르게 진행되는 질병을 가진 대조군 및 ALS 환자의 LBP의 혈청 수준. (C) LBP의 혈청 수준과 AALS 점수 간의 상관 관계; 및 (D) LBP의 혈청 수준과 sCD14의 혈청 수준 간의 상관 관계.
도 10은 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 C-반응성 단백질(CRP)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 CRP의 혈청 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 CRP의 혈청 수준.
도 11은 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 MIF의 혈청 수준; (B) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 MIF의 혈청 수준.
도 12는 건강한 지원자(건강한 대조군) 및 ALS 피험자의 혈청에서 가용성 종양 괴사 인자 수용체 I 및 II(sTNFRI 및 sTNFRII)의 수준을 도시한다. (A) 건강한 대조군 및 ALS 환자에서 sTNFRI의 혈청 수준; (B) HV 및 ALS 환자에서 sTNFRII의 혈청 수준; (C) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환을 가진 ALS 환자에서 TNFRI의 혈청 수준; (D) 건강한 대조군 및 느리거나 빠르게 진행하는 질환이 있는 ALS 환자에서 TNFRII의 혈청 수준; 및 (E) ALS 환자에서 TNFRI 및 TNFRII의 혈청 수준 간의 상관 관계.
도 13은 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군(C)) 및 ALS를 가진 피험자(두 번째 연구)의 혈청 샘플에서 sCD14의 수준을 제공한다. (A) 첫 번째 또는 두 번째 연구에서 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 sCD14 수준. (B) 첫 번째 및 두 번째 연구의 코호트를 비교하는 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가진 환자 또는 건강한 대조군의 혈청 sCD14 수준. (C) 두 번째 연구에서 ALS 환자의 혈청 sCD14와 질환 진행 속도 간의 상관 관계. (D) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.767; 특이성: 0.710). (E) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 대 느린 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.942; 특이성: 0.958). (F) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 신속한(빠른) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.950; 특이성: 0.958). (G) 혈청 sCD14 수준을 사용하여 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.633; 특이성: 0.654).
도 14는 건강한 지원자(건강한 대조군 또는 대조군(C)) 및 ALS를 가진 피험자(두 번째 연구)의 혈청 샘플에서 LBP 수준을 제공한다. (A) 첫 번째 또는 두 번째 연구에서 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 LBP 수준. (B) 첫 번째 및 두 번째 연구의 코호트를 비교하는 느리거나 빠르게 진행하는 ALS 또는 건강한 대조군 환자의 혈청 LBP 수준. (C) 두 번째 연구에서 ALS 환자의 혈청 LBP와 질환 진행 속도 간의 상관 관계. (D) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.817; 특이성: 0.920). (E) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 대 느린 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.923; 특이성: 0.938). (F) 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.967; 특이성: 1). (G) 혈청 LBP 수준을 사용하여 느린 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.783; 특이성: 0.865)
도 15는 느리고 빠르게 진행하는 ALS 환자의 혈청에서 sCD14와 LBP 사이의 상관 관계를 도시한다.
도 16은 혈청 sCD14와 혈청 LBP의 조합을 사용하여 질환의 진행을 예측하기위한 ROC 곡선을 도시한다. (A) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른) 또는 느린(S) 진행 대 대조군을 예측하기 위한 ROC 곡선. (B) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 대 느린(S) 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선. (C) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선. (D) 혈청 sCD14 및 LBP 수준을 사용하여 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선. (E) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 또는 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.783; 특이성: 0.950). (F) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 대 느린(S) 진행을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.942; 특이성: 0.958). (G) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 신속한(빠른; F) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 1; 특이성: 1). (H) 스케일된 혈청 sCD14 및 스케일된 혈청 LBP 수준을 사용하여 느린(S) 진행 대 대조군(C)을 예측하기 위한 ROC 곡선(Mann Whitney 테스트에 의한 P<.0001; 민감성: 0.800; 특이성: 0.808).
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어들이 아래에 정의된다.
본 발명에서 관사 "a" 및 "an"은 본 발명의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 하나 이상)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "바이오마커"는 하나의 바이오마커 또는 하나 이상의 바이오마커를 의미한다.
본 발명에 사용된 "및/또는"은 대안적(또는)으로 해석될 때 조합이 결여될 뿐만 아니라 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 의미하고 포함한다.
용어 "ALS" 및 "루게릭병"은 동일한 상태를 지칭하기 위해 본 발명에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 가족성 ALS 및 산발성 ALS 모두 치료될 수 있거나 이의 발달 또는 진행은 피험자 방법에 의해 측정될 수 있다. 모든 형태의 ALS는 본 발명에서 고려된다. ALS를 가진 피험자는 빠르게 진행하는 ALS(빠르게 진행하는 ALS와 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되는 용어) 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 수 있으며, 용어는 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자는 느리고 빠르게 진행하는 피험자의 정확한 분류가 질환 및 질환 진행을 평가하는 데 사용되는 점수 시스템에 의존할 것임을 인식할 것이다. 예시적인 점수 시스템은, 예를 들어, 시험 기반 Appel ALS(AALS) 점수 및 설문지 기반 ALS 기능적 평가 척도(ALSFRS) 점수를 포함한다. ALSFRS 점수는 4개 영역(미세 운동, 총 운동, 구근 및 호흡기)으로 분류된 10개의 질문을 기반으로 하며 40(정상)에서 0(최저 기능)까지의 범위이다(Cedarbaum et al. J Neurol Sci 1997;152(suppl 1):S1-9). AALS 점수는 5개 범주(구근, 호흡기 기능, 팔과 다리 기능, 근력)의 객관적인 테스트를 기반으로 하며 30(정상)에서 164(최대 장애)까지의 범위이다(Appel et al. Ann Neurol 1987;22:328 -333; Haverkamp et al. Brain. 1995; 118:707-19). 특정 예에서 AALS 점수 시스템이 사용되며, 임계 값은 빠르게 진행하는 ALS와 느리게 진행하는 ALS를 구분한다. 임계 값은, 예를 들어, 약 1.0 내지 약 2.0 AALS 포인트/월, 예컨대 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0 AALS 포인트/월일 수 있으며, 여기서 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 역치 이상의 속도로 진행하는 피험자이고, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 역치 미만의 속도로 진행하는 피험자이다. 다른 예에서, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 역치보다 더 큰 속도로 진행하는 피험자이고, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 역치 이하의 속도로 진행하는 피험자이다. 특정 실시태양에서, 빠르게 진행하는 ALS를 느리게 진행하는 ALS와 구별하기 위한 임계 값은 1.5 AALS 포인트/월이고, 여기서 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자는 1.5 AALS 포인트/월 이상의 속도로 진행하는 피험자이고, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 월 1.5 AALS 포인트 미만의 속도로 진행하는 피험자이다(Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79).
바이오 마커의 "양" 또는 "수준"은 샘플에서 검출 가능한 수준이며 절대적인 양 또는 수준 또는 상대적인 양 또는 수준을 나타낼 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 의해 측정될 수 있으며, 이의 예시적인 예가 본 발명에 개시되어 있다.
본 발명에 사용된 "및/또는"은 대안적(또는)으로 해석될 때 조합이 결여될 뿐만 아니라 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합을 의미하고 포함한다.
"항원 결합 분자"는 표적 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 항원 결합 활성을 나타내는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 비 면역글로불린 유래 단백질 프레임워크로 확장되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 대표적인 항원 결합 분자는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 특히 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단클론 항체(전장, 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체) 및 단일 가변 도메인 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 뿐만 아니라 이의 멀티머(예를 들어, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭될 수 있다) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약칭될 수 있다) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역과 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 항체의 FR(또는 이의 항원 결합 부분)은 인간 생식 계열 서열과 동일할 수 있거나 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 일치 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석을 기반으로 정의될 수 있다. 용어 "항체"의 범위에는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 임의의 부류의 항체가 포함되며 항체는 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다른 부류에 할당될 수 있다. 5개 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 존재하며, 이들 중 일부는 하위 부류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.
"항원-결합 단편"은 비 항체 단백질 스캐폴드 상의 하나 이상의 CDR의 배열에 의해 제공될 수 있다. 본 발명에 사용된 "단백질 스캐폴드"는 면역글로불린(Ig) 스캐폴드, 예를 들어 4개 사슬 또는 2개 사슬 항체일 수 있거나, 항체의 Fc 영역만을 포함할 수 있거나, 항체로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있고, 불변 영역은 인간 또는 영장류 기원일 수 있거나, 인간 및 영장류 불변 영역의 인공 키메라일 수 있는 IgG 스캐폴드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단백질 스캐폴드는 Ig 스캐폴드, 예를 들어 IgG 또는 IgA 스캐폴드일 수 있다. IgG 스캐폴드는 항체의 일부 또는 모든 도메인(즉, CH1, CH2, CH3, VH, VL)을 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgG4PE로부터 선택된 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 IgG1일 수 있다. 스캐폴드는 항체의 Fc 영역으로 이루어지거나 포함할 수 있거나 이의 일부이다. 항원 결합 단편의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초 가변 영역(예를 들어, CDR3 펩타이드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR)) 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위. 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 결실 항체, 키메라 항체, CDR 이식 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 작은 모듈형 면역치료제(SMIP) 및 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 기타 조작된 분자는 또한 본 발명에서 사용되는 "항원 결합 단편"이라는 표현에 포함된다. 항체의 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성물일 수 있으며 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 관련된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치될 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체의 항원 결합 단편은 하나 이상의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비 제한적이고 예시적인 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3, (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2, (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 나열된 예시적인 구성 중 임의의 것을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연한 또는 반-유연한 연결을 생성하는 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인와의 비 공유 결합으로 상기 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성 중 임의의 것의 동종 이량체 또는 이종 이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다. 완전한 항체 분자와 마찬가지로, 항원 결합 단편은 단일 특이적 또는 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적)일 수 있다. 항체의 다중 특이적 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 동일한 항원상의 상이한 에피토프 또는 별개의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에 개시된 예시적인 이중 특이적 항원 결합 분자 형식을 포함하는 임의의 다중 특이적 항원 결합 분자 형식은 당업계에서 이용 가능한 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 개조될 수 있다.
용어 "결합하다", "특이적으로 결합하다", "특이적인" 및 관련 문법적 변이체는 일반적으로 공유 또는 비 공유 상호작용 또는 공유 또는 비 공유 상호작용의 조합에 의해 매개될 수 있는 이러한 쌍을 이룬 종(예를 들어, 항체 및 항원) 사이에 발생하는 결합을 의미한다. 두 종의 상호작용이 비공유 결합 복합체를 생성할 때, 발생하는 결합은 일반적으로 정전기, 수소 결합 또는 친유성 상호작용의 결과이다. 따라서, "특이적 결합"은 항체/항원 또는 효소/기질 상호작용의 특징을 갖는 결합 복합체를 생성하는 둘 사이에 상호작용이 있는 쌍을 이룬 종 사이에서 발생한다. 특히, 특이적 결합은 한 쌍의 구성원이 특정 종에 결합하고 결합 구성원의 상응하는 구성원이 속하는 화합물 패밀리 내의 다른 종에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용된 용어 "바이오마커"는 특정 질환, 표현형, 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, ALS의 존재, 이의 증상, 중증도 및 질환 진행 속도)과 정량적으로 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미한다. 적합한 바이오마커의 예시적인 예는 단백질, 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 또는 단백질의 단편; 탄수화물 및/또는 당지질 기반 분자 마커; 유전자 산물, RNA 또는 RNA 단편, 폴리뉴클레오타이드 카피 수 변경(예를 들어, DNA 카피 수)과 같은 폴리뉴클레오타이드; 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 변형(예를 들어, 번역 후 변형, 인산화, DNA 메틸화, 아세틸화 및 기타 염색질 변형, 글리코실화 등)을 포함한다. 특정 실시태양에서, "바이오마커"는 다른 샘플 또는 적합한 대조군/참조에서 동일한 마커에 대해 측정/비교될 때 샘플에 차별적으로 존재하는(즉, 증가/상향 조절되거나 감소/하향 조절되는) 분자/화합물을 의미한다. 다른 실시태양에서, 바이오마커는 동일하거나 다른 샘플 또는 적합한 대조군/참조에서 다른 마커에 대해 측정/비교될 때 샘플에 차별적으로 존재할 수 있다. 추가 실시태양에서, 바이오마커는 동일한 또는 또 다른 샘플 또는 적합한 대조군/참조의 다른 마커 및 다른 샘플 또는 적합한 대조군/참조의 동일한 마커에 대해 측정/비교될 때 샘플에 차별적으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 바이오마커는 제 2 표현형(예를 들어, 질환 또는 상태가 없거나 덜 심각한 버전의 질환 또는 상태를 가짐)을 갖는 피험자 또는 피험자 그룹으로부터의 샘플과 비교될 때 제 1 표현형(예를 들어, 질환 또는 상태를 갖는)을 갖는 피험자 또는 피험자 그룹으로부터의 샘플에 차별적으로 존재할 수있다. "ALS 진행 바이오마커"는 ALS 진행 속도와 관련된 분자를 의미한다.
본 명세서 전체에서, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 포함하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "포함하는" 등의 사용은 열거된 요소가 필수이거나 필수적이지만, 다른 요소는 선택적이며 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "이루어지는"은 "이루어지는"이라는 구절을 따르는 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "이루어지는"이라는 구절은 열거된 요소가 필수이거나 필수이며, 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "필수적으로 이루어지는"은 문구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하며, 열거된 요소에 대해 본 발명에서 특정된 활동 또는 동작을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, "필수적으로 이루어지는"이라는 구절은 열거된 요소가 필수이거나 필수이지만, 다른 요소는 선택적이며, 열거된 요소의 활동 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다.
상태를 치료하는 맥락에서 "유효량"에 의해, 이러한 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 증상의 발생을 예방하고 그러한 증상을 확인하고 기존 증상을 치료하는 데 효과적인 단일 투여량으로 또는 일련의 일부로 제제 또는 조성물의 양을 투여하는 것을 의미한다. 유효량은 치료할 피험자의 연령, 건강 및 신체 상태 및 질환의 증상이 명백한지 여부, 치료할 개체의 분류학적 그룹, 조성물의 제제, 의학적 상황의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 변할 것이다. 최적의 투약 스케줄은 피험자 신체의 약물 축적 측정으로부터 계산될 수 있다. 최적 투여량은 개별 피험자에서의 상대 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 생체 외 및 생체 내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50 값에 기초하여 추정될 수 있다. 당업자는 최적 용량, 투여 방법 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다. 이 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
용어 "상승된 수준" 등은 샘플링시 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자 또는 ALS가 없는 것으로 알려진 건강한 피험자의 샘플에서 동일한 바이오마커의 수준과 같은 적합한 참조 수준에 비해 샘플에서 증가된 수준 또는 양의 바이오마커를 의미한다.
용어 "감소된 수준" 등은 샘플링시 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자 또는 ALS가 없는 것으로 알려진 건강한 피험자의 샘플에서 동일한 바이오마커의 수준과 같은 적합한 참조 수준에 비해 샘플에서 감소된 수준 또는 양의 바이오마커를 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 적합한 참조 수준과 비교하여 "동일하거나 유사한" 샘플에서 바이오마커 수준에 대한 언급은 샘플에서 바이오마커 수준과 참조 수준의 임의의 차이가 그것들을 서로 구별하거나 그들이 나타내는 상태 또는 표현형(예를 들어, 건강하고 느리게 진행되는 ALS 또는 빠르게 진행되는 ALS)을 구별하는 데 불충분하다는 것을 의미한다. 이해되는 바와 같이, 이것은 수학적 모델 및/또는 통계적 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 예에서, "동일 또는 유사"는 단지 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 수준 차이를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "교육 자료"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는 데 사용될 수 있는 출판물, 기록물, 다이어그램 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육 자료는 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩타이드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착되거나 핵산, 펩타이드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 배송될 수 있다. 대안으로, 교육 자료는 수령인이 교육 자료와 화합물을 협력적으로 사용할 의도로 용기와 별도로 배송될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단핵구"는 면역계의 백혈구 유형을 의미한다. 단핵구는 일반적으로 CD14의 발현을 특징으로 한다. 단핵구는 또한 125I-WVH-1, 63D3, 아디포필린, CB12, CD11a, CD11b, CD15, CD54, Cd163, 시티딘 데아미나제, Flt-1 등의 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현할 수 있다. 용어 "단핵구"는 인간 혈액에 존재하는 고전적 단핵구 및 비 고전적 전 염증성 단핵구 둘 다를 제한없이 포함한다. "고전적 단핵구"는 높은 수준의 세포 표면 CD14 발현(CD14++ 단핵구)을 특징으로 하는 단핵구 유형을 의미하는 반면, 용어 "비-고전적 전 염증성 단핵구"는 일반적으로 낮은 수준의 세포 표면 CD14 발현을 가지나, 선택적으로 세포 표면 CD16 수용체(CD14+ CD16+ 단핵구)의 추가 공동-발현을 갖는 단핵구를 의미한다.
용어 "환자" 및 "피험자"는 본 발명에서 상호 교환적으로 사용되며 광범위하게 임의의 척추 동물을 의미한다. 적합한 척추 동물은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 영장류(예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원)를 포함하는 척추동물아문의 구성원을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 피험자는 인간이다. 일부 실시태양에서, 피험자는 ALS, 예컨대 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "유전자 물질", "유전자 형태", "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태 및 혼합 폴리머, 센스 및 안티센스 가닥 모두를 포함하고, 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 비 천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 함유할 수 있다.
용어 "예후" 및 이의 문법적 변형은 일반적으로 개인에서 ALS와 같은 질환 또는 상태의 가능한 진행 또는 중증도에 관한 정보를 제공하는 바이오마커(들), 바이오마커 프로파일 또는 방법을 의미한다. 일부 실시태양에서, 예후는 또한 피험자의 질환 또는 상태에 대한 요법 또는 다른 치료 요법에 대한 양성 또는 음성 반응을 입증하는 능력을 이미한다. 일부 실시태양에서, 예후는 질환/상태 관련 증상의 존재 또는 감소를 예측하는 능력을 의미한다. 예후 인자 또는 방법은 피험자로부터 얻은 피험자 또는 샘플을 여러 범주 중 하나로 분류하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 범주는 피험자가 특정 결과를 경험할 다른 가능성과 상관 관계가 있다. 예를 들어, 범주는 위험이 낮고 위험이 높을 수 있으며, 위험이 낮은 범주의 피험자는 고위험 범주의 피험자보다 불량한 결과를 경험할 가능성이 낮다(예를 들어, 5년 또는 10년과 같은 주어진 기간 내). 나쁜 결과는, 예를 들어, 질환의 진행, 질환의 재발 또는 질환으로 인한 사망일 수 있다. "가능성"은 특정 바이오마커 수준을 가진 피험자가 주어진 수학적 모델에 기초하여 실제로 빠르게 진행하는 ALS를 갖는지 또는 느리게 진행되는지의 척도를 의미한다. 예를 들어, 증가된 가능성은 상대적이거나 절대적일 수 있으며 질적으로 또는 양적으로 표현될 수 있다. 예를 들어, 증가된 가능성은 단순히 바이오 마커의 수준을 결정하고 이전 모집단 연구에 기초하여 피험자를 "증가된 가능성" 범주에 배치함으로써 결정될 수 있다. 용어 "가능성"은 또한 본 발명에서 용어 "확률"과 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, ALS의 진행 속도는 질환의 중증도가 증가하는 데 걸리는 시간의 평가를 의미한다. 질환의 중증도는 환자가 나타내는 질환의 증상 수 및/또는 하나 이상의 증상의 중증도를 측정하여 평가될 수 있다. 검사 기반 Appel ALS(AALS) 점수 및 설문지 기반 ALS 기능 평가 척도(ALSFRS) 점수(위에서 논의됨)를 포함하여 다양한 채점 시스템을 사용하여 다이아제의 중증도를 평가할 수 있다. 이러한 상황에서 진행 속도는 시간 경과에 따른 점수 변화, 예를 들어, 매월 AALS 점수의 변화를 계산하여 결정될 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같이, sCD14 및/또는 LBP와 같은 바이오마커는 질환 진행 속도와 강한 상관 관계가 있으며 이러한 바이오마커의 수준은 또한 ALS의 진행 속도를 평가하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 사용 된 용어 "샘플"은 피험자로부터 추출, 미처리, 치료, 희석 또는 농축될 수 있는 본 발명에 기술된 생물학적 마커를 포함하는 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 샘플은 하나의 생물학적 마커(예를 들어, sCD14) 또는 생물학적 마커 집단을 함유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위해 고려되는 생물학적 샘플의 예시적인 예는 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액(CSF) 및 타액을 포함한다.
본 발명에 개시된 방법은 샘플에서 바이오마커의 값 또는 수준을 "참조", "적합한 대조군", "대조군" 등으로 상호 교환적으로 지칭되는 "참조 수준"과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. "참조 수준"은 건강한 상태, 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS와 같은 표현형 또는 상태를 나타내는 값, 수준 또는 값 또는 수준의 범위이다. 일부 실시태양에서, 참조 값은 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 하나 이상의 피험자, 느리게 진행하는 ALS를 갖는 하나 이상의 피험자, 또는 ALS가 없는 하나 이상의 피험자, 예컨대 하나 이상의 건강한 개인으로부터 취한 하나 이상의 생물학적 샘플로부터 결정된다. 다른 실시태양에서, "참조 값"은 예를 들어 건강한 피험자, 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자를 반영하는 것으로 확립된 미리 결정된 또는 미리 정의된 값 또는 수준이다(예를 들어, 특정 바이오마커 프로필과 관련된 바이오마커 수준). 따라서, 일부 실시태양에서, 참조 수준은 본 발명에 개시된 방법을 수행하기 전에 결정되었다. 참조 수준 또는 값은 또한 생물학적 샘플(예를 들어, ELISA, LC-MS, GC-MS, PCR 등)에서 바이오마커의 수준을 측정하는 데 사용되는 특정 기술에 맞게 조정될 수 있으며, 여기서 바이오마커의 수준은 사용되는 특정 기술에 따라 다를 수 있다. 특정 실시태양에서, 참조 수준은 임계 수준 또는 값이며, 그 초과 또는 그 미만은 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 표시한다.
본 발명에 사용된 용어 "고체 지지체"는 핵산 및/또는 폴리펩타이드와 같은 분자 종이 고정될 수 있는 고체 불활성 표면 또는 몸체를 의미한다. 고체 지지체의 비 제한적인 예는 유리 표면, 플라스틱 표면, 라텍스, 덱스트란, 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아마이드 겔, 금 표면 및 실리콘 웨이퍼를 포함한다. 일부 실시태양에서, 고체 지지체는 막, 슬라이드, 칩, 입자 (비드 포함) 및 다중 벽 플레이트의 형태이다. 지지체는 각각 다른 부착된 분자 종을 갖는 복수의 입자 또는 비드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 고체 지지체는 공유 부착을 허용하는 반응성기를 포함하는 중간 물질의 층 또는 코팅을 분자에 적용함으로써 "작용화"된 불활성 기재 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 분자는 중간 물질에 직접 공유 결합될 수 있지만 중간 물질 자체는 기질이나 매트릭스에 비공유 결합될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, ALS 질환의 "증상"에 대한 언급은 ALS 질환을 나타내는 것으로 간주되는 신체적 또는 정신적 특징이다. 비 제한적인 ALS 매개 질환 증상은 진행성 근육 위축, 마비, 경련, 과반사 및 삼킴 곤란, 사지 쇠약, 불분명한 언어, 보행 장애, 안면 쇠약, 호흡기 변화 및 근육 경련과 같은 기타 증상을 포함한다. 전형적으로, 피험자는 질환 중증도, 질환의 임상 단계 및 개별 피험자에 따라 하나 또는 여러 가지 증상을 나타낼 것이다. 어느 증상이 ALS 질환을 나타내는 것으로 간주되는지의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있을 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 등은 치료가 필요한 피험자, 즉 ALS를 갖거나 ALS 갖는 것으로 진단된 피험자 또는 ALS의 발병 위험이 있는 피험자에서 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. "치료"는 다음을 의미한다:
(a) ALS의 발병 및/또는 진행 지연;
(b) ALS의 증상 개선;
(c) ALS 또는 이의 증상을 억제; 및/또는
(d) 삶의 질 향상 또는 연장.
"치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 반드시 피험자를 치료하거나 질환 진행을 무기한으로 예방하는 것을 의미하지는 않는다. 피험자는 궁극적으로 신경 퇴행성 질환에 굴복할 수 있지만, 질환 또는 상태의 발병이 지연되기 때문에 삶의 질은 치료하지 않은 것보다 더 오랜 기간 연장된다.
성공적인 "치료"의 표시는 완화; 경감; 환자가 더 견딜 수 있는 기억 또는 상태의 감소; 퇴행 속도 또는 질병의 쇠퇴 또는 악화의 감소; 악화의 최종점을 덜 쇠약하게 만드는 것; 또는 피험자의 신체적 또는 정신적 안녕 향상과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경학적 검사 및/또는 정신과 평가를 포함하는 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다.
본 발명에 기술된 각각의 실시태양은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 각각의 모든 실시태양에 준용된다.
2. ALS 진행 속도를 평가하는 방법
본 발명은 적어도 부분적으로, ALS를 갖는 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커(즉, ALS 진행 바이오마커)의 수준이 피험자에서 ALS의 진행 속도와 상관 관계가 있다는 결정에 근거한다. 예를 들어, 본 발명에서 입증된 바와 같이, 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자의 생물학적 시료에서 하나 이상의 바이오마커의 수준은 일반적으로 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자의 생물학적 시료에서 동일한 바이오마커의 수준 및 건강한 피험자와 비교하여 증가(또는 상승)된다. 반대로, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 수준은 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 생물학적 시료에서 동일한 바이오마커의 수준과 비교하여 감소(또는 축소)된다. 평가되는 생물학적 샘플에 따라, 그리고 본 발명에서 교시된 바와 같이, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 하나 이상의 바이오마커의 수준은 건강한 피험자의 생물학적 샘플에서 동일한 바이오마커의 수준과 비교하여 동일하거나 유사하거나 증가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 참조 수준(참조 수준이 특정 진행 속도를 나타내거나 나타내는 경우)에 비례하여 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준을 결정하고 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준에 기초하여 진행 속도를 결정함으로써 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 참조 수준에 비례하여 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준을 결정하고 생물학적 샘플에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자가 빠르거나 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정함으로써 피험자가 빠르거나 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 방법을 포함한다. 통상적으로, 피험자는 이미 ALS로 진단되었거나 동시에 ALS로 진단되는데, 예를 들어, 본 발명에 기술된 ALS 진행 바이오마커의 평가는 ALS의 진단을 확인하기 위해 다른 평가와 함께 이루어질 수 있다. 추가 실시태양에서, 피험자는 ALS에 대한 치료를 받고 있고, ALS 진행 속도의 평가는 치료 효능을 평가하기 위해 사용된다.
본 발명에 기술된 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 증가 또는 상승된 수준은 참조 수준과 비교하여 본 발명에 기술된 것과 같은 표준 당업계 공지 방법에 의해 검출된 바이오마커 수준의 적어도 또는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 임의의 것의 전체 증가를 의미한다. 특정 실시태양에서, 증가 또는 상승된 수준은 샘플에서 바이오마커의 수준/양의 증가를 의미하며, 여기서 증가는 참조 수준의 적어도 또는 약 1.5x, 1.75x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 25x, 50x, 75x, 또는 100x의 임의의 것이다.
본 발명에 기술된 임의의 방법의 일부 실시태양에서, 감소 또는 축소된 수준은 참조 수준과 비교하여 본 발명에 기술된 것과 같은 표준 당업계 공지 방법에 의해 검출된 바이오마커 수준의 적어도 또는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 임의의 것의 전체 감소를 의미한다. 특정 실시태양에서, 감소 또는 축소된 수준은 샘플에서 바이오마커의 수준/양의 감소를 의미하며, 여기서 감소는 참조 수준의 적어도 또는 약 0.9x, 0.8x, 0.7x, 0.6x, 0.5x, 0.4x, 0.3x, 0.2x, 0.1x, 0.05x, 또는 0.01x의 임의의 것이다.
바이오마커
ALS의 진행 속도를 예후하는 ALS 진행 바이오마커의 예는 가용성 CD14(sCD14)이다. 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 막 당 단백질인 CD14는 호중구에서도 낮은 수준이 발견되지만 단핵구/대식세포에 의해 우세하게 발현되는 골수 분화 마커이다. Toll-유사 수용체 4 및 MD-2와 함께, CD14는 LPS의 공동 수용체 역할을 한다. 단핵구가 활성화되면, 막 CD14(mCD14)가 세포 표면에서 절단되고 sCD14가 방출된다. mCD14의 단핵구 활성화 의존적 배출(shedding)은 sCD14의 대부분을 산출한다.
본 발명에서 입증된 바와 같이, ALS를 가진 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 sCD14 수준은 ALS의 진행 속도를 평가하는 데 사용될 수 있으며 해당 피험자가 ALS가 빠르게 또는 느리게 진행될 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다. sCD14 수준은 질환 진행과 밀접한 관련이 있으며 낮은 수준의 sCD14는 느린 진행과 관련이 있고, sCD14의 높은 수준은 빠른 진행과 관련이 있다. 따라서, 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자는 일반적으로 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자 및 건강한 피험자와 비교하여 증가된(또는 상승된) 수준의 sCD14를 갖는다. 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 빠르게 진행되는 ALS를 가진 피험자와 비교하여 감소된(또는 축소된) 수준의 sCD14를 갖는다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 또는 CSF일 수 있다.
생물학적 샘플이 혈액, 혈청, 혈장 또는 CSF인 경우, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 건강한 대상체와 비교하여 동일하거나 유사한 수준의 sCD14를 가질 수 있거나, 건강한 피험자와 비교하여 증가된 수준의 sCD14를 가질 수 있다. 생물학적 샘플이 소변인 경우, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 건강한 피험자와 비교하여 증가된(또는 상승된) 수준의 sCD14를 갖지만, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자에서 관찰된 수준만큼 증가하지는 않는다(즉, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자의 소변에서 sCD14 수준은 일반적으로 건강한 개인과 비교하여 증가하지만 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자와 비교하여 감소된다).
따라서, ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 sCD14 수준의 결정은 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하고/하거나 피험자가 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
지질다당류 결합 단백질(LBP, 본 발명에서 sLBP로도 지칭됨)은 ALS의 진행 속도와 관련하여 예후 가치를 갖는 또 다른 ALS 진행 바이오마커이다. 지질다당류 결합 단백질은 LPS에 결합하는 가용성 급성기 단백질이다. CD14는 LPS에 대한 공동 수용체이지만 LBP가 있는 경우에만 LPS에 결합할 수 있다. LBP는 간세포와 장 상피 세포에 의해 합성되며 신호 전달을 위해서는, LPS와 LBP의 복합체를 CD14에 결합시키는 것이 필요하다.
LBP 수준은 또한 질환 진행과 밀접한 관련이 있으며, 낮은 수준의 LBP는 느린 진행과 관련이 있고, 높은 수준의 LBP는 빠른 진행과 관련이 있다. 일반적으로, LBP 수준은 일반적으로 ALS가 느리게 진행되는 피험자 또는 건강한 피험자에 비해 빠르게 진행되는 ALS를 갖는 피험자에서 증가(또는 상승)된다. 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자와 비교하여 감소된(또는 축소된) 수준의 LBP를 가지며, 건강한 피험자와 동일하거나 유사한 수준의 LBP 또는 건강한 피험자와 비교하여 증가된 수준의 LBP를 가진다. 따라서, ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 LBP 수준의 결정은 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하고/하거나 피험자가 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
ALS 진행에 대한 예후 가치를 갖는 또 다른 예시적인 바이오마커는 C 반응성 단백질(CRP)이다. CRP는 간에서 생성되며 염증이 있을 때 증가한다. 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자 및 건강한 피험자와 비교하여 증가(또는 상승된) 수준의 CRP를 갖는다. 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자와 비교하여 생물학적 샘플에서 감소된(또는 축소된) 수준의 CRP를 가지며, 건강한 피험자와 동일하거나 유사한 수준의 CRP를 가진다. 따라서, ALS를 가진 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 CRP 수준의 결정은 피험자가 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
가용성 종양 괴사 인자 수용체 I(sTNFR1) 및 가용성 종양 괴사 인자 수용체 II(sTNFRII)는 또한 ALS 진행을 위한 예후 바이오마커로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다. TNFRI 및 TNFRII는 TNF에 결합하는 세포 표면 수용체이다. 두 수용체 모두 편재적으로 발현되고 구조적으로 유사한 세포 외 도메인을 표시하지만 별개의 세포 내 영역을 통해 신호를 보내며, TNFRI는 TNFRII에 존재하지 않는 사멸 도메인을 포함한다. 2개의 TNFR은 엑소좀에서 세포 외 도메인의 단백질 분해 절단, 또는 막 횡단 및 세포질 도메인의 손실로 이어지는 mRNA 전사체의 선택적 스플라이싱을 통해 가용성 단백질로 방출된다.
본 발명에서 입증된 바와 같이, sTNFRI 및 sTNFRII의 수준은 일반적으로 느리게 진행하는 ALS를 가진 대상체 및 건강한 피험자와 비교하여 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자에서 증가(또는 상승)된다. 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자와 비교하여 감소된(또는 축소된) 수준의 sTNFRI를 가지며, 건강한 피험자와 동일하거나 유사한 수준을 가진다. 따라서, ALS를 가진 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 TNFRI 및/또는 TNFRII 수준의 결정은 피험자가 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에서 적어도 sCD14의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 생물학적 샘플에서 적어도 LBP의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, sCD14 및 LBP 둘 다의 수준이 측정된다. 선택적으로, 이러한 방법은 CRP, TNFRI 및 TNFRII 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 다른 바이오마커의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적인 실시태양에서, 본 발명의 방법은 임의로 sCD14, LBP 및 CRP 중 하나 이상을 사용하여 적어도 TNFRI 또는 TNFRII의 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서 평가될 수 있는 다른 바이오마커는, 예를 들어, 전 염증성 사이토카인 MIF(본 발명에서 입증된 바와 같이, 일반적으로 건강한 피험자와 비교하여 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자 및 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자 모두에서 상승됨), 신경섬유 경쇄(NFL; Tortelli et al., Eur J Neurol. 2012;19(12):1561-7; Gaiani et al. JAMA Neurol. 2017, 74(5):525-532), miR-206, miR-143-3p 및/또는 miR-374b-5p(Waller et al. Neurobiol Aging 2017, 55:123-131), 인산화된 신경섬유 중쇄(pNfH)(Boylan et al., J Neurochem. 2009;111(5):1182-91; Steinacker et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016, 87(1):12-20) 및/또는 p75 뉴로트로핀 수용체 세포 외 도메인(p75NTRECD; Shepheard et al. Neurology. 2017, 88(12):1137-1143)을 포함한다. 이들 추가 바이오마커는 본 발명 및 이전에 기술된 바와 같이 질환 부담 및/또는 진행 속도에 대한 추가 명확성을 제공할 수 있다.
생물학적 샘플
생물학적 샘플은 피험자로부터 추출, 미처리, 처리, 희석 또는 농축된 샘플을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 평가에 적합한 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 CSF를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 혈청에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준이 평가된다. 다른 예시적인 실시태양에서, 소변에서 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준이 평가된다. 생물학적 샘플을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
2개 이상의 바이오마커가 평가되는 경우, 2개 이상의 바이오마커가 동일한 피험자의 동일한 생물학적 샘플 또는 상이한 생물학적 샘플에서 평가될 수 있음이 이해된다. 이것은 서로 다른 시간에 채취한 동일한 유형의 생물학적 샘플(예를 들어, 서로 다른 시간에 채취한 두 개의 혈청 샘플, 일반적으로 서로 몇 분 또는 몇 시간 이내) 및 서로 다른 유형의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈청 샘플 및 소변 샘플)을 포함한다.
바이오마커 수준 평가
본 발명에 따른 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계는, 예를 들어, 데이터베이스, 컴퓨터, 또는 기술자 또는 실험실로부터의 통신 또는 보고로부터, 하나 이상의 바이오마커의 이전에 측정된 수준을 얻는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하는 단계는 또한 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시태양에서, 생물학적 샘플에서 하나 이상의 바이오마커의 수준은 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하기 위해 측정된다.
하나 이상의 바이오마커의 수준은 당업자에게 알려진 임의의 적절한 기술 또는 수단을 사용하여 측정 또는 평가될 수 있다. 특정 실시태양에서, sCD14, LBP, CRP, MIF, sTNFRI 및/또는 sTNFRII와 같은 바이오마커의 수준은 항체 기반 기술을 사용하여 평가되며, 이의 비 제한적인 예는 효소-연결 면역 흡착 분석(ELISA) 및 방사 면역 분석(RIA)과 같은 면역 분석을 포함한다. 이러한 분석 형식을 사용하는 광범위한 면역 분석 기술이 이용 가능하며, 예를 들어, U.S. Pat. 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653 참조. 이들은 비경쟁 유형의 단일 부위 및 2개 부위 또는 "샌드위치" 분석뿐만 아니라 전통적인 경쟁 결합 분석을 모두 포함한다. 이러한 분석은 또한 표지된 항체에 대한 표적 바이오마커의 직접 결합을 포함한다. sCD14, LBP, CRP, MIF, sTNFRI 및/또는 sTNFRII의 수준을 측정하기 위한 ELISA는 시판되고/있거나 sCD14, LBP, CRP, MIF, sTNFRI 및/또는 sTNFRII에 특이적인 공지된 항체를 사용하여 당업자에 의해 쉽게 개발될 수 있다.
2개 이상의 바이오마커의 수준이 평가되는 특정 실시태양에서, 다중 면역분석(예를 들어, 다중 ELISA)과 같은 다중 분석이 사용될 수 있다. 다중 분석은 일반적으로 항체 어레이라고 하는 공간적으로 주소가 지정된 항원 결합 분자를 포함하는 어레이를 포함하며, 이는 여러 단백질의 광범위한 병렬 분석을 용이하게 할 수 있다. 항체 어레이는 필요한 특이성과 허용 가능한 배경 특성을 갖는 것으로 나타났다. 항체 어레이의 제조를 위한 다양한 방법이 보고되었다(예를 들어, Lopez et al., 2003 J. Chromatogr. B 787:19-27; Cahill, 2000 Trends in Biotechnology 7:47-51; U.S. Pat. App. Pub. 2002/0055186; U.S. Pat. App. Pub. 2003/0003599; PCT publication WO 03/062444; PCT publication WO 03/077851; PCT publication WO 02/59601; PCT publication WO 02/39120; PCT publication WO 01/79849; PCT publication WO 99/39210 참조)
개별적으로 공간적으로 구별되는 단백질 포획제는 일반적으로 평면이거나 윤곽이 있는 지지체 표면에 부착된다. 일반적인 물리적 지지체는 유리 슬라이드, 실리콘, 마이크로웰, 나이트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인, 자기 및 기타 마이크로비드를 포함한다.
부유 입자는 식별을 위해 암호화된 경우 다중 분석 및 어레이의 기초로 사용될 수 있다; 시스템은 마이크로비드(예를 들어, Luminex, Bio-Rad and Nanomics Biosystems에서 구입 가능) 및 반도체 나노결정(예를 들어, QDotsTM, Quantum Dots에서 구입 가능)에 대한 색상 코딩과 비드(UltraPlex®, Smartbeads에서 사용 가능) 및 다중 금속 마이크로로드에 대한 바코드를 포함한다(NanobarcodesTM 입자, Surromed에서 구입 가능). 비드는 반도체 칩(예를 들어, LEAPS 기술 및 BioArray 솔루션에서 구입 가능)의 평면 어레이로 조립될 수 있다. 입자가 사용되는 경우, 개별 단백질 포획제는 일반적으로 개별 입자에 부착되어 어레이의 공간적 정의 또는 분리를 제공한다. 그런 다음 입자는 개별적으로 분석될 수 있지만, 예를 들어, 미세적정 플레이트의 웰 또는 별도의 테스트 튜브에서 구획화된 방식으로 병렬로 분석될 수 있다.
단백질 포획 어레이의 한 가지 예시적인 예는 비드 기반 멀티플렉싱 분석인 Luminex® 기반 멀티플렉스 분석이며, 비드가 내부적으로 형광 염료로 염색되어 특정 스펙트럼 주소를 생성한다. 생체 분자(예를 들어, 항체)는 비드 표면에 접합하여 관심 바이오마커를 포착할 수 있다. 그런 후에, 비드의 특성화 및 바이오마커의 검출 및 정량화를 위해 유세포 분석 또는 당업자에게 공지된 다른 적합한 이미징 기술이 사용될 수 있다.
단백질 바이오마커를 검출하고 정량하는 다른 방법은 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS), 실시간 질량 분광법(DART MS)의 직접 분석, SELDI-TOF 및 MALDI-TOF를 포함하는 질량 분광법(MS)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
ALS 진행 평가
본 발명의 방법은 피험자에서 ALS의 가능한 진행 속도를 평가하는 데 사용될 수 있고, ALS를 갖는 피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이는 상기 및 본 발명에 기술된 바와 같이 하나 이상의 ALS 진행 바이오마커의 수준을 결정하고 선택적으로 그 수준을 적합한 참조 수준과 비교함으로써 수행된다. 이해되는 바와 같이, 참조 수준과 비교하여 증가(또는 상승), 감소(또는 축소) 또는 동일하거나 유사한 수준의 바이오마커는 피험자가 느리게 진행하는 ALS 또는 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는지 또는 피험자가 가진 진행 속도를 나타내는지는 평가에 사용되는 참조 수준에 따라 달라질 것이다.
참조 수준은 건강한 피험자, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자, 또는 특정 진행 속도를 가진 피험자(예를 들어, 월별 AALS 포인트로 측정)를 나타낼 수 있다. 따라서, 참조 수준과 비교하여 바이오마커 수준의 증가, 감소 또는 변화 없음이 피험자가 느리게 진행하는 ALS 또는 빠르게 진행하는 ALS 또는 특정 진행 속도를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는지는 참조 수준이 건강한 피험자, 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자, 빠르게 진행하는 ALS 또는 특정 진행 속도를 가진 피험자를 나타내는지에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 상기 및 본 발명에 기술된 바와 같이, 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자는 전형적으로 느리게 진행하는 ALS 및 건강한 피험자와 비교하여 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, CSF 또는 소변)에서 증가된(또는 상승된) 수준의 sCD14 및/또는 LBP를 가진다. 또한 본 발명에서 입증된 바와 같이, sCD14 및 LBP의 수준은 ALS의 진행 속도와 밀접한 관련이 있으며, 여기서 낮은 수준의 sCD14 및/또는 LBP는 높은 수준의 sCD14 및/또는 LBP보다 더 낮은 진행 속도(예를 들어, 한 달에 AALS 포인트로 측정)와 관련이 있다.
하나 이상의 ALS 바이오마커의 수준을 측정하여 진행 속도를 평가하는 경우, 바이오마커의 수준과 특정 진행 속도(예를 들어, 진행 속도가 알려진 ALS 환자 코호트의 표준 곡선에 의해 생성)를 나타내는 참조 수준 간의 직접 비교가 이루어질 수 있으며, 이에 따라 바이오마커의 수준이 참조 수준과 동일하거나 유사한 경우, 피험자에서 ALS의 진행 속도는 해당 참조 수준으로 표시되는 진행 속도와 동일하거나 유사하다.
다른 예에서, 건강한 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자를 나타내는 참조 수준과 비교하여 ALS를 갖는 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 sCD14 수준의 증가는 ALS를 갖는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 참조 수준이 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준과 동일하거나 유사한 sCD14 수준은 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것을 나타낼 것이다. 반대로, 본 발명에 기술된 바와 같이, 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자는 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자에 비해 감소된(또는 축소된) 수준의 sCD14를 갖는다. 따라서, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 참조 수준과 비교하여 ALS를 가진 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 sCD14 수준의 감소는 ALS를 가진 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 참조 수준이 건강한 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준과 동일하거나 유사한 생물학적 샘플에서 sCD14 수준은 ALS를 가진 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가지고 있다는 것을 나타낼 수 있다.
유사하게, 건강한 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 참조 수준과 비교하여 ALS를 가진 피험자의 생물학적 샘플에서 LBP 수준의 증가는 LBP를 가진 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낼 수 있다. 참조 수준이 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준과 동일하거나 유사한 LBP 수준은 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것을 나타낼 것이다. 반대로, 본 발명에 기술된 바와 같이, 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자는 일반적으로 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 피험자에 비해 감소된(또는 축소된) 수준의 LBP를 갖는다. 따라서, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 참조 수준과 비교하여 ALS를 가진 피험자로부터의 생물학적 샘플에서 LBP 수준의 감소는 ALS를 가진 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 참조 수준이 건강한 피험자 또는 느리게 진행하는 ALS를 가진 피험자를 나타내는 경우, 참조 수준과 동일하거나 유사한 생물학적 샘플에서 LBP 수준은 ALS를 가진 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가지고 있다는 것을 나타낼 수 있다.
특정 실시태양에서, 참조 수준은 임계치이며, 이보다 높거나 낮으면 피험자가 빠르게 진행하는 ALS 또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 것을 나타낸다. 예를 들어, 참조 수준은 임계치일 수 있으며 참조 수준과 같거나 그 초과의 샘플에서 바이오마커의 수준이 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내며, 참조 수준보다 낮은 샘플에서 바이오마커의 수준은 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다. 다른 예에서, 참조 수준은 임계치일 수 있으며 참조 수준 초과의 샘플에서 바이오마커의 수준이 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내며, 참조 수준과 동일하거나 낮은 샘플에서 바이오마커의 수준은 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 예측할 수 있는 허용 가능한 능력을 제공하는 임계치가 선택될 수 있다. 예시적인 예에서, 수신자 조작 특성(ROC) 곡선은 두 집단에서 변수의 값(예를 들어, 바이오마커 수준) 대 상대 빈도를 플로팅하여 계산되며, 예를 들어, 첫 번째 집단은 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것으로 간주되고 두 번째 집단은 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것으로 간주된다.
임의의 특정 바이오마커의 경우, 특정 ALS 진행 속도를 갖는 피험자, 빠르게 진행하는 ALS를 갖거나 가질 가능성이 있는 피험자 및 느리게 진행하는 ALS를 갖거나 가질 가능성이 있는 피험자에 대한 바이오마커 수준의 분포가 중첩될 수 있다. 이러한 조건에서, 테스트는 특정 진행 속도를 가진 피험자를 다른 진행 속도를 가진 피험자 또는 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 절대(즉, 100%) 정확도로 절대적으로 구별하지 못할 수 있으며, 중첩 영역은 테스트가 두 피험자를 구별할 수 없다는 것을 나타낸다. 임계치는 그 초과(또는 위험에 따라 바이오마커가 어떻게 변하는지에 따라 그 미만)에서 테스트가 "양성"으로 간주되고 그 미만에서 테스트가 "음성"으로 간주되도록 선택될 수 있다. ROC 곡선 아래 영역(AUC)은 감지된 측정이 상태의 정확한 식별을 가능하게 할 확률의 측정인 C-통계를 제공한다(예를 들어, Hanley et al., Radiology 143: 29-36 (1982) 참조). 당업자는 현재 개시된 방법에 따라 사용하기 위해 임계치를 포함하는 적절한 참조 수준을 쉽게 결정할 수 있다.
3. 키트, 고체 지지체 및 조성물
본 발명은 또한 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 키트로 확장된다. 따라서 이러한 키트는 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하거나 피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 단백질 기반 검출 키트는 상기 및 본 발명에 기술된 하나 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 및 선택적으로 양성 대조군으로 사용될 수 있는 적어도 하나의 바이오 마커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시태양에서, 키트는 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및/또는 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함한다. 추가 실시태양에서, 키트는 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및/또는 miR-374b-5p와 같은 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 함유한다. 따라서, 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하기 위한 키트의 제조를 위한 또는 피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성을 결정하기 위한 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자의 용도 및/또는 LBP에 특이적인 항원 결합 분자의 용도가 또한 고려된다. 일부 예에서, 용도는 또한 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및/또는 miR-374b-5p와 같은 다른 바이오마커에 특이적인 적어도 하나의 다른 항원 결합 분자의 용도를 포함한다. sCD14 또는 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자, 예를 들어 항체 및 이의 항원 결합 단편은 당업계에 잘 알려져 있고 본 발명에 기술된 키트 및 용도에 사용될 수 있다.
키트는 또한 예를 들어 검출을 용이하게 하는 접합체 및 기질(예를 들어, 스트렙타비딘, 비오틴, 호오스래디쉬 과산화효소 등으로 표지된 항체)을 포함하는 적합한 검출제를 포함할 수 있다. 키트는 또한 다양한 장치 및 추가 시약 및/또는 완충제, 및/또는 키트를 사용하여 하나 이상의 바이오마커 수준을 정량화하기 위한 인쇄된 지침 자료를 특징으로 할 수 있다. 검출 가능한 라벨과 선택적으로 연관될 수 있는 본 발명에 기술된 키트 시약은 복수의 비드, 다중벽 플레이트, 마이크로어레이, 슬라이드, 마이크로플루이딕스 카드 또는 샘플의 바이오마커 수준의 측정을 위해 본 발명에 기술된 기술과 함께 사용하도록 개조된 칩의 형식으로 제공될 수 있다.
키트의 구성요소를 포장하는 데 적합한 재료는 크리스탈, 플라스틱(폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 봉투 등을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 키트는 키트에 포함된 상이한 구성요소의 동시, 순차적 또는 개별 사용을 위한 교육 자료를 포함할 수 있다. 교육 자료는 인쇄된 자료의 형태이거나 지시를 저장할 수 있는 전자 지지체의 형태일 수 있어서 이들은 전자 저장 매체(자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체(CD-ROM, DVD) 등과 같이 피험자가 읽을 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 매체는 교육 자료를 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
또한, 상기 및 본 발명에 기술된 하나 이상의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)를 포함하여, 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하기 위한 또는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 방법에 사용하기 위한 고체 지지체 및 조성물이 제공된다. 특정 실시태양에서, 고체 지지체 및/또는 조성물은 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및/또는 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함한다. 고체 지지체 및 조성물은 또한 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및/또는 miR-374b-5p와 같은 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 선택적으로 포함할 수 있다. 예시적인 고체 지지체는 멀티 웰 플레이트, 슬라이드 및 칩을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시태양에서, 고체 지지체는 복수의 비드이다. 전술한 바와 같이, 이러한 고체 지지체는 sCD14 및/또는 LBP, 및 선택적으로 하나 이상의 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및/또는 miR-374b-5p의 수준과 같은 생물학적 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 수준을 결정하기 위해 다중 면역분석에서 사용될 수 있다.
4. 피험자 계층화 및 치료 적용
본 발명은 임상 시험 또는 질환의 관리 또는 질환의 치료와 같은 피험자 계층화 및 또한 치료 적용으로 확장된다. 예를 들어, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 피험자는 새로운 치료법의 효능을 평가하는 임상 시험에 포함되도록 식별되고 선택될 수 있다. 이러한 피험자를 임상 시험에 포함시키는 것은 질환 진행에 대한 더 짧은 기간이 치료의 효능에 대한 더 빠른 증거를 산출할 수 있기 때문에 바람직하다. 다른 실시태양에서, 적절하거나 최적화된 치료 요법은 피험자가 느리거나 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것으로 확인되었는지 여부에 기초하여 발명될 수있다.
ALS의 치료에 유용한 것으로 기술된 치료 요법은 하나 이상의 항-신경변성제 투여를 포함하는 것을 포함한다. 이러한 제제는 릴루졸(Rilutek®/Teglutik®), 에다라본(Radicava®/Radicut®), CD14 길항제(예를 들어, CD14 길항제 항체), 항염증제, 예를 들어 C5a 수용체 작용제(예를 들어, PMX205 또는 에클리주맙(Lee J.D. et al., (2017) British Journal of Pharmacology, 174(8))과 같은 보체 경로의 차단제, CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 제제(CD40 및/또는 CD40 리간드에 특이적으로 결합하는 항체 포함)(예를 들어, AT-1502), GM604 및 마시티닙을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
한 실시태양에서, 치료 요법은 CD14 길항제 항체의 전신(예를 들어, 정맥) 투여와 같은 투여를 포함한다. CD14 효현제 항체는 CD14(예를 들어, mCD14 또는 sCD14)에 결합할 수 있고 CD14에 대한 DAMP 또는 PAMP의 결합을 차단하고/하거나 CD14에 결합하고 CD14 효현제-매개 반응을 억제 또는 감소시켜서 전 염증성 사이토카인의 생산을 포함하여 전 염증성 매개체의 생산을 초래한다. 일부 실시태양에서, CD14 길항제 항체는 CD14 효현제, 적합하게는 DAMP 또는 PAMP의 CD14에 대한 결합을 억제하여 전 염증성 사이토카인의 생산을 억제 또는 감소시킨다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, CD14 길항제 항체는 인간 CD14의 아미노산 7 내지 아미노산 14의 영역의 적어도 일부에 포함된 에피토프에 결합하는 3C10 항체(van Voohris et al., 1983. J. Exp. Med. 158: 126-145; Juan et al., 1995. J. Biol. Chem. 270(29): 17237-17242), CD14의 아미노산 57 내지 아미노산 64의 영역의 적어도 일부에 포함된 에피토프에 결합하는 MEM-18 항체(Bazil et al., 1986. Eur. J. Immunol. 16(12):1583-1589; Juan et al., 1995. J. Biol. Chem. 270(10): 5219-5224), 4C1 항체(Adachi et al., 1999. J. Endotoxin Res. 5: 139-146; Tasaka et al., 2003. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.; 2003. 29(2):252-258)뿐만 아니라 LPS의 결합을 억제하고 전 염증성 사이토카인의 생산을 억제하는 28C5 및 23G4 항체, 및 LPS의 결합을 부분적으로 억제하고 전 염증성 사이토카인의 생산을 억제하는 18E12 항체(U.S. Patent Nos. 5,820,858, 6,444,206 및 7,326,569)로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 CD14 길항제 항체는 TLR4와 같은 TLR에 대한 CD14의 결합을 억제함으로써, CD14-효현제 매개 반응을 차단하고, 이의 예는 국제 공개 WO2002/42333에 개시된 F1024 항체를 포함한다. CD14 길항제 항체는 전장 면역 글로불린 항체 또는 온전한 항체의 항원-결합 단편일 수 있으며, 이의 대표적인 예는 Fab 단편, F(ab')2 단편, VH 및 CH1로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편(Ward et al., 1989. Nature 341:544-546); 및 단리된 CDR을 포함한다. 적합하게는, CD14 길항제 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
일부 실시태양에서, CD14 길항제 항체는 미국 특허 제5,820,858호에 개시된 항체로부터 선택된다:
(1) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ [SEQ ID NO: 1] (3C10 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 2] (3C10 VH);
(2) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 3] (28C5 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID NO: 4] (28C5 VH); 및
(3) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5] (18E12 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 6] (18E12 VH).
상기 항체의 VL 및 VH CDR 서열을 포함하는 항체가 또한 고려되며, 이의 대표적인 실시태양은 다음을 포함한다 :
(1) a) L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인, 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 L-CDR1은 서열 RASESVDSFGNSFMH[SEQ ID NO: 7](3C10 L-CDR1)을 포함하고; L-CDR2는 서열 RAANLES[SEQ ID NO: 8](3C10 L-CDR2)를 포함하고; L-CDR3은 서열 QQSYEDPWT[SEQ ID NO: 9](3C10 L-CDR3)를 포함한다; 및 b) H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 H-CDR1은 서열 SYAMS[SEQ ID NO: 10](3C10 H-CDR1)를 포함하고; H-CDR2는 서열 SISSGGTTYYPDNVKG[SEQ ID NO: 11](3C10H-CDR2)를 포함하고; H-CDR3은 서열 GYYDYHY[SEQ ID NO: 12](3C10 H-CDR3)를 포함하는 항체;
(2) a) L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 L-CDR1은 서열 RASESVDSYVNSFLH[SEQ ID NO: 13](28C5 L-CDR1)를 포함하고; L-CDR2는 서열 RASNLQS[SEQ ID NO: 14](28C5 L-CDR2)를 포함하고; L-CDR3은 서열 QQSNEDPTT[SEQ ID NO: 15](28C5 L-CDR3)를 포함한다; 및 b) H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 H-CDR1은 서열 SDSAWN[SEQ ID NO: 16](28C5 H-CDR1)을 포함하고; H-CDR2는 서열 YISYSGSTSYNPSLKS[SEQ ID NO: 17](28C5 H-CDR2)를 포함하고; H-CDR3은 서열 GLRFAY[SEQ ID NO: 18](28C5 H-CDR3)를 포함하는 항체; 및
(3) a) L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 L-CDR1은 서열 RASQDIKNYLN[SEQ ID NO: 19](18E12 L-CDR1)을 포함하고; L-CDR2는 서열 YTSRLHS[SEQ ID NO: 20](18E12 L-CDR2)를 포함하고; L-CDR3은 서열 QRGDTLPWT[SEQ ID NO: 21](18E12 L-CDR3)를 포함한다; 및 b) H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 H-CDR1은 서열 NYDIS[SEQ ID NO: 22](18E12 H-CDR1)를 포함하고; H-CDR2는 서열 VIWTSGGTNYNSAFMS[SEQ ID NO: 23](18E12 H-CDR2)를 포함하고; H-CDR3은 서열 GDGNFYLYNFDY[SEQ ID NO: 24](18E12 H-CDR3)를 포함하는 항체.
일부 실시태양에서, CD14 길항제 항체는 인간화된다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 인간화 CD14 길항제 항체는 CD14 길항제 항체(예를 들어, 상기 기재된 CD14 길항제 항체 중 하나) 및 인간 수령자 프레임워크에 상응하는 공여자 CDR 세트를 적절하게 포함한다. 인간 수령자 프레임워크는 인간 생식 계열 수령자 프레임워크에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 이는 CDR에 인접한 잔기; 글리코 실화 부위 잔기; 희귀 잔기; 표준 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기; 버니어 구역 내의 잔기; 및 코티아-정의된 VH CDR1과 카 밧-정의된 제 1 중쇄 프레임 워크 사이에 중첩되는 영역의 잔기를 포함할 수 있다. 인간화된 mAb를 생산하는 기술은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, Jones et al., 1986. Nature 321: 522-525; Riechmann et al. 1988. Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988. Science 239: 1534-1536; Carter et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289; Sandhu, JS., 1992. Crit. Rev. Biotech. 12: 437-462, and Singer et al., 1993. J. Immunol. 150: 2844-2857 참조). 키메라 또는 뮤린 단클론 항체는 마우스 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄에서 마우스 CDR을 인간 항체의 상응하는 가변 도메인으로 전달함으로써 인간화될 수 있다. 키메라 단클론 항체에서 마우스 프레임워크 영역(FR)은 또한 인간 FR 서열로 대체된다. 단순히 마우스 CDR을 인간 FR로 옮기는 것은 종종 항체 친화도의 감소 또는 심지어 상실을 초래하기 때문에, 뮤린 항체의 원래 친화력을 회복시키기 위해 추가의 변형이 필요할 수 있다. 이것은 FR 영역에서 하나 이상의 인간 잔기를 이의 뮤린 대응 물로 대체하여 이의 에피토프에 대한 우수한 결합 친화력을 갖는 항체를 수득함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Tempest et al. (1991. Biotechnology 9:266-271) and Verhoeyen et al. (1988 supra) 참조. 일반적으로, 뮤린 대응물과 다르고 하나 이상의 CDR 아미노산 잔기에 근접하거나 접촉하는 인간 FR 아미노산 잔기가 치환 후보가 될 수 있다.
한 실시태양에서, CD14 길항제 항체는 IC14 항체(본 발명에 그 전문이 참조로 포함된 (Axtelle et al., 2001. J. Endotoxin Res. 7: 310-314; and U.S. Pat. Appl. No. 2006/0121574) 또는 이의 항원 결합 단편이다. IC14 항체는 인간 CD14에 특이적으로 결합하는 키메라(뮤린/인간) 단클론 항체이다. 이 항체의 뮤린 모는 상기 언급된 28C5이다(US Patent Nos. 5,820,858, 6,444,206 and 7,326,569 to Leturcq et al., and Leturcq et al., 1996. J. Clin. Invest. 98: 1533-1538 참조). IC14 항체는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며, 여기서:
VL 도메인은 아미노산 서열: METDTILLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO : 25]을 포함한다; 및
VH 도메인은 아미노산 서열: MKVLSLLYLLTAIPGILSDVQLQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [SEQ ID NO : 26]을 포함한다.
2개 이상의 항-신경퇴행성제는 이들의 부가적 활성 및 특정 경우에 이들의 상승 효과를 위해 조합하여 사용될 수 있다. 병용 요법이 필요한 경우, 제제는 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 이는 각각의 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약학적 제제를 투여하거나, 또는 둘 이상의 개별 조성물 또는 제제(각각 하나 이상의 제제를 함유)를 동시에 투여함으로써 달성될 수 있다. 다른 실시태양에서, 하나의 작용제를 사용한 치료는 분 내지 일 범위의 간격으로 다른 작용제를 사용한 치료에 선행하거나 후행할 수 있다.
둘 이상의 제제가 피험자에게 "함께" 또는 "동시에" 투여되는 경우, 이들은 동시에 단일 조성물로, 또는 동시에 별도의 조성물로, 또는 별도의 시간에 별도의 조성물로 투여될 수 있다.
치료 요법은 또한 또는 대안적으로 다른 개입을 포함할 수 있다. 이것은 음식, 정제, 경구 용액, 패치 또는 정맥 주사 또는 기타 비경구 투여 방식을 통해 제공되는 것과 같은 의약 및/또는 영양 개입을 포함한다. 다른 예에서, 개입은 호흡 곤란을 완화하는 데 사용되는 비 침습성 인공호흡 장치와 같이 기계적일 수 있다. 비 침습성 환기 장치는, 예를 들어, 음압 인공호흡 장치(NPV) 및/또는 비 침습성 양압 인공호흡 장치(NIPPV)를 포함할 수 있으며, 후자의 예는 지속 기도 양압기(CPAP), 이중 기도 양압기(BiPAP) 및 평균 체적 보장 압력 지원장치(AVAPS)이다. 대상 방법은 물리 치료, 언어 치료, 심리 치료 및 작업 치료를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 치료와 조합하여 실행될 수도 있다.
항-신경퇴행성제는 ALS와 관련된 증상의 완화와 같은 피험자에서 의도된 목적을 달성하기 위해 "유효량(들)"으로 투여될 수 있다. 환자에게 투여되는 제제(들)의 용량은 신경퇴행성 질환과 관련된 적어도 하나의 증상의 감소와 같이 시간이 지남에 따라 피험자에서 유익한 반응을 달성하기에 충분해야 한다. 일부 실시태양에서, 진행성 근육 위축, 마비, 경련, 과반사, 호흡 기능 및 삼킴 곤란, 사지 쇠약, 구음장애, 불분명한 언어, 보행 장애, 안면 쇠약, 및 근육 경련과 같은 기타 증상으로부터 선택된 적어도 하나의 증상의 감소가 있다.
투여되는 제제(들)의 양 또는 투여 빈도는 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태, 질환 부담 및 질환 진행 속도를 포함하여 치료될 피험자에 따라 달라질 수 있다. 이와 관련하여, 투여를 위한 제제(들)의 정확한 양은 의사의 판단에 달려 있을 것이다. 당업자는, 일상적인 실험에 의해, 원하는 치료 결과를 위한 약학적 조성물에 포함시킬 유효량의 본 발명에 기술된 항-신경퇴행성제를 결정할 수 있을 것이다.
특정 실시태양에서, 피험자가 노출되는 치료 요법은 하나 이상의 항-신경퇴행성제 투여를 포함하지 않는다. 그러한 치료 요법은 대신 영양 보충제의 투여 및/또는 적절한 식이 요법, 비 침습성 인공호흡, 물리 치료, 언어 치료, 심리 치료 및/또는 작업 치료를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것으로 결정되는 경우, 6, 12, 18, 24, 30, 36개월 또는 그 이상의 특정 기간 동안 하나 이상의 신경퇴행성제의 투여를 포함하지 않거나 적어도 하나 이상의 신경퇴행성제의 투여를 포함하지 않는 치료 요법이 구현된다. 다른 예에서, 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것으로 결정되는 경우, 피험자는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 피험자보다 일찍 비 침습성 환기를 받을 수 있다.
본 발명이 용이하게 이해되고 실질적인 효과를 발휘할 수 있도록 하기 위해, 특히 바람직한 실시태양이 이하의 비 제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
실시예 1
연구 주제
표준 프로토콜 승인, 등록 및 환자 동의. 이것은 휴스턴 감리교 병원의 MDA/ALSA ALS 클리닉에서 ALS 환자와 건강 지원자(HV; 건강한 대조군, 대조군 또는 NC라고도 함) 환자로부터 혈청 샘플을 수집한 전향적 코호트 연구이었다. 휴스턴 감리교 병원의 기관 검토위원회(IRB)의 윤리 승인 후 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. ALS 환자(2011년 1월부터 2016년 11월 사이에 모집)는 수정된 El Escorial 기준 및 Appel ALS (AALS) 점수(범위: 30-164, Haverkamp et al., 1995 Brain 118:707-719; Voustianiouk et al., 2008 Muscle Nerve. 37(5):668-72)에 따라 숙련된 ALS 신경과 전문의 (SHA)에 의해 진단되었다. ALS를 가진 환자 중 어느 누구도 지속적인 감염 질환이 없었다. HV(2008년 6월부터 2015년 2월 사이에 모집)는 일반적으로 환자의 배우자 및 친구였으며, 제외 기준은 신경학적 질환, 자가 면역 질환 또는 감염성 질환을 포함한다. 임상 정보는 증상 발병 및 진단에서 기준 평가 및 샘플 수집에 이르기까지 조사자에 의해 수집되었다. ALS 환자와 지원자 간의 인구 통계는 유사하였다.
바이오마커 정량
sCD14, LBP, CRP, MIF, sTNFRI 및 sTNFRII는 ELISA로 정량하였다.
단핵구 분리
인간 단핵구는 ALS 환자와 정상 대조군의 말초 혈액에서 새로 분리하였다. 인간 팬 단핵구 분리 키트(Miltenyi Biotec, San Diego, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 음성 선택을 통해 고순도 팬 단핵구를 얻었다.
유세포 분석
분리된 팬 단핵구를 비특이적 결합을 피하기 위해 Fc 차단제로 염색하였다. 분리된 단핵구와 신선한 혈액 샘플을 모두 항-인간 CD14-V450 항체(eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-인간 CD16-FITC(eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-인간 HLA-DR-PerCP Cy5.5(eBioscience, San Diego, CA, USA), 항-인간 TIM3-PE(eBioscience, San Diego, CA, USA)와 함께 배양하였다. 적혈구를 제거하기 위한 추가 용해 단계를 말초 혈액 샘플에 대해 수행하였다. 죽은 세포를 LIVE/DEAD® 고정식 청색 죽은 세포 염색 키트(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 염색하였다. 세포는 355, 488, 405, 561 및 633 레이저로 구성된 LSR II™ 13 컬러 유세포 분석기를 사용하여 즉시 분석하였다.
통계
2개 이상의 그룹에 대해 ANOVA를 사용하거나 2개 그룹에 대해 스튜던트 t-테스트를 사용하여 비교를 수행하였다. 상관 관계는 SigmaStat 소프트웨어에서 Spearman 순위 순서를 사용하여 수행하였다. ROC 곡선 분석은 R 통계 소프트웨어 패키지(Vienna, Austria; V.3.0.2)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균±SE로 표현되며 0.05 미만의 p 값은 중요한 것으로 간주되었다.
결과
PBMC 상의 CD14 및 CD16 표면 마커 및 ALS 및 HV 환자로부터 분리된 팬 단핵구.
CD14 및 CD16은 주로 단핵구/대식세포에 의해 발현된다. 세포 표면 발현에 따라 인간 단핵구는 CD14+/CD16-, CD14+/CD16+, 및 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 세 가지 별개의 하위 집합으로 나눌 수 있다. 유세포 분석을 사용하여, CD14 및 CD16 단핵구 표면 마커는 ALS 및 연령 일치 HV 환자 코호트의 PBMC에서 정량화되었다(도 1 a). CD14-/low/CD16+ 단핵구의 빈도는 HV와 비교하여 ALS 환자의 전체 PBMC 샘플에서 감소하였다(p = 0.04). ALS 환자는 1.5 Appel ALS(AALS 점수 시스템; Haverkamp et al., Brain 1995; 118:707-719) 포인트/월 이상의 속도로 진행되는 것으로 정의되는 빠르게 진행하는 환자 및 1.5 AALS 포인트/월 미만의 속도로 진행하는 것으로 정의된 느리게 진행하는 환자(Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79)로 분리하였다. 빠르게 진행하는 환자는 PBMC에서 감소된 CD14-/low/CD16+ 단핵구 수를 가졌다(p = 0.016). CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 집단의 빈도에는 차이가 관찰되지 않았다.
ALS 및 연령 일치 HV 환자의 두 번째 코호트에서, 팬 단핵구는 가능한 단핵구 활성화를 피하기 위해 음성 선택 프로토콜을 사용하여 PBMC에서 분리 및 정제 된 다음 다시 유세포 분석을 실시하였다; 양성 선택 또는 긴 구배 분리는 단핵구를 활성화할 수 있다. 정제된 단핵구의 CD14-/low/CD16+ 서브세트의 빈도는 느리게 진행하는 환자(p<0.001) 및 HV(p<0.001)와 비교하여 빠르게 진행하는 환자에서 다시 감소하였다(도 1b). PBMC 샘플에서 관찰된 바와 같이, CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 집단의 빈도에서 차이가 발견되지 않았다.
막 결합 CD14 (mCD14)의 세포 표면 발현이 실제로 감소했는지 확인하기 위해, CD14 중앙 형광 강도(MFI)를 PBMC 샘플에 대해 측정하였다. 결과는 ALS가 빠르게(p<0.01) 및 느리게 진행하는(p<0.01) ALS를 가진 환자가 HV보다 CD14+/CD16- 단핵구 표면에서 CD14 단백질 신호를 감소시켰음을 보여주었다(도 1c). 분리 및 정제된 팬 단핵구 데이터를 분석했을 때, ALS(p<0.01) 및 HV(p<0.01)를 가진 느리게 진행하는 환자와 비교하여 빠르게 진행하는 ALS 환자의 CD14 +/CD16- 및 CD14 +/CD16+ 단핵구에서 세포 표면 CD14 MFI가 감소하였다(도 1d). 이러한 데이터는 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 빈도와 CD14의 세포 표면 발현이 세포 표면에서 CD14를 능동적으로 배출하거나 단핵구 세포 표면에서 CD14의 감소된 생산 및 후속 발현에 의해 환자의 단핵구에서 감소됨을 시사한다.
CD14-/low/CD16+ 단핵구와 ALS 질환 부담 또는 진행 속도 간의 상관 관계
CD14-/low/CD16+ 단핵구의 빈도가 빠르게 진행하는 환자에서 감소하는 것으로 나타났기 때문에 스피어만 상관 계수 분석을 수행하여 단핵구 하위 집단의 빈도가 ALS 환자에서 질환 부담 또는 질환 진행 속도와 관련이 있는지 확인하였다. ALS 환자에서 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 백분율은 AALS 점수 시스템에 근거하여 질환 부담과 음의 상관 관계가 있었다(p<0.0001, R = 0.584)(도 2a); 질환 부담이 커짐에 따라, 이러한 단핵구의 빈도가 감소하였다. 또한, CD14-/low/CD16+ 단핵구의 백분율은 AALS 점수 시스템에 기반한 질환 진행 속도와 음의 상관 관계가 있었다(p<0.0001, R = 0.638)(도 2b); 질병 진행 속도가 빠를수록 이러한 단핵구의 감소가 커진다.
ALS 및 HV 환자로부터 분리된 PBMC의 CD14-/low/CD16+ 세포 및 단핵구의 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 하위 집단.
말초 면역 활성화는 이제 ALS 병리학의 인정된 구성 요소이고 TIM-3은 선천성 면역 세포에 의해 발현될 때 전 염증 반응을 촉진하는 것으로 나타났기 때문에(Anderson et al., Science 2007; 318(5853):1141-1143; Han et al., Front Immunol 2013; 4:449)), TIM-3 발현은 ALS 환자로부터 유래된 단핵구의 염증 촉진 능력에 대한 바이오마커로 사용되었다. CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 빈도는 느리게 진행하는 환자(p<0.001) 및 HV(p<0.001)로부터의 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 빈도와 비교하여 빠르게 진행하는 ALS 환자의 PBMC에서 증가하였다(도 3a). 분리 및 정제된 팬 단핵구를 CD14-/low/CD16+에 대한 TIM-3의 발현에 대해 분석했을 때, CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 빈도는 느리게 진행하는 환자(p<0.001) 및 HV(p<0.001)로부터의 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 빈도와 비교하여 빠르게 진행하는 ALS 환자의 PBMC에서 다시 증가하였다(도 3b). PBMC 및 팬 단핵구 샘플 모두에서 CD14+CD16- 또는 CD14+CD16+ 단핵구에 대한 TIM-3 발현 빈도는 느리거나 빠르게 진행하는 환자 또는 HV에서 변화되지 않는다. CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구 백분율은 또한 ALS 환자의 질환 진행 속도 및 질환 부담과 양의 상관 관계가 있다(각각 p = 0.005, R = 0.385; p = 0.009, R = 0.442)(도 3c 및 d).
혈청 가용성 CD14
단핵구가 활성화되면, mCD14가 세포 표면에서 절단되고 가용성 CD14(sCD14)가 방출된다; 증가된 혈청 sCD14 수준은 단핵구 활성화에 대한 바이오마커로 간주된다(Shive CL et al., AIDS. 201;29(10):1263-1265). CD14-/low/CD16+ 단핵구의 빈도와 CD14의 단핵구 표면 발현이 감소되었기 때문에, 혈청에서 sCD14 수준을 조사하였다. 환자 혈청 sCD14 수준은 HV의 혈청과 비교하여 상승하였다(p = 0.0001)(도 4a). 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 더 분리했을 때(n = 37), sCD14는 느리게 진행하는 환자(p<0.001) 또는 HV(p<0.001)과 비교하여 빠르게 진행하는 환자의 혈청에서만 상승하였다(도 4b). 느리게 진행하는 환자와 HV 사이에 혈청 sCD14 수준에는 차이가 없었다(p = 0.948).
sCD14 수준은 또한 이들 환자의 하위 집단에서 뇌척수액(CSF)과 소변에서 평가되었다. CSF sCD14의 절대 수준은 이들 환자의 혈청에서 측정된 것보다 10배 더 낮았다. sCD14는 HV에서 얻은 CSF와 비교하여 ALS 환자의 CSF에서 상승하였다(p = 0.021)(도 4c). 그러나, 환자를 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, 빠르게 진행하는 환자의 CSF 샘플만 느리게 진행하는 환자(p = 0.033) 및 HV 환자(p = 0.002)와 비교하여 증가된 sCD14 수준을 가졌다; ALS를 갖는 느리게 진행하는 환자 및 HV 환자 사이에 차이가 없었다(p = 0.154)(도 4d). 더욱이, sCD14의 CSF 수준은 sCD14의 혈청 수준과 양의 상관 관계가 있었다(p = 0.004, R = 0.619)(도 4e).
소변에서 sCD14의 수준과 관련하여, sCD14는 HV와 비교하여 ALS 환자에서 증가하였다(p = 0.000003)(도 4f). 환자를 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, 빠르게 진행하는 환자의 소변 샘플은 HV 환자(p = 0.0000006)와 비교하여 증가된 sCD14 수준을 가졌고, 느리게 진행하는 환자(p = 0.077)와 비교하여 빠르게 진행하는 환자의 소변에서 증가된 sCD14 수준에 대한 경향이 있었다(도 4g). HV와 비교하여 ALS를 가진 느리게 진행하는 환자의 소변 sCD14 수준에서 통계적으로 유의미한 증가가 있었지만, 이 증가는 빠르게 진행하는 환자(p = 0.022)에서 볼 수 있는 것보다 덜 두드러졌다(도 4g).
sCD14는 세포 표면으로부터의 절단에 의해 생성되거나 세포 내 풀로부터 방출될 수 있다. CD14 mRNA도 감소하는지 확인하기 위해, 환자의 PBMC에서 분리된 mRNA에 대해 qRT-PCR 분석을 수행하고 HV에서 분리된 mRNA와 비교하였다. CD14 mRNA는 환자의 PBMC에서 감소하였다(p = 0.003)(도 5a). mRNA 샘플을 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, CD14 mRNA는 느리게 진행하는 환자(p<0.001) 또는 HV(p<0.001)와 비교하여 빠르게 진행하는 환자에서만 감소되었다(도 5b). 느리게 진행하는 ALS 환자와 HV 사이에 CD14 mRNA에는 차이가 없었다(p = 0.691).
ALS 환자의 증가된 혈청 sCD14 수준이 이런 신경퇴행성 질환에 특이적인지 확인하기 위해, 치매 환자(알츠하이머 병 및 전두엽 치매), 기타 신경퇴행성 질환 환자의 혈청을 sCD14 농도에 대해 분석하고 적절한 연령 일치 HV(n = 13)와 비교하였다. HV와 비교하여 치매 환자의 혈청 sCD14 수준에 차이가 없었다(p = 0.177)(도 6a). 치매 환자를 경증 알츠하이머 병 환자(경증 AD; n = 10), 진행성 알츠하이머 병 환자(AD; n = 13), 전두엽 치매 환자(FTD; n = 4)로 분리하였을 때, 상이한 환자 그룹 사이에 차이가 없으며(경증 AD 대 AD, p = 0.689, 경증 AD 대 FTD, p = 0.894, AD 대 FTD, p = 0.742), 치매 환자의 각 그룹과 HV 사이에 차이가 없었다(경증 AD 대 HV, p = 0.569; AD 대 HV, p = 0.118; 및 FTD 대 HV, p = 0.369)(도 6b). 치매 환자/HV는 ALS 환자/HV보다 나이가 많았기 때문에 치매 환자 및 이들의 연령 일치 HV를 ALS 환자 및 이들의 개개의 연령 일치 HV와 직접 비교하지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
ALS 환자의 증가된 혈청 sCD14 수준이 다른 신경 질환과 다른지 확인하기 위해, 자가면역 신경 질환인 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP, n = 14) 환자의 혈청을 sCD14 수준에 대해 분석하고 적절한 연령 일치 HV와 비교하였다. 혈청 sCD14 수준은 CIDP 환자와 HV 사이에 차이가 없었다(p = 0.387)(도 6c). 이 분석에서, CIDP 환자와 연령 일치 HV는 ALS 환자 및 연령 일치 대조군과 다르지 않았으므로, CIDP 환자를 ALS 환자와 비교하였다(도 6d). 또한, 두 HV 그룹의 연령이 다르지 않았기 때문에(p = 0.751), 두 그룹 간의 혈청 sCD14 수준을 비교하였고 차이가 없었기 때문에(p = 0.555), 두 HV 그룹을 합쳤다(n = 34). 모든 ALS 환자의 혈청 sCD14 수준은 CIDP 환자의 혈청 sCD14 수준에 비해 증가하였다(p = 0.043). 그러나, ALS 환자를 빠르게 진행하는 환자(n = 20)와 느리게 진행하는 환자(n = 20)로 구분한 후, CIDP 환자와 비교했을 때, 빠르게 진행하는 ALS 환자만 CIDP 환자와 달랐다(p = 0.0002); 느리게 진행하는 ALS 환자와 CIDP 환자 사이에 차이가 발견되지 않았다(p = 0.637). 또한, CIDP 환자와 합쳐진 HV 그룹 사이에 차이가 없었다(p = 0.174).
혈청 sCD14와 ALS 질환 부담의 상관 관계
혈청 sCD14 수준은 AALS 점수 시스템에 기초하여 ALS 환자(n = 28)의 증가하는 질환 부담과 상관 관계가 있었다. 혈청 sCD14 수준은 채혈 당시 환자의 AALS 점수와 양의 상관 관계가 있었다(p <0.0001, R = 0.684)(도 7a). 또한, ALS Tregs가 최근에 기능 장애가 있는 것으로 나타났기 때문에(Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79; Beers et al., JCI Insight. 2017;2(5):e89530), 혈청 sCD14 수준과 ALS Tregs의 기능 장애 억제 능력의 상관 관계를 분석하였고 환자의 손상된 Tregs 억제 기능과 양의 상관 관계가 있는 것으로 밝혀졌다(p = 0.009, R = 0.613)(도 7b).
sCD14는 현재 진행 속도를 예측한다
sCD14와 질환 진행 속도 사이의 상관 관계는 환자의 현재 임상적으로 평가된 질환 진행 속도의 잠재적 지표로서 sCD14 혈청 수준의 평가를 촉발시켰다. 수신자 조작 특성(ROC) 분석(도 7c)을 사용하여 이러한 환자의 혈청 수준의 정확도를 평가하여 혈청 수집시 질환 진행 속도가 빠른 속도와 느린 속도를 반영한다(이전에 설명한 진행을 모두 사용, Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79). 혈청 sCD14 수준은 질환 진행 속도의 정확한 지표이었다. 2.73μg/ml의 대조군에 대해 양으로ROC 컷오프를 사용하면, 혈청 sCD14 수준은 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자를 구별하기 위한 90.9%의 정확성, 88%의 민감성 및 90%의 특이성을 가졌다.
이전 연구는 낮은 FOXP3 mRNA 수준에 대한 0.66배 컷오프의 ROC 점수가 더 나쁜 임상 결과를 예측하는지 여부를 평가했으며 이 컷오프 미만의 FOXP3 수준을 가진 환자의 35%가 인공 호흡기를 사용하였거나 사망한 반면, 컷오프 초과의 FOXP3 수준을 가진 환자의 13%만이 인공 호흡기를 사용하였거나 사망하였다고 보고하였다. 2.73μg/ml의 혈청 sCD14의 ROC 점수 컷오프를 사용하여, 컷오프 초과의 sCD14 값을 가진 ALS 환자의 72%(21/29)가 사망한 반면 컷오프 초과의 sCD14 값을 가진 환자의 28%(8/29)만이 살아 남았다(도 8a). ALS 질환 부담에 대한 임상 점수 시스템은 역치 초과의 ROC 점수를 가진 환자가 역치 미만의 점수를 가진 환자보다 더 빨리 100점의 AALS 점수에 도달한 것으로 나타났다(도 8c). 질환 진행의 척도로서, 컷오프 초과의 ROC 점수를 가진 환자는 컷오프 미만의 점수를 가진 환자보다 진단에서 사망까지의 기간이 더 짧았다. 스피어만 상관 계수 분석은 질환 부담과 질환 진행을 환자의 혈청 sCD14 수준과 연관시키는 데 사용되었다(도 8b 및 8c). 분석은 혈청 sCD14의 수준이 높을수록, 환자가 100 AALS 포인트에 더 빨리 도달하고(도 8d) 진단 후 환자의 생존 시간이 더 짧다는 것을 보여주었다(도 8e).
혈청 용해성 LBP 농도
환자의 혈청과 HV에서 가용성 지질 다당류 결합 단백질(LBP, sLBP라고도 함)의 수준을 검출하기 위해 분석을 수행하였다. LBP는 HV와 비교하여 모든 환자의 혈청에서 증가하였다(p<0.0001)(도 9a). 혈청 샘플을 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, LBP는 느리게 진행하는 환자(p<0.0001) 또는 HV(p<0.0001)와 비교하여 빠르게 진행되는 환자에서만 상승하였다(도 9b). 느리게 진행하는 ALS 환자와 HV 사이의 혈청 LBP에 차이가 없었다(p = 0.208). 흥미롭게도, ALS 환자에서 혈청 LPS/내독소가 증가하는 경향이 있었지만, HV의 혈청 수준과 비교할 때 수준이 중요하지 않았다(데이터는 표시되지 않음).
이들 환자(n = 28)의 서브세트에서 혈청 LBP는 환자의 질환 부담과 양의 상관 관계가 있었다(p = 0.001, R = 0.587)(도 9c); LBP가 증가함에 따라 증가된 AALS 점수에 의해 결정된 바와 같이 환자의 건강 상태가 악화되었다. 혈청 sCD14는 질환 부담과 양의 상관 관계가 있었기 때문에, 이들 환자에서 LBP와 sCD14 사이에 양의 상관 관계가 있었다(p = 0.001, R = 0.584)(도 9d); 따라서 LBP가 증가함에 따라 sCD14도 증가하였다.
C 반응성 단백질
CRP는 환자의 혈청과 HV에서 측정하였다. CRP는 HV와 비교하여 모든 환자의 혈청에서 상승했지만(p = 0.003)(도 10a), 느리게 진행하는 환자(p <0.048) 또는 HV(p = 0.0008)와 비교하여 빠르게 진행하는 환자에서만 상승하였다(도 10b). 느리게 진행하는 ALS 환자와 HV 사이의 혈청 CRP에 차이가 없었다(p = 0.072).
혈청 MIF
대식세포 이동 억제 인자(MIF)를 환자의 혈청에서 측정하였다. MIF는 HV와 비교하여 모든 환자의 혈청에서 상승하였다(p<0.0001)(도 11a). 혈청 샘플을 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, MIF는 HV와 비교하여 빠르게 진행하는 환자(p<0.0001)와 느리게 진행하는 환자(p<0.0001) 모두에서 상승하였다(도 11b). 빠르게 진행하는 ALS 환자와 느리게 진행하는 ALS 환자 사이에 차이가 없었다(p < 0.102).
혈청 가용성 TNFR1 및 TNFR2
종양 괴사 인자(TNF)는 다른 세포와 마찬가지로 단핵구/대식세포에 의해 생성되며, 일반적으로 세포 표면에 결합되는 두 개의 세포 표면 수용체인 TNFRI 및 TNFRII를 통해 다발성 활성을 매개하는 전 염증성 사이토카인이다. 가용성 TNFRII 및 TNFRII는 환자의 혈청에서 측정하였다. 이 수용체의 혈청 수준은 HV와 비교하여 환자에서 증가하였다(TNFRI, p = 0.008; TNFRII, p = 0.003)(도 12a 및 b). 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리할 때, 가용성 TNFRI 및 TNFRII 수준은 느리게 진행하는 환자(TNFRI, p<0.0001; TNFRII, p<0.0001) 또는 HV(TNFRI, p<0.0001; TNFRII, p<0.0001)와 비교하여 빠르게 진행하는 환자에서만 증가하였다(도 12c 및 d). 느리게 진행하는 환자와 HV 사이에 혈청 용해성 TNFRI 및 TNFRII 수준에 차이가 없었다(TNFRI, p = 0.373; TNFRII, p = 0.668).
가용성 TNFRI와 TNFRII 수준 모두가 환자의 혈청에서 상승하였고, 가용성 TNFRI와 TNFRII 수준이 빠르게 진행하는 ALS 환자에서만 상승하였기 때문에, 스피어만 상관 계수 분석을 사용하여 이 두 수용체의 혈청 수준 사이에 연관성이 있는지 확인하였다. 이 분석은 이들 환자에서 혈청 가용성 TNFRI와 TNFRII 사이에 양의 상관 관계가 있음을 입증하였다(p <0.0001, R = 0.851). 따라서, 가용성 TNFRI 수준이 증가함에 따라, 가용성 TNFRII 수준도 증가하였다. 그러나, HV 혈청에서 TNFRI와 TNFRII 수준 사이에 연관성이 없었다(p = 0.98, R = 0.01).
토론
염증은 이제 ALS의 병리 생물학에서 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다(Appel et al., Trends Immunol. 2010;31(1):7-17; Appel et al., Acta Myol. 2011;30(1):4-8). 적응성 및 선천성 면역 시스템의 반응은 질환 진행 및 생존 속도를 조절하는 중추적이고 상호 의존적인 역할을 한다. 헨켈 등(EMBO Mol Med 2013; 5: 64-79)은 Tregs는 적응성 면역 반응인 ALS 환자에게 보호 역할을 한다고 보고하였다. 감소된 Treg 수 및 FOXP3 발현은 보다 빠른 질환 진행과 관련이 있었다. 낮은 순환 수준의 Tregs 및 FOXP3 발현은 3.5년 후 증가된 사망률 증가와 관련이 있는 반면, 높은 수준의 Tregs 및 FOXP3 발현은 같은 기간 동안 낮은 사망률과 관련이 있었다. 깊은 RNA-서열화 및 qRT-PCR 기술을 사용하는 다른 연구는 ALS 환자로부터 분리된 단핵구가 선천성 면역 반응인 전 염증성 면역 반응과 관련된 고유한 유전자 프로필을 발현한다는 것을 보여주었다(Zhao et al., Neurol. 2017;74(6):677-685). 10개의 상위 상향 조절된 차별적으로 발현된 유전자 중 9개가 염증에 관여하였다. 이 연구는 CD14-/low/CD16+ 단핵구가 ALS 환자에서 감소하고 단핵구에서 CD14의 세포 표면 발현이 감소함을 보여준다. 이러한 관찰에 따라, 혈청 sCD14 수준은 빠르게 진행하는 환자에서 증가하는 것으로 나타났으며, 이 환자 그룹에서 감소된 생존 시간을 정확하게 예측하였다. 이것은 혈청 sCD14 수준이 질환 진행을 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여주는 첫 번째 보고서이다. 가용성 LBP, MIF, CRP, TNFRI 및 TNFRII도 환자의 혈청에서 상승하였다. 이러한 요인의 집합적 프로파일은 ALS에 대해 구별되며 질환 진행 속도를 더욱 구별한다. 또한, 집합적 프로파일은 ALS에 대한 특이성과 민감성을 증가시킬 가능성이 더 높다. 따라서, 본 연구는 ALS 환자에서 전 염증성 선천성 면역 반응에 대한 확증적 증거와 추가 증거를 제공한다; 이 반응은 증가된 질환 부담 및 빠른 질환 진행과 관련이 있다. 이러한 전 염증 환경은 환자의 임상 상태를 악화시키는 원인이 된다.
글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 막 당 단백질인 CD14는 주로 단핵구/대식세포에 의해 발현되는 골수 분화 표지자이지만, 호중구에서 낮은 수준이 발견되고 톨-유사 수용체 4 및 MD-2와 함께 LPS의 공동 수용체로서 작용한다. CD16은 또한 단핵구/대식세포에 의해 발현되며 Fc 수용체로 확인되었다. CD14 및 CD16 세포 표면 발현을 기반으로, 인간 단핵구는 고전적인 CD14+/CD16- 단핵구, 중간 CD14+/CD16- 단핵구 및 비고전적인 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 세 가지 별개의 서브세트로 나뉠 수 있다. 세 가지 중 가장 우세한 것은 CD14+/CD16- 단핵구이며 이들은 전체 단핵구 인구의 약 80%를 차지하는 반면 후자의 두 서브세트는 총 단핵구의 나머지 집단을 차지한다. 이 보고서는 비 고전적 단핵구인 CD14-/low/CD16+ 단핵구가 ALS 환자의 총 PBMC에서 감소했음을 입증하였다; 이 하위 집단은 PBMC와 빠르게 진행하는 환자로부터 분리된 팬 단핵구 모두에서 감소하였다. 또한, MFI에 의해 나타낸 바와 같이, CD14의 세포 표면 발현은 CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 단핵구 하위 집단에서도 감소된다. CD14의 세포 표면 발현 감소는 단핵구 활성화와 관련이 있다; CD14는 단핵구 활성화시 sCD14로 배출된다. 따라서, CD14-/low/CD16+ 단핵구의 감소된 수와 CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 단핵구에서 mCD14의 감소된 세포 표면 발현은 이들 환자에서 전 염증성 선천성 면역 반응에 대한 추가 증거를 제공한다.
면역 반응 동안 TIM-3의 조절은 다양한 적응성 및 선천성 면역 기능을 시사한다(Han et al., Front Immunol 2013; 4:449). 한편, TIM-3은 세포 사멸을 유도함으로써 T 세포 반응의 음성 조절자로 확인되었다; TIM-3은 적응성 면역 반응에서 Th1 면역을 종료한다(Hastings, et al., Eur J Immunol 2009; 39(9):2492-2501). 다른 한편으로, 연구는 동일한 TIM-3 분자가 선천성 면역 세포에서도 발현되고 TLR 신호 전달 경로와 상승적으로 작용하여 염증 반응을 촉진하는 것으로 나타났다; TIM3은 단핵구 및 대식세포에 대한 전 염증 마커로 간주된다(Anderson et al., Science 2007; 318(5853):1141-1143). ALS 환자에서 비고전적인 CD14-/low/CD16+ 단핵구의 수가 감소한 것과는 대조적으로, CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 빈도는 빠르게 진행하는 환자로부터의 PBMC와 분리된 팬 단핵구 모두에서 증가하였다. 이것은 이러한 환자들의 전 염증성 말초 면역 환경의 또 다른 지표이다.
mCD14의 단핵구 활성화 의존적 배출은 sCD14의 대부분을 산출한다. 또한, 증가된 mCD14 발현 또는 GPI 연결을 우회하는 직접 CD14 분비는 sCD14 변이에 기여할 수 있다. LPS는 CD14에 결합하고 sCD14의 세포 방출을 유도하는 강력한 단핵구 활성화제이지만 플라젤린 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 다른 TLR 리간드도 sCD14의 방출을 유도한다(Marcos et al., Respir Res. 2010; 11:32; Shive et al., AIDS. 201;29(10):1263-1265). 최근 몇 년 동안, sCD14에 초점을 맞춘 많은 임상 연구는 패혈증 및 HIV와 같은 감염성 질환에서, sCD14 수치가 상승하고 질환 중증도 또는 더 나쁜 예후와 관련이 있음이 밝혀졌다(Shive et al., AIDS. 201;29(10):1263-1265). 또 다른 연구는 관상 동맥 질환(CAD) 환자의 소변에서 sCD14의 상승을 보고하였으며 이러한 수준은 CAD의 중증도와 상관 관계가 있다(Lee et al., PLoS One. 2015;10(2):e0117169). 현재의 연구는 ALS 환자의 혈청에서 sCD14 수치가 증가했음을 보여주었지만, 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, sCD14 수치는 빠르게 진행하는 환자의 혈청에서만 증가하였다. 또한, sCD14 수준은 환자의 CSF에서도 상승했지만, 다시 상이한 진행 속도를 가진 환자들로 분리할 때, sCD14 수준은 빠르게 진행하는 환자의 CSF에서만 상승하였다. 따라서, CD14-/low/CD16+ 단핵구의 수가 감소하고 CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 단핵구에서 mCD14의 세포 표면 발현이 감소한다는 증거를 고려할 때, 혈청 sCD14의 상승된 수준은 단핵구로부터의 mCD14의 활성화 의존적 절단 및 배출 때문일 가능성이 가장 높다. 실질 미세아교세포도 mCD14를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문에, 증가된 CSF sCD14 수준의 가능한 소스는 이 구획에서 활성화된 단핵구/대식세포로부터의 mCD14를 배출하는 것 외에도 활성화된 미세아교세포로부터의 mCD14를 배출하기 때문일 수 있다. 따라서, 이러한 데이터는 ALS 환자, 특히 빠르게 진행하는 질환 환자에서 전 염증성 단핵구 반응의 개념을 다시 뒷받침한다.
앞서 언급한 바와 같이, 이전 연구는 단핵구가 mCD14의 단백질 분해 절단에 의해 sCD14를 생성한다는 것을 보여주었다. 그러나 인간 단핵구는 프로테아제 독립적 메커니즘에 의해 sCD14를 생성하는 것으로 알려져 있다; sCD14는 CD14의 세포 내 풀에서 방출된다. CD14가 PBMC에서 활발하게 생산되어 CD14의 세포 내 풀과 sCD14로서 이들 세포로부터의 가능한 방출을 증가시키는지 확인하기 위해, PBMC를 CD14 mRNA 수준에 대해 qRT-PCR에 의해 분석하였다. CD14 mRNA는 환자의 PBMC에서 감소하였으나, 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, CD14 mRNA는 빠르게 진행하는 환자에서만 감소하였다. 따라서, sCD14는 빠르게 진행하는 환자의 혈청에서 증가한 반면, 동일한 환자의 PBMC로부터의 CD14 mRNA는 감소하여 sCD14의 증가된 혈청 수준은 단핵구 표면에서의 절단 때문이며 CD14의 세포 내 풀에서 sCD14의 방출 때문이 아님을 시사한다. 이전 증거와 함께 고려할 때, 이러한 데이터는 혈청 sCD14의 상승된 수준이 단핵구의 활성화에 의해 매개됨을 다시 시사한다.
이것은 신경 퇴행성 질환에서 혈청 sCD14의 상승을 보여주는 최초의 보고서이다. 이와 같이, 치매 환자(알츠하이머 병 및 전두엽 치매) 또는 CIDP, 다른 신경 퇴행성 질환 및 자가 면역 신경 질환 환자와 같은 다른 신경 질환에서도 혈청 sCD14 수치를 평가하였다. In은 증가된 염증은 AD 증상의 악화와 관련이 있음이 최근에 입증되었다. 골수성 세포 2(TREM2)에서 발현되는 트리거링 수용체는 미세아교세포, 파골세포 및 대식세포와 같은 단핵 식세포에서 발현되는 V형 면역글로불린(Ig) 도메인 함유 막 횡단 단백질이다(Colonna and Wang, Nat Rev Neurosci. 2016 Apr;17(4):201-7). 여러 최근 연구는 아밀로이드증의 마우스 모델에서 TREM2 의존적 표현형을 설명했는데, 이는 TREM2가 AD 병리학에서 선천성 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 또한, 염증 경로에서 TREM2를 연루시키는 가용성 TREM2 단편의 CSF 수준의 상승은 신경 세포 손상 및 임상 치매의 발병과 일치한다. CIDP는 신경의 수초를 파괴하는 염증에 의해 발생하며 일반적으로 운동 및 감각 신경 기능 장애를 모두 수반한다. CIPD는 때때로 급성 염증성 탈수초성 다발신경병증 길랭 바레 증후군의 만성 형태로 생각된다. 이 말초 신경 염증 반응의 주요 세포 구성요소는 대식세포 매개 미엘린 스트리핑이 있는 후신경 및 내막 T 림프구 및 대식세포이다. 따라서, 이들 신경계 질환은 이들 세포의 활성화시 mCD14의 배출 가능성을 가진 단핵구/대식세포/미교아교세포를 수반한다. 이러한 추가 환자는 ALS를 다른 신경 질환과 구별하기 위해 혈청 sCD14 수준에 대해 평가되었다. 치매 또는 CIPD 환자와 sCD14의 혈청 수준에서 차이가 발견되지 않았다. 또한 치매 환자를 경증 AD, AD, FTD 환자로 분리했을 때, 세 그룹의 환자에서 혈청 sCD14의 차이는 발견되지 않았다. 따라서, 혈청 sCD14의 상승된 수준은 ALS에 대해 두드러지며 ALS를 다른 두 가지 신경 질환과 구별시킨다. 이러한 데이터는 또한 ALS의 선천성 말초 면역 반응이 다른 신경 질환과 비교하여 강화된 단핵구 활성화와 관련이 있으며, 이후 mCD14가 배출된다는 것을 시사한다.
이전 연구는 ALS 환자와 ALS 동물 모델 모두에서 질환이 진행되고 질환 부담이 증가함에 따라 선천성 면역 염증 반응의 부수적 증가가 있음을 입증하였다(Beers et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(40):15558-63, Beers et al. Brain 2011; 134: 1293-1314, Beers et al. Brain Behav Immun. 2011;25(5):1025-35; Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79; Beers et al., JCI Insight. 2017;2(5):e89530). ALS를 가진 환자와 동물 모두에서 중추 신경계에서 전 염증성 선천성 소교 세포 반응이 있다는 것은 수십 년 동안 잘 알려져 있다. 그러나, 말초 신경계(PNS)에서 선천성 면역의 역할은 잘 정의되어 있지 않다. 이전 연구는 돌연변이 형질전환 ALS 마우스에서 PNS 전체에 걸쳐 CD169/CD68/Iba1+ 대식세포의 활성화를 특징으로 하였다(Chiu et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(49):20960-5). 대식세포 활성화가 사전 증상으로 발생되었고 증상 개시 이후 신경 다발 내의 초점 배열에서 조직 전체 분포로 확장되었다. 이 연구는 이 마우스에서 척수 면역 활성화와 분리되고 구별되는 말초 신경의 점진적인 선천성 면역 반응을 밝혀내었다. 보다 최근의 연구는 ALS 형질전환 마우스에서 운동 약화의 임상 징후가 시작되는 초기 사건인 퇴행성 말초 신경 섬유를 둘러싸는 단핵구/대식세포의 존재를 입증하였다(Lincecum et al., Nat Genet. 2010;42(5):392-9, Kano et al., Neurology. 2012;78(11):833-5). 더욱이, CD68+ 대식세포는 전 증상이 없는 ALS 마우스의 말초 신경 내에서 관찰되었으며 이러한 염증 세포는 입증 가능한 탈신 경화 후에만 침윤되었다. 이 후기 연구는 또한 CD68+ 대식세포의 출현과 수반되는 CCL2의 증가된 발현을 보여주었는데, 이는 아마도 슈반 세포에 의해 분비 될 가능성이 있는 CCL2가 이러한 말초 신경에서 이러한 세포의 침윤을 조절할 수 있음을 시사한다. 현재 연구에 더 필수적으로, 머독 등(JAMA Neurol. 2017;74(12):1446-1454)은 최근 급속히 진행되는 ALS 환자의 말초 염증 반응을 평가하고 총 백혈구, 호중구, CD16+ 및 CD16- 단핵구 및 자연 살해 세포의 수가 증가했다고 보고하였다. CD11b+ 골수 세포의 급격하고, 일시적인 증가도 관찰되었으며, 면역 세포 수의 이러한 초기 변화는 질환 진행 속도와 양의 상관 관계가 있었다. 현재 연구는 단핵구의 절대 수를 계산하지 않았지만, CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구가 빠르게 진행하는 환자의 PBMC 및 분리된 팬 단핵구 모두에서 증가했으며, 이 증가된 비율의 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구는 질환 진행 속도와 양의 상관 관계가 있었다; CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 비율이 높을수록, 질환 진행이 더 빨라진다. 또한, 현재 연구는 또한 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 백분율과 AALS 점수 사이에 양의 상관 관계를 보여준다; CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 비율이 클수록, 질환 부담이 더 커진다. 따라서, 이 구획에서 CNS와 면역계 사이의 누화(cros-talk) 외에도, ALS 질환이 진행되는 동안 PNS 전체에 걸쳐 PNS와 선천적 면역계 사이에 누화가 발생한다(Henkel et al., J Neuroimmune Pharmacol. 2009;4(4):389-98; Appel et al., Acta Myol. 2011;30(1):4-8; Zhao et al., Neurol. 2017;74(6):677-685; Hooten et al., Neurotherapeutics. 2015;12(2):364-75).
ALS 형질전환 마우스 모델에서, Tregs의 부족은 염증 과정을 악화시켜 운동 신경 세포의 죽음을 가속화하고 질환의 진행을 더욱 빠르게 하며 생존을 단축시켰다(Beers et al., Brain 2011; 134: 1293-1314). ALS 환자에서 Treg 수와 FOXP3 mRNA 발현은 빠르게 진행하는 환자에서 감소했으며 ALS Tregs는 Tresp 증식을 억제하는 데 덜 효과적이었다; 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자 모두 Treg 기능 장애가 있었지만, 임상적으로 평가된 질환 부담이 더 크거나 환자가 더 빠르게 진행될수록, Tregs 기능 장애가 더 커진다(Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79; Beers et al., JCI Insight. 2017;2(5):e89530). 또한 이미 언급했듯이, 이전 연구는 0.66배 컷오프의 ROC 점수 컷오프가 낮은 FOXP3 mRNA 수준이 나쁜 임상 결과와 연관이 있고 이 컷오프 미만의 FOXP3 수준을 가진 환자의 35%가 인공 호흡기를 사용하거나 사망한 반면, 이 컷오프 초과의 FOXP3 수준을 가진 환자의 13%만이 인공 호흡기를 사용하거나 사망하였다는 것을 보고하였다. 혈청 수집시 질환 진행 속도가 빠르거나 느린 환자를 구별하기 위해 동일한 ROC 분석을 사용하여, 혈청 sCD14 수준은 질환 진행 속도의 정확한 지표이었다; 2.73μg/ml의 대조군에 대해 양으로 ROC 컷오프를 사용하면, 혈청 sCD14 수준은 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자를 90.9%의 정확성, 88%의 민감성 및 90%의 특이성으로 정확하게 구별하였다. 또한 이전 보고서(Henkel et al., EMBO Mol Med 2013; 5:64-79)와 대조적으로, 이러한 ROC 분석은 컷오프 초과의 sCD14 값을 가진 환자의 72%가 사망한 반면, 컷오프 초과의 sCD14 값을 가진 환자의 28%만이 4년 연구가 끝날 때까지 살아 남았다는 것을 입증하였다. 또한 컷오프 초과의 혈청 sCD14 값을 가진 환자의 70%가 사망한 반면, 컷오프 미만의 sCD14 값을 가진 환자의 30%만이 사망하였다. 이 데이터는 혈청 내 sCD14의 양이 많을수록, 환자가 AALS 점수 100점에 더 빨리 도달하고 진단에서 사망으로의 진행이 더 빠르다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 데이터는 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 증가된 백분율이 증가된 질환 진행 속도 및 증가된 질환 부담과 관련이 있을뿐만 아니라 증가된 혈청 sCD14 수준이 증가된 질환 진행 속도 및 증가된 질환 부담의 직접적 바이오마커인 것을 시사한다. 다시, 이것은 증가된 혈청 sCD14 수준이 향상된 선천성 면역 반응의 직접적인 척도인 단핵구 활성화 mCD14 배출을 나타낸다는 것을 시사한다.
생리적 및 병리적 상황에서 CD14의 정확한 역할은 잘 정의되어 있지 않다(Bas et al., J Immunol. 2004;172(7):4470-9). 혈청 sCD14는 단핵구에서 mCD14의 절단 및 배출 때문이다. 단핵구 표면에서 급성기 단백질(APP)인 mCD14와 LBP는 LPS와 단계적으로 상호작용하여 단핵구가 LPS의 존재를 감지할 수 있게 하는 고친 화성 삼분자 복합체를 형성한다. 이 복합체는 하류 신호 전달을 위해 톨-유사 수용체 4(TLR4) 및 MD-2와 상호작용한다(Zhou et al., 2016). 대조적으로, sCD14에 대해 두 가지 반대 기능이 기술되었다. 이것은 LPS 결합을 위해 mCD14와 경쟁함으로써 내독소 유도 활성을 감소시킬 수 있거나 비-CD14-발현 내피, 상피 및 평활근 세포의 LPS 유도 활성화를 매개할 수 있다. sCD14는 단핵구로부터의 프로테아제 매개 배출과는 별도로 APP의 주요 공급원을 나타내는 간세포에 의해 생성되기 때문에 APP가 될 수 있다(Pan et al., J Biol Chem. 2000;275(46):36430-5; Bas et al., J Immunol. 2004;172(7):4470-9). 흥미롭게도, 간세포는 LBP의 주요 원인이다. 따라서, ALS 환자의 혈청에서도 LBP 수준을 평가하였다. LBP는 모든 환자의 혈청에서 증가했지만, 샘플을 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, LBP는, sCD14에서 나타난 바와 같이, 빠르게 진행하는 환자의 혈청에서만 증가하였다. 또한, sCD14에 대해 다시 나타난 바와 같이, 혈청 LBP는 환자의 질환 부담과 양의 상관 관계가 있다. 더 흥미로운 것은, 이 환자들에서 LBP와 sCD14 사이에 양의 상관 관계가 있었다; sCD14가 증가함에 따라, LBP의 부수적 증가가 있었다. ALS 환자의 혈청에서 유리 내독소/LPS가 증가하지 않은 가능한 이유는, 이전 보고서(Zhang et al., 2009)와 대조적으로, LPS가 내피 또는 상피 세포와 같은 mCD14를 발현하지 않는 세포의 표면에서 TLR4와 상호 작용하여 염증 반응을 악화시킬 수 있는 sCD14/LBP 복합체에 결합되어 있기 때문이다.
CRP는 전 염증성 사이토카인에 의해 조절되고 간세포에 의해 분비되는 고전적인 APP이다. CRP는 여러 유형의 종양, 심혈관 질환 및 류마티스 질환에 대한 예후적 가치가 있다. 이전 보고서는 ALS 환자에서 광범위한 CRP 수준과 임상적으로 평가된 장애 사이에 양의 상관 관계가 있다고 결정하였다(Keizman et al., Acta Neurol Scand. 2009;119(6):383-9). ALS 환자의 대형 코호트에 의한 최근 연구는 혈청 CRP는 이런 환자에서 증가하였고 CRP 수준이 높은 환자는 CRP 수준이 낮은 환자보다 더 빠르게 진행한다는 것을 발견하였다(Lunetta et al., JAMA Neurol. 2017;74(6):660-667). sCD14와 LBP, 두 APP 모두 상승했고 CRP가 이전 연구에서 상승했기 때문에, CRP를 이 연구에서 평가하였다. CRP는 모든 환자의 혈청에서 상승하였으나 환자를 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리했을 때, CRP는 빠르게 진행하는 환자에서만 상승하였다. 따라서, 이러한 데이터는 두 가지 이전 보고서를 확인하고 간이 이 질환에서 전 염증 반응의 잘 알려진 참여자 및 조절자가 아니라는 것을 시사한다.
전 염증성 사이토카인 MIF는 선천성 및 적응성 면역 반응의 기본이다; MIF는 전신 염증 반응의 핵심 매개체이다. MIF는 글루코코르티코이드의 항 염증 활성에 대한 생리적 반대 조절제로 특징화되었다. 다양한 자극에 반응하여, MIF는 미리 형성된 세포 내 풀에서 방출된다. MIF는 다수의 전 염증성 모이어티의 생성을 촉진하며 염증이 있는 조직으로의 정상적인 백혈구 유입에 필요하다. MIF의 상승된 혈청 수준은 많은 감염성 및 염증성 질환에서 발견되며 sCD14에 대해 나타난 바와 같이, MIF 수준은 패혈증에서 상승된다. MIF는 모든 ALS 환자의 혈청에서 상승하는 것으로 밝혀졌지만 sCD14, LBP 및 CRP와 달리, MIF는 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자 모두에서 상승하였다. 따라서 이러한 데이터는 MIF가 ALS에서 발생하는 전 염증 반응의 초기 지표가 될 수 있으며 진행 속도가 증가함에 따라 MIF 수준이 증가함을 시사한다.
종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 다른 세포와 마찬가지로 단핵구/대식세포에 의해 생성되며, 2개의 세포 표면 수용체인 TNFRI와 TNFRII를 통해 다발성 활성을 매개하는 전 염증성 사이토카인이다. 두 수용체 모두 편재적으로 발현되고 구조적으로 유사한 세포 외 도메인을 표시하지만 별개의 세포 내 영역을 통해 신호를 보내며, TNFRI는 TNFRII에 존재하지 않는 사멸 도메인을 포함한다. 2개의 TNFR은 엑소좀에서 세포 외 도메인의 단백질 분해 절단, 또는 막 횡단 및 세포질 도메인의 손실로 이어지는 mRNA 전사체의 선택적 스플라이싱을 통해 가용성 단백질로 방출된다. 가용성 TNFR은 TNF 길항제 역할을 할 수 있으며 TNF 매개 전 염증 효과를 억제 할 수 있다. 그러나, 가용성 수용체는 순환하는 가용성 TNF를 안정화하고 보존할 수 있으므로 TNF 효현제로 기능한다. 따라서, 가용성 TNFR은 TNF-α의 생물학적 활성을 조절하는 역할을 할 수 있다. TNFRI는 주로 염증성 신호 전달 경로를 촉진하는 반면, TNFRII는 면역 조절 기능을 매개하고 조직 항상성 및 재생을 촉진한다. 다발성 경화증(MS)에는, 감수성과 관련된 TNFRI 다형성이 있다(Gregory et al., Nature 2012, 488, 508-511). 이 다형성의 기능은 TNF-α를 분비하고 결합하는 새로운 TNFRI 변이체를 생성하는 것이다. MS 환자의 경우, 질환 초기에 혈액에서 과도한 TNF 수용체 배출이 발견되어 TNF의 생체 이용률이 낮음을 시사한다. 여러 연구는 TNFRII가 인간 및 마우스 Tregs의 최대 억제 하위 집합에서 우선적으로 발현되고 TNFRII의 활성화가 Tregs의 증식 및 기능에 중요하다고 보고하였다(Chen et al., J. Immunol. 2007, 179, 154-161; Chen et al. J. Immunol. 2008, 180,6467-6471, Chen et al., Curr. Dir. Autoimmun. 2010, 11, 119-134, Chen et al. J. Immunol. 2013, 190, 1076-1084; Heinrich et al., Antibodies 2015;4:34-47). 현재 연구에서, 두 TNFR은 모든 ALS 환자의 혈청에서 상승했지만, 이 연구를 통해 밝혀진 바와 같이 환자가 빠르게 진행하는 환자와 느리게 진행하는 환자로 분리되었을 때, 수용체는 빠르게 진행되는 환자에서만 상승하였다. 폴로니 등(Neurosci Lett. 2000; 287(3): 211-4)은 TNF-α 및 가용성 수용체 수준이 ALS 환자의 혈청에서 상승했다고 보고하였다. 흥미롭게도, 결합되지 않은 삼량체 분자에 해당하는 TNF-α의 생물학적 활성 형태는 환자와 HV간에 유사하였다. 이후 연구는 또한 ALS 환자의 소규모 코호트 혈청에서 TNF-α 수준이 상승한 것을 발견하였다(Babu et al., Neurochem Res 2008; 33: 1145-1149). 이 두 가지 초기 연구와 현재 연구와 관련하여, 이러한 데이터는 환자의 이중 면역 반응을 시사한다. 첫째, ALS의 병리 생물학과 관련된 알려진 염증 반응 때문에, 두 수용체가 TNF 길항제 역할을 하고 염증 유발 효과 TNF-α를 억제하도록 배출된다. 이러한 데이터와 빠르게 진행하는 환자로부터 분리된 Tregs는 매우 기능 장애가 있고, 진행이 느린 환자의 Tregs는 덜 기능한다는 최근 보고서를 고려하여, Tregs 표면으로부터 TNFRII의 배출, 따라서, TNFRII를 통한 TNF-α 신호 전달을 차단하는 것은 이러한 세포의 억제 기능을 억제한다(Beers et al., JCI Insight. 2017;2(5):e89530). 둘째, 혈청 TNFR의 상승은 TNF-α에 결합할 수 있으며, 향후 TNF-α 방출 및 후속 염증 반응을 위한 저장소 역할을 할 수 있다.
ALS 환자의 중추 신경계 조직에서 미세아교세포 유도 전 염증 반응이 있다는 것은 잘 입증되어 있다(Turner et al., Neurobiol Dis 2004; 5: 601-609; Appel et al., Acta Myol. 2011;30(1):4-8; Corcia et al., PLoS One 2012; 7:e52941; Brites and Vaz, Front Cell Neurosci. 2014; 8: 117). 따라서, 이 보고서에 제시된 데이터는 이러한 환자, 특히 빠르게 진행하는 질환이 있는 환자의 말초 순환에 존재하는 진행 중인 단핵구 유도 전 염증 환경의 개념을 뒷받침한다(Zhao et al., Neurol. 2017;74(6):677-685). CD14-/low/CD16+ 단핵구의 감소된 수, CD14+/CD16- 및 CD14+/CD16+ 단핵구에서 mCD14의 세포 표면 발현 감소, 이러한 환자에서 CD14-/low/CD16+/TIM-3+ 단핵구의 증가된 비율이 개념과 일치한다. 더 중요한 것은, 혈청 sCD14 수치가 빠르게 진행하는 환자에서 증가하는 것으로 밝혀졌으며, 감소된 생존 시간을 정확하게 예측하였다. 가용성 LBP, MIF, CRP, TNFRI 및 TNFRII가 환자의 혈청에서도 상승했다는 추가 증거를 포함하여, 이러한 인자와 sCD14는 ALS에 대해 두드러지며, 이 질환에 대한 바이오마커 특이성과 민감성을 증가시킬 가능성 있는 집단 면역 바이오마커 프로파일을 구성한다.
실시예 2
sCD14 및 LBP가 ALS 진행 속도에 대한 바이오마커 역할을 하는 능력과 관련하여 위의 결과를 확인하기 위해 더 많은 환자 코호트를 사용한 두 번째 연구를 수행하였다. 이 연구에서, 100명의 ALS 환자와 60명의 건강한 지원자(HV)를 위에서 기술한 바와 같이 본질적으로 평가하여 혈청 내 sCD14 및 LBP의 수준을 결정하였다.
ALS 환자의 진행 속도는 Appel ALS(AALS) 점수 시스템에서 계산하였다(Haverkamp et al., 1995 Brain 118:707-719; Voustianiouk et al., 2008 Muscle Nerve. 37(5):668-72). AALS 점수는 30점(HV) 내지 164점(심각한 ALS)의 범위이었다. 진행 속도를 결정하기 위해, 환자가 병원을 마지막으로 방문했을 때의 AALS 점수를 병원에 처음 방문했을 때의 점수에서 빼고 그 숫자를 두 방문 사이의 개월 수로 나눴다. 1.5AALS pts/월 이상의 점수는 급속하게(또는 빠르게) 진행하는 환자를 나타내며, 1.5AALS pts/월 미만의 점수는 느리게 진행하는 환자를 나타내었다.
혈청 sCD14
이 코호트에서 ALS 환자의 혈청에서 sCD14 수준의 분석은 첫 번째 연구(실시예 1)에서 ALS 환자의 sCD14 수준이 HV에 비해 유의하게 증가했다는 사실이 본질적으로 확인되었다(도 13a). 흥미롭게도, 이 두 번째 연구는 첫 번째 연구에서 보여준 바와 같이, 빠르게 진행하는 환자 대 느리게 진행하는 환자에서 sCD14 수준 간의 명확한 차이를 확인했지만 HV와 비교하여 느리게 진행하는 환자에서 sCD14 수준이 통계적으로 유의하게 증가했음을 보여주었다(도 13b). 전반적으로, 혈청 내 sCD14 수준과 ALS 환자의 질환 진행 속도 사이에 명확한 상관 관계가 있었다(도 13c).
수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석을 사용하여 혈청 수집시 빠른 대 느린 질환 진행 속도를 반영하기 위해 이 환자 코호트에서 sCD14 혈청 수준의 정확도를 평가하였다(더 13d-g). 도 13e에 나타난 바와 같이, 혈청 sCD14 수준은 질환 진행 속도의 명확한 지표였으며, 빠른 진행과 느린 진행 환자를 매우 정확하게 구별할 수있었다(3.16μg/ml의 ROC 컷오프; AUC = 0.982; 민감성: 0.942; 특이성: 0.958). 더 적은 정도로, 혈청 sCD14 수준은 느리게 진행하는 환자를 HV와 구별할 수 있었다(도 13g)(2.74μg/ml의 ROC 컷오프; AUC = 0.686; 민감성: 0.633; 특이성: 0.654).
혈청 LBP
이 코호트에서 ALS 환자의 혈청에서 LBP 수준의 분석은 또한 이전 연구에서 ALS 환자의 LBP 수준이 HV에 비해 유의하게 증가했다는 사실을 본질적으로 확인하였다(도 14a). sCD14와 마찬가지로, 이 두 번째 연구는 느리게 진행하는 환자와 비교하여 빠르게 진행하는 환자의 LBP 수준 사이의 차이를 확인했지만(첫 번째 연구에서 나타낸 바와 같이), HV에 비해 느리게 진행하는 환자의 LBP 수준이 통계적으로 유의미하게 증가하는 것으로 또한 입증되었다(도 14b). 전반적으로, 첫 번째 연구에서 관찰된 혈청 내 LBP 수준과 ALS 환자의 질환 진행 속도 사이의 명확한 상관 관계가 이 두 번째 연구에서도 관찰되었다(도 14c).
빠른 질환 진행 속도 대 느린 질환 진행 속도를 반영하기 위해 이 환자 코호트에서 혈청 LBP 수준의 정확성을 평가하는 ROC 분석을 사용하면, sCD14와 마찬가지로, LBP도 다양한 진행 속도를 정확하게 구별하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음이 분명하였다(도 14d-g). 도 14e에 나타낸 바와 같이, 혈청 LBP 수준은 질환 진행 속도를 나타내는 좋은 지표였으며 느리게 진행하는 환자와 비교하여 빠르게 진행하는 환자를 매우 정확하게 구별할 수 있었다(40.8μg/ml의 ROC 컷오프; AUC = 0.966; 민감성: 0.923; 특이성: 0.938). 이 연구에서, 혈청 LBP 수준은 느리게 진행하는 환자를 HV와 구별할 수도 있다(도 13g)(26.1μg/ml의 ROC 컷오프; AUC = 0.880; 민감성: 0.783; 특이성: 0.865).
혈청 sCD14 및 LBP
첫 번째 연구에서 관찰된 바와 같이, 빠르게 진행하는 ALS를 가진 환자에서 sCD14와 LBP의 수준 사이에 명확한 상관 관계가 있었는데, 이는 느리게 진행하는 ALS를 가진 환자에서는 볼 수 없었던 상관 관계이다(도 15a).
혈청 sCD14와 혈청 LBP 수준의 조합이 바이오마커 단독과 비교하여 느리게 진행하는 ALS와 빠르게 진행하는 ALS를 더 효과적으로 구별하는 데 사용할 수 있는지 확인하기 위해, ROC 분석을 수행하였다(도 16). 혈청 sCD14와 혈청 LBP 수준의 조합은 ALS 환자가 느리게 또는 빠르게 진행하는 질환을 갖는지를 예측하는 데 특히 효과적이라는 것이 입증되었다. 이것은 분석에서 sCD14 및 LBP의 실제 혈청 수준을 사용하고(도 16b; AUC = 0.9944), 혈청 sCD14 + LBP의 스케일된 수준을 사용하여(도 16f; AUC = 0.994) 입증되었다. 후자의 분석에서, sCD14와 LBP의 수준이 어느 정도 차이가 나기 때문에, 각 단백질의 수준을 먼저 표준화한 다음 새로운 측정 값-스케일된(sCD14) + 스케일된(LBP)을 만들기 위해 추가하였다.
본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개의 개시 내용은 그 전문이 본 발명에 참조로 포함된다.
본 발명에서의 임의의 참고 문헌의 인용은 이러한 참고 문헌이 본 출원에 "선행 기술"로서 이용 가능하다는 인정으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 본 발명의 목적은 본 발명을 임의의 한 실시태양 또는 특정한 특징의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시태양을 설명하는 것이다. 따라서, 당업자는 본 발명에 비추어, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시태양에서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 모든 수정 및 변경은 첨부된 청구 범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
Claims (53)
- 근 위축성 측삭 경화증(ALS)를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행되는 ALS를 가질 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) ALS를 가진 피험자로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 여기서 바이오마커는 가용성 CD14(sCD14) 또는 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다; 및
(b) 적절한 참조 수준에 비해 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
참조 수준은 건강한 피험자 및/또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내며, 참조 수준에 비해 바이오마커 수준의 증가는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
참조 수준은 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내며, 참조 수준에 비해 유사한 수준의 바이오마커는 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
참조 수준은 건강한 피험자 및/또는 느리게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내며, 참조 수준에 비해 유사한 수준의 바이오마커는 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
참조 수준은 빠르게 진행하는 ALS를 갖는 것으로 알려진 피험자를 나타내며, 참조 수준에 비해 바이오마커 수준의 감소는 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있다는 것을 나타내는 것인 방법. - 제 1 항에 있어서,
참조 수준은 임계 수준이고 그 초과에서 피험자는 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있으며, 그 미만에서 피험자는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 것인 방법. - 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) ALS를 갖는 피험자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 여기서 바이오마커는 가용성 CD14(sCD14) 또는 지질다당류 결합 단백질(LBP)이다; 및
(b) 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준에 기초하여 피험자에서 ALS의 진행 속도를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 sCD14 및 LBP의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 뇌척수액(CSF)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 샘플에서 적어도 하나의 다른 바이오마커의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 10 항에 있어서,
적어도 하나의 다른 바이오마커는 LBP, CRP, MIF, sTNFRI 및/또는 sTNFRII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
바이오마커의 수준을 측정하기 전에 생물학적 샘플을 획득하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
ALS를 치료하기 위한 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - ALS를 갖는 피험자에서 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 키트로서, 여기서 키트는 생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 측정할 수 있는 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하며, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP인 키트.
- 제 14 항에 있어서,
생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준을 측정하게 하는 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하는 것인 키트. - 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및 miR-374b-5p 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 추가로 포함하는 것인 키트. - 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하는 고체 지지체로서, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP인 고체 지지체.
- 제 17 항에 있어서,
sCD14에 특이적인 항원 결합 분자 및 LBP에 특이적인 항원 결합 분자를 포함하는 것인 고체 지지체. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p 및/또는 miR-374b-5p 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자를 추가로 포함하는 것인 고체 지지체. - 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
고체 지지체는 멀티웰 플레이트, 슬라이드, 칩 또는 복수의 비드 중에서 선택되는 것인 고체 지지체. - ALS에 대한 치료에 대해 피험자를 계층화하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하거나, 피험자의 ALS의 진행 속도를 평가하는 단계; 및
(b) 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행 ALS를 가질 가능성이 있는지, 또는 피험자에서 ALS의 진행 속도에 기초하여 피험자에 적합한 최적화된 치료 요법을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 21 항에 있어서,
피험자를 최적화된 치료 요법에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 피험자의 생물학적 샘플의 수준을 기초로 하여 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다; 및
(b) 빠르게 진행하는 ALS를 치료하기에 최적화된 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 23 항에 있어서,
(a)는 피험자의 생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준에 기초하여 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
피험자를 선택하기 전에, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 피험자가 빠르게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
치료 요법은 항-신경퇴행성제의 투여를 포함하는 것인 방법. - 제 26 항에 있어서,
항-신경퇴행성제는 릴루졸, 에다라본, CD14 길항제, GM604, 마시티닙, 보체 경로 억제제 및 CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제 중에서 선택되는 것인 방법. - 제 27 항에 있어서,
CD14 길항제는 CD14 길항제 항체인 방법. - 제 28 항에 있어서,
CD14 길항제는 다음으로부터 선택되는 것인 방법:
(1) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ [SEQ ID NO: 1] (3C10 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 2] (3C10 VH);
(2) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 3] (28C5 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID NO: 4] (28C5 VH); 및
(3) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5] (18E12 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 6] (18E12 VH). - 제 27 항에 있어서,
보체 경로 억제제는 C5a 억제제인 방법. - 제 30 항에 있어서,
C5a 억제제는 PMX205 또는 에클리주맙인 방법. - 제 27 항에 있어서,
CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제는 CD40 및/또는 CD40 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인 방법. - 제 32 항에 있어서,
항체는 AT-1502인 방법. - 제 23 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
치료 요법은 피험자를 비 침습성 인공호흡 장치에 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 34 항에 있어서,
비 침습성 인공호흡 장치는 평균 체적 보장 압력 지원장치(AVAPS), 지속 기도 양압기(CPAP) 및/또는 이중 기도 양압기(BiPAP)를 포함하는 것인 방법. - 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 경우 피험자는 보다 더 일찍 비 침습성 인공호흡 장치에 노출되는 것인 방법. - 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 피험자의 생물학적 샘플의 수준을 기초로 하여 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계, 여기서 바이오마커는 sCD14 또는 LBP이다; 및
(b) 느리게 진행하는 ALS를 치료하기에 최적화된 치료 요법에 피험자를 노출시키는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 37 항에 있어서,
(a)는 피험자의 생물학적 샘플에서 sCD14 및 LBP의 수준에 기초하여 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는 피험자를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서,
피험자를 선택하기 전에, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 피험자가 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
치료 요법은 항-신경퇴행성제의 투여를 포함하지 않는 것인 방법. - 제 37 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
치료 요법은 항-신경퇴행성제의 투여를 포함하는 것인 방법. - 제 41 항에 있어서,
항-신경퇴행성제는 릴루졸, 에다라본, CD14 길항제, GM604, 마시티닙, 보체 경로 억제제 및 CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제 중에서 선택되는 것인 방법. - 제 42 항에 있어서,
CD14 길항제는 CD14 길항제 항체인 방법. - 제 43 항에 있어서,
CD14 길항제 항체는 다음으로부터 선택되는 것인 방법:
(1) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSFGNSFMHWYQQKAGQPPKSSIYRAANLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQQSYEDPWTFGGGTKLGNQ [SEQ ID NO: 1] (3C10 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LVKPGGSLKLSCVASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGTTYYPDNVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGYYDYHYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 2] (3C10 VH);
(2) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYVNSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLQSGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYCCQQSNEDPTTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 3] (28C5 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LQQSGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDSAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCVRGLRFAYWGQGTLVTVSA [SEQ ID NO: 4] (28C5 VH); 및
(3) 다음을 포함하는 항체:
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VL 도메인: QTPSSLSASLGDRVTISCRASQDIKNYLNWYQQPGGTVKVLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQRGDTLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO: 5] (18E12 VL); 및
다음 서열을 포함하거나, 이루어지거나 필수적으로 이루어진 VH 도메인: LESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQPPGKGLEWLGVIWTSGGTNYNSAFMSRLSITKDNSESQVFLKMNGLQTDDTGIYYCVRGDGNFYLYNFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO: 6] (18E12 VH). - 제 43 항에 있어서,
보체 경로 억제제는 C5a 억제제인 방법. - 제 45 항에 있어서,
C5a 억제제는 PMX205 또는 에클리주맙인 방법. - 제 42 항에 있어서,
CD40과 CD40 리간드 사이의 상호 작용을 차단하는 치료제는 CD40 및/또는 CD40 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인 방법. - 제 47 항에 있어서,
항체는 AT-1502인 방법. - 제 23 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 및 CSF로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 방법. - ALS를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하거나 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하기 위한 키트의 제조에서 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자의 용도로서, 여기서 바이오 마커는 sCD14 또는 LBP인 용도.
- 제 50 항에 있어서,
용도는 ALS를 가진 피험자가 빠르게 또는 느리게 진행하는 ALS를 가질 가능성이 있는지 여부를 결정하거나 피험자에서 ALS의 진행 속도를 평가하기 위한 키트의 제조에서 sCD14에 특이적인 항원 결합 분자와 LBP에 특이적인 항원 결합 분자의 조합인 용도. - 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,
키트의 제조에서 적어도 하나의 다른 바이오마커에 특이적인 항원 결합 분자의 용도를 추가로 포함하는 것인 용도. - 제 52 항에 있어서,
적어도 하나의 다른 바이오마커는 CRP, MIF, sTNFRI, sTNFRII, NFL, pNfH, p75NTRECD, miR-206, miR-143-3p, 및 miR-374b-5p 중에서 선택되는 것인 용도.
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