CN114854863A - 基于生物标志物构建的模型在预测癌症免疫疗效中的应用 - Google Patents

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杨静悦
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Abstract

本发明公开了一种基于生物标志物构建的模型在预测癌症免疫疗效中的应用，具体涉及基于与胃癌免疫疗效相关的铜死亡特征基因构建的预测模型。通过研究发现该预测模型与肿瘤突变负荷、MSI和PD‑L1表达等免疫疗效相关指标存在显著相关性，同时该预测模型与患者CR/PR、SD/PD也显著相关。与预测模型风险评分高的癌症患者相比，风险评分低的癌症患者的总体生存率得到显著延长，因此该预测模型可用于评估癌症免疫治疗疗效。

Description

基于生物标志物构建的模型在预测癌症免疫疗效中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及基于生物标志物构建的模型在预测癌症免疫疗效中的应用。
背景技术
胃癌是我国高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一，最新数据显示其发病率和死亡率均位居第二位。胃癌早期症状不典型，多数患者就诊时已进入中晚期，治疗效果较差，5年生存率较低。目前，临床上对中晚期胃癌患者仍缺乏有效的治疗手段。近年来，免疫治疗已经成为癌症治疗中最有前景的策略之一，在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等肿瘤中表现出了杰出的效果。免疫治疗能够使胃癌患者获得有效且持久的临床反应，但仍有部分胃癌患者存在免疫治疗不敏感或治疗抵抗现象。因此，寻找可靠地预测免疫疗效的生物标志物，对胃癌的个体化治疗、提高免疫疗效至关重要。美国国家综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)指南对于胃癌的治疗纳入了免疫治疗，目前对于胃癌患者，微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)以及程序性死亡受体配体1(programmed celldeath 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1)的表达能够有效评估免疫治疗的疗效(石学淑,张永杰,祁向争.胃癌免疫治疗相关生物标志物的研究进展[J].癌症进展,2021,19(4):3.)。
尿路上皮癌(UC)是世界第四大最常见的肿瘤，主要包括肾盂尿路上皮癌、输尿管尿路上皮癌和膀胱尿路上皮癌。已经发生转移的患者5年生存率约为5％。对于失去手术治疗机会或已经发生远处转移的尿路上皮癌患者，化疗并联合药物治疗的方案虽然可获得较好的反应率和生存获益，但患者中位总生存期仅为15个月，且几乎所有的患者均会经历疾病进展。二线治疗的患者生存获益非常低(李强,王有贵,丁祥黎,等.PD-1/PD-L1抑制剂在尿路上皮癌免疫治疗中的研究进展[J].临床泌尿外科杂志,2019,34(03):242-245.)。目前免疫检查点抑制剂在内的免疫疗法被认为是治疗尿路上皮癌尤其是晚期或转移性尿路上皮癌的重大突破。
PD-1(程序性死亡受体-1)及其配体PD-L1是一对重要的抑制性免疫检查点，参与介导负性免疫调节作用，一方面限制正常机体的免疫应答强度，可诱导免疫耐受，避免发生自身免疫疾病，另一方面，也削弱了机体对肿瘤细胞本应具有的免疫监视、防御作用，肿瘤细胞经此发生免疫逃避，杀伤肿瘤细胞的免疫效应强度降低。肿瘤细胞的免疫逃避机制主要包括：(1)肿瘤细胞抗原缺失；(2)肿瘤细胞表面MHCI类分子表达低下；(3)肿瘤细胞表面缺乏共刺激信号；(4)肿瘤细抗凋亡作用；(5)肿瘤免疫微环境导致的免疫抑制；(6)肿瘤细胞的漏逸等。研究证实PD-1/PD-L1介导的信号通路在免疫逃逸中发挥重要作用。目前，已有大量研究证实PD-1、PD-L1在晚期黑色素瘤、食管癌等多种肿瘤中异常高表达。研究发现PD-1、PD-L1的异常高表达现象在胃癌中也普遍存在(危慧君.PD-1,PD-L1在胃癌组织中的表达特征及其与预后的关系[D].福建医科大学.)。此外，大量证据表明肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定(MSI)、PD-L1的表达可能决定了个体对癌症免疫疗法的反应。
胃癌和尿路上皮癌的常规治疗(如手术、化疗及靶向治疗)对患者的疗效十分有限。从目前的临床试验结果来看，免疫检查点抑制剂的效果非常明显，但是目前评估免疫治疗的生物标志物比较局限，这些生物标志物除了对肿瘤细胞产生直接的免疫杀伤作用外，还与肿瘤免疫刺激信号及效应细胞的激活有关，其中的机制较为复杂，仍需要通过基础实验和临床试验进一步探索，因此筛选可靠、简便的生物标志物具有重要的研究意义。
发明内容
为弥补现有技术的不足，寻找可靠、简便的预测癌症免疫疗效及其与免疫疗效相关的指标的生物标志物，本发明提供了一种预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的生物标志物，并基于该生物标志物构建风险模型用于预测癌症肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、PD-L1表达及癌症免疫疗效。本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效产品中的应用，所述生物标志物包括AHCYL2、ANKRD6和/或PDGFRB。
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
优选地，所述免疫疗效是PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效。优选地，所述样本包括外周血样本、血清样本、血浆样本、尿样本、唾液样本或组织样本。
本发明第二方面提供了一种预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的产品，所述产品包括检测本发明第一方面所述的生物标志物的蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂。
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
优选地，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
优选地，所述试剂包括与所述生物标志物基因特异性结合的引物或探针；或与所述生物标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。
优选地，所述产品包括检测AHCYL2、ANKRD6和/或PDGFRB的试剂盒及所述试剂盒的说明书。
本发明第三方面提供了一种癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型以本发明第一方面所述的生物标志物作为输入变量。
优选地，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型为Cox回归模型。
优选地，所述Cox回归模型为LASSO Cox回归模型。
优选地，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型的公式为风险评分
Figure BDA0003677804300000031
其中，N为用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的基因数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数。
优选地，所述风险评分CuPS＝-0.205*exp(AHCYL2)+0.231*exp(ANKRD6)+0.237*exp(PDGFRB)。
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
本发明第四方面提供了一种用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的装置，所述装置包括：
获取单元，用于获取待测样本中本发明第一方面所述的生物标志物的数据；
处理单元，用于将本发明第一方面所述的生物标志物的数据输入预测模型中，获得待测样本的预测结果；所述预测结果为肿瘤突变负荷/微卫星不稳定性/PD-L1表达/免疫疗效预测结果。
优选地，所述预测模型为本发明第三方面所述的癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型。
优选地，所述免疫疗效是PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效。
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
本发明第五方面提供了如下任一项的应用，所述应用包括：
(1)本发明第一方面所述的生物标志物在构建癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型中的应用；
(2)本发明第三方面所述的癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型在构建用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的装置中的应用。
优选地，(1)和(2)任一项所述的癌症为胃癌、尿路上皮癌。
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
本发明的优点和有益效果：
本发明选择与癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效相关的铜死亡特征基因作为生物标志物构建预测模型，该预测模型可以有效预测癌症患者的癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效，从而简便、快速地判断患者的临床获益情况。
附图说明
图1是随CuPS增加的胃癌患者生存时间和生存状态分布图；其中，图A是GEO-meta训练集中随CuPS增加的胃癌患者生存时间和生存状态分布图；图B是GEO-meta测试集中随CuPS增加的胃癌患者生存时间和生存状态分布图；图C是GSE84437独立验证集中随CuPS增加的胃癌患者生存时间和生存状态分布图；图D是TCGA-STAD独立验证集中随CuPS增加的胃癌患者生存时间和生存状态分布图；
图2是CuPS高低风险组与胃癌患者肿瘤突变负荷的关系图；
图3是CuPS高低风险两组间的胃癌患者不同MSI状态分布比例关系图；
图4是不同MSI状态间的胃癌患者CuPS评分差异分析条形图；
图5是CuPS高低风险两组的胃癌患者PD-L1表达差异分析条形图；
图6是CuPS高低风险组与转移性尿路上皮癌患者免疫疗效间的关系图；
图7是CuPS评分在转移性尿路上皮癌PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效不同群体间的差异分析条形图；
图8是CuPS高低风险组转移性尿路上皮癌PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效的K-M生存分析图。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，基于铜死亡相关的特征基因，综合分析了1401例胃癌患者生存和基因表达数据，筛选出与胃癌预后相关的生物标志物，并基于筛选的生物标志物构建预测模型CuPS，发现CuPS预测模型与胃癌肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、PD-L1表达显著相关，同时，得出CuPS预测模型可用于评估尿路上皮癌PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效。
在本发明中使用的“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B中的每一种的具体公开，就像每一种在本发明中单独列出一样。
肿瘤突变负荷
如本发明所用的术语“肿瘤突变负荷”(TMB)是指肿瘤基因组中体细胞突变的数目和/或单位面积肿瘤基因组的体细胞突变的数目。确定TMB时，排除种系(遗传)变体，因为免疫系统具有更高的可能性将这些识别为自身。肿瘤突变负荷(TMB)也可以与“肿瘤突变载量”、“肿瘤突变的负荷”或“肿瘤突变的载量”互换使用。肿瘤突变负荷(TMB)可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效。研究表明，当TMB越高，就越容易从免疫抑制剂治疗中获益。
MSI
术语“MSI”、“微卫星不稳定性”定义为由于微卫星区域中一个或多于一个重复单元的缺失或插入而导致的微卫星长度的变化。当与来自同一个体的正常/生殖系细胞中的基因组DNA相比时，这产生了肿瘤细胞基因组DNA总长度改变的新微卫星等位基因。遗传超变异性的这种状况是由DNA错配修复(MMR)受损引起的。MMR是一种纠正DNA复制过程中基因组DNA中发生的自发突变的机制。通常，突变是短核苷酸插入或缺失的单碱基错配。如果后两种情况发生在ORF中，并且如果插入或缺失的核苷酸序列的长度不能被三整除，则可能发生移码突变。微卫星不稳定性是微卫星中重复DNA核苷酸单位数目的克隆改变或体细胞改变。MSI状态可以是三个离散种类之一：MSI-H，也称为MSI-高、MSI阳性或MSI；MSI-L，也称为MSI-低；微卫星稳定(MSS)，也称为缺乏MSI。通常，为了分类为MSI-H，用于分类MSI状态的标记中的至少20％需评分为阳性，而对于MSS分类，不到2.5％评分为阳性。如果中间数目的标记评分为阳性，则将肿瘤分类为MSI-L。应注意，由于这些初始界限衍生自扩展的Bethesda标记系列(其仅由10个标记组成)，由于通常将评估不到100个标记，且阳性标记的数目是整数，该百分比是近似值。MSS和MSI-L之间的差异通常将是1％和9％之间的标记评分为阳性(在评估10个标记时，这意味着1个阳性标记导致MSI-L分类)，而MSI-L和MSI-H之间的差异通常将是15％和25％之间的阳性标记(即，在该阈值之上，肿瘤是MSI-H，在该阈值之下，肿瘤是MSI-L)。备选地，仅评估微卫星不稳定性的存在和缺乏之间的差异而不是在三个种类中进行区分，在这种情况下，该状态为存在MSI或缺乏MSI(＝MSS)。鉴于完整的错配修复(MMR)系统的缺乏和MSI的存在之间的相关性，诊断MSI的存在(或诊断MSI状态)可以解释为诊断MMR效率。但是，应注意，MMR可以有功能或缺乏，不存在中间种类。因此，MSI-L也对应于MMR缺陷—这种情况等同于仅评估MSI的存在或缺乏。微卫星状态不同的实体瘤对免疫检查点抑制剂药物响应率方面有显著差异，提示微卫星状态对肿瘤免疫微环境具有重要影响。MSI-H肿瘤的基因不稳定性导致其表达大量新抗原，这些抗原是良好的免疫靶点，阻断PD-1/PD-L1信号通路可强化对这些新抗原的免疫反应，更易在免疫治疗中获益。
PD-1/PD-L1
术语“PD-1”“程序性死亡1”、“细胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PDCD1”和“hPD-1”可互换使用，且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物、以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。
术语“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种为PD-L2)，它在与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。如本发明中使用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型、和种间同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。PD-1抑制剂pembrolizumab目前已被FDA批准用于PD-L1阳性晚期胃癌的三线治疗。目前，PD-L1在肿瘤组织中的表达情况是预测抗PD-1疗效的主要方式，PD-L1在肿瘤组织中的高表达，PD-L1阳性患者的总体ORR(客观缓解率)明显高于阴性患者。
免疫疗效
如本发明所述，术语“免疫疗效”和“免疫治疗效果”在本发明中可以互换使用。在本发明中“免疫疗效”涉及通过诱导或增强免疫应答，治疗疾病或病症的效果。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(Immune-checkpointinhibitors，ICIs)治疗在癌症治疗方面取得了重大突破。PD-1抑制剂包括，但不限于帕博利珠单抗、纳武利尤单抗、西米普利单抗、特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗。PD-L1抑制剂包括但不限于阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、度伐利尤单抗。本发明中的成果都适用于PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂的免疫疗效预测。在本发明的一些实施方案中，以PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效验证基于生物标志物构建的癌症免疫疗效预测模型评估免疫治疗疗效的准确性。在本发明的具体实施方案中，PD-L1抑制剂为阿替利珠单抗。
生物标志物
术语“生物标志物”是指可在样品(例如单核苷酸多态性(SNP)，或由此衍生的(例如PRS))中检测到的指数，例如预测性、诊断性和/或预测免疫疗效指数。在一些方面，生物标志物是遗传基因座、遗传基因座的集合或基因集合中的突变/变异(例如，体细胞突变)的集合数量。“生物标志物”、“分子标志物”、“标志物基因”、“基因特征”、“特征基因”、“生物标志物基因”在本发明中可以互换使用，生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)、多核苷酸改变(例如，多核苷酸拷贝数改变，例如，DNA拷贝数改变)、多肽、多肽和多核苷酸修饰(例如，翻译后修饰)、碳水化合物和/或基于糖脂的分子标志物。生物标志物可以作为发展给定病理学状态、疾病或病症(例如，自身免疫病症)或发展以某些分子、病理学、组织学和/或临床特征(例如，对包括免疫检查点抑制剂在内的疗法的应答性)为特征的疾病或疾患(例如，癌症)的特定亚型的可能性的指数。
生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。
优选地，生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。
在本发明的具体实施方式中，所述生物标志物包括AHCYL2、ANKRD6和PDGFRB。
在一些实施方式中，基因特征能对个体的免疫疗效进行分类。如本发明所使用的，免疫疗效是指对通过作用于免疫细胞的受体，解放免疫细胞的束缚，让其发挥更强的杀灭肿瘤细胞的作用。免疫疗效可以基于诸如1-3年总体存活率(1-3years Overall survivalrate，OS)、无进展生存期(progression-free survival，PFS)、1-3年无进展生存期(1-5years PFS)、疾病进展时间(time to progress，TTP)、无病生存期(Disease-freesurvival，DFS)、治疗失败时间(time to treatment failure，TTF)、客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)、应答率(response rate，RR)、完全应答率(completeresponse，CR)、部分应答率(partial response，PR)、疾病稳定(stable disease，SD)、疾病进展(progressive disease，PD)的度量，进而用于确定治疗或诊断工作时间表。
在一些实施方式中，如本领域技术人员所理解的，当与免疫疗效预测相关的铜死亡特征基因由上述基因组成时，用于执行分析的方法可包括测量其它基因的表达(例如，用于归一化)，但仅使用基因特征来分类个体。在本发明中所述特征基因的来源可以是人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在本发明的一些实施方案中，优选的基因的来源是人。
AHCYL2基因：adenosylhomocysteinase like 2，以gene ID：23382在NCBI数据库中可以找到典型的智人mRNA和蛋白序列。
ANKRD6基因：ankyrin repeat domain 6，以gene ID：22881在NCBI数据库中可以找到典型的智人mRNA和蛋白序列。
PDGFRB基因：platelet derived growth factor receptor beta，以gene ID：5159在NCBI数据库中可以找到典型的智人mRNA和蛋白序列。
样本
术语“样本”与“样品”在本发明中可以互换使用，用于本发明时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液(follicular fluid)，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液(tissue culture medium)，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物或组织样本(例如肿瘤组织样本)及其组合。作为优选的实施方式，所述样本选自组织。
本发明包含用于检测生物标志物表达的现有技术中任何可用方法。本发明生物标志物的表达可在核酸水平上被检测(如，mRNA转录物)或蛋白质水平。通过“检测蛋白表达量/mRNA表达量”旨在确定mRNA转录物或其生物标志物基因的表达产物的数量或存在。因此，“检测蛋白表达量/mRNA表达量”包含了生物标志物被确定不能被表达、不能被检测表达，表达在低水平、表达在正常水平或过表达的实例。
检测蛋白表达量/mRNA表达量
“检测蛋白表达量”和“蛋白表达水平的测量”在本发明中可以互换，是评价生物样品中从癌症生物标志物基因表达的蛋白的存在和表达水平以预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的过程，其中使用与所述蛋白特异性地结合的抗体、肽、适配体或化合物来测量所述生物标志物基因的蛋白产物的量。用于测量蛋白水平的分析方法包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
“检测mRNA表达量”和“mRNA表达水平的测量”在本发明中可以互换，意指评价生物样品中癌症生物标志物基因的mRNA的存在和表达水平以预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的过程，并且可以通过例如测量mRNA水平来确定。分析方法的具体示例可包括但不限于基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。用于测量mRNA表达水平的试剂可以是引物对、探针或反义寡核苷酸。由于本发明的生物标志物的核酸序列是已知的，因此本领域普通技术人员可基于序列设计特异性结合基因特定区域的引物、探针或反义寡核苷酸。此外，可以间接地测量所述一种或多种生物标志物的水平，例如通过使用测量与期望被测量的生物标志物的水平相关的一种化合物(或多种化合物)的水平的测定。
“蛋白质印迹”是指固定于载体如硝基纤维素或膜上的蛋白质(或多肽)的分析。将蛋白质在丙烯酰胺凝胶上运行以分离蛋白质，随后将蛋白质从凝胶转移到固体支持物，如硝基纤维素或尼龙膜。然后将固定的蛋白质暴露于具有针对目标抗原的反应性的抗体。可以通过各种方法检测所述抗体的结合，其中包括使用放射性标记的抗体。
“酶联免疫吸附测定或ELISA”涉及一种以多孔板形式(通常96-孔板)从样品如血浆、血清或细胞/组织提取物定量或半定量确定蛋白浓度的方法。广泛地讲，溶液中的蛋白被吸附至ELISA板。对所关注的蛋白具有特异性的抗体可以用来探测板。通过优化封闭和洗涤方法(对于IHC)将背景最小化，并且通过阳性和阴性对照的存在确保特异性。检测方法通常基于比色法或化学发光法。
本发明提供了一种预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的产品，所述产品包括检测样本中本发明所述的生物标志物蛋白表达量、mRNA表达量的试剂。所述产品包括但不限于试剂盒、核酸膜条或芯片。
试剂盒
术语“试剂盒”是指封装或销售用于一起使用的组件。例如，本发明的试剂盒可以包括本发明的检测所述生物标志物的试剂，以及在例如两个容器中使用该试剂盒的说明书。
本发明的试剂盒进一步包含用于将生物分子预官能化的叠氮化物试剂和用于执行预官能化的说明书。该试剂盒可进一步包含用于将肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质和/或它们的衍生物预官能化的叠氮化物试剂，以及用于执行对肽、蛋白质、适体、抗体、酶、碳水化合物、核酸、脱氧核糖核酸、寡核苷酸、多肽、重组蛋白、核糖核酸脂质和/或它们的衍生物的预官能化的说明书。
术语“核酸膜条”包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针，所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
术语“芯片”包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于AHCYL2、ANKRD6和/或PDGFRB的部分或全部序列。
引物
“引物”是指能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
探针
术语“探针”是指蛋白(包括肽)、核酸、糖链(包括糖缀合物)、脂质(包括缀合的脂质)等生物聚合物。具体地，探针包括酶、激素、信息素、抗体、抗原、半抗原、肽、合成肽、DNA、合成DNA、RNA、合成RNA、DNA/RNA杂合体、PNA、合成PNA、神经节苷脂、寡核苷酸、适体、凝集素等。
抗体
术语“抗体”包括整个抗体和任何抗原结合片段或其单链。整个抗体是糖蛋白，其包含至少通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：CH1，CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)，轻链恒定区包括一个结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着更加保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链可变区CDR和FR是HFR1，HCDR1，HFR2，HCDR2，HFR3，HCDR3，HFR4。轻链可变区CDR和FR是LFR1，LCDRl，LFR2，LCDR2，LFR3，LCDR3，LFR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)。本发明中所述的“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼源化(camelised)抗体、和嵌合抗体。抗体可以属于任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“肽”具有与靶物质高度结合的能力，并且在热处理/化学处理期间不会发生变性。而且，由于其尺寸小，可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言，因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上，它可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。
本发明所使用的术语“适配体”是指一种由特定类型的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)组成的多核苷酸，所述单链核酸自身具有稳定的三级结构，并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。如上所述，由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质，但比蛋白更稳定并具有简单的结构，并且是由易于合成的多核苷酸组成，因此可以代替抗体来使用。
本发明提供了一种癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型，所述模型采用回归方法分析筛选与癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效相关的铜死亡特征基因。
回归方法
如本发明所用，回归方法是指用于估算变量之间的关系、特别是因变量与一个或多个自变量之间的关系的统计过程。回归分析还用于理解自变量之中哪些与因变量相关，并探讨这些关系的形式。优选地，所述回归方法包括线性回归。优选地，所述回归方法包括使用收缩的线性回归。收缩是指数据值向中心点(如均值)收缩。在本发明中，所述回归方法包括最小绝对收缩和选择算子(LASSO)。
LASSO鼓励使用简单、稀疏的模型(即参数较少的模型)。这种特定类型的回归非常适合于多重共线性水平较高的模型或者模型选择的某些部分(如变量选择和/或参数消除)期望自动化实现的模型。LASSO回归执行L1正则化(regularization)，即加入等于系数幅度(magnitude)绝对值的惩罚项。这种类型的正则化可生成系数较少的稀疏模型；一些系数可以变为零并从模型中消除。惩罚越大，系数值就越接近零，这是生成更简单模型的理想选择。换言之，LASSO可用于减少线性模型的自变量的数量。在本发明中，术语“LASSO”、“lasso”、“Lasso”和“Lasso回归”作为同义词使用。
癌症
如本发明所述，所述癌症包括所有类型的癌性生长或致癌性过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭的阶段。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括但不限于膀胱癌(例如尿路上皮癌(UC)，包括转移性尿路上皮癌(mUC)；肌肉侵入性膀胱癌(MIBC)，和非肌肉侵入性膀胱癌(NMIBC))；肾癌或肾的癌(例如肾细胞癌(RCC))；肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)；尿道癌；乳腺癌(例如HER2+乳腺癌和雌激素受体(ER-)，孕酮受体(PR-)，和HER2(HER2-)阴性的三重阴性乳腺癌(TNBC))；前列腺癌，诸如去势抗性前列腺癌(CRPC)；腹膜癌；肝细胞癌；胃的癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)；胰腺癌(例如胰腺导管腺癌(PDAC))；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(例如肝细胞癌(HCC))；肝瘤；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜或子宫癌；唾液腺癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝的癌；肛门癌；阴茎癌；黑素瘤，包括浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端黑素瘤，和结节性黑素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小无核裂细胞NHL；贮积病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病(CML)；移植后淋巴增殖性病症(PTLD)；和骨髓增生异常综合征(MDS)，以及与瘢痣病，水肿(诸如与脑瘤有关的)，梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖，脑癌，头和颈癌，和相关转移。在一些实施方案中，癌症是胃癌、膀胱癌(例如尿路上皮癌，例如转移性尿路上皮癌)。在本发明的具体实施方案中，癌症是胃癌和转移性尿路上皮癌。
患者
术语“患者”、“个体”和“对象”在本发明中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“患者”、“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。
术语“CR”是指完全缓解，具体指所有目标病灶消失，任何病理性淋巴结(无论是否为目标病灶)的短轴值必须小于10mm。
术语“PR”是指部分缓解，具体指以临界半径的总和为参照，所有目标病灶半径的总和至少减少30％。
术语“SD”是指病灶稳定，具体是指以所研究(目标病灶半径)的总和最小值为参照，既达不到缓减标准、也达不到恶化标准者。
术语“PD”是指疾病进展，具体是指以整个研究过程中所有测得的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20％(如果基线测量值最小就以基线值为参照)。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例构建预测模型CuPS，验证CuPS与PD-L1抑制剂免疫疗效预测效果
1、通过文献获取10个铜死亡调控的关键基因。其中铜死亡正性调控基因7个，分别是：FDX1、LIPT1、LIAS、DLD、DLAT、PDHA1和PDHB；负性调控基因3个，分别是：MTF1、GLS和CDKN2A。
2、通过TCGA数据集和GEO数据集获取包含生存和基因表达的胃癌患者数据，本研究共纳入1401例胃癌患者，包括来自TCGA-STAD数据集(n＝350)、GSE84437数据集(n＝433)、GSE34942数据集(n＝56)、GSE57303数据集(n＝70)、GSE15459数据集(n＝192)、GSE62254数据集(n＝300)。同时通过TCGA数据集获取胃癌的基因表达的RNA转录组数据(FPKM格式)，将RNA转录组数据转换为百万/千碱基(TPM)的转录组格式。使用SVA包去除各数据集之间的批次效应(batch effect)。
将四个GEO数据集(GSE34942、GSE57303、GSE15459和GSE62254)组合成GEO-meta数据集，并按1：1比例分为训练集和测试集，GSE84437数据集和TCGA-STAD数据集作为独立验证集。
3、基于上述10个铜死亡调控的关键基因的表达，利用“NMF”进行无监督聚类分析，鉴定出3种铜死亡调控模式。
4、利用“limma”包筛选3种铜死亡调控模式下的3个铜死亡亚型(Cu1、Cu2和Cu3)，取三者间的显著差异基因(|logFC|>0.1，校正P＜0.01)，共得到470个铜死亡调控模式相关的差异表达基因(DEGs)。进一步通过单因素Cox分析，在GEO-meta、GSE84337和TCGA-STAD三个数据集中筛选预后相关的基因(P<0.05)，最终得到18个与预后显著相关的铜死亡亚型差异基因。
5、在GEO-meta训练集中，通过Lasso Cox回归分析得到的18个与预后显著相关的铜死亡亚型差异基因，得到8个与预后显著相关的铜死亡亚型差异表达基因，进一步通过多因素Cox风险回归得到3个与预后显著相关的铜死亡亚型差异表达核心基因，分别是AHCYL2、ANKRD6、PDGFRB。
6、基于以上筛选到的3个与预后显著相关的铜死亡亚型差异表达核心基因，构建癌症预后风险模型。该模型的具体计算公式是CuPS＝-0.205*exp(AHCYL2)+0.231*exp(ANKRD6)+0.237*exp(PDGFRB)，exp(AHCYL2/ANKRD6/PDGFRB)为AHCYL2/ANKRD6/PDGFRB基因的mRNAi表达水平。
7、通过“survival”包中的“surv_cutpoint”函数，确定CuPS的最佳截断值为1.1，根据最佳截断值将各数据集中的患者分为高风险组和低风险组(图1)。
8、通过Kaplan-Meier生存分析，比较两组在生存时间上的差异，发现高风险组患者的总体生存率显著低于低风险组。训练集、测试集与独立验证集的结果一致，高风险组患者的总体生存率显著低于低风险组，得到当风险评分较高时，患者预后不良；当风险评分较低时，患者预后良好。
9、患者肿瘤突变负荷评分(TMB)与免疫治疗疗效潜在相关，在上述TCGA-STAD数据集中计算胃癌患者TMB，并比较高风险组和低风险组胃癌患者的TMB，发现高风险组患者的TMB显著低于低风险组(图2)，即CuPS评分低的胃癌患者比CuPS评分高的胃癌患者更易在免疫治疗中获益。
10、患者微卫星不稳定(MSI)状态与免疫治疗疗效同样相关。通过进一步比较了MSS、MSI-L、MSI-H与风险评分的关系，发现高风险组患者MSS为84％，MSI-L为12％，MSI-H为3％；低风险组患者MSS为56％，MSI-L为17％，MSI-H为27％(图3)，即低风险组患者的MSI-H显著高于高风险组；此外通过比较风险评分和MSI之间的相关性，得出CuPS风险评分越低，微卫星不稳定性越高(图4)，即CuPS风险评分越低，更易在免疫治疗中获益。
11、PD-L1表达与免疫治疗疗效潜在相关，在上述TCGA-STAD数据集中，比较了PD-L1表达在高、低风险两组胃癌患者间的差异，发现低风险组患者的PD-L1表达显著高于高风险组(图5)，即CuPS风险评分越低，PD-L1免疫治疗后胃癌患者的客观缓解率越高，更易在免疫治疗中获益。
12、通过外部免疫治疗数据集IMvigor210数据集共348例接受PD-L1抑制剂阿替利珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌患者，来评估CuPS模型与免疫治疗疗效的关系，发现高风险组患者CR(完全缓解)为5％，PR(部分缓解)为2％，SD(病灶稳定)为25％，PD(疾病进展)为68％；低风险组CR为9％，PR为18％，SD为20％，PD为53％(图6)；此外发现患者的CR/PR、SD/PD免疫治疗反应与风险评分存在差异显著性，CR/PR(完全缓解和部分缓解)患者的CuPS评分显著低于SD/PD(病情稳定和进展)患者(图7)。进一步通过K-M生存曲线，评估高低风险组两组患者总体生存率有无显著差异，发现低风险组患者表现出显著延长的生存期(图8，P<0.001，对数秩检验)。
综上可以得出，基于胃癌预后相关的生物标志物构建的预测模型可有效预测胃癌患者的肿瘤突变负荷、MSI和PD-L1表达免疫疗效，进而判断胃癌患者的免疫疗效获益情况；此外，与模型风险评分高的转移性尿路上皮癌患者相比，风险评分低的尿路上皮癌患者表现出显著延长的生存期，即该预测模型可用于尿路上皮癌患者的免疫疗效评估。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括AHCYL2、ANKRD6和/或PDGFRB；
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌；
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌；
优选地，所述免疫疗效是PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本包括外周血样本、血清样本、血浆样本、尿样本、唾液样本或组织样本。
3.一种预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1中所述的生物标志物的蛋白表达量和/或mRNA表达量的试剂；
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌；
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述检测蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、免疫组织化学染色、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述检测mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
6.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述试剂包括与所述生物标志物基因特异性结合的引物或探针；或与所述生物标志物蛋白特异性结合的抗体、肽、适配体或化合物。
7.根据权利要求3-6任一项所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒、核酸膜条或芯片。
8.一种癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型，其特征在于，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型以权利要求1中所述的生物标志物作为输入变量；
优选地，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型为Cox回归模型；
优选地，所述Cox回归模型为LASSOCox回归模型；
优选地，所述癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型的公式为风险评分
Figure FDA0003677804290000021
其中，N为用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的基因数，Expi为每个基因的表达水平，Ci为每个基因的回归系数；
优选地，所述风险评分CuPS＝-0.205*exp(AHCYL2)+0.231*exp(ANKRD6)+0.237*exp(PDGFRB)；
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌；
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
9.一种用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的装置，其特征在于，所述装置包括：
获取单元，用于获取待测样本中权利要求1中所述的生物标志物的数据；
处理单元，用于将权利要求1中所述的生物标志物的数据输入预测模型中，获得待测样本的预测结果；所述预测结果为肿瘤突变负荷/微卫星不稳定性/PD-L1表达/免疫疗效预测结果；
优选地，所述预测模型为权利要求8中所述的癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型；
优选地，所述免疫疗效是PD-L1抑制剂治疗的免疫疗效；
优选地，所述癌症为胃癌、尿路上皮癌；
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1中所述的生物标志物在构建癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型中的应用；
(2)权利要求8中所述的癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效预测模型在构建用于预测癌症肿瘤突变负荷/癌症微卫星不稳定性/癌症PD-L1表达/癌症免疫疗效的装置中的应用；
优选地，(1)和(2)任一项所述的癌症为胃癌、尿路上皮癌；
优选地，所述尿路上皮癌为转移性尿路上皮癌。
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