CN116042832B - 一种预测非小细胞肺癌免疫治疗获益程度及预后的生物标志物及应用 - Google Patents

一种预测非小细胞肺癌免疫治疗获益程度及预后的生物标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预测非小细胞肺癌免疫治疗获益程度及预后的生物标志物及应用。本发明筛选出相关41个标志物并建立了一种基于肿瘤微环境的分子评分模型(IKC评分)。本发明的IKC评分依据肿瘤微环境特征构建，一定程度上反映了肿瘤微环境激活情况，同时结合肿瘤细胞特征及免疫检查点基因表达水平，可以更全面地评估肿瘤及肿瘤微环境，进而更精准筛选出免疫治疗获益潜在人群。另外，该IKC评分可筛选出一部分可从免疫治疗中获益PD‑L1阴性或低肿瘤突变负荷患者，可大幅提高现有分子分型在非小细胞肺癌患者免疫治疗的疗效预测精度，为非小细胞肺癌患者提供更个体化的免疫效益评估，极大推动非小细胞肺癌免疫治疗的精准进程。

Description

一种预测非小细胞肺癌免疫治疗获益程度及预后的生物标志 物及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种预测非小细胞肺癌免疫治疗获益程度及预后的生物标志物及应用。
背景技术
肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率都位列前茅的恶性肿瘤，2015版世界卫生组织肺部肿瘤的组织病理学分类依据形态和结构基础将肺癌分为鳞癌和腺癌两大类，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占其总数的85％，成为严重威胁人类生命健康的社会问题。肺癌的预后因素众多，具有相同临床分期和组织学分级的肺癌患者接受相同的治疗方案，其预后也可能不同。
近年来，以免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint blocades，ICBs)为主的免疫治疗在晚期肺癌中取得了突破性的进展，为患者带来了更多的生存获益，改变了非小细胞肺癌的整体治疗格局。但该疗法最大的挑战在于患者疗效差异悬殊，多项研究显示仅部分肺癌患者可从该疗法获益。寻找能精准预测该治疗反应的生物标志物，发现该疗法的耐药机制，制定相应的个体化治疗方案，避免过度治疗和不当治疗给患者带来的伤害和负担，是临床迫切需要解决的问题。近年的研究结果显示，免疫治疗在抗肿瘤上显示出巨大价值，作为癌症免疫疗法的关键组成部分，免疫检查点阻断疗法(如PD-1/PD-L1抗体)颠覆了多种晚期癌症的治疗。不过，目前，只有少部分肿瘤患者能够响应这类疗法，因此，如何精准得筛选出能从检查点抑制剂中获益的患者群体，是肺癌免疫治疗面临的最大挑战。
根据TNM分期系统进行分期，同一类型肿瘤相同分期的不同患者经过相同或类似治疗后,其临床结局有显著差异,这表明该分期系统在提供预后信息和指导术后化疗决策方面存在局限性。目前用于预测晚期非小细胞肺癌免疫检查位点阻滞剂疗效的生物标志物的研究主要集中在免疫组化技术检测的PD-L1的表达水平，肿瘤突变负荷(Tumor mutationburden，TMB)，和高度微卫星不稳定性(High-frequency microsatellite instability，MSI-H)等。虽然对于免疫治疗适宜人群筛选和疗效预测的生物标志物越来越多，但PD-L1仍是目前应用最为广泛的指标。KEYNOTE-024研究中，对于PD-L1高表达(≥50％)的晚期NSCLC患者，帕博利珠单抗较含铂化疗显著改善5年生存率(32％vs 16％)。IMpower110研究中，PD-L1高表达人群使用阿替利珠单抗，其OS较化疗显著延长(20.2vs 13.1)。
然而，PD-L1作为生物标志物预测检查点抑制剂疗效存在局限性：①PD-L1在肿瘤中的表达存在异质性，不同瘤种以及同一肿瘤的不同区域，肿瘤病灶和转移灶之间都可存在PD-L1的表达差异；②抗体和染色情况缺乏标准化，PD-L1表达水平主要通过免疫组化染色情况进行评估。而目前临床研究中用于PD-L1免疫组化染色的抗体不一，染色情况也受制于评估者的主观判断；③关于PD-L1有效性的界定标准模糊，PD-L1表达强度，即多少百分比判定为“阳性”存在争议。在KEYNOTE-010研究中证实了PD-L1表达水平(＞50％)与临床获益之间的相关性。PD-L1 28-8pharm Dx(Dako)IHC检测在晚期NSCLC和接受纳武利尤单抗的黑素瘤患者中被批准，其评分系统定义PD-L1表达＜1％为阴性，低表达为1％-5％，中间表达为5％-10％，高表达为＞10％。④通过免疫组织化学检测为PD-L1阴性的患者仍然可以通过抗PD-1或抗PD-L1疗法获得临床益处，PD-L1阳性只是帕博利珠单抗治疗NSCLC患者的必要条件。
肿瘤突变负荷被定义为肿瘤基因组中每个编码区的突变总数，其范围包含几个到数千个突变。高肿瘤突变负荷(TMB-H)可反映肿瘤基因突变量累积被认可为肿瘤免疫治疗潜在的生物标志物，通常提示着更高的免疫原性和增加的T细胞反应性(4)。TMB-H在晚期NSCLC可能帮助预测较高的ICIs治疗反应，但其在预测OS获益上并不完全可靠。如在纳武单抗及阿替利珠单抗的临床研究中，TMB-H患者的治疗反应率较高、进展较晚，但OS并无差异。在MYSTIC研究中，在TMB-H患者接受度伐利尤单抗单药免疫治疗较化疗，既未推迟进展，亦未提升OS。因此，TMB效用的主要限制在于TMB并不总是与更好的ICB反应和延长总生存期相关。另外，不同的测试算法的使用和未经验证的界值设定也是影响TMB的疗效预测的可靠性的重要因素。两项对比非小细胞肺癌一线化疗与免疫治疗优劣性的临床研究，KEYNOTE-021和KEYNOTE-189的研究结果表明，不同肿瘤突变负荷的患者疗效表现一致。
微卫星是短DNA序列的串联重复序列，在真核生物的基因组中广泛存在。人类错配修复基因(MMR基因)经转录翻译后可表达相应的错配修复蛋白，如果任一MMR蛋白表达缺失可造成细胞的错配修复功能缺陷，则对DNA复制过程中的碱基错配丧失修复功能而造成累积，导致微卫星不稳定(MSI)的发生。2017年，美国FDA批准PD-1抑制剂pembrolizumab治疗微卫星高度不稳定(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，瘤种覆盖结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌等15个不同部位的恶性肿瘤。以上研究报道表明MSI-H是一种泛肿瘤免疫治疗预测因子，但其预测价值仅适用于<1％的NSCLC患者中，这表明MSI-H不能适用于大范围筛选免疫治疗应答者。
综上，现有的生物标志物包括PD-L1的表达水平，TMB和MSI-H等的临床应用均面临挑战，仅局限于肿瘤细胞特征，而忽略了肿瘤细胞所处的微环境同样在介导抗肿瘤免疫过程中发挥重要作用，提示仍然需要开发更精准更全面的标志物以预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效，开发新的稳健的生物标志物及探索有效的生物标志物联合检测策略可能是应对这一挑战的关键。
而且，目前多种生物标志物在预测PD-1/PD-L1单抗疗效的稳定性欠佳，且都集中于异质性明显的肿瘤内在特征，存在一定局限性，忽略了对肿瘤微环境状况的评估，从免疫治疗的作用机理来说并不全面，这也一部分解释了多项生物标志物的临床试验中肺癌对检查点抑制剂反应率不高的原因；因此，亟需更精准的生物标志物用于预测免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1单抗的疗效。
随着肿瘤免疫研究的深入，人们逐渐认识到肿瘤细胞并不是孤立存在的个体，其所处的微环境是肿瘤发生发展的主动参与者。肿瘤微环境中浸润模式及免疫和代谢等肿瘤内在通路的表达，与单一生物标志物PD-L1、MSI-H、TMB相比，更能全面反映肿瘤免疫治疗的演变规律。因此，根据有关肿瘤免疫浸润特征预测免疫检查点抑制剂PD-L1/PD-1单抗的反应性是提高当前肺癌免疫检查点抑制剂治疗成功率和开发下一代免疫疗法的重要举措。
为了更准确、更全面地预测免疫治疗疗效，国际上已有学者从肿瘤免疫微环境角度预测疗效(包括GEPs,TIDE,IMPERS,IPS,Pan-F-TBRS等评分)。其中GEPs(T细胞炎症基因评分)是目前研究较为可靠的预测免疫治疗的生物标志物，该基因评分模型是基于黑色素瘤的基因表达谱数据建立，在黑色素瘤和头颈部肿瘤中都获得较好的预测准确度，开创了使用高通量转录组数据建立标签基因进行免疫治疗预测的先河，但该评分还没有报道在晚期肺癌免疫治疗的预测价值。IMvigor210研究结果证实，通过基因表达谱数据所获得的CD8效应T细胞评分和间质的成纤维细胞评分与TMB相关性不显著，但都可预测患者对PD-L1单抗的治疗反应。
随着分子生物学技术的飞速发展，使用聚合酶链反应(PCR)、基因芯片和测序等分子生物学方法发现并检测肺癌预后相关基因已成为可能。2002年Van’t Veer等通过DNA芯片技术筛查117例乳腺癌病例，发现70个与乳腺癌预后相关的基因；2004年美国研究者又利用RT-PCR方法对675例乳腺癌样本进行验证，获得21个与预后相关的基因评分模型，Genomic Health公司根据此研究开发了乳腺癌预后相关产OncotypeDX(14)，OncotypeDX是目前唯一一项被(NCCN指南、ASCO临床指南及St Gallen临床共识)3个全球最权威临床指南共同推荐的乳腺癌预后检测产品。Genomic Health公司也开发了针对前列腺癌和结肠癌的Oncotype DX基因检测项目，但迄今为至世界上尚未有针对肺癌预后的类似检测。因此，亟待在现有研究和技术的基础上，设计研发一项肺癌的多基因表达谱和预后评分系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的标志物、PCR检测试剂盒、模型及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面，提供一种预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的标志物，所述标志物包括A类基因、B类基因和C类基因：
A类基因：MS4A6A、C1QC、HLA-DQB1、RAMP2、MATN3、CDK15、WNT2、FOLR2、HPGD、KDR、LGMN、PTGER2、F13A1、SLCO2B1、TMEM100；
B类基因：KRTAP5-5、KCNC1、ADAM30、CELF3、PNMA5、POU3F2、UNC80、TMEM132D、ATP2B3、CPLX2、ZFP42、INA、KRTAP5-1、GP2、SCGN、ST18、BLOC1S5-TXNDC5、FMN2、ANO3；
C类基因：CD274、PDCD1LG2、CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2、TIGIT。
在本发明的一些实施方式中，所述标志物用于预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的风险评分的计算公式为：风险评分＝A类基因表达量的平均值+B类基因表达量的平均值-C类基因表达量的平均值。
在本发明的一些实施方式中，所述风险评分的cut-off值为风险评分的中位数。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫治疗包括免疫检查点抑制剂治疗。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1/PD-L1抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明第二方面，提供标志物在制备预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的产品中的应用，所述标志物如本发明第一方面所述。
在本发明的一些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明第三方面，提供检测标志物的物质在制备预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的产品中的应用，所述标志物如本发明第一方面所述。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测标志物基因表达水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
本发明第四方面，提供一种产品，所述产品包括检测本发明第一方面所述的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测标志物基因表达水平的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述物质包括试剂、仪器、软件。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括基因组合、抗体、探针。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂盒、试剂盒、诊断试剂、检测试剂、试纸、基因芯片或蛋白质芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述内参包括TUBB、ACTB。
本发明的第五方面，提供一种用于预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的系统，包括：
获取模块：用于获取本发明第一方面所述标志物的表达水平；
预测模块：用于根据所述获取模块获得的表达水平预测肺癌免疫治疗获益程度和/或预后的风险评分，所述预测模块包括一个非小细胞肺癌化疗获益程度和/或预后的评分模型，所述评分模型的公式为：风险评分＝A类基因表达量的平均值+B类基因表达量的平均值-C类基因表达量的平均值。
本发明的第六方面，提供一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如本发明第五方面所述的系统的功能。
本发明的有益效果是：
目前非小细胞肺癌领域预测免疫治疗疗效的生物标志物主要包括PD-L1表达水平及肿瘤突变符合，但是这两个指标主要依赖肿瘤细胞的特征，忽略了肿瘤微环境在介导肿瘤免疫治疗反应中的关键作用。本发明通过解析接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者的转录组谱筛选出相关的41个标志物，并运用机器学习算法建立一种基于肿瘤微环境的分子评分模型(IKC评分)。本发明的IKC评分依据肿瘤微环境特征构建，一定程度上反应了肿瘤微环境激活情况，同时结合肿瘤细胞特征及免疫检查点基因表达水平，可以更全面地评估肿瘤及肿瘤微环境，进而更精准筛选出免疫治疗获益潜在人群。另外，该IKC评分可筛选出一部分可从免疫治疗中获益PD-L1阴性或低肿瘤突变负荷患者，可大幅提高现有分子分型在非小细胞肺癌患者免疫治疗的疗效预测精度。
相较于已有的分子标志物，该模型不仅是非小细胞肺癌患者接受免疫治疗后进展与死亡风险的预后独立预测因素，也是一个有效的预测患者治疗应答的工具，为非小细胞肺癌患者提供更个体化的免疫效益评估，有一定的临床转化意义。
同时，本发明还针对标志物特异性的提供了一种PCR探针试剂盒，非常便于临床常规检测，可很好的实现临床转化，极大推动非小细胞肺癌免疫治疗的精准进程。
附图说明
图1为建模工作流程图。
图2为训练组IKC评分预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效。图2A疗效不应答组和应答组中IKC评分及其他相关免疫评分的表达水平。图2B ROC曲线评估IKC评分预测非小细胞肺癌患者免疫治疗应答的效能。图2C高低IKC评分的非小细胞肺癌患者接受免疫治疗的无进展生存期生存曲线。
图3为训练组中对比IKC评分与其他标志物预测疗效效能。图3A ROC曲线评估IKC评分和PD-L1预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的效能。图3B ROC曲线评估IKC评分和肿瘤突变负荷预测非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的效能。
图4为验证组IKC评分预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效。图4A箱线图展示验证组中疗效不应答组和应答组中IKC评分及其他相关免疫评分的表达水平。图4B ROC曲线评估IKC评分在验证组中预测免疫治疗疗效的准确性。图4C验证组中高低IKC评分的无进展生存期生存曲线。
图5为验证PCR检测IKC评分与转录组的一致性。图5A ROC曲线评估PCR检测IKC评分预测免疫治疗疗效的效能。图5B基于转录组数据计算的IKC评分与PCR检测IKC评分的相关性图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1非小细胞肺癌患者队列的构建及转录组表达谱的获取
1、训练组及验证组患者队列的构建
申请人首先收集于2017年至2021年于南方医科大学南方医院肿瘤科接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者队列，患者入组标准如下：1)病理诊断为非小细胞肺癌；2)有接受PD-1/PD-L1抑制剂的指征；3)可获取治疗前的肿瘤组织标本；4)有疗效评价数据。结合入组标准，获取的队列一共有65名患者，为训练组。从GEO数据库获取的GSE135222队列为验证组。
2、转录表达谱的获取方法
①组织RNA提取：使用Trizol RNA分离液(ThermoFisher,USA)提取组织样本中的总RNA，并用DNase I去除残留的DNA。应用Oligo(dT)磁珠从总RNA中分离纯化mRNA。在第一链合成反应缓冲液(5X)中，二价阳离子能够在高温度下使RNA碎片化。根据说明书，使用/>UltraTM RNA Library Prep Kit for/>(NEB,USA)构建测序库。
②RNA测序和数据获取：通过Illumina Hiseq测序仪进行测序，最终获得150bp双末端数据。去除质量较差的数据后，参照GRCh37使用带参数的Hisat2对初始FASTQ文件基因比对。
最后，分别通过HTSeq v0.6.0和GENCODE v19注释文件对RNA片段进行统计和注释。使用TPM的标准化方法获取基因的相对表达量。
实施例2筛选建模候选基因
筛选建模基因，模型开发思路如图1所示。对南方医院收治的65例晚期非小细胞肺癌患者标本进行转录组测序，获取肿瘤微环境、代谢及肿瘤内在通路相关基因标签，通过分析基因差异和治疗反应相关的基因标签，进行特征工程筛选目标基因。
一方面，本研究运用R包IOBR的batch_wilcoxon()函数获取与治疗反应正向和反向相关按照p值各选取排名前15的基因标签，提取这15个基因标签包涵的所有基因，其中留下这些基因中与免疫治疗疗效的相关性达到统计学差异的16个基因；另一方面，根据实体瘤疗效评价标准RECIST1.1标准进行疗效评价，其中完全缓解(CR)和部分缓解(PR)定义为治疗应答(R)，疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)定义为治疗非应答(NR)，针对两组患者标本的转录组数据进行基因差异分析筛选出差异表达基因。综合上述方法提取出与治疗应答相关的免疫基因以及与治疗不应答相关的角蛋白基因。最后，基于这些基因运算获得的IKC评分计算公式具体如下：IKC评分＝免疫评分(Immune score)+免疫检查点评分(Immunecheckpoint score)-角蛋白评分(KRTscore)。
针对两组患者标本的转录组数据进行基因差异分析，获得在R和NR组分别高表达的各35个差异基因。然后，将这70个差异基因与前文所述留下的16个基因取并集，去除假基因获得70个基因。随后，为进一步精简基因检测数量，再次运用R包IOBR的batch_wilcoxon()函数将70个基因精简为60个基因，包含与非小细胞肺癌治疗反应正向和负向相关的各30个基因。随后，对这60个目标基因基于K-means分群分析，将目标基因分为5个表达模式，包括免疫模式、角蛋白模式、未定义模式1、未定义模式2、未定义模式3，并通过富集分析验证，其中免疫模式和角蛋白模式分别在治疗反应和非应答组表达上调。进一步通过单样本基因集富集分析(ssGSEA)算法计算免疫评分、角蛋白评分(KRTscore)和免疫检查点评分。最后，基于这些基因运算获得的IKC评分计算公式具体如下：IKC评分＝免疫评分(Immunescore，包括以下基因：MS4A6A、C1QC、HLA-DQB1、RAMP2、MATN3、CDK15、WNT2、FOLR2、HPGD、KDR、LGMN、PTGER2、F13A1、SLCO2B1、TMEM100)+免疫检查点评分(Immune checkpointscore，包括以下基因：CD274、PDCD1LG2、CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2、TIGIT)-角蛋白评分(KRTscore，包括以下基因：KRTAP5-5、KCNC1、ADAM30、CELF3、PNMA5、POU3F2、UNC80、TMEM132D、ATP2B3、CPLX2、ZFP42、INA、KRTAP5-1、GP2、SCGN、ST18、BLOC1S5-TXNDC5、FMN2、ANO3)。
实施例3IKC评分模型在训练组中对于接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者疗效及预后的预测作用
按照实施例2的方法，计算得到训练组中65例患者的IKC评分，在训练组中探索IKC评分的使用效果。将IKC评分的中位数定为cut-off值，据此将患者分为高IKC评分组和低IKC评分组，箱线图显示，在接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者中，非应答组IKC评分分布显著高于应答组(图2A)。进一步，运用ROC曲线评估IKC评分预测非小细胞肺癌患者免疫治疗应答的效能，分析显示IKC评分预测AUC值为0.841，提示IKC评分预测免疫治疗疗效准确性为84.1％(图2B)。随后，进一步对有PFS数据的患者进行生存分析(图2C)，结果显示，具有高IKC评分的非小细胞肺癌患者接受免疫治疗具有显著更长的无进展生存期。高评分的患者进展风险(HR＝0.37，95％CI＝0.15-0.94)显著高于低评分患者。接下来对比IKC评分与PD-L1表达水平和肿瘤突变负荷的预测效能。无论是与连续的PD-L1表达水平或三分类、二分类的PD-L1表达水平相对比，IKC评分预测非小细胞肺癌免疫治疗疗效的AUC值更高(图3A)。IKC评分预测非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的准确性亦优于肿瘤突变负荷(图3B)。上述结果提示，在训练组中，IKC评分预测免疫治疗疗效准确性优于PD-L1表达水平及肿瘤突变负荷。
实施例4IKC评分模型在验证组中对于非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的预测作用
在验证组中探索IKC评分的使用效果。选择GSE135222为验证队列。箱线图显示，在接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者中，非应答组IKC评分分布显著高于应答组(图4A)。ROC曲线分析显示IKC评分对非小细胞肺癌患者免疫治疗应答的预测准确率为77.6％(图4B)。进一步对于有PFS数据的患者生存分析显示(图4C)，IKC评分与接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者的无进展生存期均显著相关。高评分的患者进展风险(HR＝0.15，95％CI＝0.03-0.66)显著高于低评分患者。
拟在验证队列GSE135222中进一步验证IKC评分对于非小细胞肺癌免疫治疗疗效预测的准确性。同样，将IKC评分的中位数定为cut-off值，据此将患者分为高IKC评分组和低IKC评分组，在接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者中，非应答组IKC评分分布显著高于应答组(图4A)。进一步运用ROC曲线评估IKC评分预测非小细胞肺癌患者免疫治疗应答的效能，分析显示IKC评分预测AUC值为0.776，提示IKC评分预测免疫治疗疗效准确性为77.6％(图4B)。进一步对于有PFS数据的患者进行生存分析(图4C)，高IKC评分非小细胞肺癌患者同样具有显著更长的PFS。高评分的患者进展风险(HR＝0.15，95％CI＝0.03-0.66)显著高于低评分患者。
PCR试剂盒的检测和实施方法(RNA提取、获取标准值)
1、提取肿瘤组织的RNA
1)提取新鲜或冰冻组织标本的RNA
①首先，将肿瘤样本的组织直接放入研钵中，加入少量的液氮，迅速研磨，待组织变软，再加入少量的液氮，再研磨，重复三次；
②将组织样品按50-100mg加入1mL Trizol，转移入离心管。另外组织体积不能超过Trizol体积的10％，再用电动均浆器充分均浆1-2min；
③然后，在12000r/min下离心五分钟，弃沉淀，按每毫升Trizol加入200微升的氯仿，盖紧离心管，用手振荡混匀15s，室温放置十分钟；
④然后，在4℃12000g离心十五分钟，吸取上层水相，移至另一新的离心管中，按每毫升Trizol加入0.6mL异戊醇，混匀放置室温5-10min；
⑤然后，在4℃12000g离心十分钟，弃上清液，按每毫升Trizol加入1mL的75％乙醇，温和振荡，悬浮沉淀；
⑥然后，在室温晾干或真空干燥5-10min，再测260nm下吸光值定量RNA浓度；
⑦最后，RNA可进行mRNA分离，或储存于70％乙醇中并保存于-70摄氏度下，加氯仿前的均浆液可以保存一个月以上；
2)提取福尔马林固定后的蜡块组织(FFPE)标本的RNA
注意事项：对于FFPE的样本，建议样本的储存时间小于2年；
①去除与空气接触的蜡块表层后，切取石蜡切片(5-10μm厚)5-8张；
②加入PBS涡旋振荡混匀室温离心，弃上清，重复3次；
③将样本装于无菌离心管中，加入二甲苯，剧烈涡旋；
④使用罗氏公司的High Pure FFPET RNA Isolation Kit提取高纯度的RNA。
2、RNA定量检测
①逆转录：根据逆转录商品试剂盒的步骤将提取的细胞总RNA逆转录为相应的cDNA。逆转录体系为10μl，具体包括：缓冲液2μl，逆转录酶0.5μl，寡核苷酸引物0.5μl，随机引物0.5μl，浓度约为1000ng的细胞总RNA 1μl(根据检测到的RNA浓度调整加入的RNA样本的体积，保证RNA量)，剩余的体系用去RNA酶水补充。配制好逆转录体系后进行逆转录。
②配置实时定量PCR反应体系：根据Roche荧光定量PCR试剂盒的说明书进行实时定量PCR实验。反应体系为10μL，具体包括：DEPC水3.6μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，SYBR Green I荧光反应液5μl，cDNA样品1μl。使用罗氏定量荧光PCR仪扩增cDNA。
③用比较法(ΔΔCt)计算基因的表达，并将靶基因和管家基因的循环阈值(Ct)进行比较。
3、内参基因和标签基因的选择
①为评估PCR检测结果与高通量测序数据的一致性，从上述队列数据中随机选择了65例有剩余标本的患者，并对组织标本进行了上述标签基因和内参基因的检测；
②通过评估内参基因的表达丰度和基因表达稳定性，选择了ACTB和TUBB作为后续标准化的参考基因；同时通过对标签基因进行表达丰度和基因表达稳定性的考量，以下基因作为PCR检测试剂盒的组成部分：免疫评分(Immune score)相关基因：MS4A6A、C1QC、HLA-DQB1、RAMP2、MATN3、CDK15、WNT2、FOLR2、HPGD、KDR、LGMN、PTGER2、F13A1、SLCO2B1、TMEM100；角蛋白评分(KRT score)相关基因：KRTAP5-5、KCNC1、ADAM30、CELF3、PNMA5、POU3F2、UNC80、TMEM132D、ATP2B3、CPLX2、ZFP42、INA、KRTAP5-1、GP2、SCGN、ST18、BLOC1S5-TXNDC5、FMN2、ANO3；免疫检查点评分(Immune Checkpoint score)相关基因：CD274、PDCD1LG2、CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2、TIGIT；内参基因：ACTB和TUBB。
4、IKC评分的计算
使用以下公式来计算每个基因的表达水平：Nrel＝N01/N02＝N×2-Ct1/N×2-Ct2＝2-(Ct1-Ct2)＝2-ΔCt(1为检测基因，2为内参基因平均值)。然后使用以下方法计算每个肿瘤患者的评分；1、计算免疫评分(Immune score)等于免疫评分基因的算术平均数；2、计算角蛋白评分(KRTscore)等于角蛋白评分基因的算术平均数；3、计算免疫检查点基因评分(Immune checkpoint score)等于免疫检查点基因的算术平均数；4、IKC评分＝免疫评分(Immune score)+免疫检查点评分(Immune checkpoint score)-角蛋白评分(KRTscore)。训练组中65例患者的IKC评分及PCR检测IKC评分结果见表1。
表1训练组中65例患者IKC评分及相应PCR检测结果
5、PCR检测与高通量测序数据的一致性评估
为评估使用PCR检测试剂盒与高通量测序数据的一致性，使用上述选择的65例标本进行了IKC评分的计算，发现PCR检测得到的IKC评分预测免疫治疗疗效的准确性可以达到0.832，同时与转录组数据获得的IKC评分进行相关性分析，二者相关性达到0.89，提示PCR检测得到的IKC评分与转录组数据得到的IKC评分具有高度一致性(图5)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (7)

1.一种预测非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的标志物，其特征在于，所述标志物包括A类基因、B类基因和C类基因：
A类基因：MS4A6A、C1QC、HLA-DQB1、RAMP2、MATN3、CDK15、WNT2、FOLR2、HPGD、KDR、LGMN、 PTGER2、F13A1、SLCO2B1和TMEM100；
B类基因：KRTAP5-5、KCNC1、ADAM30、CELF3、PNMA5、POU3F2、UNC80、TMEM132D、ATP2B3、 CPLX2、ZFP42、INA、KRTAP5-1、GP2、SCGN、ST18、BLOC1S5-TXNDC5、FMN2和ANO3；
C类基因：CD274、PDCD1LG2、CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2和TIGIT。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物用于预测非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的风险评分的计算公式为：风险评分= A类基因表达量的平均值+B类基因表达量的平均值-C类基因表达量的平均值。
3.特异性检测标志物表达水平的物质在制备预测非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的产品中的应用，其特征在于，所述标志物如权利要求1所述。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质包括通过核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测标志物基因表达水平的物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述物质包括引物、探针。
6.一种用于预测非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的系统，包括：
获取模块：用于获取权利要求1所述标志物的表达水平；
预测模块：用于根据所述获取模块获得的表达水平预测非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的风险评分，所述预测模块包括一个非小细胞肺癌免疫治疗应答、非应答和/或接受免疫治疗后无进展生存期的评分模型，所述评分模型的公式为：风险评分＝A类基因表达量的平均值+B类基因表达量的平均值-C类基因表达量的平均值。
7.一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如权利要求6所述的系统的功能。
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