JP2014517282A - 膀胱癌におけるｒｂｍ３ - Google Patents

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Abstract

本明細書は、その局面の１つにおいて、膀胱癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良い方法に関する。該方法は、ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、該サンプル値が該参照値よりも高いとき、ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、該サンプル値が該参照値以下であるとき、ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける工程を含む。

Description

技術分野
本明細書は、膀胱癌の分野、特にその予後および処置に関する。さらに、本明細書は、予後または処置予測の確立において有用であることを意味することに関する。
背景
癌
癌は、西欧諸国において最も一般的な疾患の１つ、および死の主な原因である。一般的に、発生率は、癌の多数の形態に対して年齢とともに増加する。一般健康状態の増加によってヒト集団が長生きし続けるため、癌はより多くの個体に影響し得る。多数の一般的な癌型の原因は、未だほとんど知られていないが、環境因子（食生活、タバコの煙、ＵＶ放射など）ならびに遺伝因子（ｐ５３、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＸＰなどのような「癌遺伝子」の生殖細胞株変異）と癌の発症の危険性の関連を提供する知識体系が増加している。
癌は本質的に細胞疾患であり、網状の細胞増殖および反社会的行動を有する形質転換細胞集団として定義されるという事実にもかかわらず、細胞生物学的観点から完全に満足する癌の定義がない。悪性転換は、不可逆性遺伝子変化に基づく悪性表現型への移行を示す。これは正式に証明されていないが、悪性転換は１つの細胞に起こり、次に、これから腫瘍が生じると考えられている（「癌のクローン」ドグマ）。発癌は、癌が産生することによるプロセスであり、一般的に、最終的に悪性腫瘍の増殖を生じる多数の事象を含むことが認められる。この多工程プロセスは、いくつかの律速工程、例えば、変異の付加および恐らくエピジェネティック事象を含み、前癌性増殖の工程の後の癌形成を引き起こす。工程的変化は、細胞分裂、反社会的行動および細胞死を決定する生命維持に必要な調節経路における誤り（変異）の蓄積を含む。これらそれぞれの変化は、周囲細胞と比較して、増殖においてダーウィン的な選択優位性利点が与えられ、腫瘍細胞集団の網状の増殖をもたらし得る。悪性腫瘍は、必ずしも形質転換された腫瘍細胞それら自体だけからならず、支持的基質として作用する周囲正常細胞からもなる。この動員された癌の基質は、形質転換された腫瘍細胞に継続している腫瘍増殖のために必要なシグナルを提供するために共同する結合組織、血管および種々の他の正常細胞、例えば、炎症性細胞からなる。
癌の最も一般的な形態は、体細胞で生じ、主に上皮性起源、例えば、前立腺、乳房、大腸、尿路上皮および皮膚、次に造血系起源の癌、例えば、白血病およびリンパ腫、神経外胚葉、例えば、悪性神経膠腫、および軟組織腫瘍、例えば、肉腫である。
癌診断および予後診断
疑わしい腫瘍由来の生検材料の顕微鏡的評価は、癌診断に対するすばらしい標準を維持している。確定診断を得るために、腫瘍組織をホルマリンに固定し、組織処理し(histo-processed)、パラフィン包埋する。得られるパラフィンブロックから、組織切片を生産し、組織化学的な、すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色、および免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法の両方を使用して染色することができる。次に、外科的標本を肉眼的および顕微鏡分析を含む病理学的技術で評価する。この分析は、しばしば、特定の診断への割り当て、すなわち、腫瘍型の分類および悪性腫瘍、腫瘍の程度の等級付けの基礎を形成する。
悪性腫瘍は、それぞれの癌型に対して特異的な分類体系にしたがって、いくつかの期に分類することができる。固形腫瘍に対する最も一般的な分類系は、腫瘍−リンパ節−転移（ＴＮＭ）病期分類システムである。Ｔ期は、原発性腫瘍の局所程度、すなわち、腫瘍が周囲組織へ増殖が侵入および浸潤している程度を示し、Ｎ期およびＭ期は、リンパ節への腫瘍の広がりを示すＮ期および他の遠隔臓器における腫瘍の増殖を示すＭ期で、腫瘍が転移を発症しているかどうかを示す。初期工程は、陰性リンパ節で限局性腫瘍を示すＴ０−１、Ｎ０、Ｍ０を含む。さらに進行した工程は、より広い増殖を含む限局性腫瘍を示すＴ２−４、Ｎ０、Ｍ０、およびリンパ節へ転移した腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ０、および遠隔臓器において検出される転移を有する腫瘍を示すＴ１−４、Ｎ１−３、Ｍ１を含む。腫瘍の病期分類は、しばしば、外科的、放射線学的および組織病理学的分析を含む検査のいくつかの形態に基づく。病期分類に加えて、多数の腫瘍型に対して、また、悪性腫瘍のレベルを等級付けするための分類系がある。評点方式は、腫瘍組織サンプルの形態学的評価に頼り、所定の腫瘍において見られる顕微鏡的特徴に基づく。これらの評点方式は、腫瘍細胞の分化、増殖および非典型的な外観の程度に基づき得る。一般的に使用される評点方式の例は、前立腺癌腫に対するグリーソン分類および乳房癌腫に対するノッティンガム組織学的グレード（ＮＨＧ）等級付けを含む。
正確な病期分類および等級付けは、正しい診断のためにしばしば重要であり、予後を予測するための道具を提供し得る。特異的な腫瘍に対する診断および予後診断情報は、所定の癌患者に対する十分な治療戦略が決定されるときに考慮される。
腫瘍に関するさらなる情報を得るために、組織切片の組織化学的染色に加えて、一般的に使用される方法は、免疫組織化学的染色である。ＩＨＣは、特異的抗体を使用して、組織および細胞におけるタンパク質発現パターンの検出を可能にする。臨床診断におけるＩＨＣの使用は、組織化学的に染色された腫瘍組織切片から評価される組織構造学および細胞形態学に関する情報に加えて、異なる細胞集団における免疫反応の検出を可能にする。ＩＨＣは、原発性腫瘍の正確な診断、例えば、病期分類および等級付けのサポートに、ならびに未知の起源の転移の診断に関与することができる。今日、臨床診療において最も一般的に使用される抗体は、細胞型「特異的な」タンパク質に対する抗体、例えば、ＰＳＡ（前立腺）、ＭｅｌａｎＡ（メラニン細胞）およびサイログロブリン（甲状腺）および中間径フィラメントを認識する抗体（上皮性、間葉性、グリア）、分化の一群（ＣＤ）の抗原（造血、リンパ細胞の下位分類）ならびに悪性度のマーカー、例えば、Ｋｉ６７（増殖）、ｐ５３（一般的に変異した腫瘍抑制遺伝子）およびＨＥＲ−２（増殖因子受容体）を含む。
ＩＨＣを除いて、遺伝子増幅を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーションおよび変異分析のための遺伝子シーケンシングの使用は、癌診断の発展している科学技術である。加えて、転写産物、タンパク質または代謝産物のグローバル分析を関連情報に加える。しかしながら、多数のこれらの分析は未だ基礎研究であり、臨床医学における使用に対して評価され、標準化されていない。
膀胱癌
世界中で、膀胱癌は、癌の９番目に一般的な形態である。膀胱癌は、女性よりも男性でより一般的であり；毎年、約３３６０００人の全新規症例の約２６００００人は男性であり、約７６０００人は女性である。発生率および癌の型は、各国間で大きく変化する。産業界において、最も一般的な型の膀胱癌は、尿路上皮癌腫（約９０％の場合）である。途上国において、扁平上皮癌は最も一般的であるが、該型は、西欧諸国における少数の割合の膀胱癌のみに寄与する。尿路上皮癌の世界中の発生率は、全ての新たな癌の約３．３％であり、１年あたり約１５００００人が該疾患によって亡くなる。膀胱癌を発症する危険性は年齢と共に増加し、診断での中央年齢は、男性および女性を合わせて７０歳である。
今日、膀胱癌に対する最も大きな既知の危険因子は、タバコの使用、特に喫煙である。他の危険因子は、石炭燃焼および電離放射線からの排煙を含む。疾患の一因となる遺伝因子は、未だ同定されていない。
膀胱癌診断
膀胱癌の早期検出のための患者のスクリーニングは、一般的に今日、推奨されない。少数のマーカー、例えばＢＴＡ−ＳｔａｔおよびＮＭＰ２２が、尿スクリーニングにおける使用のためにＦＤＡにより承認されているが、しかしながら、これらは、十分に信頼できると証明されていない。尿中の血液は、膀胱癌の一般的な最初の症状であるが、常に存在しない。他の症状は、恥骨を介する疼痛、頻尿および刺すような痛み(stinging)、または通常の膀胱感染と同様の症状であり得る。患者が膀胱癌を示し得る症状を有するとき、ＣＴ尿路造影が行われる。ＣＴ尿路造影後、フレキシブルな(flexible)チューブが尿道を介して膀胱に導入される膀胱鏡試験が行われる。該チューブは、疑わしい病変から組織を除去するためのカメラおよびツールを備えている。腫瘍組織が見られるとき、膀胱の切除を行い、腫瘍の全ての痕跡を除去し、複数の生検もまた通常、いわゆるマッピング処理において、粘膜から取り出される。
悪性度１の腫瘍の細胞学診断は困難であり得、今日、これらの場合において、診断精度はわずか約５０％だけである。交絡因子は、例えば炎症を含み得る。
膀胱癌の処置
腫瘍の早期の検出および外科手術は、処置の成功のために非常に重要であり得る。表在性腫瘍は外科的に除去するか、または「刈り取る」ことができるが、侵襲性腫瘍に対して、さらなる根治手術は必要とされることがあり、標準アプローチは、今日、化学療法と共に、またはそれ無しで、根治的膀胱切除術(radical cystectomy)／膀胱の除去である。膀胱癌は、一般的に、局所リンパ節へ転移するが、肺、皮膚、肝臓および骨における遠隔転移は珍しい。
診断時に、通常、非侵襲性膀胱癌に対する治癒的処置であり得る膀胱の経尿道的電気切除術（ＴＵＲ Ｂ）が行われる。しかしながら、再発の高い危険性を有する場合、患者は、点滴処置として化学療法またはカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）を与えられ得る。多病巣性腫瘍または頻繁な再発を有する場合、長期間の膀胱内点滴が考えられ得る。
膀胱のインサイチュの癌は、現在、ＢＣＧ点滴により処置される。腫瘍が処置に応答しないとき、膀胱の全てまたは一部を除去される膀胱切除術が行われ得る。
Ｔ２−Ｔ４ａ期の筋肉侵襲性膀胱癌は、現在、根治的膀胱切除術および小骨盤のリンパ節郭清により処置される。ネオアジュバント化学療法もまた、考慮することができる。スウェーデンにおける現在のプロトコールによると、膀胱切除術後のアジュバント化学療法は、制御された臨床試験に登録される患者のみに推奨される。手術不可能な患者に対して、放射線療法は、恐らく化学療法と組み合わせて、与えられ得る。
予後および処置予測因子
予後診断情報は、腫瘍等級から得ることができる。尿路上皮腫瘍は、ＷＨＯ標準：パピローマ、ＬＭＰ（低い悪性度）、および癌の悪性度１−３にしたがって、５つの等級に分類される。該等級付けは、組織学的基準および細胞形態に基づく。悪性度１において、腫瘍細胞はよく分化しており、主に組織的に成長し、悪性度２において、腫瘍細胞は中程度に分化し、主に組織的でない構造を有し、悪性度３において、腫瘍細胞はあまり分化しない。
尿路上皮腫瘍は、ＴＮＭ病期分類システムにしたがって分類される。ＴＩＳは、インサイチュの腫瘍（または癌）を示す。膀胱のインサイチュの癌は、３つの異なる形態において生じる平らに(flat)少し分化している腫瘍（等級３）である。
原発：他の腫瘍増殖なしで存在するＴＩＳ；
続発：外部寄生の(exophytic)腫瘍の処置後の追跡期間中に発見されるＴＩＳ；または
同時：他の腫瘍増殖と共に存在するＴＩＳ。
Ｔａ期は非侵襲性腫瘍であり、Ｔ１期において、腫瘍は固有層（上皮下結合組織）に侵入している。Ｔ２期において、腫瘍は筋肉に侵入し、Ｔ３期において、腫瘍は膀胱周囲組織に侵入し、Ｔ４期において、腫瘍は他の臓器に侵入する。
約７０％の膀胱癌は、完全に表在性腫瘍または固有層の遙かに遠くの侵入のみのいずれかである（ＴａまたはＴ１期）。これらの腫瘍の局所再発は一般的（５０−７０％の再発率）であり、患者は、通常、早期に何らかの再発を検出するために、膀胱鏡検査が定期的に行われる必要がある。これは、患者に対して多大な不快感を引き起こす高価な処置である。これらの表在性腫瘍は、さらなる侵襲性形態にあまり進行しないが、約１０−１５％が進行する。これらの腫瘍の中、３つの危険なグループが、泌尿器科の欧州協会（ＥＡＵ）により提案されている、すなわち：
低い危険性の腫瘍：ＬＭＰであるか、Ｔａ期かつ悪性度１であるか、またはサイズ３ｃｍ未満であるもの；
中程度の危険性の腫瘍：悪性度１または２のＴａ期、サイズ３ｃｍ以上の腫瘍；および
高い危険性の腫瘍：Ｔａ期かつ悪性度３、Ｔ１期またはＴｉｓ期の腫瘍。
高い危険性の腫瘍は、さらなる侵襲性形態に進行する傾向が高く、高い危険性の腫瘍を有する患者は、低いまたは中程度の危険性の腫瘍を有する患者よりも、より厳密なモニタリングをするべきである。
少なくとも悪性腫瘍ＴａおよびＴ１は、比較的好ましい結果、それぞれ９０および７５％の現在の５年生存率と関連する。さらなる侵襲性腫瘍は、Ｔ２期に対して約６０％およびＴ３期に対して３５％の５年生存率であまり好ましくない予後を有する。転移を有する腫瘍（Ｎ１−４および／またはＭ１）は、さらに悪い予後を有する。
シスプラチンをベースとする化学療法は、単剤処置に対して約３０％および他の薬剤との組合せ処置に対して５０％以上の応答率で、進行した膀胱癌において困難であることが証明されている。しかしながら、長期間の生存は現在低く、１０−１５％のみの患者が最大５年生存し、わずかな分子マーカーが、処置応答の予測において価値があることが証明されている。
要約
本発明者らは、新規バイオマーカーが、膀胱癌の予後および処置予測を進展するために必要とされていることに気づいた。今日、腫瘍が進行している患者において予測することが困難であり、したがって、追跡膀胱鏡検査を予定するとき、低い危険性の患者が、できるだけひどい不快感を回避する、早期に腫瘍進行予測するための方法を見つけることが重要である。また、高い危険性の患者を早期に選択することができるとき、さらなる侵襲性処置レジメンを、これらの患者において使用することができる。
以下は、その局面において本発明により提供される種々の特徴および組合せを提供する目的のために示される、非限定的かつ項目別の本明細書の態様である。
１ 膀胱癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法。
２ 膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後を決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象に対する予後が該参照予後よりも悪いか、または同等であると結論づける
工程を含む方法。
３ 該予後が生存、例えば、全生存、無再発生存または膀胱癌特異的生存である、項目１または２に記載の方法。
４ 生存の可能性が５年、１０年または１５年生存の可能性である、項目３に記載の方法。
５ 膀胱癌を有する対象が膀胱癌の処置レジメンの必要性がないかを決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象は膀胱癌の処置レジメンの必要性がないと結論づける
工程を含む方法。
６ 膀胱癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）膀胱癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
工程を含む方法。
７ 膀胱癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ）該対象を膀胱癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法。
８ 膀胱癌の処置レジメンが、根治的膀胱切除術(radical cystectomy)および／または放射線療法を含む、項目５−７のいずれかに記載の方法。
９ 膀胱癌の処置レジメンが、ネオアジュバントおよび／またはアジュバント化学療法を含む、項目５−８のいずれかに記載の方法。
１０ 膀胱癌の処置レジメンが、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）の投与を含む、項目５−９のいずれかに記載の方法。
１１ 膀胱癌が尿路上皮癌である、項目１−１０のいずれかに記載の方法。
１２ 膀胱癌が扁平上皮癌である、項目１−１１のいずれかに記載の方法。
１３ 膀胱癌がＴａ期またはＴ１期である、項目１−１２のいずれかに記載の方法。
１４ 該サンプルが、該対象由来の細胞、例えば、腫瘍細胞を含む、項目１−１３のいずれかに記載の方法。
１５ 該サンプルが、膀胱組織サンプル、例えば、膀胱腫瘍組織サンプルである、項目１−１４のいずれかに記載の方法。
１６ 工程ａ）の評価が該サンプルの細胞核に限定される、項目１４または１５に記載の方法。
１７ 工程ａ）の評価が該サンプルの腫瘍細胞の核に限定される、項目１６に記載の方法。
１８ 該対象がヒトである、項目１−１７のいずれかに記載の方法。
１９ 該参照値が参照サンプルにおけるあらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質に対応する値である、項目１−１８のいずれかに記載の方法。
２０ サンプル値が核強度の核画分である、項目１−１９のいずれかに記載の方法。
２１ 該参照値が１０−７５％の核画分である、項目２０に記載の方法。
２２ 該参照値が弱い、中程度の、または強い核強度である、項目２０に記載の方法。
２３ 工程ａ）が
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、工程１−２２のいずれかに記載の方法。
２４ 工程ａ）が
ａ１）定量されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
ａ２）非結合アフィニティーリガンドを除去し、
ａ３）サンプルと共に残っているアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含む、工程１−２２のいずれかに記載の方法。
２５ 定量化可能なアフィニティーリガンドが抗体、そのフラグメントおよびその誘導体からなる群から選択される、項目２３または２４に記載の方法。
２６ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：４および５から選択される配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目２５に記載の方法。
２７ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２１以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目２５に記載の方法。
２８ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８、１６、１７、２２、２４、２５および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目２５に記載の方法。
２９ 該定量化可能なアフィニティーリガンドがオリゴヌクレオチド分子である、項目２３または２４に記載の方法。
３０ 定量化可能なアフィニティーリガンドが、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメイン、リポカリン、アンキリン反復ドメイン、セルロース結合ドメイン、γ結晶、緑色蛍光タンパク質、ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４、プロテアーゼ阻害剤、ＰＤＺドメイン、ペプチドアプタマー、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、テンダミスタット、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよびジンクフィンガーからなる群から選択される骨格由来のタンパク質リガンドである、項目２３または２４に記載の方法。
３１ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である、項目２３−３０のいずれかに記載の方法。
３２ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、配列番号：４および５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である、項目２３−３１のいずれかに記載の方法。
３３ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２１以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目２３−３２のいずれかに記載の方法。
３４ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８、１６、１７、２２、２４、２５および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目２３−３３のいずれかに記載の方法。
３５ 該定量化可能なアフィニティーリガンドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目２３−３４のいずれかに記載の方法。
３６ 該定量化可能なアフィニティーリガンドを、該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを使用して検出する、項目２３−３５のいずれかに記載の方法。
３７ 該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である該二次アフィニティーリガンドが、蛍光色素および金属、発色色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性同位体、粒子および量子ドットからなる群から選択される標識を含む、項目３６に記載の方法。
３８ 膀胱癌に対する予後のマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質のエキソビボでの使用。
３９ 該タンパク質が膀胱癌を有する対象由来のサンプルにおいて提供される、項目３８に記載の使用。
４０ 該サンプルが膀胱癌の組織サンプルである、項目３９に記載の使用。
４１ 該マーカーが膀胱癌に対する比較的良好な予後のマーカーである、項目３８−４０のいずれかに記載の使用。
４２ 膀胱癌に対する予後診断薬の選択または精製のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントのエキソビボでの使用。
４３ 膀胱癌に対する予後診断薬の生産のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用。
４４ 該予後診断薬が、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドである、項目４２または４３に記載の使用。
４５ ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含む、項目３８−４４のいずれかに記載の使用。
４６ ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列が
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号：２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなる、項目３８−４４のいずれかに記載の使用。
４７ フラグメントが、５０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：４−１９および２２−２６から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、項目４２−４４のいずれかに記載の抗原的に活性なフラグメントの使用。
４８ フラグメントが２９以下のアミノ酸残基からなる、項目４７に記載の使用。
４９ フラグメントが、２１以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４８に記載の使用。
５０ フラグメントが、２０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８、１６、１７、２２、２４、２５および２６から選択されるアミノ酸配列を含む、項目４９に記載の使用。
５１ フラグメントが、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなる、項目４９または５０に記載の使用。
５２ 膀胱癌に対する予後診断薬としての、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドのエキソビボでの使用。
５３ アフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：４または５からなるペプチド、または、２１以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目５２に記載の使用。
５４ アフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：５からなるペプチド、または、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８、１６、１７、２２、２４、２５および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる、項目５２に記載の使用。
５５ アフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：４または５からなるペプチド、または、２１以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目５２に記載の使用。
５６ アフィニティーリガンドが、アミノ酸配列が配列番号：５からなるペプチド、または、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８、１６、１７、２２、２４、２５および２６から選択されるアミノ酸配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目５２に記載の使用。
５７ ２１以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２−２６から選択される配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
５８ １５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基、例えば、６以下のアミノ酸残基からなる、項目５７に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
５９ 配列番号：２２、２４、２５および２６から選択される配列を含む、項目５７または５８に記載のＲＢＭ３タンパク質フラグメント。
６０ ２１以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２−２６から選択される配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド。
６１ 配列番号：２４または２５のアミノ酸残基からなるＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目６０に記載のアフィニティーリガンド。
６２ １０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２および２６から選択される配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目６０に記載のアフィニティーリガンド。
６３ ６以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２の配列を含む、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である、項目６２に記載のアフィニティーリガンド。
６４ 項目６０−６３のいずれかに記載のポリクローナルまたはモノクローナル抗体。
図１Ａは、尿路上皮癌と診断されたコホートＩにおいてすべての患者、すなわち５９の対象の全生存（ＯＳ）に対するＲＢＭ３発現の影響を示す。患者は、ＲＢＭ３発現に基づく２つのグループに分類された。実線は、低いＲＢＭ３発現、核スコア（ＮＳ）≦３を有する患者を示し、点線は、高いＲＢＭ３発現（ＮＳ＞３）を有する患者を示す。図１Ｂは、早期尿路上皮癌（ＴａまたはＴ１期）を有する患者、すなわち４４の対象の全生存（ＯＳ）を示す。患者は、ＲＢＭ３発現に基づく２つのグループに分類された。実線は、低いＲＢＭ３発現（ＮＳ≦３）を有する患者を示し、点線は、高いＲＢＭ３発現（ＮＳ＞３）を有する患者を示す。
図２は、尿路上皮癌と診断されたコホートＩＩにおいてすべての患者、すなわち９８の対象の全生存（ＯＳ）に対するＲＢＭ３発現の影響を示す。患者は、ＲＢＭ３発現に基づく２つのグループに分類された。実線は、低いＲＢＭ３発現、核スコア（ＮＳ）≦１を有する患者を示し、点線は、高いＲＢＭ３発現（ＮＳ＞１）を有する患者を示す。
図３は、コホートＩＩにおいて患者の全生存（ＯＳ）に対するＲＢＭ３発現の影響を示す。患者は、ＲＢＭ３発現に基づく２つのグループに分類された。実線は、低いＲＢＭ３発現、核スコア（ＮＳ）≦１を有する患者を示し、点線は、高いＲＢＭ３発現（ＮＳ＞１）を有する患者を示す。図３Ａは、Ｔ２期の尿路上皮癌を有する３５の対象における全生存を示す。図３Ｂは、悪性度３の尿路上皮癌を有する５４の対象における全生存を示す。
図４は、左から右に、７Ｆ５、１０Ｆ１、１２Ａ１０、１２Ｃ９、１４Ｄ９および抗−ＲＢＭ３に対するウェスタンブロット結果を示す。したがって、レーン１から５は、モノクローナル抗体を示すが、レーン６はポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体を示す。
図５は、配列番号：４ならびにモノクローナル抗体のエピトープマッピングのために使用されたペプチドのアラインメントを示す。
詳細な説明
したがって、本明細書の第１の局面として、膀胱癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
工程を含む方法を提供する。
膀胱癌状態の指標としてＲＮＡ結合モチーフ３（ＲＢＭ３）レベルに基づく本発明は、多くの利益を有する。当業者により知られているとおり、予後は、種々の理由のために重要であり得る。頻繁に、膀胱癌対象に対する予後は、癌の攻撃性を反映する。一般的に、膀胱癌の攻撃性のレベルの同定は、適当な処置戦略を選択する医師を手助けするため、極めて重要である。例えば、特に癌の侵襲性形態が同定されたとき、通常、避けられる苦痛、または他のあらゆる不快な感覚の処置がどうしても考えられ得る。さらに、あまり侵襲性でない形態が同定することができたとき、過剰な処置を避け得る。
また、進行した期の膀胱癌を有する対象の場合、本明細書の方法により提供されるさらなる予後診断情報は、対象を残り時間中の苦しみから軽減するために、長期生存を望んで侵襲性処置を適用するか、または一時的処置を続けるかを決定する医師（および対象）を導くことができる。ここで、高いＲＢＭ３レベルは、二者のうち前者を選択するであろう。
膀胱癌対象由来のサンプルの形態学的試験において、腫瘍が筋肉組織に侵襲しているか否かを決定することが困難であり得る。すなわち、病理学者に対して、腫瘍がＴＮＭのＴ１またはＴ２期であるか否かを決定することが困難であり得る。このような状況において、本明細書の方法により得られるさらなる予後診断情報は、特に関連し得る。
加えて、発現の特定のレベルが疾患進行の特定のパターンと相関しているマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質は、例えば、予測または予後の作成または処置レジメンの選択のための一団(panel)において大きな可能性を有する。
第１の局面の方法において、膀胱癌対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定することであって、第１のグループの対象が、一般的に、第２のグループの対象よりもより良い予後を有すると決定する。膀胱癌対象の２つのグループへの分配は、対象由来のサンプル値を参照値と比較することにより決定される。種々の参照値は、一般的に比較的に長い期間生存した対象（より上の曲線により示される）と一般的に比較的に短い期間生存した対象（より下の曲線により示される）を区別するために使用され得る。したがって、該参照値は、それぞれのグループのサイズに対する決定因子であり、参照値をより高くすると、第１のグループにおける対象がより少なくなり、試験される対象が第１のグループに属する可能性がより小さくなる。一般的に、サンプル値が減少すると予後は悪化するため、場合によっては、特に乏しい予後を有する対象を同定するために比較的低い参照値が選択され得る。本明細書により導かれると、当業者は、過度の負荷なしに関連参照値を選択し得る。
第１および第２のグループは、試験される対象と同じまたは同様の等級、期および／または型の膀胱癌を有する対象からなり得る。
第１および第２のグループが、試験される対象の膀胱癌と同じ期の膀胱癌を有する対象のみからなり得るとき、予後は期と独立した予後(stage-independent prognosis)である。期と独立した予後は、従来の病期分類から利用できる情報を提供するため、特に興味深い。
第１および第２のグループが、試験される対象の膀胱癌と同じ悪性度の膀胱癌を有する対象のみからなり得るとき、予後は等級と独立した予後(grade-independent prognosis) である。等級と独立した予後は、従来の等級付けから利用できる情報を提供するため、特に興味深い。
さらに、該グループは、同じまたは同様の年齢、人種、性別、遺伝的特性および／または医学的状態または病歴を有する対象のみからなり得る。
結果として、医師は、同様に後の行動に関して十分な情報を得たうえで決定するための手助けとなり得る膀胱癌対象の予後に関してさらなる情報を得るために、第１の局面の方法を使用し得る。
試験される対象の予後はまた、参照予後と比較して決定され得る。したがって、第１の局面の第１の構成として、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後を決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ１）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づけ、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ２）該対象に対する予後が該参照予後よりも悪いか、または同等であると結論づける
工程を含む方法を提供する。
同じ概念により密接に関連しており、覆われているが、ｃ１）およびｃ２）は、２つのいずれかの結論を提供する。
同様に、第１の局面の第２の構成として、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後よりも良いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）において得られたサンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づける
工程を含む方法を提供する。
第１の局面の第３の構成として、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後が参照予後以上に悪いか否かを決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）において得られたサンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ）該対象に対する予後が該参照予後よりも悪いか、または同等であると結論づける
工程を含む方法を提供するということになる。
本発明の概念は、また、特定の処置レジメンを控えることを決定するための基準を形成し得る。
例えば、図面に示されているとおり、高いＲＢＭ３レベルを示す対象に対する予後は、低いＲＢＭ３レベルを示す対象に対する予後よりも一般的に良い。本明細書の教示で提供されるとおり、医師は、ＲＢＭ３の高い対象の予後を、特定の処置レジメンを避け、侵襲性でない処置レジメンを代わりに選択することが好ましいと考えられ得る。したがって、根治的膀胱切除術または放射線療法は、対象が低いＲＢＭ３であるときのみ選択され得る。他の場合、決定は、対象が高いＲＢＭ３であるとき、任意のアジュバント療法を控えることであり得る。別の例として、単剤療法を併用療法の代わりに選択し得、または治療剤を、対象が高いＲＢＭ３値を示すとき、より少ない用量で与えられ得る。
結論として、本明細書は、対象を過剰処置から軽減し得る。
したがって、第１の局面の第４の構成として、膀胱癌を有する対象が膀胱癌の処置レジメンの必要性がないかを決定する方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象は膀胱癌の処置レジメンの必要性がないと結論づける
工程を含む方法を提供する。
さらに、第１の局面の第５の構成として、膀胱癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）膀胱癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
工程を含む方法を提供する。
例えば、第５の構成の工程ｃ）は、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１週、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも３月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも６月、例えば、工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも１年、例えば、少なくとも工程ａ）−ｂ）の完了から少なくとも２年の間、処置レジメンを控えることであり得る。
あるいは、工程ｃ）の控えることは、該方法が行われる次のとき、または膀胱癌の再発まで処置を控えることであり得る。
第１の局面の別の構成として、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後を確立するための方法であって、
ａ）対象由来のサンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３タンパク質の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）工程ａ）のサンプル値を対象に対する予後と相関させる
工程を含む方法を提供する。
本明細書の文脈において、「予後を確立する」は、特異的予後または予後間隔を確立することを示す。
別の構成の態様において、サンプルは早期に得られたサンプルであり得る。
工程ｂ）の相関は、対象に対する予後を確立するように、得られたサンプル値と生存データを関連づけるあらゆる方法を示す。
本明細書において、種々の予後に対応する異なるＲＢＭ３値（サンプル値）を与える。一般的に、低いサンプル値は高いサンプル値よりも乏しい予後と関連する。第１の局面の第３の構成の方法において、サンプル値を参照値と比較して、サンプル値が参照値以下であるとき、対象に対する予後が参照値と関連する参照予後以下の悪さであると結論づける。
結果として、上記方法は参照値に適合させ得る。このような場合、状況が関連すると考えられる下でサンプル値から出発し、サンプル値と同等である参照値が選択され得る。次に、参照予後を、参照値が確立され得ることと関連させる。本明細書に導かれると、当業者は、所定の参照値に対応する参照予後を確立する方法を理解できる。例えば、癌患者の関連グループにおけるサンプル値と生存データ間の関係を以下の実施例に記載されているものしたがって試験され得る。本明細書に記載されている処理は、所定の参照値に適合させ得る。次に、所定の参照値に対応する予後は、参照予後として選択され得る。
また、上記方法は、所定の参照予後に適合させ得る。このような場合、状況が、例えば、適当な治療を選択するために関連すると考えられる下で参照予後から出発し、対応する参照値が確立され得る。本明細書に導かれると、当業者は、所定の参照予後に対応する参照値を確立する方法を理解できる。例えば、例えば、癌患者のグループにおけるサンプル値と生存データ間の関係を以下の実施例のとおりに試験され得るが、本明細書に記載されている処理は、所定の参照予後に対応する参照値を確立することに適合させ得る。例えば、所定の参照予後と相関関係であるものが見出されるまで、異なる参照値が試験され得る。
上記論理は、第１の局面の他の構成に変更すべきところは変更して適用する。
したがって、第１の局面の構成の参照予後は、例えば、対象の関連集団の試験により得られる以前に確立されている予後に基づき得る。このような参照集団は、試験される対象の年齢、性別、人種、膀胱癌期、膀胱癌型および／または医学的状態および病歴が合うように選択され得る。さらに、予後は、一般的な集団における背景リスク、統計的予後／危険性、または対象の試験に基づく仮定に適合させ得る。このような試験は、また、対象の年齢、性別、人種、膀胱癌期、膀胱癌型および／または医学的状態および病歴を含み得る。したがって、医師は、例えば、参照予後を、対象の膀胱癌歴、腫瘍の型および／または期、腫瘍の形態、腫瘍の位置、転移の存在および広がりおよび／またはさらなる癌の特性に適合させ得る。
一般的に、膀胱癌を有する患者に対する適当な処置戦略を決定するとき、処置に関与する医師は、いくつかのパラメーター、例えば、免疫組織化学的評価の結果、患者年齢、腫瘍型、期および等級、全身状態および病歴、例えば、膀胱癌歴を考慮し得る。決定に導くために、該医師は、第１の局面にしたがって、ＲＢＭ３試験を実施するか、または実施されるＲＢＭ３試験を指示し得る。さらに、医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
本発明の概念は、また、種々の処置レジメンを提供するための基準を形成し得る。
例えば、図面において示されているとおり、低いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後は、高いＲＢＭ３タンパク質レベルを示す対象に対する予後よりも一般的に悪い。本明細書の教示で提供されるとおり、したがって、医師は、ＲＢＭ３タンパク質の低い対象の予後を、特定の処置レジメンが適当であることが乏しいと考え得る。したがって、本明細書は、以前に処置されていないグループの正確な処置のために提供され得る。
本明細書の第２の局面として、したがって、膀胱癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
ｃ）該対象を膀胱癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
１つの態様にしたがって、該方法は
ｄ）該サンプル値が該参照値よりも高いとき、膀胱癌の処置レジメンで該対象を処置することを控える
さらなる工程を含み得る。
第２の局面の方法の１つの態様において、工程ｂ）の参照値は参照予後と関連し得、工程ｃ）の該処置レジメンは参照予後以下の悪い予後に適合させ得る。このような態様において、方法は、ｄ）該サンプル値が該参照値よりも高いとき、該対象を参照予後よりも良い予後に適している処置レジメンで処置し、適当な処置レジメンが処置をしないことであり得る、さらなる工程を含み得る。
第２の局面の処置に関与する医師は、工程ｃ）および所望によりｂ）を医師自身で実施するが、工程ａ）および所望により工程ｂ）を実施することを他の誰か、例えば、研究員に割り当ててもよい。
さらに、工程ａ）およびｂ）の結果は、第２の局面の処置の方法が開始されるとき、目前であり得る。
したがって、方法は、対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量に対応するサンプル値があらかじめ決められた参照値以下であるとき、膀胱癌を有する対象に膀胱癌の処置レジメンを適用し得る。
処置の方法は、意思決定および処置に限定され得る。したがって、第２の局面の構成として、膀胱癌を有する対象の処置の方法であって、
α）対象由来のサンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質のレベルに対応するサンプル値を参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値以下であるとき、
β）該対象をアジュバント膀胱癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
対象由来のサンプルにおけるＲＢＭ３のレベルに対応するサンプル値を得る多数の方法が、本明細書に記載されている。
対象は、アジュバント療法が、通常、余分な不必要な苦痛と考えられる進行した期における膀胱癌を有し得る。しかしながら、このような場合において、医師は、問題の対象が高いＲＢＭ３タンパク質値によって長期生存の可能性が高いとき、アジュバント療法を適用することをどうしても決定し得る。
したがって、第２の局面の構成として、進行した期、例えば、ＴＮＭ期Ｔ３またはＴ４の膀胱癌を有する対象の処置の方法であって、
ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
ｃ）該対象を長期生存のためのアジュバント膀胱癌の処置レジメンで処置する
工程を含む方法を提供する。
さらに、該サンプル値が該参照値以下であるとき、対象は、一時的処置のみで処置され得る。
本明細書の文脈において、「ＲＢＭ３のレベル」は、ＲＢＭ３タンパク質のレベルまたはＲＢＭ３ ｍＲＮＡのレベルを示す。特定の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質発現のレベルは、いつも、相互関係しない。しかしながら、本発明者らは、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のレベルが種々の組織におけるＲＢＭ３遺伝子と相互関係することを知っている。以下の実施例において、ＲＢＭ３タンパク質発現を測定する。したがって、好ましい態様において、「ＲＢＭ３」はＲＢＭ３タンパク質を示す。
当業者は、タンパク質が関連遺伝子によってコードされ、発現の関連パターンを示す限り、上記局面の方法の有用性が問題の対象に存在するＲＢＭ３タンパク質またはＲＢＭ３ｍＲＮＡの任意の特定の変異体の定量化に限定されないことを認識すべきである。
非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含み得る。
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
別の非限定的な例として、ＲＢＭ３タンパク質は、
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号：２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
いくつかの態様において、上記配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
本明細書の文脈において使用される「％同一」なる用語は、以下のとおりに計算される。質問(query)配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ アルゴリズム（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を使用して、標的配列にアラインされる。それぞれの位置でアミノ酸残基を比較し、標的配列において同一一致を有する質問配列における位置のパーセントを％同一として報告する。また、標的配列は、比較される位置の数を決定する。結果として、本明細書の文脈において、標的配列よりも短い質問配列は、標的配列と１００％同一であり得ない。例えば、８５個のアミノ酸残基の質問配列は、１００個のアミノ酸残基の標的配列と最大で８５％同一であり得る。
本明細書の方法の工程ａ）に関して、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、一般的に、サンプル値の増加をもたらし、反対にはならない。しかしながら、いくつかの態様において、評価された量は、別々のサンプル値の任意のあらかじめ決められた数のいずれかに対応し得る。このような態様において、第１の量および第２の増加した量は、同じサンプル値に対応し得る。とにかく、ＲＢＭ３タンパク質の量の増加は、本明細書の文脈においてサンプル値の減少をもたらさない。
しかしながら、不便なことに、同等の様式において、工程ｂ）とｃ）間の制限が逆であるとき、評価された量はサンプル値と逆に関連し得る。例えば、例えば、句「サンプル値が参照値よりも高いとき」が「サンプル値が参照値よりも低いとき」と置き換えられると、工程ｂ）とｃ）間の制限は逆になる。
本明細書の文脈において、「予後」は、疾患の経過または結果およびその処置の予測を示す。例えば、予後は、また、疾患からの生存率または回復率の決定、ならびに対象の予期される生存時間の予測を示し得る。予後は、具体的に、将来の期間、例えば、３年、５年、１０年または他のあらゆる期間の対象の生存の可能性を確立することを含み得る。さらに、予後は、単一の値または広範な値により示され得る。
さらに、本明細書の方法の文脈において、「早期に得られた」は、該方法が実施される前に得られることを示す。結果として、対象由来の早期に得られたサンプルが方法において使用されるとき、該方法は対象由来のサンプルを得ることを含まない、すなわち、該サンプルは該方法から離れている工程において該対象からあらかじめ得た。
処置の方法を除いて、本明細書の方法および使用は、他に記載のない限り、完全にエキソビボで実施され得る。
さらに、本明細書の文脈において、「膀胱癌を有する哺乳動物対象」は、原発性膀胱腫瘍を有する哺乳動物対象または原発性膀胱腫瘍を除去されている哺乳動物対象を示し、腫瘍の除去は手術または治療のあらゆる適当な型により腫瘍を根絶されることを示す。本明細書の方法および使用局面において、「膀胱癌を有する哺乳動物対象」はまた、哺乳動物対象が哺乳動物対象が使用または方法の実施時に膀胱癌を有することが疑われ、膀胱癌診断が後に確立される場合を含む。
さらに、本明細書の文脈において、「あらかじめ決められた参照値」は、対象に対する予後または適当な処置戦略に関して、決定の作成または結論の引き出しに関連することが見出されているあらかじめ決められた値を示す。
また、本明細書の文脈において、参照予後と「関連する」参照値は、経験的データおよび／または臨床的に関連した仮定に基づいて対応する参照予後に割り当てられる参照値を示す。例えば、参照値は、対象の関連グループにおける平均ＲＢＭ３タンパク質値であり得、参照予後は同じグループにおける平均生存であり得る。さらに、参照値は、参照値を示す対象のグループの予後データに直接由来する参照予後に割り当てなくてもよい。参照予後は、例えば、参照値以下を示す対象に対する予後に対応し得る。すなわち、参照値が０から２の尺度で１であるとき、参照予後は値０または１を示す対象の予後であり得る。結果として、参照予後は、また、利用できるデータの性質に適合され得る。さらに上記されているとおり、参照予後は同様に他のパラメーターにさらに適合し得る。
上記局面の方法の工程ａ）は、サンプルの少なくとも一部に存在するＲＢＭ３の量を評価すること、および該量に対応するサンプル値を決定することを含む。「サンプルの少なくとも一部」は、適当な処置に関して、予後の確立または結論の引き出しのためのサンプルの関連部分を示す。当業者は、方法を実施するときに、環境下で関連するどの部分が存在するか理解している。例えば、細胞を含むサンプルを評価するとき、当業者は、サンプルの腫瘍細胞または腫瘍細胞の核のみを考えてもよい。
さらに、工程ａ）において、量が評価され、量に対応するサンプル値が決定される。結果として、ＲＢＭ３の量の正確な測定は、サンプル値を得るために必要でない。例えば、ＲＢＭ３の量は、調製され染色された組織サンプルの目視検査により評価され得、次に、サンプル値は、例えば、評価された量に基づいて高いまたは低いとして分類され得る。
当業者は、工程ａ）の評価および決定は、対象から得られるサンプルの何らかのプロセスまたは操作を必要とすることを理解している。単なる検査によりサンプル値を決定することが可能でない。このような評価および決定のためにいくつかが以下に挙げられている種々の技術は、当業者によく知られている。したがって、本明細書の方法は、工程ａ）の実施のために何ら特定の技術に限定されない。
本明細書の処置レジメンは、手術、例えば、根治的膀胱切除術を含み得るか、またはそれからなる。
さらに、本明細書の処置レジメンは、アジュバントおよび／またはネオアジュバント療法であり得る。このような処置レジメンは、例えば、化学療法および／またはカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）の投与を含むか、またはそれからなり得る。化学療法の例は、エピルビシン、ゲムシタビンおよび／またはマイトマイシンの適用である。化学療法の他の例は、白金を用いた処置、例えば、カルボプラチン、パラプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチンまたはシスプラチンの適用である。適用され得る化学療法のさらに他の例は、ドセタキセル、メトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、チオテパ、バルルビシンおよびビンフルニンである。
シスプラチンは、例えば、メトトレキサート、ビンブラスチンおよび／またはドキソルビシンと組み合わせて適用され得る。これらの薬剤（ときどきＭＶＡＣと称される）の全ての組合せは、重度の副作用と通常関連するが、（乏しい予後の）進行した疾患の場合において適用され得る。シスプラチンはまた、ゲムシタビンと組み合わせて適用され得る。ゲムシタビンはまた、特に対象がシスプラチンに不寛容であるとき、カルボプラチンと組み合わせて適用され得る。
さらに、処置レジメンは、生物学的治療、例えば、インターロイキン２、ソラフェニブ、スニチニブまたはラパチニブの適用を含み得る。生物学的処置は、化学療法と組み合わされ得る。
処置レジメンはまた、放射線療法を含むか、またはそれからなり得る。化学療法および／または生物学的治療は、放射線療法の前または後に実施され得る。
対象が早期膀胱癌と診断されるとき、処置に関与する医師が、膀胱切除術を適用するか否かを決定することが困難であり得る。図１ｂに示されるとおり、比較的乏しい予後を有する早期膀胱癌対象のグループは、本明細書の方法で同定され得る。このような乏しい予後を有する対象は、膀胱切除術に適していると考えられるが、これらの癌は早期である。言い換えれば、本願発明の方法は、早期膀胱癌、例えば、ＴＮＭのＴａまたはＴ１期の癌を有する対象に特に関連し得る。
さらに、医師が、Ｔ２期の膀胱癌を有する対象にネオアジュバント化学療法を適用するか否かを決定することが困難であり得る。このような場合、低いＲＢＭ３値は、ネオアジュバント化学療法を適用することを医師に助言することができ、高いＲＢＭ３値は、このような処置を控えることを医師に助言することができる。したがって、ＲＢＭ３が低いＴ２Ｎ０膀胱癌対象は、かかる期の癌を有する対象は通常、このような処置を受けないがネオアジュバント療法を受け得る。したがって、本明細書のいくつかの態様において、膀胱癌はＴ２期である。
本明細書の態様において、予後は生存の可能性であり得、「生存」を測定するためにいくつかの方法がある。本明細書の生存は、例えば、全生存（図、参照）、無再発生存または膀胱癌特異的生存（当業者はこれらの用語を知っている）であり得る。さらに、「生存」は、異なる期間、例えば、５、１０または１５年にわたって測定され得る。したがって、生存は、５年、１０年または１５年生存であり得る。当業者は、参照予後が使用されるとき、対象に対する予後と同じ型であると理解している。
上記局面の方法の態様において、サンプルは体液サンプルであり得る。例えば、体液サンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、リンパ液、精液および滲出液からなる群から選択され得る。あるいは、サンプルは、細胞学的サンプルまたは糞便サンプルであり得る。
ＲＢＭ３タンパク質発現のレベルは、好ましくは、細胞内的に測定され得る。したがって、体液、細胞学的または糞便サンプルは、例えば、細胞、例えば、腫瘍細胞を含み得る。
さらなる上記局面の方法の態様において、サンプルは、例えば、生検または外科的に除去された試料由来の、組織サンプル、例えば、膀胱組織サンプル、例えば、膀胱腫瘍組織サンプルであり得る。したがって、膀胱の経尿道的電気切除術後に、サンプルは得られ、本発明の方法が行われ得る。
ＲＢＭ３タンパク質は、核および細胞質の両方において見られる。しかしながら、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質の核発現が、予後を決定すること、または処置を選択することに特に関連することについて述べている（図参照）。したがって、工程ａ）の評価は、該サンプルの細胞、例えば、腫瘍細胞の核に限定され得る。結果として、組織サンプルが試験されるとき、腫瘍細胞の核のみが考慮され得る。このような試験は、例えば、免疫組織化学的染色により補助され得る。
以下の実施例における組織サンプルは、男性および女性のヒト由来であり、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質発現が、対象の性別から独立して予後的に関連していることを見出した。したがって、上記局面の方法の対象はヒトであり得、さらに、上記局面の方法の対象は男性または女性であり得る。
参照値よりも高いＲＢＭ３のサンプル値、またはこのようなサンプル値が得られる対象は、ときどき本明細書において「高いＲＢＭ３」であると称される。さらに、参照値以下であるＲＢＭ３のサンプル値、またはこのようなサンプル値が得られる対象は、ときどき本明細書において「低いＲＢＭ３」であると称される。
本明細書の文脈において、「サンプル値」および「参照値」なる用語は、広く解釈するべきである。これらの値を得るためのＲＢＭ３の定量化は、自動方法を介して、サンプルの視覚的または顕微鏡的検査に基づく採点システムを介して、またはそれらの組合せを介して行われ得る。しかしながら、また、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現のために調製され染色された組織スライドの検査によりサンプルおよび参照値を決定することが、当業者、例えば、組織病理学的の当業者に可能である。
したがって、サンプル値が参照値よりも高いことの決定は、サンプル組織スライドが参照組織スライドよりも、より密に染色されていること、および／または染色された細胞のより大きな画分を示すことの視覚的または顕微鏡的検査で決定され得る。サンプル値はまた、文献参照により得られる参照値、例えば、言葉において記載されている、または参照図による参照値と比較され得る。結果として、サンプルおよび／または参照値は、いくつかの場合において、当業者が検査および比較時に決定する精神的な(mental)値であり得る。
本明細書の方法の１つ以上の工程は、装置において実行し得る。例えば、工程ａ）および所望により工程ｂ）は、自動分析装置において実施され得、このような装置は、免疫組織化学的分析のために適合させた基盤に基づき得る。一例として、問題の対象由来の１つ以上の腫瘍組織サンプルは、免疫組織化学的な分析のために手動的に調製され、次に工程ａ）のサンプル値を与え、また所望により工程ｂ）の参照値との比較を行う自動分析装置に負荷され得る。次に、分析を実施するオペレーター、分析を指示する医師または装置それ自体は、工程ｃ）の結論を引き出し得る。結果として、工程ｃ）の結論を引き出すために適合させたソフトウェアは、装置を実行させ得る。
対象由来のサンプル値との比較としての使用のための、膀胱癌対象に関する予後の確立または処置決定の作成に関連する参照値は、種々の方法において提供され得る。本明細書の教示の知識で、当業者は、過度の負荷を強いることなく、本明細書の方法を実施するための関連参照値を提供することができる。
上記局面の方法を実施する者は、例えば、参照値を所望の情報に適合させ得る。例えば、参照値は、非常に重要な予後診断情報、例えば、第１の局面の第１および第２のグループ間の生存の最も大きな違いに対応する、ＲＢＭ３が高い生存曲線とＲＢＭ３が低い生存曲線間の最も大きな分離（図面、参照）を得るために適合され得る。あるいは、参照値は、特に良い予後または特に不良な予後を有する対象のグループを選ぶように選択され得る。
上記局面の方法の態様において、参照値は、方法の対象の健常組織におけるＲＢＭ３の量に対応し得る。別の例として、参照値は、別の比較できる対象由来の正常組織の標準サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３の量により提供され得る。別の例として、参照値は、腫瘍細胞を含む参照サンプル、例えば、膀胱腫瘍組織の参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３の量により提供され得る。参照サンプルのタンパク質発現の量は、好ましくは以前に確立されていてもよい。結果として、該参照値は、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３を発現する細胞を含む参照サンプルにおいて測定されるＲＢＭ３の量により提供され得る。
さらに、参照値は、例えば、あらかじめ決められた、または制御されたＲＢＭ３タンパク質の量を発現する細胞株、例えば、癌細胞株を含む参照サンプルにおいて測定されたＲＢＭ３タンパク質の量により提供され得る。当業者は、例えば、Rhodesら (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により導かれて、このような細胞株を提供する方法を理解している。
結果として、本明細書の方法の態様において、参照値は、参照サンプルにおけるＲＢＭ３の量に対応するあらかじめ決められた値であり得る。
しかしながら、以下にさらに記載されているとおり、参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質の量は、参照値に直接対応しなくてもよい。参照サンプルは、また、種々の参照値を評価するための方法を実施する者を手助けするＲＢＭ３タンパク質の量を提供し得る。例えば、該参照サンプルは、「陽性」参照値および／または「陰性」参照値を提供することにより、参照値の心像(mental image)の創造において手助けとなり得る。
サンプル、例えば、対象由来の早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、特定のレベルを越えるＲＢＭ３タンパク質発現を示すサンプルにおける細胞の画分の決定である。画分は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞画分」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質画分」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核画分」であり得る。核画分は、例えば、関連細胞集団の免疫反応細胞が＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５として分類され得る。「核画分」は、核において陽性染色を示すサンプルにおける関連細胞のパーセントに対応し、核における中位の、またははっきりとしたおよび強い免疫反応は陽性と考え、核における存在しない、またはわずかな免疫反応は陰性と考える。病理学的の当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて核画分を決定し得る。関連細胞は、例えば、腫瘍細胞であり得る。さらに、当業者は、「細胞質画分」または「細胞画分」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
サンプル、例えば、対象から早期に得られたサンプルまたは参照サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質発現の定量化のための別の方法は、サンプルの全染色強度の決定である。強度は、例えば、全細胞のＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞強度」、細胞の細胞質のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「細胞質強度」、または細胞の核のみのＲＢＭ３タンパク質発現が考慮される「核強度」であり得る。核強度は、臨床的組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価される。核強度決定の結果は、存在しない＝サンプルの関連細胞の核において全免疫反応がない、弱い＝サンプルの関連細胞の核においてわずかな全免疫反応、中程度＝サンプルの関連細胞の核において中位の全免疫反応、または強い＝サンプルの関連細胞の核においてはっきりとしたおよび強い全免疫反応として分類され得る。当業者は、方法を実施するとき、条件と関連するどの細胞が存在するか理解しており、一般知識および本明細書の教示に基づいて核強度を決定し得る。関連細胞は、例えば、腫瘍細胞であり得る。さらに、当業者は、「細胞質強度」または「細胞強度」を使用して対応する測定を実施する方法を理解している。
本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質の核発現が予後の確立と特に関連することを見出した。
したがって、上記局面の方法の態様において、参照値は、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。したがって、サンプル値は、核画分、核強度またはそれらの組合せであり得る。
したがって、上記局面の方法の態様において、工程ｂ）の参照値は、９５％以下、例えば、９０％以下、例えば、８５％以下、例えば、８０％以下、例えば、７５％以下、例えば、７０％以下、例えば、６５％以下、例えば、６０％以下、例えば、５５％以下、例えば、５０％以下、例えば、４５％以下、例えば、４０％以下、例えば、３５％以下、例えば、３０％以下、例えば、２５％以下、例えば、２０％以下、例えば、１５％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、例えば、２％以下、例えば、１％以下、例えば、０％の核画分である。
さらに、上記局面の方法の態様において、工程ｂ）の参照値は、ＲＢＭ３タンパク質発現の中程度の核強度またはそれ未満、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現の弱い核強度またはそれ未満、例えば、ＲＢＭ３タンパク質発現の存在しない核強度であり得る。
また、上記局面の方法の態様において、参照値は、画分値および強度値の組合せまたは相関関係であり得る。したがって、参照値は、２つ以上の基準でさえ含み得る。
一般的に、参照値としての強度値および／または画分値の選択は、染色処理、例えば、使用される抗体の型および量／濃度ならびに染色試薬の型および濃度に依存し得る。
本明細書により導かれると、当業者、例えば、病理学者は、画分、例えば、細胞、細胞質または核画分、または、強度、例えば、細胞、細胞質または核強度を得て、評価を行う方法を理解している。例えば、当業者は、特定の画分または強度の外観を確立するために、あらかじめ決められた量のＲＢＭ３タンパク質を含む参照サンプルを使用し得る。
しかしながら、参照サンプルは、実際の参照値の提供のために使用されるだけでなく、参照値に対応する量より高いＲＢＭ３の量を有するサンプルの例の提供のためにもまた使用され得る。一例として、組織化学的染色において、例えば、免疫組織化学的染色において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有する染色されたサンプルの外観を確立するための参照サンプル、例えば、陽性参照を使用し得る。次に、当業者は、より少ない量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観、例えば、参照値に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有するサンプルの外観を評価し得る。言い換えれば、当業者は、参照サンプルを使用して、参照サンプルのＲＢＭ３タンパク質の量よりも少ないＲＢＭ３タンパク質の量に対応する参照値の心像を創造し得る。あるいは、または相補的に、このような評価において、当業者は、このようなサンプルの外観を確立するために少量のＲＢＭ３タンパク質を有する、または検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている別の参照サンプル、例えば、「陰性参照」を使用し得る。
例えば、中程度の核強度が参照値として使用されるとき、以下の２つの参照サンプルを使用し得る。検出可能なＲＢＭ３タンパク質を有さず、したがって、参照値よりも低い、存在しない核強度に対応する第１の参照サンプル、および、参照値よりも高く、強い核強度に対応するＲＢＭ３タンパク質の量を有する第２の参照サンプル。
結果として、評価において、当業者は、高い量のＲＢＭ３タンパク質を有するサンプルの外観を確立するために参照サンプルを使用し得る。このような参照サンプルは、高い量のＲＢＭ３タンパク質を発現する組織を含むサンプル、例えば、以前に確立されている高い発現のＲＢＭ３タンパク質を有する膀胱癌組織を含むサンプルであり得る。
したがって、参照サンプルは、強い核強度（ＮＩ）の一例を提供し得る。強いＮＩを有するサンプルの外観が分かると、次に当業者はサンプルをＮＩカテゴリー、存在しない、弱い、中程度および強いに分け得る。この分配は、さらに、検出可能なＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、存在しない核強度を提供する参照サンプルにより補助され得る。また、参照サンプルは、７５％以上の核画分（ＮＦ）を有するサンプルの一例を提供し得る。７５％以上の陽性細胞を有するサンプルの外観が分かると、次に、当業者は、例えば、より低いパーセントの陽性細胞を有する他のサンプルのＮＦを評価し得る。この分配は、さらに、本質的にＲＢＭ３タンパク質を欠いている参照サンプル（陰性参照）、すなわち、低いＮＦ（例えば、＜５％、例えば、＜２％）、または０のＮＦを提供する参照サンプルにより補助され得る。
上記のとおり、制御された量のＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞株は、参照、特に陽性参照として使用され得る。
１つ以上の図(picture)は、また、「参照サンプル」として提供され得る。例えば、このような図は、特定の条件で特定の抗体で染色され、特定の核強度および／または画分を示す腫瘍組織スライドの一例を示し得る。「参照サンプル」に対する上記載は、図に変更すべきところは変更して適用する。
いくつかの態様において、上記局面の方法の工程ａ）は、対象由来の生物学的材料を得て、生物学的材料の関連部分を切除または選択し、該サンプルを得て、所望によりサンプルを固相上に配置し、工程ａ）の評価を容易にすることを含み得る。工程ａ）は、したがって、一例として、対象由来の膀胱腫瘍組織材料を得て、所望によりパラフィンまたはホルマリンにおいて組織材料を固定し、該組織材料を組織処理し、該サンプルを構成する切片を得て、所望により透明なスライド、例えば、顕微鏡のスライドガラス上に該サンプルを置くことを含み得る。
上記局面の方法の態様において、ＲＢＭ３タンパク質は、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である検出可能および／または定量化可能なアフィニティーリガンドのサンプルへの適用を介して、検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドの適用は、サンプルにおけるＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施される。
具体化するために、上記局面の方法の態様において、工程ａ）は
ａ１）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａ２）非結合アフィニティーリガンドを除去し、
ａ３）該サンプルと共に残っているアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
「サンプルと共に残っているアフィニティーリガンド」は、工程ａ２）において除去されなかったアフィニティーリガンド、例えば、サンプルへ結合したアフィニティーリガンドを示す。ここで、結合は、例えば、抗体と抗原間の相互作用であり得る。
しかしながら、いくつかの態様において、ａ２）の非結合アフィニティーリガンドの除去、例えば、洗浄は、いつも必要ではない。したがって、上記局面の方法のいくつかの態様において、工程ａ）は
ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は該サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質への該アフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施され、
ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーを定量し、該量を評価する
ことを含み得る。
本明細書の文脈において、例えば、その標的または抗原とアフィニティーリガンドの、「特異的」または「選択的」相互作用は、相互作用が、特異的と非特異的、または選択的と非選択的の相互作用間の区別が意味を成すということであることを意味する。２つのタンパク質間の相互作用は、ときどき、解離定数により測定される。解離定数は、２つの分子間の結合（またはアフィニティー）の強度を示す。一般的に、抗体とその抗原間の解離定数は、１０−７から１０−１１Ｍである。しかしながら、高い特異性／選択性は、必ずしも高いアフィニティーを必要としない。その対応物に対して低いアフィニティー（モル範囲において）を有する分子は、さらに高いアフィニティーを有する分子と同程度の選択的／特異的を示している。本明細書の場合において、特異的または選択的相互作用は、特定の方法が、組織サンプルまたは天然の、または処理された生物学的液体の液体サンプルにおける他のタンパク質の存在における所定の条件下で特異的タンパク質、標的タンパク質の存在および／または量を決定するために使用することができる程度を示す。言い換えれば、特異性または選択性は、関連タンパク質間で区別する能力である。例えば、抗体の特異性または選択性は、以下の実施例の部２において決定され、分析は、それぞれタンパク質アレイ設定、懸濁液ビーズアッセイおよび多重競合アッセイを使用して実施され得る。特異性および選択性決定は、また、Nilsson Pら (2005) Proteomics 5:4327-4337に記載されている。
適当なアフィニティーリガンドを選択または製造する、および検出および／または定量化のための適当な形式および条件を選択することは、当業者の能力の範囲内と考えられる。それにもかかわらず、有用であることが認められ得るアフィニティーリガンドの例、ならびに検出および／または定量化のための形式および条件の例は、説明のために以下に挙げられている。
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、抗体、そのフラグメントおよびその誘導体、すなわち、免疫グロブリン骨格に基づくアフィニティーリガンドからなる群から選択され得る。抗体およびそのフラグメントまたは誘導体は単離され得る。抗体は、マウス、ウサギ、ヒトおよび他の抗体、ならびに異なる種由来の配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的ヒト化抗体、例えば、部分的ヒト化マウス抗体を含む、あらゆる起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体は、選択した抗原で動物の免疫化により生産される。ポリクローナル抗体は精製された抗原であり得る。定義された特異性のモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (Koehler G and Milstein C (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519)により開発されたハイブリドーマ技術を使用して生産することができる。本明細書の抗体フラグメントおよび誘導体は、フラグメントまたは誘導体である抗体と同じ抗原（例えば、ＲＢＭ３タンパク質）と選択的相互作用が可能である。抗体フラグメントおよび誘導体は、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）からなるＦａｂフラグメント；２つの可変抗体ドメインＶＨおよびＶＬからなるＦｖフラグメント(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)；フレキシブルなペプチドリンカーにより一緒に連結された２つのＶＨおよびＶＬドメインからなる一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）(Bird RE and Walker BW (1991) Trends Biotechnol. 9:132-137)；ベンズ・ジョーンズ(Bence Jones)ダイマー(Stevens FJら (1991) Biochemistry 30:6803-6805)；ラクダ重鎖ダイマー(Hamers-Casterman Cら (1993) Nature 363:446-448)および単一可変ドメイン(Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:6280-6285; Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:893-896)、および単一ドメイン骨格、例えば、テンジクザメ由来の新規抗原受容体（ＮＡＲ）(Dooley Hら (2003) Mol. Immunol. 40:25-33)および可変重鎖ドメインに基づくミニボディー（minibody）(Skerra A and Pluckthun A (1988) Science 240:1038-1041)を含む。
いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である。配列番号：１のＲＢＭ３フラグメントは、成熟型タンパク質において開裂されるため、大腸菌において効率的な発現を保証するために膜貫通領域を欠くように、任意のシグナルペプチドを欠くように設計された。したがって、配列番号：１は、免疫化のために設計された。加えて、タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い配列同一性を有するユニークな(unique)配列からなり、産生されたアフィニティー試薬の交差反応性を最小限にし、立体構造エピトープの形成やさらには細菌系における効率的なクローニングおよび発現を可能にするのに適当なサイズであるように設計された。したがって、アフィニティーリガンドが抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体である場合において、アフィニティーリガンドは、アミノ酸配列が配列番号：１の配列からなるペプチドで動物を免疫化する工程を含むプロセスにより得ることができる。例えば、免疫化処理は、フロイント完全アジュバント中のタンパク質での一次免疫化を含み得る。また、免疫化処理は、さらに、２−６週間の間隔をおいてフロイント不完全アジュバント中のタンパク質で少なくとも２回の追加免役を含み得る。所定の標的に対する抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体の生産の工程は、当分野で知られている。
本明細書の文脈において、「抗原で精製された抗体(antigen purified antibody)」は、それ自体の抗原におけるアフィニティー精製され、それにより、他の抗血清タンパク質および非特異的抗体からこのような抗原で精製された抗体を分離されたポリクローナル抗体の１つまたは集団である。このアフィニティー精製は、その抗原に選択的に結合する抗体をもたらす。本明細書の場合において、ポリクローナル抗血清は、２工程免疫アフィニティーに基づくプロトコールにより精製され、標的タンパク質に対して選択的な抗原で精製された抗体を得る。抗原フラグメントの一般的なアフィニティータグに対する抗体は、捕獲剤として固定されたタグタンパク質を使用する第１の枯渇工程において除去される。第１の枯渇工程後、血清を捕獲剤として抗原を有する第２のアフィニティーカラムに負荷し、抗原に対して特異的な抗体を豊富にする（Nilsson Pら (2005) Proteomics 5:4327-4337も参照）。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体は、選択的生体分子認識を必要とする適用における、例えば、上記方法の局面のＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化におけるアフィニティーリガンドの従来の選択性を示す。しかしながら、当業者は、選択的結合リガンドのハイスループット産生および低コスト生産系の要求の増加によって、新規生体分子多様性技術がこの１０年間に開発されていることを知っている。これは、免疫グロブリンならびに生体分子認識適用における結合リガンドとして同程度に有用であることが認められ、免疫グロブリンの代わりに、または一緒に使用することができる非免疫グロブリン起源の両方のアフィニティーリガンドの新規型の産生を可能にしている。
アフィニティーリガンドの選択性に必要な生体分子の多様性は、複数の可能性ある骨格分子の１つの組み合わせ操作により産生され得、次に、特異的／選択的アフィニティーリガンドは、適当な選択基盤を使用して選択される。骨格分子は、免疫グロブリンタンパク質起源(Bradbury AR and Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290:29-49)、非免疫グロブリンタンパク質起源(Nygren PA and Skerra A (2004) J. Immunol. Meths. 290:3-28)、またはオリゴヌクレオチド起源(Gold Lら (1995) Annu. Rev. Biochem. 64:763-797)のものであり得る。
多くの非免疫グロブリンタンパク質骨格は、新規結合タンパク質の開発における支持構造として使用されている。本明細書の使用のためにＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドを産生するために有用なこのような構造の非限定的な例は、ブドウ球菌タンパク質Ａおよびそのドメインおよびこれらのドメインの誘導体、例えば、タンパク質Ｚ(Nord Kら (1997) Nat. Biotechnol. 15:772-777)；リポカリン(Beste Gら (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:1898-1903)；アンキリン反復ドメイン(Binz HKら (2003) J. Mol. Biol. 332:489-503)；セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）(Smith GPら (1998) J. Mol. Biol. 277:317-332; Lehtio Jら (2000) Proteins 41:316-322)；γ結晶(Fiedler U and Rudolph R, W001/04144)；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Peelle Bら (2001) Chem. Biol. 8:521-534)；ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）(Hufton SEら (2000) FEBS Lett. 475:225-231; Irving RAら (2001) J. Immunol. Meth. 248:31-45)；プロテアーゼ阻害剤、例えば、ノッティン(Knottin)タンパク質(Wentzel Aら (2001) J. Bacteriol. 183:7273-7284; Baggio Rら (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134)およびクニッツ(Kunitz)ドメイン(Roberts BLら (1992) Gene 121:9-15; Dennis MS and Lazarus RA (1994) J. Biol. Chem. 269:22137-22144)；ＰＤＺドメイン(Schneider Sら (1999) Nat. Biotechnol. 17:170-175)；ペプチドアプタマー、例えば、チオレドキシン(Lu Zら (1995) Biotechnology 13:366-372; Klevenz Bら (2002) Cell. Mol. Life Sci. 59:1993-1998)；ブドウ球菌ヌクレアーゼ(Norman TCら (1999) Science 285:591-595)；テンダミスタット(McConell SJ and Hoess RH (1995) J. Mol. Biol. 250:460-479; Li Rら (2003) Proteins Eng. 16:65-72)；フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づくトリネクチン(Koide Aら (1998) J. Mol. Biol. 284:1141-1151; Xu Lら (2002) Chem. Biol. 9:933-942)；およびジンクフィンガー(Bianchi Eら (1995) J. Mol. Biol. 247:154-160; Klug A (1999) J. Mol. Biol. 293:215-218; Segal DJら (2003) Biochemistry 42:2137-2148)である。
非免疫グロブリンタンパク質骨格の上記の例は、新規結合特異性の産生のために使用される単一の無作為化ループを提供する骨格タンパク質、タンパク質表面から突出している側鎖が新規結合特異性の産生のために無作為化されている強固な二次構造を有するタンパク質骨格、および新規結合特異性の産生のために使用される非連続の超可変ループ領域を示す骨格を含む。
非免疫グロブリンタンパク質に加えて、オリゴヌクレオチドは、また、アフィニティーリガンドとして使用され得る。アプタマーまたはデコイと呼ばれる一本鎖核酸は、明確に定義された三次元構造に折りたたまれ、高いアフィニティーおよび特異性を有するその標的に結合する（Ellington AD and Szostak JW (1990) Nature 346:818-822; Brody EN and Gold L (2000) J. Biotechnol. 74:5-13; Mayer G and Jenne A (2004) BioDrugs 18:351-359)。オリゴヌクレオチドリガンドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってよく、広範な標的分子クラスに結合することができる。
任意の上記骨格構造の変異体のプールから所望のアフィニティーリガンドの選択性のために、多くの選択基盤が、選択された標的タンパク質に対する特異的新規リガンドの単離のために利用できる。選択基盤は、ファージディスプレイ(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)、リボソームディスプレイ(Hanes J and Pluckthun A (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4937-4942)、酵母ツーハイブリッド系(Fields S and Song O (1989) Nature 340:245-246)、酵母ディスプレイ(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473)、ｍＲＮＡディスプレイ(Roberts RW and Szostak JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12297-12302)、細菌ディスプレイ(Daugherty PS (2007) Curr Opin Struct Biol 17:474-480, Kronqvist Nら (2008) Protein Eng Des Sel 1-9, Harvey BRら (2004) PNAS 101(25):913-9198)、ミクロビーズディスプレイ(Nord Oら (2003) J Biotechnol 106:1-13、W001/05808)、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法(System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)）(Tuerk C and Gold L (1990) Science 249:505-510)およびタンパク質フラグメント相補性アッセイ（ＰＣＡ）(Remy I and Michnick SW (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5394-5399)を含むが、これらに限定されない。
したがって、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、任意の上記タンパク質骨格由来の非免疫グロブリンアフィニティーリガンド、またはオリゴヌクレオチド分子であり得る。
上記のとおり、配列番号：１のＲＢＭ３タンパク質フラグメントは、他のヒトタンパク質と低い配列同一性を有するユニークな配列からなり、産生されたアフィニティー試薬の交差反応性を最小限にするように設計された。結果として、本明細書の態様において、アフィニティーリガンドは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと選択的相互作用が可能であり得る。
配列番号：４および５のエピトープ領域は、配列番号：１の範囲内に同定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、配列番号：４および５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドと選択的相互作用が可能である。
さらに、別の４つのエピトープ領域（配列番号：６−９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
また、別の１０個のエピトープ領域（配列番号：１０−１９）が特定されている。したがって、いくつかの態様において、本明細書のアフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：１０−１９から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
単一のエピトープ領域に対する選択性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、より長いペプチド配列（例えば、ＰｒＥＳＴまたは全長タンパク質）に対して産生された抗体と比較して、検出分析における再現性が高いため提供され得る。単一のエピトープ領域に対して選択的な抗体は、また、免疫組織化学的分析における染色を明瞭に、および強くするために提供され得る。これらの利益は、独立して、または共同で、本明細書の処置に関して処置予測または決定するときに重要であり得る。
「６Ｆ１１」および「１Ｂ５」と称されるモノクローナル抗体は、特に有益であると考えられる。６Ｆ１１および１Ｂ５の両方は、ポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体よりもさらに選択的であることが示されている。さらに、１Ｂ５は、６Ｆ１１よりもさらに選択的であることが示されている。１Ｂ５は、また、以下の実施例の部において使用されている。
１Ｂ５が結合する配列番号：１７は、配列番号：５の範囲内である。本明細書の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、配列番号：５からなるＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能であり、本明細書の特に好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：１７の配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
６Ｆ１１は、配列番号：８および配列番号：１６に結合することが示されている。本明細書の他の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、したがって、２０以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：８および１６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。配列番号：８および１６が重複しており、このようなフラグメントが配列番号：８および１６の両方の配列を含み得ることに注意すること。
以下の実施例において、配列番号：２４および２５と選択的相互作用が可能である抗体は、特に選択的であることを示す。したがって、本明細書の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、配列番号：２４および２５から選択される配列からなるＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
さらに、エピトープ領域配列番号：２２および２６は、同定されている。したがって、本明細書の他の好ましい態様において、アフィニティーリガンドは、例えば、１５以下のアミノ酸残基、例えば、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３フラグメントと選択的相互作用が可能である。
ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドの検出および／または定量化は、生物学的相互作用に基づくアッセイにおける結合試薬の検出および／または定量化のための当業者に知られている任意の方法において成し遂げられ得る。したがって、上記のあらゆるアフィニティーリガンドが、ＲＢＭ３タンパク質の存在を定量的および／または定性的に検出するために使用され得る。これらの「一次」アフィニティーリガンドは、それ自体を種々のマーカーで標識させてもよく、また、検出、視覚化および／または定量化を可能にする標識化された二次アフィニティーリガンドにより同様に検出され得る。これは、ＲＢＭ３タンパク質との相互作用が可能であるアフィニティーリガンドへ、または任意の二次アフィニティーリガンドへ接合することができる任意の１つまたはそれ以上の多数の標識を使用して、任意の１つまたはそれ以上の多数の当業者に既知の技術を使用して、それ自体何ら過度の実験を必要とせず成し遂げることができる。
一次および／または二次アフィニティーリガンドに接合することができる標識の非限定的な例は、蛍光色素または金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミナール、イミダゾール）および生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）を含む。種々の他の有用な蛍光剤および発色団は、Stryer L (1968) Science 162:526-533およびBrand L and Gohlke JR (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティーリガンドは、また、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）および粒子（例えば、金）で標識化することができる。本明細書の文脈において、「粒子」は、分子の標識化のために適当な粒子、例えば、金属粒子を示す。このような粒子は当業者によく知られている。さらに、アフィニティーリガンドは、また、蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）で標識化され得る。量子ドットは、上位の量子収量を有し、有機フルオロフォアと比較してさらに光安定であり、したがってさらに容易に検出される（Chanら (2002) Curr Opi Biotech. 13: 40-46）。異なる型の標識は、種々の化学、例えば、アミン反応またはチオール反応を使用してアフィニティーリガンドに接合することができる。しかしながら、アミンおよびチオール以外の反応基は、例えば、アルデヒド、カルボン酸およびグルタミンを使用することができる。
上記の方法の局面は、限定されない選択が以下に記載されているいくつかの知られている形式および設定のいずれかにおいて使用され得る。
組織学に基づく設定において、そのＲＢＭ３タンパク質標的に結合する標識化されたアフィニティーリガンドの検出、局在化および／または定量化は、視覚化技術、例えば、光学顕微鏡検査または免疫蛍光顕微鏡検査に関連し得る。他の方法は、フローサイトメトリーまたはルミノメトリーを介する検出に関連し得る。
対象由来の生物学的材料は、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のためのサンプルを得るために使用され得る。したがって、該サンプルは早期に得られたサンプルであり得る。方法において早期に得られたサンプルを使用するとき、方法の工程はヒトまたは動物体で実施されない。
アフィニティーリガンドは、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のためのサンプルに適用され得る。この処理は、ＲＢＭ３タンパク質の検出を可能にするだけでなく、加えて、その発現の分布および相対レベルを示し得る。
該アフィニティーリガンドにおける標識の視覚化の方法は、蛍光、発光および／または酵素技術を含むが、これらに限定されない。蛍光は、蛍光標識を特定の波長の光に暴露することにより検出および／または定量され、その後、特定の波長領域の放射光が検出および／または定量される。発光的にタグを付けたアフィニティーリガンドの存在は、化学反応中に生じた発光により検出および／または定量され得る。酵素反応の検出は、化学反応を生じるサンプルにおける色の変化による。当業者は、種々の異なるプロトコールを適当な検出および／または定量化のために修飾することができることを知っている。
上記局面の方法の態様において、サンプルは、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロースまたは適用される生物学的サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質を固定することが可能であるあらゆる他の固体支持体マトリックス上に固定され得る。本発明において有用ないくつかのよく知られている固体支持材は、ガラス、炭水化物（例えば、セファロース）、ナイロン、プラスチック、ウール、ポリスチレン、ポリエテン、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、フィルム、樹脂、セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、アルミナ、斑糲岩および磁鉄鉱を含む。生物学的サンプルの固定化後、ＲＢＭ３タンパク質に特異的な一次アフィニティーリガンドは、適用され得る。一次アフィニティーリガンドがそれ自体標識化されていないとき、支持マトリックスは、当分野で知られている１つ以上の適当なバッファーで洗浄され、次に標識化された二次アフィニティーリガンドへ暴露され、再びバッファーで洗浄され、結合していないアフィニティーリガンドを除去され得る。その後、選択的アフィニティーリガンドは、慣用の方法で検出および／または定量され得る。アフィニティーリガンドに対する結合特性は、１つの固体支持体から他のものへ変化し得るが、当業者は、日常の実験によりそれぞれの決定のための機能的な、および最適なアッセイ条件を決定することができるはずである。
結果として、上記局面の方法の態様において、ａ１）またはａＩ）の定量化可能なアフィニティーリガンドは、該定量化可能なアフィニティーリガンドを認識することが可能である二次アフィニティーリガンドを使用して検出され得る。したがって、ａ３）またはａＩＩ）の定量化は、定量化可能なアフィニティーリガンドに対するアフィニティーを有する二次アフィニティーリガンドの手段により実施され得る。一例として、二次アフィニティーリガンドは、抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体であり得る。
一例として、ＲＢＭ３タンパク質の検出および／または定量化のための１つの利用できる方法は、アフィニティーリガンドを、次に酵素免疫測定法（例えば、ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）において後に検出および／または定量することができる酵素に連結させることによるものである。このような技術はよく確立されており、それらの実現には当業者に何ら過度の困難性が存在しない。このような方法において、生物学的サンプルを、固体材料、または、次に酵素的に標識化された二次アフィニティーリガンドで検出および／または定量される、ＲＢＭ３タンパク質に対するアフィニティーリガンドへ接合した固体材料と接触させる。この後、適当な基質を、例えば、分光光度計、蛍光光度計、照度計を使用して、または視覚化手段により検出および／または定量される化学部分を生産するように適当なバッファー中で酵素標識と反応させるために提供する。
上記のとおり、一次およびあらゆる二次アフィニティーリガンドは、検出および／または定量化を可能にするために放射性同位体で標識化することができる。本明細書における適当な放射性同位体の非限定的な例は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉである。標識化されたアフィニティーリガンドの比活性は、放射性標識の半減期、同位体純度、および標識がアフィニティーリガンドに組み込まれているかどうかに依存する。アフィニティーリガンドは、好ましくは、よく知られている技術（Wensel TG and Meares CF (1983) in: Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy (Burchiel SW and Rhodes BA eds.) Elsevier, New York, pp 185-196）を使用して標識化される。したがって、放射性標識されたアフィニティーリガンドは、インビボまたはエキソビボにおいて放射能の検出によりＲＢＭ３タンパク質を可視化するために使用することができる。例えば、ガンマカメラを有する放射性核種スキャン、磁気共鳴分光学または放出断層撮影は、インビボおよびエキソビボにおいて検出のために機能するが、ガンマ／ベータカウンター、シンチレーションカウンターおよびＸ線撮影は、エキソビボにおいても使用される。
ｍＲＮＡレベルでのバイオマーカーを検出および定量化するための方法は、当分野で周知である。
１つのこのような方法によれば、全細胞ＲＮＡを、核酸抽出バッファーの存在下での均質化、次に遠心分離により細胞から精製する。次に、核酸を沈澱させ、ＤＮａｓｅでの処理および沈殿によりＤＮＡを除去する。次に、ＲＮＡ分子を、標準技術にしたがってアガロースゲル上のゲル電気泳動によって、ＲＮＡ分子を分離し、例えば、いわゆる「ノーザン」ブロッティング技術により、ニトロセルロースフィルターに移す。次に、ＲＮＡを加熱によりフィルター上に固定する。特異的ＲＮＡの検出および定量化は、目的のＲＮＡに相補的な適当に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook Jら、(1989) 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press）参照。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製方法およびその標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーション条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrook Jら (1989) 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。例えば、核酸プローブは、例えば、放射性核種、例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃもしくは３５Ｓ；重金属；または標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして機能することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジンまたは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素などで標識されていてもよい。
プローブは、ニックトランスレーション法(Rigbyら (1977) J. MoI Biol, 113: 237-251)またはランダムプライミング法(Fienberg, (1983) Anal. Biochem., 132: 6-13)のいずれかにより高い比活性に標識してもよい。後者は、高い比活性の３２Ｐ−標識プローブをＲＮＡ鋳型から合成するための方法であり得る。例えば、ニックトランスレーション法にしたがって、予め存在しているヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドと置き換えることによって、１０ｃｐｍ／マイクログラムを越える十分な高い比活性を有する３２Ｐ−標識核酸プローブを調製することができる。次に、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフ検出は、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに曝露することにより行うことができる。ハイブリダイズしたフィルターに曝露された写真フィルムのデンシトメトリースキャニングは、バイオマーカーレベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いると、バイオマーカーレベルは、コンピューター処理画像化システム、例えば、Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ., USA)により定量化することができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識化が実用的でない場合、ランダム−プライマー法は、アナログ、例えば、ｄＴＴＰアナログ５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−エプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジントリホスフェートをプローブ分子中に取り込むために使用することができる。ビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を生じる酵素と結合しているビオチン結合タンパク質、例えば、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば、抗ビオチン抗体）との反応により検出することができる。
ノーザンおよび他のＲＮＡブロッティングハイブリダイゼーション技術に加えて、ＲＮＡ転写産物のレベルの決定は、インサイチュハイブリダイゼーションの技術を使用して成し遂げられ得る。該技術は、ノーザンブロット技術よりも少ない細胞を必要とし、顕微鏡カバースリップ上に全細胞を置き、放射性標識または他の方法で標識された核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含む溶液で細胞の核酸含量をブローブすることを含む。該技術は、対象由来の組織生検サンプルを分析するために特によく適している。
細胞中のＲＮＡ転写産物の相対的な数はまた、ＲＮＡ転写産物の逆転写、次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写された転写産物の増幅により決定することができる。ＲＮＡ転写産物のレベルは、内部標準、例えば、同じサンプル中に存在する標準遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルとの比較において定量することができる。当業者は、内部標準として使用するための適当な遺伝子を選択することができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲのための方法およびその変形方法は、当分野の技術内である。
いずれかの適当なプライマーは、定量的ＲＴ−ＰＣＲのために使用することができる。好ましくは、該プライマーはＲＢＭ３に特異的である。ＲＢＭ３に特異的なプライマー（例えば、配列番号：３から開始する）を生成することは、当分野の技術内である。プライマーは、任意の適当な長さであり得るが、好ましくは、１９から２３（例えば、１９、２０、２１、２２または２３）個のヌクレオチドである。理想的には、アンプリコン長は、最適なＰＣＲ効率のために、５０から１５０（必要に応じて最大２５０で、次いで、温度サイクリングプロトコールおよび反応成分の最適化が必要とされ得る）塩基であるべきである。非常に長いアンプリコンを生じるプライマーを設計することは、乏しい増幅効率をもたらし得る。プライマー設計および最適なアンプリコンサイズについての情報は、例えば、www.ambion.com.で見ることができる。
場合によっては、バイオマーカー発現を検出するためにマイクロチップ技術を使用することが望ましいかもしれない。マイクロチップは、当分野で知られている技術により製作することができる。例えば、適当な長さ、例えば、４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位置で５’−アミン修飾され、市販のマイクロアレイシステム、例えば、GENEMACHINE OmniGrid 100 MicroarrayerおよびAmersham CODELINK活性化スライドを使用してプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、標的ＲＮＡを標識プライマーと共に逆転写することにより調製される。第１鎖の合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡ鋳型を破壊する。したがって、次に、調製された標識された標的ｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーション条件下、例えば、６倍ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド、２５℃で１８時間、次に、０．７５倍ＴＮＴ中、３７℃で４０分間洗浄でマイクロアレイチップにハイブリダイズする。固定化されたプローブＤＮＡがサンプル中の相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置に、ハイブリダイゼーションが起こる。標識された標的ｃＤＮＡは、結合が起こるアレイ上の正確な位置に印を付け、それにより、自動的検出および定量化を可能にする。アウトプットは、ハイブリダイゼーション事象のリストからなり、それは、対象サンプル中、特異的ｃＤＮＡ配列の相対存在量、したがって、対応する相補的バイオマーカーの相対存在量を示す。１つの態様において、標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識されたｃＤＮＡである。次に、マイクロアレイは、例えば、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを使用して、ビオチン含有転写産物の直接的検出により処理され、慣用のスキャニング方法を使用してスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、対象サンプル中の対応するバイオマーカーの存在量に比例する。
アレイの使用は、ｍＲＮＡ発現検出に関して１以上の利点を有する。第一に、数個から数千もの遺伝子の広範囲な発現を、単一のサンプル中で一度に同定することができる。第二に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計を介して、成熟および前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第三に、ノーザンブロット分析との比較において、チップは少量のＲＮＡを必要とする。
ＲＢＭ３ ｍＲＮＡは、例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織から取り出され得る。したがって、本明細書の方法のサンプルは、ＲＢＭ３タンパク質またはＲＢＭ３ ｍＲＮＡが検出されるときと独立して、ホルマリン固定および／またはパラフィン包埋膀胱腫瘍組織であり得る。
本発明者らは、本明細書のＲＢＭ３ ｍＲＮＡ分析が個別化された処置計画をサポートするために設計されるｍＲＮＡベースのアッセイに包含され得ることを理解している。このようなアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、いくつかの遺伝子の発現を分析され得る。
上記発見にしたがって、本発明者らは、ＲＢＭ３タンパク質およびそのフラグメントに対するいくつかの使用を実現した。
本明細書の第３の局面として、膀胱癌に対する予後のマーカーとしてのＲＢＭ３タンパク質の使用を提供する。好ましくは、該タンパク質は、膀胱癌を有する対象由来のサンプル、例えば、膀胱癌の組織サンプルにおいて提供される。
通常、第３の局面のＲＢＭ３タンパク質は、比較的良好な膀胱癌の予後のマーカーとして使用される。
第３の局面の使用は、完全にエキソビボであり得る。
本明細書の文脈において、「予後マーカー」は、存在が予後を示すあらゆる物質を示す。したがって、該マーカーは、バイオマーカー、例えば、ヒトタンパク質であり得る。
第４の局面または本明細書として、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後診断薬の生産、選択または精製のためのＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用を提供する。
本明細書の文脈において、ＲＢＭ３タンパク質の「抗原的に活性なフラグメント」は、フラグメントを含むＲＢＭ３タンパク質と選択的に相互作用するアフィニティーリガンド、例えば、抗体の産生のために有用である十分なサイズのフラグメントである。
該選択および精製はエキソビボであり得るが、生産はインビボ（動物）であり得る。
本明細書の文脈において、「予後診断薬」は、予後、例えば、膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後の確立において重要である少なくとも１つの特性を有する薬物を示す。例えば、該予後診断薬は、予後診断マーカーと選択的相互作用が可能であり得る。
予後診断薬は、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドであり得る。このようなアフィニティーリガンドの例は、方法の局面に関連して上記されている。
本明細書の教示によって導かれると、当業者は、予後診断薬の生産、選択または精製におけるＲＢＭ３タンパク質またはフラグメントの使用の仕方を理解している。例えば、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質が固定されている固体支持体におけるアフィニティー精製を含み得る。例えば、該固体支持体はカラム中に配置され得る。さらに、該使用は、ＲＢＭ３タンパク質が固定されている固体支持体を使用して、ＲＢＭ３タンパク質に対する特異性を有するアフィニティーリガンドの選択性を含み得る。このような固体支持体は、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）、電磁ビーズ、アガロースビーズまたはセファロースビーズであり得る。さらに、該使用は、例えば、デキストランマトリックス、または表面プラズモン共鳴装置、例えば、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ装置を使用して可溶性マトリックス上のアフィニティーリガンドの分析を含み、該分析は、例えば、固定されたＲＢＭ３タンパク質に対する多くの可能なアフィニティーリガンドをモニタリングすることを含み得る。
また、予後診断薬の生産のために、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントは、動物、例えば、ウサギまたはマウスの免疫化において使用され得る。
このような使用は
ｉ）抗原としてＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントを使用して動物を免疫化し、
ｉｉ）免疫化された動物から予後診断薬を含む血清を得、所望により
ｉｉｉ） 血清から予後診断薬を単離する
工程を含む方法を含み得る。
あるいは、第１の工程の次の工程は
ｉｉ’） 免疫化された動物から予後診断薬をコードするＤＮＡを含む細胞を得、
ｉｉｉ’）胞を骨髄腫細胞と融合し、少なくとも１つのクローンを得、
ｉｖ’） クローンにより発現される予後診断薬を得る
であり得る。
第３または第４の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：１、および
ｉｉ）配列番号：１と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含み得る。
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：１と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
さらに、第６の局面の態様において、ＲＢＭ３タンパク質のアミノ酸配列は
ｉ）配列番号：２、および
ｉｉ）配列番号２と少なくとも８５％同一である配列
から選択される配列を含むか、またはそれからなり得る。
いくつかの態様において、配列ｉｉ）は、配列番号：２と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一である。
第４の局面の抗原的に活性なフラグメントは、例えば、５０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：４−１９および２２−２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントであり得る。第４の局面の態様において、フラグメントは、２９以下のアミノ酸残基からなる。第４の局面のさらなる態様において、フラグメントは、２１以下のアミノ酸残基、例えば、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：６−１９および２２−２６から選択される配列を含む。
また、第４の局面に関連して、２１以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２−２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメント（それ自体）を提供する。例えば、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントは、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２、２４、２５および２６から選択される配列を含み得る。さらなる例として、ＲＢＭ３タンパク質フラグメントは、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２および２６から選択される配列を含む。
ＲＢＭ３タンパク質またはそのフラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドの種々の態様は、方法の局面に関連して上記されている。
本明細書の第５の局面として、膀胱癌に対する予後診断薬としてのこのようなアフィニティーリガンドの使用を提供する。結果として、アフィニティーリガンドは、膀胱癌を有する対象に対する予後を確立するために使用され得る。例えば、このような使用は、例えば、対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量の決定を含んで、エキソビボで実施され得る。
第５の局面に関連して、２１以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２−２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンド（それ自体）を提供する。このようなアフィニティーリガンド（特にモノクローナル抗体）は、以下の実施例に記載されている。一例として、アフィニティーリガンドは、１５以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２、２４、２５および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である。さらなる例として、アフィニティーリガンドは、１０以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２および２６から選択される配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能である。また、アフィニティーリガンドは、６以下のアミノ酸残基からなり、配列番号：２２の配列を含むＲＢＭ３タンパク質フラグメントと選択的相互作用が可能であり得る。
１．膀胱癌 ＴＭＡ、コホートＩ
ａ）材料および方法
腫瘍材料は、２０００年のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ＵＭＡＳにおいて尿路上皮癌と診断された５９人の患者から回収された。患者の中央年齢は、７３（４８−９１）歳であった。４９人の男性および１０人の女性患者であった。腫瘍サンプルは等級間で均等に分化しており、１８個の腫瘍がよく分化し（等級１）、１７個が中程度に分化し（等級２）、２４個があまり分化しなかった（等級３）。大多数のサンプルはＴａ期（３３／５９）であり、１１個がＴ１期であり、１３個がＴ２期であり、３個がＴ３期であった。中央追跡時間は、６．２年であった。該試験の許可は、Ｌｕｎｄ大学の倫理委員会から得た。
ＴＭＡ構築前に、それぞれの場合由来の、すべて利用できるヘマトキシリンおよびエオシン染色したスライドを、組織病理学的に再評価した。標準セットの４×１ｍｍ核を、比例形式においてそれぞれの浸潤性腫瘍から得た。半自動アレイ装置を使用した（TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA）。
ＲＢＭ３の免疫組織化学的分析のために、４μｍのＴＭＡ切片を、ＰＴ−リンク系(DAKO, Copenhagen, Denmark)を使用して自動前処理し、次に、１：１００００希釈された以前に記載されているとおりに（ＷＯ２０１０／０９２１９０の実施例、セクション３、６および１１参照）得られたＲＢＭ３マウスモノクローナル抗体１Ｂ５で、Ｔｅｃｈｍａｔｅ ５００(DAKO, Copenhagen, Denmark)において染色した。
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた(annotated)。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性(representativity)および免疫反応に関して試験した。
基本注釈パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。ＲＢＭ３は、腫瘍細胞核に主に発現した。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない（ＳＩ＝０）、弱い＝わずかな免疫反応（ＳＩ＝１）、中程度＝中程度の免疫反応（ＳＩ＝２）、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応（ＳＩ＝３）として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％（０−３に及ぶＦＳＣ）として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allredら (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。
統計分析のために、組合せ核スコア（ＮＳ）が核ＳＩ×ＦＳＣとして計算され、ＮＳ＝０−１が低い発現として定義され、ＮＳ＝２−４が中程度の発現として定義され、ＮＳ＞４が強い発現として定義された。個々の層における生存傾向に基づき、さらなる統計分析のために二分変数を作成した。高い核スコアをＮＳ＞４として定義し、低い染色スコアをＮＳ≦４として定義した。サンプルの上記の分類を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法にしたがって全生存（ＯＳ）分析のために使用し、対数順位検定を使用し、異なる層内で生存を比較した。期および等級を調整した後に、コックス比例回帰ハザードモデルを使用して、一変量および多変量の両方の分析においてＯＳに対するＲＢＭ３発現の影響を概算した。すべての統計的試験は両側であり、＜０．０５のｐ値を有意と考えた。すべての計算を統計パッケージＳＰＳＳ１９．０（SPSS Inc. Illinois, USA）を用いて行った。
ｂ）結果
コホートの最初の分析は、すべての患者についての７年ＯＳが約４０％であることを明らかにした。ＲＢＭ３発現ならびにＴ期および悪性度の両方との間の逆相関関係があった（Ｓｐｅａｒｍａｎｓ Ｒｈｏ、ｐ＝０．００１）。全コホートの生存分析は、抗ＲＢＭ３に対して陽性の染色された腫瘍細胞の画分がＯＳと有意に相関した（図１Ａ）、すなわち高いＲＢＭ３タンパク質レベルは、改善された生存に相当したことを明らかにした。
興味深いことに、ＴａまたはＴ１期の腫瘍を有する患者のグループが分析されたとき、ＲＢＭ３タンパク質レベルおよびＯＳ間の相関関係は有意であった（図１Ｂ）。結果として、早期尿路上皮腫瘍と診断された患者は、ＲＢＭ３のレベルの分析のために特に適当であり得る。
コックス回帰一変量分析は、ＲＢＭ３発現の増加が、現在のコホートにおいて改善されたＯＳ（ＲＲ＝０．２７、９５％ ＣＩ：０．１４−０．５５、Ｐ＜０．００１）と関連することを示した（表）。多変量分析は、ＲＢＭ３発現の増加が、同じコホートにおいて期および悪性度と独立して改善されたＯＳ（ＲＲ＝０．２９、９５％ ＣＩ：０．１４−０．６３、Ｐ＝０．００２）と関連することを示した（表）。
表
Figure 2014517282
 ＊期および悪性度に対して調整
２．膀胱癌 ＴＭＡ、コホートＩＩ
ａ）材料および方法
腫瘍材料は、２００２年１０月１日から２００３年１２月３１日までのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ＵＭＡＳにおいて尿路上皮癌と診断された９８人の患者から回収された。患者の中央年齢は、７３（３９−９０）歳であった。７１人（７２％）の男性および２７人（２８％）の女性患者であった。腫瘍サンプルは、腫瘍がよく分化した１４個（等級１）、中程度に分化した３０個（等級２）、あまり分化しなかった５４個（等級３）を含んだ。腫瘍は、４０個のＴａ期、２２個のＴ１期、３５個のＴ２期、１個のＴ３期であった。中央追跡時間は、５．８年であった。該試験の許可は、Ｌｕｎｄ大学の倫理委員会から得た。
ＴＭＡ構築前に、それぞれの場合由来の、すべて利用できるヘマトキシリンおよびエオシン染色したスライドを、組織病理学的に再評価した。標準セットの２×１ｍｍ核を、比例形式においてそれぞれの浸潤性腫瘍から得た。半自動アレイ装置を使用した（TMArrayer; Pathology Devices, Inc, Westminster, MD, USA）。
ＲＢＭ３の免疫組織化学的分析のために、４μｍのＴＭＡ切片を、ＰＴ−リンク系(DAKO, Copenhagen, Denmark)を使用して自動前処理し、次に、１：１００００希釈された以前に記載されているとおりに（ＷＯ２０１０／０９２１９０の実施例、セクション３、６および１１参照）得られたＲＢＭ３マウスモノクローナル抗体１Ｂ５で、Ｔｅｃｈｍａｔｅ ５００(DAKO, Copenhagen, Denmark)において染色した。
免疫組織化学的に染色された組織の全てのサンプルを、顕微鏡下で手動で評価し、認定された病理学者により注釈を付けた(annotated)。それぞれのサンプルの注釈を、ＩＨＣ結果の分類のための簡易化スキームを使用して行った。それぞれの組織サンプルを、典型性(representativity)および免疫反応に関して試験した。
基本注釈パラメーターは、ｉ）細胞内局在性（核および／または細胞質／膜）、ｉｉ）染色強度（ＳＩ）およびｉｉｉ）染色された細胞の画分（ＦＳＣ）の評価を含んだ。ＲＢＭ３は、腫瘍細胞核に主に発現した。染色強度を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を、存在しない＝免疫反応がない（ＳＩ＝０）、弱い＝わずかな免疫反応（ＳＩ＝１）、中程度＝中程度の免疫反応（ＳＩ＝２）、または強い＝はっきりとしたおよび強い免疫反応（ＳＩ＝３）として分類した。また、染色された細胞の画分を、臨床組織病理学的診断において使用される標準にしたがって主観的に評価し、結果を関連細胞集団の免疫反応細胞の＜２％、２−２５％、＞２５−７５％または＞７５％（０−３に及ぶＦＳＣ）として分類した。当業者は、この注釈処理がＡｌｌｒｅｄスコアの計算と同様であることを理解する、例えば、Allredら (1998) Mod Pathol 11(2), 155参照。
統計分析のために、組合せ核スコア（ＮＳ）が核ＳＩ×ＦＳＣとして計算され、ＮＳ＝０−１が低い発現として定義され、ＮＳ＝２−４が中程度の発現として定義され、ＮＳ＞４が強い発現として定義された。個々の層における生存傾向に基づき、さらなる統計分析のために二分変数を作成した。高い核スコアをＮＳ＞１として定義し、低い染色スコアをＮＳ≦１として定義した。サンプルの上記の分類を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法にしたがって全生存（ＯＳ）分析のために使用し、対数順位検定を使用し、異なる層内で生存を比較した。コックス回帰比例ハザードモデルを使用して、一変量の分析においてＯＳに対するＲＢＭ３発現の影響を概算した。すべての統計的試験は両側であり、＜０．０５のｐ値を有意と考えた。すべての計算を統計パッケージＳＰＳＳ１９．０（SPSS Inc. Illinois, USA）を用いて行った。
ｂ）結果
コホートの最初の分析は、すべての患者についての７年ＯＳが約４０％であることを明らかにした。全コホートの生存分析は、抗ＲＢＭ３に対して陽性の染色された腫瘍細胞の画分がＯＳと有意に相関した（図２）、すなわち高いＲＢＭ３タンパク質レベルは、改善された生存に相当したことを明らかにした。分析がＴ２期の癌を有する対象に限定されるとき、高レベルのＲＢＭ３タンパク質を示す対象に対する良い生存率の傾向もある（図３Ａ）。したがって、データは、ＲＢＭ３が期と独立した予後因子であることを示す。分析が悪性度３の癌を有する対象に限定されるとき、高レベルのＲＢＭ３タンパク質を有する対象に対する良い生存率の傾向もある。したがって、データは、ＲＢＭ３がまた、等級と独立した予後因子であることを示す。有意でない相関関係の理由（すなわちｐ−値＞０．０５）は、恐らく、それぞれの期および悪性度を有する対象の数が比較的低い（Ｔ２期において３５対象および悪性度３において５３対象）ことである。
コックス回帰一変量分析は、ＲＢＭ３発現の増加が、改善されたＯＳ（ＲＲ＝０．５４、９５％ ＣＩ：０．３２−０．９１、Ｐ＝０．０２）と関連することを示した。ＲＢＭ３発現ならびにＴ期および悪性度の両方との間の逆相関関係があった（Ｓｐｅａｒｍａｎｓ Ｒｈｏ、ｐ＜０．００１）。
３．Ｂｉｏｐｌｅｘを使用するエピトープマッピング
ａ）合成ペプチド調製物
ＲＢＭ３タンパク質のタンパク質フラグメント配列番号：１に対応する２５個のビオチン化ペプチド（配列番号：２、配列番号：３）からなるＰＥＰｓｃｒｅｅｎライブラリーを、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により合成した。ペプチドは、１０個のアミノ酸重複を有する１５アミノ酸長であり、共に全タンパク質フラグメント（配列番号：１）を含む。ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に８０％のＤＭＳＯに溶解させた。
ｂ）ビーズ結合
ニュートラアビジン（Pierce, Rockford, IL）を、製造業者のプロトコールにしたがって、カルボキシル化ビーズ（BioPlex COOH Beads, BioRad）上に固定した。１０６個のビーズの結合を、以前に記載されているとおりに（Larssonら (2009) J Immunol Methods 15;34(1-2):20-32、Schwenkら (2007) Mol Cell Proteomics 6(1) 125:32）、フィルター膜底マイクロタイタープレート（MultiScreen-HTS, Millipore, Billerica, MA）を使用して実施した。異なる色コードＩＤを有する２５個の異なるグループのビーズを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して活性化させた。ニュートラアビジン（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７，４中で２５０μｇ／ｍｌ）をビーズに加え、振とう器で１２０分間インキュベートした。最後に、ビーズを洗浄し、再懸濁し、ＰＢＳ−ＢＮ（１ｘＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０，０５％ ＮａＮ３）中で４℃で保存のために微小遠心管に移した。すべての結合したビーズ集団を、３分間、超音波洗浄器（Branson Ultrasonic Corporation, Danbury, CT）において超音波処理で処理した。ビオチン化ペプチドを０，１ｍｇ／ｍｌの濃度にＰＢＳ−ＢＮで希釈し、５０μｌのそれぞれのペプチドを結合反応に使用し、これを室温で６０分間振とうしながら行った。最後に、ビーズを３×１００μｌのＢＲＥバッファーで洗浄し、さらなる使用まで４℃で保存した。
ｃ）結合特異性の決定
すべての２５個のビーズＩＤを含むビーズ混合物を調製し、以前に記載されている（ＷＯ２０１０／０９２１９０の実施例、セクション１および２参照）とおりに得られる１０μｌのポリクローナルウサギ抗体「抗−ＲＢＭ３」を、３０μｌのビーズ混合物と混合し、室温で６０分間インキュベートした。フィルター底マイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を洗浄および次のそれぞれのインキュベーションのために利用し、すべてのウェルを２×１００μｌのＰＢＳ−ＢＮで洗浄した。ビーズに、２５μｌのＲ−フィコエリトリン標識抗−ウサギＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）を室温で３０分の最終インキュベーションのために加えた。
測定を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ５．０ ソフトウェアを備えたBioplex 200 Suspension Array装置を使用して行った。それぞれの実験のために、ビーズＩＤあたり５０個の事象をカウントし、中央蛍光強度（ＭＦＩ）を個々のビーズ集団への抗体結合の測定として使用した。
ｄ）結果
抗−ＲＢＭ３の特異性を、合成ビオチン化ペプチドと結合したビーズを使用して、アッセイで試験した。抗−ＲＢＭ３は、配列番号：２０の配列（配列番号：１の部分配列）に対応するペプチド６が１つであるいくつかのペプチドに強い結合を示した（図５参照）。
４．ポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体の分別
ａ）材料および方法
ペプチド特異的抗体は、ポリクローナル抗−ＲＢＭ３抗体が実施例、セクション３において結合することが示されているペプチドに対する抗−ＲＭＢ３のアフィニティー精製により得た。ペプチド中、選択したものはペプチド６であり、６００ｎｍｏｌのビオチン化ペプチドをＨｉＴｒａｐＴＭストレプトアビジン結合バッファーで１１００μｌの最終容量に希釈し、結合のために１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ ストレプトアビジン ＨＰカラム（GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden）に適用した。結合後、カラムをＨｉＴｒａｐＴＭストレプトアビジン結合バッファーで洗浄し、結合していないペプチドを除去した（ブランクをサンプルローディングの前に全てのカラムに流した）。
Ｈｉｓ６−ＡＢＰタグに融合した組換えＲＢＭ３フラグメント配列番号：１で免疫化したＮｅｗ Ｚｅｅｌａｎｄ 白色ウサギから得られた血清を、以下のとおり連続モードで８つのカラムでＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓＴＭ（GE Healthcare）液体クロマトグラフィーシステムにて精製した：２つの５ｍｌのＨｉｓ６−ＡＢＰカラム、次に、５つのエピトープ特異的ペプチドカラムおよび最後にＨｉｓ６−ＡＢＰ−ＲＢＭ３融合タンパク質カラム。サンプルローディング後、カラムを洗浄し、並行して溶離し、別々の抗体画分を得た。溶離した抗体画分を、上記のとおり、ＢｉｏＰｌｅｘを使用してエピトープマッピングした。ペプチド６に結合した抗体画分に対するエピトープ分離をさらに改善するために、ペプチドのアラニンスキャンニングを以下の方法を使用して行った：それぞれの残基で導入された単一のアラニン突然変異をそれぞれで有する配列ＴＱＲＳＲＧＦＧＦＩＴＦＴＮＰＥＨＡＳＶ（配列番号：２１）の２０個のビオチン化合成ペプチド（Sigma-Aldrich）をＤＭＳＯに溶解し、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを補った１００μＬ ＰＢＳ７．４で４μモルのペプチドに希釈した。ペプチドを、上記のとおり２０個のユニークなレポーター色素を有する２０ Ｂｉｏｐｌｅｘニュートラアビジン被覆ビーズと結合させた。ペプチド６に結合する抗体画分を、ＩＤあたり約１５，０００ビーズからなる異なるビーズのカクテルとＰＢＳＴ中で１時間インキュベートした。次に、抗体をＰＥ−接合二次試薬（Moss Inc., USA）で標識化し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ５．０ソフトウェアを備えたBioplex 200 Suspension Array装置を使用して分析した。
ｂ）結果
抗体画分がエピトープマッピングされたとき、分画された抗体は、その予期されるペプチドに結合した。ペプチド６に結合した抗体画分は、ＩＨＣおよびウェスタンブロット分析により、全長ＲＢＭ３タンパク質（配列番号：２）に結合することが確認された。ペプチド６に結合した画分に対する保存された抗体結合は、エピトープのアラニン置換Ｐｈｅ１２Ａｌａ、Ｔｈｒ１３ＡｌａおよびＡｓｎ１４Ａｌａを除く、全てのアミノ酸位置に対して観察された。したがって、抗体画分に対するエピトープは、配列番号：４内の配列ＦＴＮ（配列番号：２２）を含むことが確認された（図５参照）。
５．モノクローナル抗体の産生
ａ）材料および方法
セクション３におけるペプチド６（配列番号：２０）およびペプチド７（配列番号：２４）を含み、ＢＳＡが標準処理にしたがって結合するＮ−末端に結合したシステイン残基を有する合成ペプチド（配列番号：２３）を、モノクローナル抗体の生産のための抗原として使用した。抗原を３週間隔でＢＡＬＢ／ｃマウス（４−６週齢、メス）に皮下的に注射した。抗原を第１の注射のために完全フロイントアジュバントおよび後の注射のために不完全フロイントアジュバントと混合した。融合の３日前に、最後にマウスに静脈内的に抗原投与した。ハイブリドーマをＳｐ２／０骨髄腫細胞株とマウス脾細胞の融合により産生した。ＥＬＩＳＡを使用するいくつかの細胞株のスクリーニングにより、抗原（配列番号：１）に対して特異的な抗体を分泌する細胞を同定した。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット（ＷＢ）および免疫組織化学（ＩＨＣ）において陽性結果を示す細胞株を、サブクローニングのために選択した。
加えて、モノクローナル抗体の免疫組織化学的染色パターンを、抗−ＲＢＭ３と比較した。
ｂ）結果
抗原（配列番号：１）を認識するが、融合タグ、ＢＳＡを認識しないモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生産する系を同定するために、細胞株をＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。３７細胞株は、ＥＬＩＳＡにおいて配列番号：１の抗原への特異的結合を示し、さらなる試験のために選択した。選択された３７個のクローンのそれぞれに対して、１５０−３００μｌの上清を回収し、アジドを加えた。上清を＋４℃で貯蔵した。細胞株のさらなる試験は、７Ｆ５、１０Ｆ１、１２Ａ１０、１２Ｃ９および１４Ｄ９と示されるクローンが、ウェスタンブロットおよびＩＨＣ分析の両方において陽性結果を与えることを示した。これらのクローンを、サブクローニングおよび拡大のために選択した。
６．抗体特異性の評価
ａ）材料および方法
以前に記載されているとおりに得られるポリクローナル抗体（抗ＲＢＭ３）および上記セクション５に記載されているとおりに得られるモノクローナル抗体（７Ｆ５、１０Ｆ１、１２Ａ１０、１２Ｃ９および１４Ｄ９）の特異性をウエスタンブロットにより分析した。還元条件下で４−２０％の標準ＴＧＸ調製ウェルゲル上でヒト細胞株ＲＴ４から全タンパク質抽出物を単離し、次に製造業者の推奨にしたがって、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電子移動することにより、ウエスタンブロットを実施した。膜を室温で１時間ブロックし（１×ＴＢＳＴ中５％ミルク（０．１％のＴｗｅｅｎ２０））、一次モノクローナル抗体とインキュベートし（１％のＢＳＡで１：１０希釈、１ｘＴＢＳＴ）、ＰＢＳＴで洗浄した。ＨＲＰと接合された二次抗体（ポリクローナル ヤギ抗−マウスまたはポリクローナル ブタ抗−ウサギ、両方ともＤａｋｏ）をブロッキングバッファーにおいて１：３０００に希釈し、化学発光検出を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＣＣＤカメラ（Syngene）およびImmobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) を使用して実施した。
ｂ）結果
ウエスタンブロット分析の結果は、抗体がＲＴ４細胞株において約１６ｋＤａのバンドを特異的に検出することを示す。ＲＢＭ３の理論分子量は、１６ｋＤａ（配列番号：２のＲＢＭ３アミノ酸配列から計算される）であり、得られた結果に十分に対応している。さらなるバンドが抗−ＲＢＭ３に対して観察された。概して、結果は、モノクローナル抗体がポリクローナル抗体よりもより特異的であったことを示す（図４参照）。
７．モノクローナル抗体のエピトープマッピング
ａ）材料および方法
セクション５に記載されているとおりに得られるモノクローナル抗体を、Ｂｉｏｐｌｅｘを使用してエピトープマッピングした。合成ペプチド調製物およびビーズカップリングは、セクション３に記載されているとおりに実施した。すべての２５個のビーズＩＤを含むビーズ混合物を調製し、ＰＢＳ−ＢＮ（１％ ＢＳＡ）で１：１０希釈された１０μｌのモノクローナル抗体を、５μｌのビーズ混合物と混合し、室温で６０分間インキュベートした。フィルター底マイクロタイタープレート（Millipore）を洗浄および次のそれぞれのインキュベーションのために利用し、すべてのウェルを３×１００μｌのＰＢＳＴで洗浄した。２５μｌのＰＥ−接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）を室温で６０分の最終インキュベーションのために加えた（４ｕｇ／ｍｌ）。
測定は、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ５．０ソフトウェアを備えたBioPlex 200 Suspension Array装置を使用して行った。それぞれの実験のために、ビーズＩＤあたり５０個の事象をカウントし、中央蛍光強度（ＭＦＩ）を個々のビーズ集団への抗体結合の測定として使用した。
ｂ）結果
モノクローナル抗体の特異性を、合成ビオチン化ペプチドと結合したビーズを使用して、アッセイで試験した。試験された全てのモノクローナルは、２つのペプチド、すなわちペプチド７（配列番号：２４）および８、配列番号：４内の配列番号：２６のコンセンサス配列に対応する配列番号：２５（図５参照）に対して強い結合を示した。
予後の確立の非限定的な例
患者における膀胱癌診断の確立後、患者由来の腫瘍組織サンプルを得る。腫瘍組織サンプルは、癌の診断中に早期に行われた生検、または腫瘍の外科的除去からの試料から得ることができる。さらに、「陰性参照」の提供のために、サンプルは、低い、または本質的に欠いているＲＢＭ３タンパク質発現を有する組織を含む保存材料から得る。このような保存組織は、例えば、以前に確立されている低いＲＢＭ３タンパク質発現レベルを有する膀胱癌組織であり得る。さらに、「陽性参照」の提供のために、サンプルは、高いＲＢＭ３タンパク質発現を有する組織、例えば、以前に確立されている高いＲＢＭ３タンパク質発現レベルを有する膀胱癌組織を含む保存材料から得る。
サンプル材料を緩衝ホルマリンで固定し、組織処理し、サンプル材料の薄片（４μｍ）を得る。
免疫組織化学を、上記にしたがって実施する。それぞれのサンプル由来の１つ以上のサンプル切片をスライドガラスに乗せ、６０℃で４５分インキュベートし、キシレンで脱パラフィン処理し（問題のサンプルがパラフィン処理されたとき）（２×１５分）、等級アルコールで水和する。抗原回復のために、スライドをＴＲＳ（Target Retrieval Solution, pH6.0, DakoCytomation）中に浸し、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ（登録商標）（Biocare Medical）中で１２５℃で４分間沸騰させる。スライドを、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）（DakoCytomation）中に置き、内因性ペルオキシダーゼを最初にＨ２Ｏ２（DakoCytomation）でブロックする。多数のサンプル切片を乗せる理由は結果の精度を増加させるためである。
モノクローナル抗体１Ｂ５（上記参照）をスライドに加え、室温で３０分間インキュベートし、次に標識された二次抗体；例えば、ヤギ−抗−ペルオキシダーゼ（ウサギまたはマウス）接合Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）と室温で３０分間インキュベートする。二次抗体を検出するために、ジアミノベンジジン（DakoCytomation）をクロモゲンとして使用し、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリン（Sigma-Aldrich）対比染色で対比染色する。すべての工程間、スライドを洗浄バッファー（DakoCytomation）で濯ぐ。次に、スライドをＰｅｒｔｅｘ（登録商標）（Histolab）マウンティング媒体(mounting media)に乗せる。
染色処理を確認する道具として、２つのコントロール細胞株、例えば、ＲＢＭ３タンパク質を発現する細胞（陽性細胞株）を有する１つのスライド、および不明確に弱いまたは非存在のＲＢＭ３タンパク質発現を有する細胞（陰性細胞株）を有する１つのスライドを使用し得る。当業者は、このような細胞株を提供する方法を、例えば、Rhodesら (2006) The biomedical scientist, p 515-520の記載により理解できる。コントロール系スライドは、他のスライドと同じ処理において同時に染色され得、すなわち、同じ一次および二次抗体とインキュベートされ得る。
例えば、対象由来の腫瘍組織スライド、染色参照スライド、および所望により、コントロール細胞株を有するスライドを、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ Ｔ２自動スライドスキャンニングシステム（Aperio Technologies）を使用して光学顕微鏡において×２０拡大でスキャンし得る。しかしながら、このスキャンニング工程は必ずしも必要としないが、例えば、スライドの調製および染色ならびに染色されたスライドの評価（以下参照）が種々の位置で、または種々の個体により実施されるとき、処理を簡単にさせ得る。
コントロール細胞株を使用するとき、これらを染色処理を確認するために検査する。細胞株が許容される基準外の染色結果、例えば、当業者により認識される染色人工物を示すとき、組織サンプルの染色は有効でないと考え、全染色処理を新しいスライドで繰り返す。陽性および陰性細胞株が、それぞれ、強い染色強度および不明確に弱いか、または非存在の染色強度を示すとき、染色は有効であると考える。
患者からの腫瘍組織サンプル由来の染色されたサンプルスライドは、目視検査により手動で評価され、それぞれのスライドのサンプル値（ＮＳ）は、上記にしたがって決定される。評価および決定を行う人は、染色された陽性および陰性参照スライドの目視検査によって助けられる。
次に、患者由来の腫瘍組織サンプルのサンプル値を参照値と比較する。２つ以上のサンプルスライドが評価され、それにより２つ以上のサンプル値が得られるとき、参照値と比較されるサンプル値は、得られるサンプル値の平均または中央値であってもよい。
参照値は４のＮＳであり得る。このような場合、試験された患者は、サンプルのＮＦが４よりも高いとき、比較的良好な予後を有する患者のグループに、サンプルのＮＦが４以下であるとき、比較的乏しい予後を有する患者のグループに属すると結論づける。それぞれのグループの予後は、図において示されるとおり二分されたデータから読むことができ、曲線より上は比較的良好な予後を有する患者のグループを示し、曲線より下は比較的乏しい予後を有する患者のグループを示す。例えば、比較的良好な予後は、約７５％の平均５年全生存であり得、比較的乏しい予後は、約２９％の平均５年全生存であり得る（図１Ａ）。
対象の癌が早期（すなわちＴａまたはＴ１）と診断されるとき、それぞれの予後は、例えば、図１Ｂにおいて、このような早期癌を有する対象にもっぱら基づく二分されたデータから読むことができる（良好な予後および乏しい予後：それぞれ約８４％および約４１％）。
本明細書で言及される、限定はしないが刊行物、ＤＮＡまたはタンパク質データ入力、および特許を含む全ての引用資料は、出典明示により本明細書に包含させる。
本発明は、このように記載されているが、様々に変化し得ることは明らかである。このような変化は、本発明の精神および範囲から逸脱すると見なされるべきでなく、このような修飾は全て、当業者に明らかであるため、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。

Claims (16)

  1. 膀胱癌を有する哺乳動物対象が第１または第２のグループのいずれに属するかを決定する方法であって、第１のグループの対象の予後が第２のグループの対象の予後よりも良く、
    ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
    ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
    該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
    ｃ１）該対象が第１のグループに属すると結論づけ、
    該サンプル値が該参照値以下であるとき、
    ｃ２）該対象が第２のグループに属すると結論づける
    工程を含む方法。
  2. 第１および第２のグループが、試験される対象の膀胱癌と同じ期の膀胱癌を有する対象のみからなる、請求項１に記載の方法。
  3. 第１および第２のグループが、試験される対象の膀胱癌と同じ悪性度の膀胱癌を有する対象のみからなる、請求項１に記載の方法。
  4. 膀胱癌を有する哺乳動物対象に対する予後を決定する方法であって、
    ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
    ｂ）該サンプル値を参照予後と関連する参照値と比較し、
    該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
    ｃ１）該対象に対する予後が該参照予後よりも良いと結論づけ、
    該サンプル値が該参照値以下であるとき、
    ｃ２）該対象に対する予後が該参照予後よりも悪いか、または同等であると結論づける
    工程を含む方法。
  5. 該予後が生存、例えば、全生存、無再発生存または膀胱癌特異的生存である、請求項１または２に記載の方法。
  6. 膀胱癌を有する対象が膀胱癌の処置レジメンの必要性がないかを決定する方法であって、
    ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
    ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
    該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
    ｃ）該対象が膀胱癌の処置レジメンの必要性がないと結論づける．
    工程を含む方法。
  7. 膀胱癌を有する対象に対する非処置戦略方法であって、
    ａ）対象から早期に得られたサンプルの少なくとも一部におけるＲＢＭ３の量を評価し、評価された量に対応するサンプル値を決定し、
    ｂ）該サンプル値をあらかじめ決められた参照値と比較し、
    該サンプル値が該参照値よりも高いとき、
    ｃ）膀胱癌の処置レジメンでの該対象の処置を控える
    ことを含む方法。
  8. 膀胱癌の処置レジメンが、根治的膀胱切除術(radical cystectomy)および／または放射線療法を含む、請求項６−７のいずれかに記載の方法。
  9. 膀胱癌が尿路上皮癌である、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
  10. 膀胱癌が扁平上皮癌である、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
  11. 膀胱癌がＴａ期またはＴ１期である、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
  12. 該サンプルが膀胱腫瘍組織サンプルである、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
  13. 工程ａ）が
    ａＩ）評価されるＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能である定量化可能なアフィニティーリガンドを該サンプルに適用し、該適用は、サンプルに存在するＲＢＭ３タンパク質へのアフィニティーリガンドの結合を可能にする条件下で実施し、
    ａＩＩ）該サンプルに結合したアフィニティーリガンドを定量し、該量を評価する
    ことを含む、請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
  14. 膀胱癌に対する予後のマーカーとしての、ＲＢＭ３タンパク質のエキソビボでの使用。
  15. 膀胱癌に対する予後診断薬の生産、選択または精製のための、ＲＢＭ３タンパク質またはその抗原的に活性なフラグメントの使用。
  16. 膀胱癌に対する予後診断薬としての、ＲＢＭ３タンパク質と選択的相互作用が可能であるアフィニティーリガンドのエキソビボでの使用。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2396657B1 (en) * 2009-02-16 2013-11-13 Atlas Antibodies AB Rbm3 as a marker for malignant melanoma prognosis
EP2746768A1 (en) * 2012-12-20 2014-06-25 Atlas Antibodies AB Podxl in bladder cancer
EP3023791A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-25 Atlas Antibodies AB Predicting the responsiveness to gemcitabine treatment
CN110195109A (zh) * 2019-07-03 2019-09-03 北京太东生物科技有限公司 Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010092190A2 (en) * 2009-02-16 2010-08-19 Atlas Antibodies Ab Prediction of response to platinum-based therapy

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
GB9917027D0 (en) 1999-07-20 1999-09-22 Affibody Technology Sweeden Ab In vitro selection and optional identification of polypeptides using solid support carriers
US20040076955A1 (en) * 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
CA2528669A1 (en) * 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
WO2007027906A2 (en) 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways
WO2007084486A2 (en) 2006-01-13 2007-07-26 Battelle Memorial Institute Animal model for assessing copd-related diseases
US20090186042A1 (en) * 2006-02-27 2009-07-23 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Identification and use of novopeptides for the treatment of cancer
WO2008021290A2 (en) * 2006-08-09 2008-02-21 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
EP2090890A1 (en) 2008-02-15 2009-08-19 Atlas Antibodies AB RBM3 as a marker for breast cancer prognosis
US7902166B2 (en) 2008-04-03 2011-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Compositions comprising inhibitors of RNA binding proteins and methods of producing and using same
CN102132311A (zh) * 2008-07-01 2011-07-20 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 用于评价临床不育的方法和系统

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010092190A2 (en) * 2009-02-16 2010-08-19 Atlas Antibodies Ab Prediction of response to platinum-based therapy
JP2012518164A (ja) * 2009-02-16 2012-08-09 アトラス・アンティボディーズ・アクチボラゲット 白金に基づく治療に対する応答の予測

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