CN110195109A - Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症的诊断和治疗领域，具体涉及Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用。本发明公开了Rbm46 mRNA或蛋白的定量检测剂在制备用于睾丸肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中降低的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量是睾丸肿瘤的指征和/或睾丸肿瘤预后不良的指征。Rbm46 mRNA或蛋白的测量可以用于睾丸肿瘤的检测或诊断，或患者预后情况的评估与监测，具有重要的临床应用价值。

Description

Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用。
背景技术
睾丸肿瘤是泌尿系统较常见的肿瘤之一，发病人群多为男性轻壮年，几乎均属恶性。睾丸癌占全身恶性肿瘤的1％，占泌尿生殖系统恶性肿瘤的3％～9％。睾丸癌的发病率有人种和地区的差异，白人睾丸癌的发病率比非白人高，美国白人发病率约为6/10万，非洲发病率为1/10万，且有逐年上升的趋势。睾丸肿瘤分原发性和继发性两类，绝大多数都是原发的，继发性极为罕见。睾丸肿瘤几乎都是恶性的，其中生殖细胞肿瘤占90％～95％，非生殖细胞肿瘤占5％～10％。生殖细胞肿瘤中以精原细胞瘤最常见，约占睾丸原发性肿瘤的40％～50％，胚胎性癌次之，约为20％～30％，再次为畸胎瘤，约为10％左右，其他细胞类型睾丸肿瘤少见。其病因尚不明了，目前认为其发病与遗传和后天因素均有关系。其中与隐睾关系最密切，隐睾发生肿瘤的机会比正常人大10～14倍，腹腔内隐睾比腹股沟更高，而睾丸固定术并不降低恶性变的发病率，但可使肿瘤更易被发现。
近10年来睾丸癌在治疗上取得了很大的进展，主要是探索出各种有效的综合化疗方案。但早期睾丸癌无明显临床症状，睾丸癌初次的误诊率高达25％。当睾丸生殖细胞肿瘤数目增殖达到105时，现有的影像学检查尚不能发现它。目前缺乏敏感性与特异性的理想肿瘤标记物，因此寻找特异性较高的睾丸癌标记物具有很大的临床意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及Rbm46 mRNA或蛋白的定量检测剂在制备用于睾丸肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中降低的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量是睾丸肿瘤的指征和/或睾丸肿瘤预后不良的指征。
通过对睾丸患者组织进行比较研究，在睾丸癌细胞中发现一个特异表达的基因Rbm46，Rbm46 mRNA或蛋白在睾丸的正常细胞和组织中高表达，而在睾丸癌细胞中显著低表达，并且该基因的表达高低与临床病理学参数有显著相关性，具有重要的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请一个实施例中Rbm46 mRNA在睾丸癌肿瘤中表达情况；
图2本申请一个实施例中Rbm46蛋白在睾丸癌肿瘤中表达情况；其中1#、2#、3#代表不同的样本编号。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明涉及Rbm46 mRNA或蛋白的定量检测剂在制备用于睾丸肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中降低的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量是睾丸肿瘤的指征和/或睾丸肿瘤预后不良的指征。
上述，需要理解的是，本发明提供一种用于睾丸肿瘤预后评估判断的新标记物：Rbm46 mRNA或蛋白。经过临床研究证实，其在睾丸肿瘤中低于正常组织的表达量。癌组织中Rbm46 mRNA或蛋白低水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，Rbm46 mRNA或蛋白作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行睾丸肿瘤预后判断的阳性率。
在本申请中，睾丸肿瘤可以是良性，也可以是恶性的，例如晚期或转移性恶性睾丸瘤。睾丸瘤也可以用术语“睾丸癌”所替代。
术语“晚期或转移性恶性睾丸瘤”是指组织学或细胞学上所证实诊断的晚期、不可切除和/或转移性复发或难治性恶性睾丸瘤，其对标准疗法无效或不存在经证明对其有效的疗法。
Rbm46蛋白即RNA binding motif protein 46，其在现有技术中常常被认为是癌症-睾丸抗原(Cancer-testis antigens，CTAs)。CTAs在配子组织中具有特异性正常表达并且在癌症中具有异常表达。然而，本公开发明人意外地发现Rbm46 mRNA或蛋白在睾丸肿瘤与癌旁组织中的表达量存在显著性差异，提示Rbm46 mRNA或蛋白可作为睾丸癌的诊断和/或预后评估标志物。
在本发明中，Rbm46 mRNA或蛋白为动物来源，优选为灵长类动物，更优选为人。
术语“Rbm46 mRNA的定量检测剂”在本发明中不应仅仅理解为对Rbm46 mRNA的检测剂，而应包括被本领域技术人员所知的其余可反映Rbm46 mRNA表达水平的检测试剂。例如可通过定量检测Rbm46 mRNA反转录所得的cDNA对Rbm46 mRNA的表达量进行间接检测。
在本发明中，若无特别声明，“Rbm46 mRNA”以及“Rbm46蛋白”可被“标志物”、“标志物基因”(特指Rbm46 mRNA)、“生化标志物”、“标志物多肽”(特指Rbm46蛋白)、“睾丸肿瘤标志物”或“睾丸癌标志物”所替换。其具体指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。
在本发明中用作标志物的Rbm46 mRNA预期包括其全长核糖核苷酸序列，或天然存在的变体，或全长序列及变体的片段，特别是可被检测并确定具体序列的片段，更优选为能够在睾丸组织中与其他RNA序列相区分的片段。优选地包含所述全长核糖核苷酸序列的至少7、8、9、10、11、12、15或20个连续的核糖核苷酸。
在本发明中用作标志物的Rbm46蛋白预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。“Rbm46蛋白”的表述包括Rbm46的完整蛋白序列，及上述所定义的所述标志物多肽。
本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的核糖核苷酸/蛋白/多肽或存在于胞外基质中的核糖核苷酸可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。如熟练的技术人员将明白的，mRNA、蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
“天然存在的变体”应被理解为，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与癌症相关疾病相关的具有与标志物基因的活性相似的活性的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
RNA的定量检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸等；常见情况下RNA的检测剂可以选自RT-PCR的引物，以及用于扩增RT-PCR的产物——cDNA的引物；
在一些实施方式中，所述Rbm46 mRNA的定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
实时荧光定量PCR、数字PCR、荧光染料法、共振光散射法、测序或生物质谱法。
在一些实施方式中，所述Rbm46 mRNA的定量检测剂为能够特异性结合Rbm46 mRNA或Rbm46 cDNA的探针或引物。
也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。同样，应理解，“标志物基因的同源物”在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40％，在某些情况下50％，在某些情况下60％，在某些情况下70％，在某些情况下80％，在某些情况下90％和在某些情况下95％或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至100bp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3′区域必须与标志物基因互补，而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。
在一些实施方式中，所述探针或引物带有可检测的标记。
在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
在一些实施方式中，Rbm46蛋白的定量检测剂是特异性地测量Rbm46蛋白所需的试剂。
在一些实施方式中，特异性地测量Rbm46蛋白所需的试剂(特异性的结合剂)是，例如，Rbm46蛋白的配体或受体(如果存在的话)、结合Rbm46蛋白的凝集素、结合Rbm46蛋白的适配体或结合Rbm46蛋白的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有108l/mol、或更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语"特异性的"表示，样品中存在的其它生物分子不与Rbm46蛋白的特异性的结合剂发生显著的结合。
优选地，与除靶分子(Rbm46蛋白)之外的生物分子结合的水平产生这样的结合亲和力，其最多分别是与靶分子亲和力的仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少、或仅1％或更少。优选的特异性的结合剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段可通过以Rbm46蛋白或其片段作为抗原免疫得到，免疫对象可以选择包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。
在一些实施方式中，所述抗体或抗体片段标记有显示信号强度的指示剂。
根据本发明的一方面，本发明还涉及Rbm46 mRNA的qRT-PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。
该引物可用于人睾丸癌的诊断和/或预后评估。
根据本发明的一方面，本发明还涉及用于检测Rbm46 mRNA表达水平的试剂盒，其包括如上所述的引物。
该试剂盒可用于人睾丸癌的诊断和/或预后评估。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括反转录试剂、内参引物、用于指示DNA合成量的荧光物质、qPCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述内参引物选自GAPDH、tubulin或actin的引物。
在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如反渗水(Reverse osmosisWater)、蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括血清β-HCG、AFP和LDH中的一种或多种的检测试剂。
血清AFP、HCG、LDH浓度升高提示睾丸癌或其预后不良，血清高浓度HCG是预后不良的一个强有力因素，若浓度持续升高，复发的危险也相应增加。国际生殖细胞肿瘤合作小组(IGCCCG)已将血清HCG、AFP、LDH浓度联合检测作为转移性生殖细胞肿瘤分类的依据，根据标志物的浓度可将肿瘤分为预后较好、一般、较差，原发性肿瘤及有无肺脏转移。本发明所提供的Rbm46 mRNA/蛋白可与上述分子标记联合用于更为精准地检测睾丸肿瘤。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种评估睾丸肿瘤的方法，所述方法包括：
(a)测量样品中的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量，(b)任选地，测量样品中的一种或更多种其它的睾丸肿瘤标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估睾丸癌，其中降低的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量是睾丸癌的指征。
在一些实施方式中，步骤a)中使用如上所述的特异性地定量测量Rbm46 mRNA或蛋白所需的试剂进行测量。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。确定受试者样品和所述正常对照样品相比，是否患有睾丸肿瘤的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。此外，可使用生化标志物(例如，血清AFP、HCG、LDH或本公开证实的Rbm46 mRNA或蛋白)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
在一些实施方式中，所述方法用于睾丸肿瘤预后评估。
在一些实施方式中，所述测量样品包括血液(全血)、血清、血浆、细胞培养上清、唾液、脑脊髓液、精液、前列腺液、组织或组织裂解液。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
定量PCR检测RBM46基因在睾丸癌组织中的表达。
睾丸癌组织与癌旁正常组织取自肿瘤医院，置于RNAlater试剂中，保存在-80℃冰箱。首先，进行细胞总RNA提取。将所有操作均低温进行。
使用Trizol试剂进行细胞总RNA的提取，
(一)试剂准备
1.TRIzol试剂。
2.氯仿
3.异丙醇
4. 75％乙醇(DEPC H2O配制)
5.DEPC H2O
具体步骤如下：
1.对组织加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min，使其充分裂解。
2.加入0.2ml氯仿，振荡混匀，室温放置10min。
3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。
4.加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5.4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6.加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
7.晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。
通过测OD值测定RNA的质量和浓度，A260/A280值在1.6～1.8之能够确保RNA的纯度。
第二步，使用PrimeScriptTM RT Reagent反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，PCR反应条件为：42℃17min(反转录)，85℃5s(热激终止反应)。
第三步，定量PCR鉴定Rbm46基因的表达量。按照下表所示试剂及浓度加入PCR反应管中最后加入RNA样品。
在PCR仪中设置反应条件为：预变性95℃10s，变性95℃5s，退火/延伸60℃34s，共40个循环，以GAPDH作为相对定量内参。2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
通过检测了癌组织以及癌旁正常组织中Rbm46的表达量(图1)，所有样本均发现Rbm46在癌组织中低表达。这些结果表明Rbm46在睾丸癌中很可能扮演着重要作用。
实施例2
Rbm46蛋白水平检测(Western blot)
采用Western blot方法对上述睾丸癌组织与癌旁正常组织进行蛋白水平表达量的检测，具体方法如下：
(1)制胶：
洗玻片：先用洗洁精洗净，再用无水乙醇冲洗，晾干或用吹风机吹干；
根据所给配方配制分离胶(下层胶)及浓缩胶(上层胶)。
装好装置，对齐玻板，保持底部齐平，高面在里，压紧防漏(可用乙醇测试)；
加入分离胶至绿色板底线附近，再加入1-2ml无水乙醇压平；
30min-1h可见分层，倒去乙醇，滤纸吸干；
加入浓缩胶至溢出，插入梳子，注意勿留气泡，放置30min。
(2)样品处理：取样品(含50μg蛋白)与loading buffer混合，97℃～98℃，5min；
(3)上样：拔下梳子，依次将样品和蛋白Marker加入上样孔，每孔上样20μl；
(4)电泳：以80V恒压进行电泳，待溴酚蓝跑到分离胶内时，换用120V恒压电泳，待溴酚兰染料跑到胶底即可；
(5)电转：
1.现用现配转膜液，4℃保存；PVDF膜、滤纸、海绵，在转膜液中浸泡10min(PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min～2min。再用转膜液涮一下。目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合)。
2.取出胶，将上层胶切去，下层胶底部切掉一点，放入转膜液中浸泡。
3.夹‘三明治’：黑面-海绵-3滤纸-胶-PVDF膜-3滤纸-海绵-白面，注意不要留气泡。
4.装好装置(红对红，黑对黑)，并将1L转膜液倒入到电泳槽中，恒电流200mA，1.5h，周围置冰防过热。
5.转膜结束，在膜上做好标记，封闭；
(6)一抗(sigma,HPA050601，1：2000)4℃孵育过夜；
(7)PBST洗膜；加入HRP标记的二抗室温孵育40min；
(8)PBST洗膜；
(9)显影：PBST多洗几次，ECL试剂盒中A、B液等体积混匀，滴加在膜正面，再反过来，暗室显影。
RBM46蛋白在睾丸癌肿瘤中表达情况如图2所示，其中肿瘤组织的RBM46蛋白表达水平显著性低于癌旁组织(p<0.05)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京太东生物科技有限公司
<120> Rbm46作为睾丸肿瘤标志物的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcccagag ttacttcatg cc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagctgcgat ggaaattgta gt 22

Claims (10)

1.Rbm46 mRNA或蛋白的定量检测剂在制备用于睾丸肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中降低的Rbm46 mRNA或蛋白的表达量是睾丸肿瘤的指征和/或睾丸肿瘤预后不良的指征。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Rbm46 mRNA的定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
实时荧光定量PCR、数字PCR、荧光染料法、共振光散射法、测序或生物质谱法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Rbm46 mRNA的定量检测剂为能够特异性结合Rbm46 mRNA或Rbm46 cDNA的探针或引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述探针或引物带有可检测的标记。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Rbm46蛋白的定量检测剂包括能够特异性结合Rbm46蛋白的凝集素、适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述能够特异性结合Rbm46多肽的检测剂为抗体或抗体片段。
7.Rbm46 mRNA的qRT-PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ IDNO：2所示。
8.用于检测Rbm46 mRNA表达水平的试剂盒，其包括权利要求7所述的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录试剂、内参引物、用于指示DNA合成量的荧光物质、qPCR反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、水中的一种或多种。
10.根据权利要求7～9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血清β-HCG、AFP和LDH中的一种或多种的检测试剂。
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