CN107385091B - Cdc42bpa作为结直肠癌转移诊断与预测预后的生物标志物 - Google Patents

Cdc42bpa作为结直肠癌转移诊断与预测预后的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了癌症、尤其是结直肠癌诊断和预测预后的生物标志物和方法。具体而言，本发明涉及蛋白标记在预测癌症如结直肠癌诊断和预测预后的应用；在另一方面，本发明还涉及了一种预测癌症患者长期存活可能性的方法。根据本发明的研究成果，可以开发用于结直肠癌诊断和预测预后的试剂盒，该试剂盒在临床上具有广泛的应用前景。

Description

CDC42BPA作为结直肠癌转移诊断与预测预后的生物标志物
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断领域，更具体地，本发明涉及以检测蛋白表达异常为手段的肿瘤诊断方法。
背景技术
结直肠癌为消化系统中最常见的恶性肿瘤，2010年美国癌症统计数据官方显示：其发病率为51.3/10万人，发病率位居所有癌症的第三位，仅次于肺癌和乳腺癌，结直肠癌70％分布在直肠及乙状结肠，其死亡率也已跃升至常见肿瘤的第3位。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率均高于世界平均水平，国内有学者对我国的结直肠癌的分析研究后显示：2009年我国结直肠癌发病率为29.44/10万人，死亡率为14.23/10万人，男性高于女性，城市高于农村，如何预防及诊疗结直肠癌是目前亟需解决的问题。
组织病理学研究显示：结直肠癌98％为腺癌，其它为鳞癌、印戒细胞癌等，其癌前病变普遍认为主要为息肉样病变。结直肠癌的发病原因至今是困扰人类的重大难题，一方面认为是与基因密切相关，另一方面亦与患者的日常生活习惯息息相关，即与患者日常生活中大量摄入高脂肪和纤维素摄入不足有很大的关系。
随着医疗技术的不断发展，结直肠癌的诊断技术水平也在不断的提高，目前诊断结直肠癌的方法有粪便潜血实验、基因标记法，纤维结肠镜检查及影像学检查。虽然结直肠癌的诊断技术水平及治疗水平在不断提高，但其术后生存率一直不高，术后5年的总生存率为30-80％左右。
结直肠癌的侵袭转移是造成结直肠癌病人死亡的主要原因，肿瘤的发生发展及转移是一个多阶段，多步骤，并由多种基因及信号通路共同参与的复杂过程。目前针对肿瘤远端转移的主要学说有：
1、直接侵袭；侵袭性较强的肿瘤细胞突破基底膜直接蔓延到邻近部位；
2、淋巴转移：肿瘤细胞进入淋巴循环内，通过淋巴管由近及远转移到各级淋巴结。除此之外，肿瘤直接转移至较远淋巴结的跳跃式转移也时常可见；淋巴结的肿瘤侵袭情况将直接影响患者的肿瘤分期，对病情及预后的评估极为重要；
3、血行转移：肿瘤细胞代谢较正常细胞显著增大，这促进了瘤体内部新生血管的形成。肿瘤细胞可脱离瘤体进入血管，并随血流转移至远隔部位如肝、骨、肺、脑等处，形成转移病灶；
4、种植：肿瘤往往起源于粘膜层，随着病情的进展，肿瘤最终可突破浆膜层，肿瘤细胞脱落并种植到腹腔内其他器官表面，如腹膜或卵巢上。
大量研究证实，发生转移的肿瘤组织与未发生转移的肿瘤组织存在大量差异性表达基因。在肿瘤发生发展过程中，由于这些转移相关的差异性表达基因导致了肿瘤细胞的代谢、运动能力、粘附性及外分泌蛋白出现了改变，从而导致了肿瘤细胞较高的侵袭性与转移性。因此，探寻结直肠癌发生发展过程中转移相关关键分子，寻找肿瘤转移诊断生物分子标记物，为肿瘤个性化治疗提供参考依据；阐明肿瘤发生发展及转移过程中的相关分子调控机制，为肿瘤治疗靶点提供理论依据是当今肿瘤研究的热点，也是提高人类对恶性肿瘤的认识，并改善肿瘤患者生存及预后的必经之路。
发明内容
在本发明中，提供了一个经识别在结直肠癌和癌旁组织中差异表达的标记。该标记是CDC42BPA，可用作预后信号用于标记结直肠癌患者发展进程。
根据癌症是否发生转移，基因标记的准确性会有差异。通过将本发明的标记整合到预后信号中可提高预测的准确性，其相比单基因方法可提供更有效的个体检测。本发明还提供技术的应用，如预后信号的统计，机器学习，人工智能，和数据挖掘以产生预测模型。患者肿瘤中用作预后信号的标记的表达水平可被应用到判断预后的预测模型中。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测CDC42BPA的试剂在制备结直肠癌转移诊断、结直肠癌预测预后工具中的应用。
进一步，所述检测CDC42BPA的试剂包括检测CDC42BPA基因表达的试剂。
更进一步，所述检测CDC42BPA的试剂包括能够定量CDC42BPA基因mRNA的试剂，和/或能够定量CDC42BPA蛋白的试剂。
本发明的定量CDC42BPA基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、半定量地、或定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量CDC42BPA基因mRNA的试剂可以是CDC42BPA基因或转录本的特异性引物，也可以是CDC42BPA基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增来制备。
本发明的定量CDC42BPA蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量CDC42BPA蛋白的试剂包括特异性结合CDC42BPA蛋白的抗体。
所述的抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，基于小鼠/兔子的杂交瘤技术和基于噬菌体抗体展示库的抗体筛选技术等。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍认可的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或多肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或多肽，添加用DMSO、缓冲剂等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒，诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
本发明用于CDC42BPA基因表达检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本领域技术人员公知，肿瘤组织的细胞会脱落到体液中，这些脱落的细胞称之为循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的性质同肿瘤组织中肿瘤细胞的性质相同，因此检测体液中尤其是血液中循环肿瘤细胞的性质就可以代表肿瘤组织的性质。就本发明而言，通过检测肿瘤组织中CDC42BPA基因表达可以用于诊断结直肠癌转移，也可以通过检测循环肿瘤细胞中CDC42BPA基因表达来诊断结直肠癌转移。
本发明还提供了一种用于结直肠癌转移诊断、结直肠癌预测预后的工具，所述工具能够检测CDC42BPA基因表达。
进一步，所述工具包括能够定量CDC42BPA基因mRNA的试剂，和/或能够定量CDC42BPA蛋白的试剂。
进一步，所述能够定量CDC42BPA基因mRNA的试剂包括CDC42BPA基因特异性扩增引物和/或特异性探针；所述能够定量CDC42BPA蛋白的试剂包括特异性结合CDC42BPA蛋白的抗体。
通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。
进一步，所述用于结直肠癌转移诊断、结直肠癌预测预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸和/或蛋白的试剂，例如用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测结直肠癌转移的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于CDC42BPA基因或其转录本、或CDC42BPA蛋白的检测来判断结直肠癌转移的试剂均包含在本发明范围内。
本发明还提供了一种结直肠癌转移诊断、结直肠癌预测预后的方法，所述方法包括但不限于免疫组织化学法、Western印迹等，能够判断结直肠癌已经发生转移、或者预测结直肠癌转移的受试者预后不良、或者评估结直肠癌转移的受试者已经复发。
本发明的“CDC42BPA基因”(NC_000001.11(200551497..200620791))序列可以NCBI数据库中进行查询。
在本发明的上下文中，“结直肠癌转移诊断”包括判断受试者是否已经发生结直肠癌转移、判断受试者是否存在结直肠癌转移的风险、判断结直肠癌转移患者是否已经复发转移。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中GM2A基因或GM2A蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的人相比，更有可能观察到特定过程或结果。
如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体。
如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的DNA的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该DNA可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型FR3-CDR3-FR4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR域。
“单克隆抗体”是由单克隆的B-淋巴细胞或由已经将编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染至其中的细胞或其后代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞来进行。这些融合细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。
“多特异性抗体”可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如Tutt等,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实CDC42BPA基因表达与结直肠癌组织转移与预后的密切相关性。该相关性的提出为结直肠癌转移的诊断与治疗提供了新的途径。
附图说明
图1显示原发性结直肠癌组织中CDC42BPA蛋白表达水平的免疫组化结果图，其中A：显示了染色参考标准(200×)，左至右依次表示：1为阴性(Negative)、2为弱阳性(Weak)、3为中阳性(Moderate)、4为强阳性(Strong)；B：2例原发性结直肠癌组织和自身癌旁组织染色图(200×)；C：原发性结直肠癌组织和自身癌旁组织中CDC42BPA蛋白染色强度百分比分布图；
图2显示结直肠癌患者的Kaplan-Meier生存曲线分析图；
图3显示结直肠癌淋巴结转移瘤组织中CDC42BPA蛋白表达水平的结果图，其中，A：结直肠癌原发病灶和淋巴结转移病灶中CDC42BPA蛋白的免疫组化结果图(200×)，B：原发性结直肠癌组织和对应淋巴结转移瘤组织中CDC42BPA蛋白染色强度百分比分布图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例Cdc42BPA蛋白表达与结直肠癌转移和生存率的相关性研究
1、组织微阵列
对包含有100例结直肠癌组织和80例癌旁组织(Shanghai Outdo Biotech，Shanghai，China)的组织微阵列(TMA)进行Cdc42BPA的免疫组化分析，以确定Cdc42BPA蛋白表达水平与预后的相关性。
对包含有33对结直肠癌原发病灶和与之对应的淋巴结转移病灶的另一个组织微阵列(TMA)(Biomax,Rockvile,MD)进行Cdc42BPA的免疫组化分析，以比较原发病灶和转移病灶的Cdc42BPA蛋白表达差异，进而确定Cdc42BPA蛋白表达水平与肿瘤转移的相关性。
2、免疫组织化学法
(1)将石蜡包埋的TMA在二甲苯中脱蜡，重复一次；
(2)梯度酒精(100％,95％,90％,80％,70％)中水化；
(3)3％过氧化氢去除组织内源性酶；
(4)柠檬酸缓冲液进行抗原修复；
(5)正常血清封闭后，Cdc42BPA一抗4℃孵育过夜；
(6)磷酸盐缓冲液洗涤数次，与相对应的生物素标记二抗孵育；
(7)磷酸盐缓冲液洗涤数次，与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育；
(8)以DAB为底物进行免疫组化的显色，并用苏木素进行复染；
(9)对TMA进行芯片扫描，并进行如下分析：根据染色强度分为(1-4)四个等级，1分代表阴性，2分代表弱阳性，3分代表中阳性、4分代表强阳性。芯片判别由两名观察者独立评估，分值为1～2的被认为是Cdc42BPA低表达，分值为3～4的被认为Cdc42BPA高表达。
3、实验结果
(1)Cdc42BPA蛋白表达
为了研究Cdc42BPA在人类肿瘤中的临床意义，采用免疫组织化学方法检测了Cdc42BPA的表达水平，采用组织微阵列法分析了100例原发性结直肠癌组织和80例癌旁组织中Cdc42BPA蛋白的表达水平。如图1A-1C所示，大多数肿瘤病例与癌旁组织相比，Cdc42BPA表现了强的胞质阳性。值得注意的是，49.5％(49/99)的结直肠癌组织显示中度或强的Cdc42BPA表达，而在癌旁组织中仅有22.5％(18/80)。与此同时，50.5％(50/99)的肿瘤组织没有或有较弱的Cdc42BPA表达，而癌旁组织中却占了77.5％(62/80)。
(2)Cdc42BPA蛋白表达与结直肠癌临床病理指标之间的关系
收集外科手术切除原发结直肠癌标本99例，经10％福尔马林固定，石蜡包埋，病理证实为结直肠癌，根据国际抗癌联盟(UICC)2003年修正版的TNM分期对患者资料进行归类，详细临床信息见表2所示。病人术前均未接受放疗或化疗。
采用免疫组化的方法对各样本进行Cdc42BPA表达的检测，将标本分为Cdc42BPA低表达组和Cdc42BPA高表达组。分析Cdc42BPA蛋白表达与结直肠癌临床病理指标之间的关系。
表2的结果显示，Cdc42BPA的高表达与淋巴结转移(P＝0.002)和远端转移(P＝0.026)显著相关。
表2 Cdc42BPA蛋白表达与结直肠癌临床病理指标之间的关系
Figure BDA0001401756380000091
(3)Cdc42BPA蛋白与结直肠癌预后的关系
对上述99例结直肠癌患者进行术后随访，调查资料可靠，术后随访资料由医生通过患者门诊复查及电话等方式获得。
Kaplan-Meier生存分析表明，较Cdc42BPA低表达的患者(中位生存期＝25.5个月)，Cdc42BPA高表达的患者(中位生存期＝15.0个月)具有更短的存活时间。Log-rank分析显示，Cdc42BPA的高表达与不良预后显着相关(Log-rank＝6.447，P＝0.011，图2)。
(4)结直肠癌原发病灶及淋巴结转移病灶中Cdc42BPA蛋白表达差异
对包含有33例结直肠癌原发性病灶和对应的淋巴结转移病灶的组织微阵列进行Cdc42BPA蛋白的表达分析。数据显示，大多数转移性病灶的Cdc42BPA表达水平明显高于对应的原发性病灶(图3)，证实了以上的研究成果，即Cdc42BPA蛋白的高表达与肿瘤的转移和不良预后显著相关，且Cdc42BPA可以作为结直肠癌诊断和预测预后的一个指标。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.检测CDC42BPA蛋白表达的试剂在制备中国结直肠癌淋巴结转移的诊断工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测CDC42BPA蛋白表达的试剂包括特异性结合CDC42BPA蛋白的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括提取组织蛋白的试剂。
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