JP7300687B2 - 肝細胞癌診断用バイオマーカーセレブロンと、これに特異的な新規なモノクローナル抗体 - Google Patents
肝細胞癌診断用バイオマーカーセレブロンと、これに特異的な新規なモノクローナル抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7300687B2 JP7300687B2 JP2021556490A JP2021556490A JP7300687B2 JP 7300687 B2 JP7300687 B2 JP 7300687B2 JP 2021556490 A JP2021556490 A JP 2021556490A JP 2021556490 A JP2021556490 A JP 2021556490A JP 7300687 B2 JP7300687 B2 JP 7300687B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- crbn
- hepatocellular carcinoma
- protein
- prognosis
- measured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Description
(a)個体から分離された生物学的試料でCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)上記の測定されたレベルを、正常個体から分離された生物学的試料で測定されたレベルと比較する段階
(a)肝細胞癌患者の肝細胞癌組織とその周辺の正常組織から分離された生物学的試料中のそれぞれCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)上記の各試料で測定されたレベルを比較する段階
(d-1)上記(a)段階の肝細胞癌組織から分離された生物学的試料で測定されたCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルが、周囲の正常組織から分離された生物学的試料で測定されたものより2倍以上高い場合、CRBN高発現患者群に分類し、2倍未満の場合はCRBN低発現患者群に分類する段階と、
(d-2)高発現群患者および低発現群患者から分離された血液から、それぞれAFP(α-fetoprotein)値を測定する段階と、
(d-3)高発現群患者から分離された血液で測定されたAFP値が、低発現群の患者から分離された血液で測定された数値よりも高い場合、高発現患者群の患者が不良な予後を有すると判断する段階
[配列番号1]
MAGEGDQQDA AHNMGNHLPL LPAESEEEDE MEVEDQDSKE AKKPNIINFD TSLPTSHTYL
GADMEEFHGR TLHDDDSCQV IPVLPQVMMI LIPGQTLPLQ LFHPQEVSMV RNLIQKDRTF
AVLAYSNVQE REAQFGTTAE IYAYREEQDF GIEIVKVKAI GRQRFKVLEL RTQSDGIQQA
KVQILPECVL PSTMSAVQLE SLNKCQIFPS KPVSREDQCS YKWWQKYQKR KFHCANLTSW
PRWLYSLYDA ETLMDRIKKQ LREWDENLKD DSLPSNPIDF SYRVAACLPI DDVLRIQLLK
IGSAIQRLRC ELDIMNKCTS LCCKQCQETE ITTKNEIFSL SLCGPMAAYV NPHGYVHETL
TVYKACNLNL IGRPSTEHSW FPGYAWTVAQ CKICASHIGW KFTATKKDMS PQKFWGLTRS
ALLPTIPDTE DEISPDKVIL CL
(a)個体から分離された生物学的試料でCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)上記の測定されたレベルを、正常個体から分離された生物学的試料で測定されたレベルと比較する段階
(a)肝細胞癌患者の肝細胞癌組織とその周辺の正常組織から分離された生物学的試料中のそれぞれCRBN遺伝子のmRNAまたはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)上記の各試料で測定されたレベルを比較する段階
(d-1)上記(a)段階の肝細胞癌組織から分離された生物学的試料で測定されたCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルが、周囲の正常組織から分離された生物学的試料で測定されたものより2倍以上高い場合、CRBN高発現群に分類し、2倍未満の場合はCRBN低発現群に分類する段階と、
(d-2)高発現群患者及び低発現群患者から分離された血液で、それぞれAFP(α-fetoprotein)値を測定する段階と、
(d-3)高発現群患者から分離された血液で測定されたAFP値が、低発現群の患者から分離された血液で測定された数値より高い場合、高発現患者群の患者が不良な予後を有すると判断する段階
セレブロン(CRBN)抗原の産生
1-1。 CRBN配列中の抗原決定ペプチドの選定
配列番号1で示されるヒトCRBNタンパク質配列のうち、モノクローナル抗体の産生に適した抗原ペプチド配列を選定するために、各配列の親水性と疎水性の測定を行った。
[配列番号2]
予測 1:C-EDEMEVEDQDSKEAK(28-42aa、16mer)
[配列番号3]
予測 2:C-DMEEFHGRTLHD(63-74aa、13mer)
[配列番号4]
予測 3:C-EIYAYREEQDFGIE(140-153aa、15mer)
[配列番号5]
予測 4:C-GRQRFKVLELRTQSD(161-175aa、16mer)
[配列番号6]
予測 5:C-DRIKKQLREWDENLKD(255-270aa、17mer)
合成されたペプチドは、SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)を利用して、KLH(Keyhole limpet hemocyanin)とBSA(Bandeiraea simplicifolia agglutinin)に接合(conjugation)させた後、ELISAスクリーニングした。
ハイブリドーマ細胞の作製
2-1。 モノクローナル抗体の産生細胞株を製造するためのマウスの免疫
ハイブリドーマ細胞の製造に必要な免疫化されたマウスを得るために、上記の実施例1で製造された組換えCRBN抗原タンパク質PEP2、PEP4及びPEP5(それぞれ30μg/μl)を混合してリン酸緩衝液(phosphate buffered saline; PBS)150μlに希釈し、同じ体積のフロイント完全アジュバント(complete Freund’s adjuvant、Sigma)と混合してエマルションを製造した。 上記のエマルションを3週間隔で4回BALB/C(雌、8週齢)のマウスの腹腔内に200μlずつ注射した。 4回目の免疫から一ヶ月後、尾静脈に精製された組換えCRBNタンパク質を投与した3日後に、脾臓を摘出し細胞融合に使用した。
まず、細胞融合のために骨髄腫細胞(myeloma cell)を準備した。 骨髄腫細胞であるSP2/O細胞を培養し、細胞密度を2.5~5Х104/mlにした。 細胞融合の24時間前に、SP2/O細胞を3分の1に希釈して準備した。
上記の実施例2-2で製造した融合細胞群の中から、CRBNにのみ特異的に反応する融合細胞を選別し、抗体の産生有無を確認するために酵素免疫測定法を用いてスクリーニングした。
CRBNに対するモノクローナル抗体の産生と精製
3-1。 CRBNに対するモノクローナル抗体の産生
上記の実施例2で選択した最終的なハイブリドーマ細胞(「1D3」と「4E11」)からCRBNに対するモノクローナル抗体を産生するために、7~8週齢の雌Balb/Cマウス腹腔(abdominal cavity)にプリスタン(pristane)500μlを注射した。 75T/C培養フラスコで培養した融合細胞を回収し遠心分離した後、上清液を除去し、リン酸緩衝液に入れてピペット操作した。 プリスタン投与から7~10日後に、上記の実施例2で選択した融合細胞[1D3と4E11]をそれぞれ8Х105~4Х107にしてマウスの腹腔内に注射した。 5~7日後、マウスの腹腔内に腹水(ascites)が満水になった時、18G注射針を用いて腹水を抜いた。 腹水を4℃で一晩置き、翌日遠心分離して黄色の脂肪層を含む塊状物質を除去し、上清液だけを分離した。 分離した上清液は、分注して-20℃で保管した。
保存液(20%のエタノール)に保存されているProtein G Fast Flow Bedの適量をカラムに詰め、20%のエタノールを流し出した後、5 Bed Volumeの結合緩衝液(20 mM sodium phosphate、pH 7.0)で洗浄した。 腹水液をリン酸緩衝液で適量希釈した後、Protein Gカラムにロードした。 3 Bed Volumeの結合緩衝液(20 mM sodium phosphate、pH 7.0)に結合した後、3 Bed Volumeの溶出緩衝液(0.1 M glycine buffer、pH 3.0~2.5)で0.5mlずつ分画を溶出した。 各分画を35μlの中和緩衝液(1 M Tris-HCl、pH 9.0)で中和した。 70%エタノールで冷蔵温度で一晩置いた後、再び保存液(20%のエタノール)で、次回使用する時まで冷蔵保管した。 各分画の純度を確認するためにSDS-PAGEを行い、Ammersharm GEカラムで脱塩(desalting)した。
ハイブリドーマ細胞(1D3と4E11)のCRBN抗原に対する結合特異性の実験-ELISA
本発明のハイブリドーマ細胞(1D3と4E11)のCRBN抗原(PEP2、PEP4及びPEP5)の結合特異性を確認するために、ELISA実験により確認した。
アイソタイピング(isotyping)によるモノクローナル抗体の選別
上記の実施例3で製造したモノクローナル抗体のアイソタイプ(isotype)の決定のためELISAを実施した。 具体的には、ウサギから採取した、それぞれのマウス(mice)のアイソタイプに対する精製抗体を、炭酸塩緩衝液(carbonate buffer、pH 9.4)で10μg/ml濃度に希釈した後、Maxisorp ELISAプレート(Nunc、アメリカ)の各ウェル当たり100μlずつ添加し、4℃で16時間反応させ、抗体をコーティングした。 それぞれのアイソタイプ抗体がコーティングされた各ウェルに1%のBSAが含まれたブロッキング緩衝液(PBS、0.05%Tween-20、1%のBSA、3%熱不活性化ウマ血清)を処理して、37℃で1時間、非特異的反応を遮断した。 各ウェルにモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞培養液を50μlずつ添加し、4℃で1時間反応させた後、洗浄緩衝液(PBS、0.05%Tween-20、0.05%BSA)で3回洗浄した。 洗浄後、1:1000倍に希釈したHRP(Horseradish peroxidase)-縮合 抗-マウスIgG+IgA+IgM抗体(1:2000; Sigma、米国)を各ウェル当たり100μlずつ添加し、37℃で1時間反応させた後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。 洗浄後、TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)(Sigma、米国)基質溶液を各ウェルに100μlずつ添加し、雌牛で30分間反応させ発色させた後、2N H2SO4を処理して酵素反応を停止させた。 反応後、ELISAリーダー(Perkinelmer Victor X3)を利用して、450nmで吸光度を測定した。 その結果を[表2]に示した。
CRBN発現を確認するための免疫組織化学法(immunohistochemistry)
ソウル峨山病院の臨床試験審査委員会の承認を受けて、2009年9月から2011年12月まで、ソウル峨山病院の外科で肝細胞癌の手術を受けた患者の中で、AJCC(The American Joint Committee on Cancer)7版病期IとIIに該当する40人の患者を対象に、ソウル峨山病院のBio-Resource Centerに保管されている手術後の肝組織のうち肝細胞癌組織と周辺の正常肝組織を、それぞれ40件ずつ移送してもらい実験に使用した。
CRBN発現の定量化のためのウェスタンブロッティング(Western blot)
総タンパク質は、30分間-20℃でPro-Prep protein extraction solution(iNtRON Biotechnology、Boca Raton、FL、USA)に溶解し、培養抽出した。 ライセートは、4℃で5分間20,217 xgで遠心分離した。 タンパク質の濃度は、Standard Bradford Assay(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)を使用して測定した。 抽出した60μgのタンパク質は、10%SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)で室温80~120 Vの条件で電気泳動し、分離されたタンパク質をPVDF(polyvinylidene fluoride)膜で4℃260 mAで90分間移動させた後、5%のスキムミルク(skim milk)を使用して室温で1時間固定した。 上記の固定させた細胞膜に1次抗体を追加して、4℃で一晩中培養した。 1次抗体は、ポリクローナルCRBN抗体(ployclonal CRBN antibody、Sigma)を5%のスキムミルクに1:1000に希釈し、対照群としてアクチン(Actin、anti-rabbit)は、5%のスキムミルクに1:5000に希釈して使用し、4℃で一晩培養した後、1X TBST(NaCl 8.766 g/Tris-base 1.211 g/Tween20 500μl)で20分間3回繰り返し洗浄した。 2次抗体として抗-マウス(anti-mouse)を5%のスキムミルクに1:2000に希釈して、室温で2時間培養した後、1X TBSTで20分間3回繰り返して洗浄し、タンパク質バンドをECL(electrogenerated chemiluminescent)試薬(Millipore、Billerica、MA、USA)を使用して視覚化した。 適切なバンドの密度は、Bio-Rad GS-670 imaging densitometerの反射率濃度測定で分析した。
臨床データの収集及び有意性の分析
研究対象の患者40人に対して医療記録を遡及的に調査した。 手術当時の患者の年齢、性別、手術名、手術前のICG値、B型肝炎表面抗体の有無、手術前のAFPとPIVKAを調査した。 手術後の組織検査をもとに、肝硬変の有無、肝細胞癌の大きさと数、微小血管浸潤の有無、病期を調査した。 手術後の無病期間、再発の有無、生存期間及び生存の有無を調査した。
また、AJCC 7版病期IとIIに基づいて分類した患者の臨床病理学的特性を比較して下記[表4]にまとめた。
CRBN発現量に応じた予後予測の可能性の分析
上記の実施例7で分類したCRBN高発現群とCRBN低発現群を対象に、肝細胞癌の手術後の累積腫瘍再発率と生存率を比較した。
既存の細胞株を用いたCRBNタンパク質発現の検証
10-1。 細胞株別CRBN発現量とMMP-2、MMP-9活性の比較
互いに異なる肝細胞でCRBN発現量を比較するために、上記の実施例6の方法で3つの細胞株のウェスタンブロッティング分析を行った。実験対象の細胞株は以下の通りである。
i)Chang Liver(HeLa derivative)cell line(Sigma-Aldrich):HeLaに由来する正常肝細胞に似た細胞株
ii)HepG2 cell line(Korean Cell Line Bank):15歳の男性の肝芽腫(hepatoblastoma)から得たもので、ヒトの肝モデルの研究に最も代表的な細胞株
iii)Hepa1c1c7 cell line(CRL-2026):マウス由来の肝癌細胞株
その結果、図5の(A)に示したように、人の正常肝細胞株であるChang Liver、人の肝芽腫細胞株であるHepG2、マウスの肝癌細胞株であるHepa1c1c7で、それぞれCRBNの発現を確認しており、正常細胞のChang Liverより腫瘍細胞のHepG2とHepa1c1c7でCRBN発現量が増加した。 このことから、正常の肝細胞より肝癌細胞でCRBN発現量が増加することを確認した。これはCRBNタンパク質の発現が細胞の癌化過程または癌化が進行した後に発現が増加したものだと考えられる。
CRBNの発現量と癌転移タンパク質の活性の変化を確認するために、CRBNタンパク質発現を抑制、または過剰発現させた後、MMP-2及びMMP-9の活性を確認した。
CRBNノックダウン(Knock down)一次肝細胞癌の細胞株を用いた腫瘍の成長の確認
生体内(in vivo)でCRBN発現による腫瘍の成長の変化を確認するために、shRNA CRBN(251、ジェノルション)を利用して、CRBNがノックダウンされた一次肝細胞癌の細胞株(CRBN KD-HCC)を確立し、このような肝細胞癌細胞株をNudeマウスに移植した後、CRBN WT-HCCを移植したマウスと比較し観察した。
(1)[この発明をサポートした国家研究開発事業]
[課題固有番号] 2018R1D1A1A02049905
[部署名] 韓国研究財団
[研究管理専門機関] 韓国研究財団
[研究事業名] 理工分野の基礎研究事業
[研究課題名] 多発性骨髄腫で免疫調節薬のcereblon依存的抗癌メカニズムの研究
[寄与率] 1/2
[主管機関] 蔚山大学産学協力団
[研究期間] 2018.05.01~2021.04.30
(2)[この発明をサポートした国家研究開発事業]
[課題固有番号] NCCR-HA16C0014010019
[部署名] 保健福祉部
[研究管理専門機関] 国立がんセンター
[研究事業名] がん征服推進研究開発事業
[研究課題名] 多発性骨髄腫の治療の際、セレブロンタンパク質発現による治療薬の選別基準の研究
[寄与率] 1/2
[主管機関] 蔚山大学産学協力団
[研究期間] 2016.05.01~2019.04.30
寄託機関名:韓国生命工学研究院
受託番号:KCTC18596P
受託日付:20170830
寄託機関名:韓国生命工学研究院
受託番号:KCTC18598P
受託日付:20170830
Claims (9)
- CRBN遺伝子のmRNAまたはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する製剤を含む、肝細胞癌の診断または予後予測のための組成物。
- 前記遺伝子のmRNAレベルを測定する製剤は、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー対、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項1に記載の肝細胞癌の診断または予後予測のための組成物。
- 前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体、またはアプタマーを含む、請求項1に記載の肝細胞癌の診断または予後予測のための組成物。
- (a)個体から分離された生物学的試料からCRBN遺伝子のmRNAまたはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)前記測定されたレベルを、正常個体から分離された生物学的試料で測定されたレベルと比較する段階、を含む、肝細胞癌の診断のための情報提供方法。 - (c)前記(a)段階の生物学的試料で測定されたmRNAまたはそれから発現されるタンパク質のレベルが、正常個体または前記(b)段階の個体の生物学的試料から分離された生物学的試料で測定されたものより高い場合は、肝細胞癌であると分類される段階をさらに含む、請求項4に記載の肝細胞癌の診断のための情報提供方法。
- (a)肝細胞癌患者の肝細胞癌組織とその周辺の正常組織から分離された生物学的試料中のそれぞれCRBN遺伝子のmRNAまたはそれから発現されるタンパク質のレベルを測定する段階と、
(b)前記各試料で測定されたレベルを比較する段階、を含む、肝細胞癌の予後予測のための情報提供方法。 - (c)前記(a)段階の肝細胞癌組織から分離された生物学的試料で測定されたCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルが、周囲の正常組織から分離された生物学的試料で測定されたものより2倍以上高い場合、不良な予後を有すると分類される段階をさらに含む、請求項6に記載の肝細胞癌の予後予測のための情報提供方法。
- (d-1)前記(a)段階の肝細胞癌組織から分離された生物学的試料で測定されたCRBN遺伝子のmRNA、またはそれから発現されるタンパク質のレベルが、周囲の正常組織から分離された生物学的試料で測定されたものより2倍以上高い場合、CRBN高発現群に分類し、2倍未満の場合、CRBN低発現群に分類する段階と、
(d-2)高発現群患者及び低発現群から分離された血液で、それぞれAFP(α-fetoprotein)値を測定する段階と、
(d-3)高発現群患者から分離された血液で測定されたAFP値が、低発現群の患者から分離された血液で測定された数値より高い場合、高発現患者群患者の患者が不良な予後を有すると分類される段階、をさらに含む、 請求項7に記載の肝細胞癌の予後予測のための情報提供方法。 - 前記不良な予後は、病期IIへの進行、微小血管の浸潤、累積腫瘍再発率の増加及び生存率の低下からなる群から選択されるいずれか一つ以上を有することを意味する、請求項7または請求項8に記載の肝細胞癌の予後予測のための情報提供方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20190032863 | 2019-03-22 | ||
KR10-2019-0032863 | 2019-03-22 | ||
PCT/KR2020/003963 WO2020197227A1 (ko) | 2019-03-22 | 2020-03-23 | 간세포암 진단용 바이오마커 세레브론 및 이에 특이적인 신규한 단일클론항체 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022526131A JP2022526131A (ja) | 2022-05-23 |
JP7300687B2 true JP7300687B2 (ja) | 2023-06-30 |
Family
ID=72610602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021556490A Active JP7300687B2 (ja) | 2019-03-22 | 2020-03-23 | 肝細胞癌診断用バイオマーカーセレブロンと、これに特異的な新規なモノクローナル抗体 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220178929A1 (ja) |
JP (1) | JP7300687B2 (ja) |
KR (1) | KR102429562B1 (ja) |
WO (1) | WO2020197227A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113517023B (zh) * | 2021-05-18 | 2023-04-25 | 柳州市人民医院 | 与性别相关的肝癌预后标志性因素及筛选方法 |
CN114935651A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-23 | 广州源康生物医药科技有限公司 | 一种肿瘤生物标志物及应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017533727A (ja) | 2014-10-13 | 2017-11-16 | セルジーン コーポレイション | 固形腫瘍の治療方法及び免疫調節療法への臨床的感度の予測因子としてのバイオマーカーの使用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20140019364A (ko) * | 2011-03-11 | 2014-02-14 | 셀진 코포레이션 | 면역-관련 및 염증성 질환의 치료에 있어서의 3-(5-아미노-2-메틸-4-옥소퀴나졸린-3(4h)-일)피페리딘-2-6-디온의 용도 |
JP6016892B2 (ja) * | 2011-04-29 | 2016-10-26 | セルジーン コーポレイション | セレブロンを予測因子として使用する癌及び炎症性疾患の治療方法 |
JP2018525991A (ja) * | 2015-08-12 | 2018-09-13 | セルジーン コーポレイション | 固形腫瘍の治療方法及び免疫調節療法に対する臨床的感度の予測因子としてのバイオマーカーの使用 |
-
2020
- 2020-03-23 JP JP2021556490A patent/JP7300687B2/ja active Active
- 2020-03-23 WO PCT/KR2020/003963 patent/WO2020197227A1/ko active Application Filing
- 2020-03-23 KR KR1020200035271A patent/KR102429562B1/ko active IP Right Grant
- 2020-03-23 US US17/441,386 patent/US20220178929A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017533727A (ja) | 2014-10-13 | 2017-11-16 | セルジーン コーポレイション | 固形腫瘍の治療方法及び免疫調節療法への臨床的感度の予測因子としてのバイオマーカーの使用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Appl Immunohistochem Mol Morphol,2016年,24,10,695-702 |
J.Med.Chem.,2019年,62,2508-2520 |
Pflugers Arch Eur J Physiol,2016年,468,1299-1309 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2022526131A (ja) | 2022-05-23 |
WO2020197227A1 (ko) | 2020-10-01 |
KR102429562B1 (ko) | 2022-08-05 |
US20220178929A1 (en) | 2022-06-09 |
KR20200112753A (ko) | 2020-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6180931B2 (ja) | 癌の診断および/または予後のための新規な抗体 | |
JP4667372B2 (ja) | 血管障害の程度の判定方法 | |
JP2017524725A (ja) | 抗b7−h3抗体及びその診断用途 | |
US10809263B2 (en) | Antigenic composition for detecting auto-antibody with specific response to exosomal protein EIF3A, and method for diagnosing liver cancer using antigenic composition | |
JPWO2006064844A1 (ja) | 大腸癌および/または大腸ポリープの診断ならびに術後経過観察および再発のモニター薬 | |
JP7300687B2 (ja) | 肝細胞癌診断用バイオマーカーセレブロンと、これに特異的な新規なモノクローナル抗体 | |
JP6977105B2 (ja) | Igf−1r抗体および癌の診断のためのその使用 | |
KR101138460B1 (ko) | 항-fasn 자가면역 항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 | |
US9416176B2 (en) | RBM3 protein in colorectal cancer prognostics | |
JP5137015B2 (ja) | Ptx3高感度測定法 | |
KR101439856B1 (ko) | 항-atic 자가면역항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물 | |
WO2022154037A1 (ja) | がんの予後バイオマーカー | |
KR20120095301A (ko) | 항-사이토케라틴 8/18 복합체 자가면역항체를 포함하는 암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 암 진단용 조성물 | |
JPWO2009044561A1 (ja) | 抗proNT/NMNモノクローナル抗体 | |
US20080241066A1 (en) | Anti-PRL-3 antibodies and methods of use thereof | |
JP7086607B2 (ja) | Igf-1r抗体および癌の診断のためのその使用 | |
EP4403581A1 (en) | Anti-ck2 alpha antibody or fragment thereof | |
TW201818972A (zh) | 針對melk的單株抗體及其用途 | |
US20200355686A1 (en) | Monoclonal antibody for predicting tamoxifen response in breast cancer patients | |
JP6793514B2 (ja) | 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤 | |
JP4319700B1 (ja) | 酸化修飾タンパク質またはポリペプチドに対する高特異性モノクローナル抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211117 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211117 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221018 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230118 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230411 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230508 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230612 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7300687 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |