KR100414637B1

KR100414637B1 - 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들에대한 항체와 면역학적 제제 및 심장질환 진단키트

Info

Publication number: KR100414637B1
Application number: KR10-2000-0005808A
Authority: KR
Inventors: 이상민; 조기승; 김효준
Original assignee: (주)에스제이바이오메드
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2004-01-13
Also published as: AU784153B2; CN1368888B; JP2003522158A; ES2355128T3; JP3736798B2; US7514227B2; US20070122846A1; CA2366468A1; EP1165133B1; HK1049121B; CN1368888A; HK1049121A1; DE60045444D1; AU6734800A; BR0010712A; ATE493658T1; RU2262939C2; EP1165133A1; EP1165133A4; CA2366468C

Abstract

본 발명은 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임 3를 이용한 심장질환 진단용 면역학적 제제 및 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 아데닐레이트 인산화 효소 이소자임 3로 이루어진 심장질환 지표, 검출 표지체(label)와 결합된 항체가 상기 지표에 선택적으로 결합하는 항체인 것인 심장 질환 진단용 면역학적 제제에 대한 것이다.

Description

사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들에 대한 항체와 면역학적 제제 및 심장질환 진단키트{ANTI-HUMAN MITOCHONDRIAL ADENYLATE KINASE ISOZYME ANTIBODY, DIAGNOSTIC FORMULATION AND DIAGNOSITC KIT FOR CARDIAC DISEASE}

40대 이후의 성인병의 일종으로 급성 심근 경색을 포함한 심장 질환이 많이 발생하고 있으며 이와 같은 심장질환으로 인한 사망자도 세계적으로 증가하는 추세이다. 국내 종합병원, 대학병원에서도 월 평균 한 병원 당 200회 이상씩 심장질환의 진단이 이루지고 있다. 미국에서는 매년 수백만명에 달하는 사람들이 흉부 통증으로 병원 응급실을 찾고 있다.

종래에 흉부 통증 환자의 심장질환을 진단하는 일반적인 방법은 심전도계를 사용하는 것이었다. 심전도계(ECG)를 사용하여 심근경색을 진단할 시에 심전도의 Q파와 비정상적인 ST-T파의 변화로 심근경색을 판정하였다. 하지만 급성심근경색으로 응급실을 찾은 환자 중 약 50% 이상이 잘못된 진단 결과를 얻었으며 이 중 5%의 심근경색증 환자가 응급실로부터 귀가되었으며, 이 중 16%가 이러한 잘못된 진단으로 말미암아 사망에까지 이르게 되었다.

이러한 문제점들을 해결하기 위하여 심근경색에 대한 생물학적 마커들이 개발되기 시작하였다. 심근경색에 대한 이상적인 생물학적 마커는 다음과 같은 특징을 가져야 한다. 첫 번째는 오직 심근 세포에만 존재함으로써 심근이 손상되었을 때 혈액내로 방출되어야 한다. 두 번째는 심근상해 후에 빠르게 혈액내로 방출되어야 하는데 이것은 생물학적 마커가 세포내에 어디에 존재하는가와 그것의 크기에 의존하게 된다. 세 번째는 심근상해의 정도와 방출된 생물학적 마커의 양 사이에 선형적인 비례 관계가 있어야 한다. 네 번째는 분석시 특별한 훈련이나 기술이 요구되지 않아야 하며 검사에 필요한 시약이 저렴하고 안정적이어야 한다.다섯 번째는 흉부에 통증을 느낀 뒤 혈청 또는 혈장내에 생물학적 마커의 양이 증가되어야 한다. 여섯 번째는 방출된 생물학적 마커는 연속적인 심근경색을 확인할 수 있도록 빠르게 제거되어야 한다. 하지만 불행히도 이러한 조건을 모두 만족하는 생물학적 마커는 존재하지 않고 있다.

현재 생물학적 마커를 이용한 심근 경색증의 진단에는 크레아틴 키나제 (CK) 질량 분석(mass assay)과 트로포닌 테스트가 활용되고 있다. CK는 근육조직에는 MM형, 뇌 및 척수에는 BB형이, 그리고 골격근이나 심장근에서는 하이브리드형인 MB형이 존재하므로 조직 손상이나 암에 대한 지표로 이들의 혈청 농도가 활용된다. 특히 CK-MB는 급성 심근경색증의 정도를 나타내는 효소로 알려져 있으며, 이들은 화상 및 외상을 포함하여 심장, 골격근 질환에 이르기까지 모든 근질환에 있어서 혈액역가의 약 5%의 변화폭을 보인다. 그러나 CK-MB를 이용한 심근경색의 진단방법은 경시효과와 탐지한계점 등의 문제점이 있고 약 20% 정도의 거짓 신호(false signal)가 나타나 정확도가 떨어지는 단점이 있기 때문에 완벽한 진단 수단은 되지 못하고 있다. 현재 세계보건기구(WHO)의 기준에 의한 심근경색 진단 근거는 (1) 전형적인 흉부통증, (2) ECG의 Q파의 이상, (3) 위에서 언급한 효소학적 최대정상수치 2배 이상의 효소유출량 증가 중 2가지가 해당될 때 심근경색으로 확진하도록 하고 있다.

한편, 넬 보이스 등(Boyce N. et al., (1996) Clinical Laboratory News, 22(1), 1-14)은 상기와 같은 종래의 심장 손상 마커로 크레아틴 키나제(CK-MB)를 사용하는 방법의 오진 가능성을 줄이기 위해 심장 트로포닌 T(cTnT) 테스트를 개발하였다. 이 방법은 FDA (United States Food and Drug Administration)로부터 공인을 받아 Boehringer Manheim Diagnostics사 (Manheim,독일)에 의해 제품화되어 미국에서는 96년 11월부터 사용되어 오고 있으나, 골격근 유래의 트로포닌 T와 교차 반응성이 있는 것으로 확인되어, 현재에는 트로포닌 I 테스트를 사용하고 있다. 그러나 cTnT 및 cTnI 테스트의 경우 모두 발병후 8-10여 시간의 경시조건이 요구되는 단점을 극복하지 못하였으므로(Eisenbrey et al, (1995) The Journal of American Medical Association, 74, 1343-1344) 이 방법 또한 만족스러운 대체법은 아니고 CK-MB 테스트의 보조 수단으로 사용될 뿐이다. 또한 상기의 모든 진단방법은 고가의 분석장비와 심장전문의 및 고도의 훈련을 받은 인력을 필요로 하기 때문에 소수의 대학병원 및 종합병원에서만 제한적으로 활용가능할 뿐만 아니라 검사 비용이 매우 고가인 문제점을 갖는다. 더욱이, 트로포닌의 경우 국내에서는 단 1회에 한하여서만 의료보험이 적용되고 있어 지속적인 검사를 필요로 하는 환자들의 사용이 제한되고 있는 실정이다.

이상과 같이 현재까지 이용되어 온 심장질환 진단을 위한 생물학적 마커들은 정확도 및 검사의 편의성 면에서 만족스럽지 못하였다. 따라서 보다 정확하고 신속한 진단을 가능하게 하면서도 고가의 분석장비를 필요로 하지 않고 소규모의 병원 및 개인이 손쉽게 검사할 수 있는 새로운 심근 손상에 대한 진단 지표(diagnostic indicator)의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 상술한 종래 기술의 기술적 요구에 부응하는 것으로, 상기의 이상적인 심근경색 진단지표의 조건을 모두 만족시키는 진단지표 후보물질로 근육조직에 CK 보다 풍부하게 존재하고, 나아가 조직간 분포도가 상이한 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들을 특이적으로 인식하는 항-AK 항체들을 이용하는 것을 특징으로 하는 정확성 및 감도가 우수하면서도 검사를 용이하게 하는 아데닐레이트 키나제 이소자임들을 이용한 심장질환 및 심근경색 진단용 면역학적 제제 및 키트를 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임들(AK) 및 그의 일부를 포함하는 면역원에 대하여 반응성이 있는 동물계에서 생성되는 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 (AK) 및 그의 일부에 대해 특이적인 면역글로불린을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양상은 본 발명의 면역글로불린과 검출 마커의 결합 형태로 구성되는 면역학적 제제를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양상은 검출 마커가 결합된 본 발명의 면역글로불린과 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 심장 질환 진단키트를 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 양상은

(a) 검체 시료와 대조 시료(control sample)를 각각 항-아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3) 항체 또는 그의 일부와 반응시켜 면역복합체를 형성시키는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에 의해 수득된 면역복합체를 검출하는 단계; 및

(c) 검체 시료와 대조 시료의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을특징으로 하는 검체 시료내의 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)의 존재 검출 방법이다.

도 1은 아데닐레이트 키나제 이소자임들의 세포내의 정성적 분포도,

도 2는 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)의 PCR 생성물 전기영동 결과도,

도 3은 pCR2.1-AK3의 유전자 지도(gene map),

도 4는 pCR2.1-AK3의 제한효소절단 패턴을 도시한 도면,

도 5는 pQE30-AK3의 제한효소절단 패턴을 도시한 도면,

도 6은 pQE30-AK3의 유전자 지도,

도 7a는 AK3의 SDS-PAGE 결과를 도시한 도면,

도 7b는 AK3의 웨스턴 블로팅 결과를 도시한 도면,

도 8a는 AK1의 SDS-PAGE 결과를 도시한 도면,

도 8b는 AK1의 웨스턴 블로팅 결과를 도시한 도면,

도 9a는 AK2의 SDS-PAGE 결과를 도시한 도면,

도 9b는 AK2의 웨스턴 블로팅 결과를 도시한 도면,

도 10은 항-AK3 토끼 항체의 정제 거동을 도시한 그래프도,

도 11은 AK 이소자임들의 정제된 재조합체를 보여주는 도면,

도 12는 정제된 항-AK 이소자임 항체들 사이의 교차반응성(cross-reactivity) 분석 결과를 보여주는 도면,

도 13은 AK 이소자임들의 조직 분포를 나타내 주는 도면,

도 14는 환원 및 비환원 조건하에서 심근경색증 환자 혈청의 항-AK2 항체와 항-AK3 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 결과를 도시한 도면,

도 15는 AK들과 사람 혈청의 네이티브 젤 전기영동의 이동 패턴도,

도 16은 환자의 혈청내에 있는 AK3의 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과도,

도 17은 실시예 6의 AK3의 웨스턴 블로팅 결과도이다.

이하에서 본 발명을 첨부 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다. 상세한 설명에 앞서 본원에서 이용되는 용어를 정의하면 다음과 같다.

본원에서 '생물학적 시료(biological sample)'란 체액 또는 체액의 일부로서, 구체적으로 인체로부터 분리된 뇨, 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함한다.

본원에서 "검출 표지체(detection label)"란 면역복합체의 검출을 위한 표지를 의미하며, 구체예로는 방사성동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민 등과 같은 형광물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 바이오틴 등을 포함하나, 반드시 이들로만 국한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "심장 질환 지표(marker)"란 심장에 특이적으로 존재하여 이를 통하여 급성 심근 경색을 포함한 심장 질환의 유무를 판정하는데 사용되는 물질을 의미한다.본원에서 "모노클로날(monoclonal)"이란 단일 클론 세포로부터 유도되는 면역글로불린 생성세포 및 단일 형태의 항체를 생성할 수 있는 계로서, 흔히 하이브리도마 세포계와 같은 세포 융합의 결과로 생성된다.

본원에서 '폴리클로날(polyclonal)'이란 면역원에 대해 일반적으로 다중의 친화력을 갖는 다수 형태의 세포로부터 유도되는 면역글로불린을 생성할 수 있는 계로서, 상기 면역글로불린은 일반적으로 후천적 면역성을 갖는 동물의 생체내에서 합성되는 면역글로불린을 의미한다.

본원에서 '미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임'은 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 2(AK2) 및 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)과 같은 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체 및 돌연변이체를 포함하며, '미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임의 일부'라 함은 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임의 항체-반응성 부분(antibody-reactive portion)을 포함하는 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임의 절단 펩타이드 단편을 의미한다.

아데닐레이트 키나제(AK)는 하기 반응식 1과 같이 세포내 XTP, ADP 및 AMP의 가역적 인산기 전이반응을 촉매하여 아데닌 뉴클레오타이드간의 매우 신속한 동적평형을 유지시켜주는 효소이다.

XTP + AMP ⇔ XDP + ADP

상기 효소는 세포 대사활동 및 신호전달과 관련된 인산화 반응에 필수적인 효소중의 하나로, 에너지 대사, 아폽토시스(apoptosis), 종양발생(tumorigenesis) 등에 관여하는 효소로 알려져 있으며, 생물계에서 약 40여종이 보고되었다(Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M., & Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10148-10152). 척추 동물계의 세포에는, 도 1에 도시한 바와 같이, 세포질에 존재하는 AK1 (EC 2.7.4.3), 미토콘드리아 막간 공간(mitochondriaintermembrane space)에 존재하는 AK2, 미토콘드리아 매트릭스에 존재하는 AK3 (EC 2.7.4.10) 등 3종류의 이소자임이 다양한 서브타입으로 존재하고 있는 것으로 여겨지고 있다(Kuby, S. A., Palmieri, R. H., Frischat, A., Wu, L. H., Maland, L., & Manship, M. (1984) Biochemistry 23, 2392-2399; Sachsenheimer, W., & Schulz, G. E. (1977) J. Mol. Biol. 114, 23-36; Egner, U., Tomasselli, A. G., & Schulz, G. E. (1987) J. Mol. Biol. 195, 649-658).

최근, 사람의 AK2(hAK2)에 대하여 두 가지의 서브타입 AK2A 및 AK2B의 유전자들이 각각 클로닝되었으며, 나아가 hAK1 및 hAK2의 mRNA는 심근, 골격근, 간 등 여러 조직에서 확인되었다(Lee,Y., J.W. Kim, I.A. Lee, H.B. Kang, Y.K. Choe, H.G. Lee, J.S. Lim, H.J. Kim, C. K. Park, and I.S. Choe, (1996) Biochem. Mol. Biol. International, 39(4), 833-842). 또한 이 유전자 산물들은 조직 특이적 발현 양상을 보여, AK1의 경우에는 심근과 골격근에서 모두 발현하지만 AK2의 경우에는 골격근에서는 발현되지 않음이 밝혀졌다(Lee,Y., J.W. Kim, S.M. Lee, H.J. Kim, K.S. Lee, C. Park, & I.S. Choe (1998) J. Biochem.-Tokyo, 123, 47-54 ).

사람 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)는 223개의 아미노산으로 이루어진 인산전이 효소로 뉴클레오시드트리포스페이트-아데닐레이트 포스포트랜스페라제(nucleosidetriphosphte-adenylate phosphotransferase)라고도 한다. 사람 AK3의 유전자 배열 및 아미노산 1차 배열은 Xu 등(Xu, G., O'Connell, P., Stevens, J. and White, R. (1992) Characterization of humanadenylate kinase 3 (AK3) cDNA and mapping of the AK3 pseudogene to an intron of the NF1 gene. Genomics 13 : 537-542)에 의해 밝혀졌다. 사람 AK3의 아미노산 서열은 아래와 같다:

Met Ala Ser Lys Leu Leu Arg Ala Val Ile Leu Gly Pro Pro Gly Ser

Gly Lys Gly Thr Val Cys Gln Arg Ile Ala Gln Asn Phe Gly Leu Gln

His Leu Ser Ser Gly His Phe Leu Arg Glu Asn Ile Lys Ala Ser Thr

Glu Val Gly Glu Met Ala Lys Gln Tyr Ile Glu Lys Ser Leu Leu Val

Pro Asp His Val Ile Thr Arg Leu Met Met Ser Glu Leu Glu Asn Arg

Arg Gly Gln His Trp Leu Leu Asp Gly Phe Pro Arg Thr Leu Gly Gln

Ala Glu Ala Leu Asp Lys Ile Cys Glu Val Asp Leu Val Ile Ser Leu

Asn Ile Pro Phe Glu Thr Leu Lys Asp Arg Leu Ser Arg Arg Trp Ile

His Pro Pro Ser Gly Arg Val Tyr Asn Leu Asp Phe Asn Pro Pro His

Val His Gly Ile Asp Asp Val Thr Gly Glu Pro Leu Val Gln Gln Glu

Asp Asp Lys Pro Glu Ala Val Ala Ala Arg Leu Arg Gln Tyr Lys Asp

Val Ala Lys Pro Val Ile Glu Leu Tyr Lys Ser Arg Gly Val Leu His

Gln Phe Ser Gly Thr Glu Thr Asn Lys Ile Trp Pro Tyr Val Tyr Thr

Leu Phe Ser Asn Lys Ile Thr Pro Ile Gln Ser Lys Glu Ala Tyr

사람 아데닐레이트 키나제 이소자임 3는 아래 반응식 2와 같은 반응을 촉매한다(Chiga,M., Rogers, A.E., Paut, G.W.E. (1961) J. Biol. Chem., 236, 1800;Albrecht, G.J., (1970) Biochemistry, 9:2426).

GTP + AMP ⇔ GDP +ADP

그동안 AK3 효소에 관한 연구는 타 효소에 비해 활발하지 못하였으며 AK3 효소의 인체에서의 조직 특이성은 아직까지 밝혀진 바 없다.

사람에 있어서 AK 효소의 유전적 결함은 유전성의 용혈성 빈혈을 유발함이 밝혀졌으며(Matsuura, S., Igarashi, M., Tanizawa, Y., Yamada, M., Kishi, F., Kajii, T., Fujii, H., Miwa, S., Sakurai, M. and Nakazawa, A. (1989) J. Biol. Chem. 264, 10148-10152), 근육 및 뇌 조직에서 크레아틴 키나제와 AK의 공여에 의해 티아민 트리포스페이트가 생합성되는 것이 밝혀졌다.

본 발명자들은 AK3도 AK2와 동일하게 심근에서는 발현되지만 골격근에서는 발현되지 않음을 최초로 확인하고, 이를 심근경색을 포함하는 심장질환의 진단에 응용하였다.

본 발명자들은 사람 근조직으로부터 미토콘드리아 AK 이소자임인 AK2(hAK2)와 AK3(hAK3) 각각의 유전자를 클로닝하여 pQE-AK2 및 pQE-AK3 발현 벡터를 구축하고, 형질전환 대장균의 배양으로 유전자 재조합 AK2 및 AK3를 대량으로 분리 정제하여 1.1 mg AK2/L 배양액, 9.8 mg AK3/L 배양액의 유전자 재조합 이. 콜라이(E. coli) 발현계를 확보하였다.

유전자 재조합 hAK 이소자임의 확인은 아미노산 조성 분석에 의해 확인하였으며, hAK2의 특이적 활성은 1,000 U/mg, pI 값은 6.6이었고 hAK3의 특이적 활성은400mU/mg, pI 값은 >11.7임을 확인하였다. 이러한 물리화학적 특징은 소의 간으로부터 분리한 AK3 이소자임의 보고된 값과 유사하였다.

AK 이소자임의 생리적 기능의 이해를 위해 먼저 조직 특이적 발현 양상을 검토하기 위해 hAK1, hAK2 및 hAK3를 이용하여 다클론 토끼 항혈청을 각각 유도하였으며, 이소자임 상호간의 교차인식항체를 제거하여 항-hAK1, 항-hAK2 및 항-AK3 항체를 확보하였다. 본 항체를 이용하여 파라핀에 임베딩된 조직(paraffin embedded tissue)에 대한 면역조직화학검사(immunohistochemistry) 결과, hAK1의 경우는 모든 조직에서 검출되었으나 hAK2는 간, 뇌, 심근, 신장, 폐 그리고 hAK3는 간, 심근, 신장, 폐에서만 검출되었다. 특히 뇌, 심근 및 골격근에 대한 웨스턴 블로팅에서도 AK1은 두 조직 모두에서 확인되었으나 AK2와 AK3는 골격근에서는 발현되지 않았고 심근 특이적인 발현을 보임을 확인하였다. 따라서 아데닐레이트 키나제 이소자임의 분포 양상이 생체 조직부위에 따라, 특히 심근과 골격근에서 다르다는 것은 심근세포 상해와 관련된 순환기질환에 대한 임상적 지표(clinical marker)로서의 활용 가능성이 매우 높다는 사실을 입증한다.

본 발명의 면역글로불린은 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임(AK) 및 그의 일부를 포함하는 면역원에 대하여 반응성이 있는 동물계에서 생성되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게 상기 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임은 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 2(AK2) 및 사람 미토콘드리아 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)이다. 이러한 본 발명의 면역글로불린(모노클로날 또는 폴리클로날)은 IgA, IgG, IgM, IgD, IgE 또는 IgY에국한되지 않고, 모든 형태의 면역글로불린이 가능하다. 또한 완전한 항체를 사용할 필요는 없으며 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 단편, 예컨대, Fab, Fab^', 또는 F(ab)'2 단편들과 같은 단편도 사용할 수 있다.

이러한 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 면역글로불린은 정제제조된 아데닐레이트 키나제 이소자임으로 면역된 동물의 혈청으로부터 또는 동물의 비장 임파구와 골수종 세포의 융합으로 인해 생기는 하이브리도마 세포로부터 또는 시험관내에서 형질전환시킨 임파구로부터 수득된다. 구체적으로, 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(예컨대, Kohler 및 Milstein (1976)European Jounral of Immunology6:511-519 참조). 이러한 방법은 항체를 분비하는 '하이브리도마'를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단중 하나의 집단은 아데닐레이트 키나제 이소자임을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득하고나서, 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 면역글로불린을 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서대량으로 배양한다.

이러한 방법에 의해 수득한 모노클로날 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는 염 침전(salt precipitation), 이온교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피를 들 수 있다.

본 발명에서 폴리클로날 항체는 정제된 아데닐레이트 키나제 이소자임 3를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 형청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개, 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.

본 발명에서 아데닐레이트 키나제 이소자임은 종래의 방법에 의해 분리하거가 전체 분자 또는 그의 여러 가지 단편들을 기존의 유전공학 기술에 의해 생합성하여 이용할 수 있다. 그렇지 않으면 아데닐레이트 키나제 이소자임 3는 유기 단백질 합성 기술에 의해 화학합성될 수도 있다.

본 발명의 다른 구현예는 상술한 본 발명의 면역글로불린과 검출 마커가 결합된 형태로 구성되는 면역학적 제제이다. 이러한 면역학적 제제에서 검출 마커는 방사성동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 형광물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 스트렙트아비딘, 바이오틴으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 항체는 혈액 또는 기타 체액을 포함하는 생물학적 시료내에서 아데닐레이트 키나제 이소자임의 존재를 측정하는데 사용된다. 구체적으로, 본 발명의 면역학적 제제와 생물학적 시료를 접촉시켜 상기의 결합된 면역글로불린 마커를 검출함으로써 생물학적 시료내의 아데닐레이트 키나제 이소자임(AK)의 존재를 결정할 수 있다. 본 발명에서 검출방법은 특별히 제한되지 않는데, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 또는 96-웰 플레이트에 항체를 부착시키고 혈청 시료를 반응시킨후 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA(sandwitch enzyme-linked immunosorbent assay)방법에 의해서 검출하거나, 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동에 의해 분리된 단백질을 니크로셀룰로오스 또는 PVDF 막에 블로팅하여 항체를 반응시켜 확인할 수도 있다.

본 발명의 심장 질환 진단키트는 본 발명의 면역글로불린과 제약학상 허용가능한 담체를 포함한다. 진단 키트화할 경우 진단 지표물질인 단백질 성분만 바꾸면 되기 때문에 본 발명의 기트는 기존의 패치(patch)형 혹은 스트립(strip)형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 심장질환 진단키트에는 각각 다른 부분에 담긴 아데닐레이트 키나제 이소자임과 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 아데닐레이트 키나제 이소자임 및 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 항체는 막(membrane)류의 고체상(solid phase)에 고정될 수 있고, 표지(labeling)될 수 있다. 효소 표지(enzyme label)가 이용되는 경우에, 본 발명의 키트는 효소 기질을 포함할 수 있다. 면역복합체를 표지하는 제 2의 항체를 이용하여 분석하는 경우에는, 본 발명의 키트는 항-아데닐레이트 키나제 이소자임 항체 또는 아데닐레이트 키나제 이소자임에 대해 특이적인 제 2의 항체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 적당한 표준(standard), 양성 및 음성 대조군(positive or negative control) 및 기타 사용설명서 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 (a) 검체 시료와 대조 시료(control sample)를 각각 항-아데닐레이트 키나제 이소자임(AK) 항체 또는 그의 일부와 반응시켜 면역복합체를 형성시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)에 의해 수득된 면역복합체를 검출하는 단계; 및 (c) 검체 시료와 대조 시료의 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검체 시료내의 아데닐레이트 키나제 이소자임(AK)의 존재 검출 방법에 관계한다. 이러한 방법에서 상기 검출단계는 면역형광항체법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 금입자(gold particle) 착물법에 의해 수행될 수 있고, 상기 대조 시료는 면역형광항체법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 금입자 착물법에 의해 양성으로 판명된 혈청을 이용할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 사용가능한 검출방법은 반드시 상기 방법들로 제한되는 것이 아니며, 기타의 당업계에서 일반적으로 사용되는 어떠한 검출 방법이라도 모두 사용할 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하나 이하의 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 보호범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1; AK3 유전자의 클로닝

사람의 골격근으로부터 토탈 RNA 추출 . RNA를 분리하기 위하여 100 mg의 근조직에 1 ml의 RNAzol(4M 구아니딘 티오시아네이트, 25 mM 소디움 시트레이트, 0.5% 살코실(salcosyl), 0.1 M 2-머캅토에탄올)를 넣고 균질시킨 후 클로로포름 100 ㎕를 넣고 15초간 진탕하여 15분간 얼음에 방치하였다. 12,000xg에서 15분간 원심분리하여 수용액층을 새 튜브에 옮긴 후 동량의 이소프로파놀을 넣어 섞은 후 -70℃에서 15분간 인큐베이션 하였다. 이어서 12,000xg, 4℃에서 15분간 원심분리하여 RNA 펠렛을 침전시킨 후 75% 에탄올로 세척하여 건조시키고나서 100 ㎕의 DEPC 처리수를 넣어 토탈 RNA를 추출하였다.

RT-PCR에 의한 AK3 cDNA의 작성 . 전단계에서 분리한 토탈 RNA 10.5 ㎕와 500 ng/㎕의 올리고 dT 1㎕, 2.5 mM dNTPs 1.5㎕, 100 mM DTT 1㎕, 200 단위/㎕ MMLV 역전사효소 1㎕, 5X 역전사효소 완충액 6㎕, DEPC-처리수 9㎕를 혼합하여 총 부피를 30㎕로 하여 42℃에서 30분간 반응시키고, 75℃에서 30분간 불활성화시켰다. PCR 반응 혼합물의 조성은 위에서 합성한 cDNA를 주형으로 하여, 2.5 mM dNTPs 8㎕, 5 단위/㎕ Ex taq DNA 폴리메라제 1㎕, 10X DNA 폴리메라제 완충액 10 ㎕, 센스-프라이머와 안티센스-프라이머(100 pmol/㎕) 각각 1㎕를 첨가하였으며 증류수를 넣어서 전체부피가 100 ㎕가 되게 하였다. 반응은 98℃에서 10 초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 익스텐션시킨 후 4℃에서 소킹(soaking)하였다. 이 과정에서 두 프라이머, 즉 5'-GGATCCATGGCTTCCAAACTCCTGC-3'(sence) 및5'-CAGGGTCAATATGCTTCTTTGG-3'(안티센스)을 사용하였으며 PCR 생성물은 1% 아가로스 겔에서 확인하였다(도 2).

AK3 서브클로닝 벡터(pCR2.1-AK3)의 구축 .아가로스 겔로부터 680 bp의 AK3 PCR 생성물을 겔 추출 키트를 사용하여 정제하여 pCR 2.1(invitrogen) PCR 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하였다(도 3). 리게이션 혼합물은 25 ng의 선형으로 만들어진 pCR 2.1 벡터 1㎕, PCR 생성물 5㎕, 4단위/㎕ T4 DNA 리가제 1㎕, 10X 리가제 완충액 1㎕, dH₂O 2㎕를 혼합하여 총 부피가 10㎕로 하였고, 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 구축한 pCR2.1-AK3 플라스미드를 형질전환시키기 위해 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) 균주 JM 109를 사용하였다. JM 109 컴피턴트 세포(competent cell) 50㎕에 2㎕의 리게이션 혼합물을 넣고 얼음에서 30분간 방치한 다음 42℃에서 45초간 열충격(heat shock)을 준 후 얼음에 2분간 담가 두었다가 SOC 배지 250 ㎕를 넣고 37℃, 225 rpm에서 1시간 동안 배양하고, X-gal과 IPTG를 포함하는 LB/암피실린 플레이트에 100㎕를 플레이팅하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 생성된 흰색 콜로니중 10개를 선택하여 50 ㎍/㎖ 암피실린이 함유된 LB 배지에 넣고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 산물은 플라스미드 prep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였으며, 분리한 플라스미드 DNA 5㎕, EcoRI 1㎕, EcoRI 반응 완충액 1㎕와 dH₂O 3㎕를 섞어 1시간 반응시킨 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 PCR 생성물이 서브클로닝 되었는지 확인하였다(도 4). 서브클로닝이 정확하게 되었는지를 확인하기 위하여 PCR 생성물이 삽입된 플라스미드를 자동 서열결정기를 사용하여 염기서열을 확인하였으며, 이 때 사용한 프라이머는 M13 역방향 프라이머와 T7 프로모터 프라이머를 사용하였다.

실시예 2; AK3의 발현벡터의 구축 및 재조합 AK3의 분리 정제

AK3 유전자를 서브클로닝한 pCR2.1-AK3 벡터를 BamHI과 XhoI으로 이중 절단(double digestion)하여 자른 뒤 아가로스 겔로부터 삽입체(insert)를 용출하였다. AK3의 발현 벡터를 작성하기 위하여 pQE 30(Quiagene제품)을 BamHI과 SalI으로 절단하여 큰 단편을 아가로스 겔로부터 용출하여 사용하였다. 유전자 DNA의 리게이션은 pQE30 큰 단편 3㎕, 절단된 AK3 단편 5㎕, T4 DNA 리가제 1㎕, 10X 리가제 반응 완충액 1㎕ 를 혼합하여 16℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 형질전환에 사용된 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli) M15를 사용하였으며 암피실린과 카나마이신이 함유된 LB 플레이트에 플레이팅하여 얻은 콜로니를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 밤새 배양하여 플라스미드를 분리한 후 EcoRI으로 절단하여 삽입체가 들어 있는가를 확인하였다(도 5 및 도 6). 유전자도입이 확인된 콜로니를 100 ㎍/㎖의 암피실린과 25 ㎍/㎖이 함유된 50 ㎖ LB 배지에서 밤새 배양한 후 50㎖를 새로운 LB 배지 1L에 접종하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 0.5-0.7 정도가 되도록 37℃에서 1시간 진탕 배양한 후 IPTG 가 최종적으로 1 mM 농도가 되도록 첨가하여 4 시간 동안 유도하였다. 유도된 배양액을 4,000xg에서 20분간 원심분리하여 세포 펠렛을 얻은 후 결합 완충액(5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween 20를 함유하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.9) 50 ml에 현탁시켜 -20℃에 밤새 저장한다.이를 얼음에서 녹인 후 세포를 용해시키기 위해 30초간 초음파파쇄한 후 1분간 휴지기간의 사이클을 5회 수행하고 4℃에서 10,000xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 가용성 단백질이 들어 있는 조제 추출물을 얻었다.

발현된 AK3를 정제하기 위하여 킬레이트 수지(Pharmacia)를 사용하였으며 킬레이트 수지를 컬럼에 베드 부피(bed volume)가 5ml가 되게 패킹한 후 증류수로 5 컬럼 용적만큼 세정하여 에탄올을 제거한 후 5 컬럼 용적의 충진 완충액(charge buffer; 0.1% Tween 20를 함유하는 50 mM NiSO₄)를 사용하여 Ni⁺를 킬레이트 수지에 결합시킨 후 3 컬럼 용적의 증류수로 세정하고 5 컬럼 용적 결합 완충액로 평형화시켰다. 위에서 준비된 조제 추출물을 로딩한 후 10 컬럼 용적 결합 완충액로 세정하고 비특이적 결합을 제거하기 위하여 5 컬럼 용적 세정 완충액(60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 0.1% Tween 20를 함유하는 20 mM Tris/HCl, pH 7.9)로 세정한 후 5 컬럼 용적의 용출 완충액(0.5 M NaCl, 1M 이미다졸, 0.1% tween 20)를 함유하는 10 mM Tris/HCl, pH 7.9)로 용출하였다. 이 때 모든 단계의 유속(flow rate)은 1ml/min가 되게 하였다. 정제된 AK3로부터 염을 제거하고 농축시키기 위하여 투석 완충액(0.1% Tween 20를 함유하는 10 mM Tris/HCl, pH 7.9)에서 12시간 동안 3번 완충액을 교환시켜 주면서 염을 제거한 후 PEG 8000을 사용하여 농축하였다. 농축된 단백질은 BCA 단백질 정량 분석 키트를 사용하여 정량하여 정제 수율(purification yield)을 계산하여 하기 표 1에 나타내었으며 정제된 AK3는 SDS-PAGE 분석(도 7) 과 다클론 항체의 정제 및 생산에 사용하였다.

재조합 AK3의 정제

정제 단계	전체 단백질(mg)	정제 수율(%)
균질물(Homogenate)	949.05	100
가용성 분획	178.75	18
Ni-킬레이트 친화성 크로마토그래피	14.3	1.5

실시예 3; 항-AK3 토끼 항체의 생산 및 정제

체중 2 kg의 NZW계 토끼(수컷)에게 정제된 AK3 단백질 1 ㎖와 프로인드 완전 애쥬벤트(Freund's complete adjuvant; FCA) 1 ㎖를 유화제(emulsifier)로 5∼6초간 섞은 후 얻어진 에멀젼을 정맥내(i.v.) 또는 피내(i.d.) 방법으로 주사하였다. 첫 번째 주에는 50∼100 ㎍/㎖의 항원 에멀젼을 i.d. 방법으로 토끼의 여러 부위에 초회항원자극 주사(prime injection)하였다. 두 번째 주사부터는 2주 간격으로 제조 항원 10 ㎍/㎖을 i.d. 방법으로 2회 추가항원자극 주사(boosting injection)하였다. 최종 접종 1주일 후에는 항체 생성을 확인하기 위하여 토끼 귀의 정맥으로부터 채혈하여 도트 블로팅(dot blotting)에 의해 항체 유도를 조사하였다. 다섯 번째 주에는 단백질 10 ㎍을 i.d. 방법으로 주사하였다. 여섯 번째 주에는 추가항원자극을 위해 애쥬벤트를 섞지 않은 단백질 용액 (20 ㎍/㎖)을 i.v. 방법으로 주사하였다. 그리고 24시간 동안 절식시킨 후 심장으로부터 채혈하여 혈청을 분리하였다.

채취한 혈액을 유리 용기에 담아 실온에서 1 시간동안 방치하여 응고시킨(clotting) 후 4℃에서 6시간 정치한 후 상층 혈청부분을 원심분리 튜브에넣고, 응고된 부분은 4℃에서 2,500×g로 30분간 원심분리하여, 상청액을 원심분리하기 전의 혈청 부분과 합쳐서 4℃에서 1,500×g로 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 아래에 기술한 항체 정제 방법에 의하여 정제하여 AK3와 상동성이 높은 이소자임 AK1과 AK2에 대한 교차 반응성을 제거하였으며 50 ㎕씩 분획하여 -80℃에서 냉동 보관하면서 환자 혈청을 스크리닝하기 위한 웨스턴 블로팅 실험에 사용하였다.

토끼 혈청으로부터 프로테아제, 알부민을 제거하고 항체의 회수율이 높은 CM Affi-겔 블루 친화성 크로마토그래피를 일차적으로 사용하였다. CM Affi-겔 블루 수지를 1.4M NaCl과 40% 이소프로파놀을 함유한 0.1 M 초산 (pH 3.0) 및 2차증류수로 세정하여 수지를 패킹한 후 PBS로 컬럼을 평형화하였다. 항-혈청을 컬럼에 로딩한 후 처음으로 나타나는 용출물의 전체 피크를 모아 유안농도 45% 포화조건으로 유안침전시켜 면역글로불린 분획들을 얻었다. 이들 면역글로불린 중 AK3에 대해 특이성을 가지며 AK1 및 AK2와 교차 반응성(교차 반응성)이 없는 AK3에 대한 항체를 얻기 위하여 정제한 AK1(도 8), AK2(도 9)는 affi-겔 15에 AK3는 affi-겔 10에 커플링하여 친화성 컬럼 크로마토그래피를 준비하였다. AK1과 AK2 그리고 AK3가 각각 로딩된 친화성 크로마토그래피 컬럼을 순차적으로 연결한 후 0.5M 염화나트륨을 함유한 0.1M 인산나트륨 완충액 pH7.5로 평형화시킨 후 평형화에 사용된 완충액에서 투석시킨 프로테아제가 없는 면역글로불린 분획을 로딩하고 평형화에 사용된 완충액로 세정한다. 항-AK3 친화성 컬럼만 제거한 후 비특이적 결합을 제거하기 위하여 1M KCl 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액 pH7.5로 세정하였고 0.1M글리신/HCl (pH2.5)로 용출시켰다(도 10). 이 때 용출물은 2.5 겔 용적의 2M Tris/HCl pH7.5에 직접 받는다. 이와 같이 정제된 AK3 특이적 다클론 항체는 PBS에 투석한 후 4℃에 보관하면서 웨스턴 블로팅 시에 사용하였다.

준비된 아데닐레이트 키나제 이소자임 항체들(항-AK1 Ab, 항-AK2 Ab 및 항-AK3 Ab)에 대하여 AK1, AK2 및 AK3 항원을 아래의 방법에 따라 웨스턴 블로팅하여 상호간의 교차 반응성이 없음을 확인하였다(도 11 및 도 12). 정제한 재조합 AK를 전기영동할 경우에는 일반적인 Lamlie의 SDS-PAGE를 수행하였으며, 비환원 조건의 경우 네이티브 겔 전기영동 변형하여 수행하였다. 웨스턴 블로팅은 SDS-PAGE 또는 변형된 네이티브 겔 전기영동 종결 후에 겔 홀더에 파이버를 놓고 그 위에 여과지를 놓고, 에탄올로 전 처리한 PVDF 막을 얹은 후 그 위에 겔을 놓고 파이버로 덮어서 전이 샌드위치(transfer sandwitch)를 만들었다. 전이 샌드위치(Transfer sandwitch)를 완충액 탱크에 넣고 냉각장치를 설치한 다음 일정 전압 (90 V, 0.8 A)을 2시간 동안 걸어 주고 사전에 염색한 마커(prestained marker)의 전이를 확인한 후 겔 홀더로부터 PVDF 막을 취하여 TBST에 탈지분유를 5% 되도록 녹인 블로킹 용액에 담가서 2분간 2번 약하게 진탕하였다. 단백질이 블로팅된 막을 적당한 농도의 항-AK3 항체 용액에 담가서 1시간 동안 실온에서 진탕한다. 이것을 TBST로 2번 세척하고 5분씩 3번 진탕한 후 TBST에 효소-표지된 항-토끼 항체를 1/1000배 희석시킨 용액에 1시간 동안 진탕한 후 TBST로 2번 세척하고 5분씩 3번 진탕하여 세척하였다. 막으로부터 TBST를 완전히 제거한 후 ECL 웨스턴 블로팅 검출 키트를 사용하여 반응시킨 후 X-레이 필름에 노출시켜 현상하였다.

실시예 4; 환자 혈청으로부터 AK3의 확인

위와 같은 웨스턴 블로팅 방법으로 골격근과 심근에서 조직분포도를 조사해 본 결과 AK1은 골격근과 심근 양쪽에 모두 존재하며 AK2와 AK3는 심근에만 존재하였다(도 13). 이와 같은 AK2와 AK3의 심장조직에 대한 특이성은 심근경색증과 같은 질병을 진단할 수 있는 생물학적 마커로서의 가능성을 제시하기 때문에 심근경색증환자의 혈청으로부터 AK2와 AK3가 측정되는지를 환원 조건과 비환원 조건 각각 전기영동한 후 웨스턴 블로팅으로 확인하여 본 결과(도 14) 환원 조건 하에서 웨스턴 블로팅은 비특이적 결합으로 인하여 AK2와 AK3의 존재를 확인 할 수 없었으며, 비환원 조건 하에서는 AK2의 경우는 확인할 수 없었고 AK3의 경우에는 정제된 AK3와 동일한 위치에 심근경색환자 혈청으로부터 밴드를 확인할 수 있었다. 그러나 비특이적 다수의 밴드들이 항상 검출되었으므로 AK3만을 확인할 수 있는 새로운 전기영동법을 개발하였다. 새로운 전기영동 방법은 계속적 네이티브 겔 전기영동을 수행할 때 전류를 일반적인 방향과 달리 역방향으로 흐르도록 하는 방법으로, 네이티브 겔은 모노머 용액(40%T 5%Cbis) 2 ml, 4X 분리 겔 완충액(158 mM Tris, 0.256 N H₃PO₄pH 6.9) 2.5 ml, H₂O 4.25 ml, 촉매(0.06% 암모늄 퍼설페이트, 0.02% 리보플라빈 포스페이트) 1.25 ml 그리고 TEMED 20 ㎕로 구성되어 있으며 시료는 혈청 1 ㎕에 DW 8 ㎕와 시료 완충액(50% 수크로오스, 0.1% 브로모페놀 블루) 1 ㎕를 섞어서 로딩 하였으며 탱크 완충액(25 mM Tris, 5.5% 글리신)에서 20 mA로 2시간 동안역방향 전류를 흘려주었다.

위의 방법으로 환자 혈청과 정상 혈청 그리고 정제된 AK1, AK2 그리고 AK3를 로딩하여 겔 상에서 AK들의 이동방향을 검토한 결과 염기성이 강한 AK3는 겔내부로, AK1 및 AK2는 탱크 완충액로 확산되는 것을 확인하였다 (도 15).

실시예 5; 항 AK-2 및 항-AK3 단클론 항체의 제조

항-AK3 및 항-AK2 단클론 항체는 4 주령의 Balb/c (H-2^dhaplotype) 마우스에 50 ug의 항원 단백질 용액(0.1ml)을 동일 부피의 프로인트 완전 애쥬벤트와 에멀젼을 만든 후 양쪽 발바닥(Foot pad)에 1차 주사하였고 10일 간격으로 2회 추가 접종하였다. 추가 접종의 경우 면역 보조약은 불완전 애쥬벤트를 사용하였다. 마우스가 항체를 유발한 것을 혈청에서 확인한 후 임파절(lymph node)을 절취하여 우태아혈청(fetal calf serum), IL-2, 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin) 등을 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액에 세포 분산용액(cell suspension)을 만든 후 미리 준비한 동일 마우스 계열의 종양세포인 Sp2/0-Ag14 세포주와 PEG처리에 의해 세포융합을 시켰다. 면역 세포(Immune cell)와 Sp2 세포를 각각 1.5x10⁸세포씩 분취하여 50 ml 원심분리 튜브(centrifuge tube)에 넣고 400 x g에서 10분간 원심분리하여 펠렛을 형성시키고 상층액을 제거한 후 37℃의 50% PEG1500 용액을 1 ml 가하여 파이펫 끝으로 1분간 매우 조심스럽게 혼합하여 저어 준 다음 추가로 37℃의 혈청을 포함하지 않은 배지를 1 ml 가하여 1분간, 그리고 무혈청 배지(serum-free medium)을 계속 가하면서 섞어주며 PEG에 의한 세포 용해가 일어나지 않도록 점진적으로 희석시켰다. 마지막으로 7 ml의 무혈처어 배지를 가하고 3분정도 저어주었다. 세포를 세척한 후 20 ml의 배양액을 가하여 충분히 세포를 분산시켰으며, 96-웰 조직배양 플레이트에 0.1 ml씩 분주하여 이를 37℃, 7% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하여 매스터 플레이트(master plate)를 작성하였다. 하이브리드 세포(Hybrid cell)의 선별은 HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine) 배지에서의 생존능을 이용하여 실시하였다. 세포융합을 실시한 익일에 각 웰당 0.1 ml의 HAT 배지를 가하였다. 그리고 2, 3, 5, 8 및 11일째에 배양액을 절반씩 애스피레이트하고, 새로이 0.1 ml의 HAT 배지를 부분 교환하여 주었다. 이후 3-4일 간격으로 동일한 조작을 반복하였고, 4주 경과하여 생존한 웰의 세포들을 모두 독립적으로 선별하고, 이들의 상층액을 취하여 AK3를 처리한 96 웰 마이크로-타이터 플레이트를 이용하여 ELISA를 시행하였으며, 이들 중 405 nm의 흡광도가 0.3 이상인 웰들 만을 선택하여 1 ml 컬처로 이행하였다. 24-웰 조직 배양 플레이트에 선택한 세포들을 옮겨 1 ml의 스케일에서 Balb/c 유래의 공여 세포(feeder cell)(Balb/c의 비장 세포를 적혈구 용해 조작 후 미토마이신을 처리한 세포 현탁액)와 함께 HAT 대신 HT 배지 조건에서 15일에 걸쳐 2 ml, 10ml 컬처로 증식시켰으며, 이 단계에서 한계희석법(limiting dilution method)에 의해 하이브리도마 세포의 클로닝을 시도하였다. 96-웰 마이크로-타이터 플레이트에서 36 웰에는 5 세포들/웰, 또다른 36 웰에는 1 세포/웰 그리고 나머지 24 웰들에는 0.5 세포들/웰의 밀도로 희석시켰으며, 배양 5일 후와 12일 째에 패싱(passing)을 실시하고, 1 ml 배양 스케일까지 앞에 언급한 바와 같이 증식시켰다. 단클론성의 항체가 유도된 것으로 여겨지는 웰의 배양 상층액을 선별하여 항체 스크린(antibody screen)을 ELISA에 의해 실시하였으며, 본 단계에서 AK1 및 AK2에 대한 교차반응성(cross-reactivity)를 보이는 클론은 제거시키고 AK3 만을 특이적으로 인식하는 하이브리도마 세포를 엄선하여 항-AK3 단클론 생성 세포주로 구별하였다. 최종적으로 선택된 하이브리도마를 5 ml 배양 플라스크로 옮겨 증식 배양을 시행하였다. 작성된 세포주로부터 단클론 항체의 생산은 융합세포를 DMEM 배양액에서 5% 이산화탄소 존재하에서 배양한 배지 상층액으로부터 정제(25 ㎍ antibody per ml culture)하거나 혹은 프리스테인(pristane) 0.5 ml을 주사하고 3일 후 2x10⁶개의 상태가 양호한 융합세포를 Balb/c 마우스에 복강주사하여 복수(ascites) 종양을 유발시켜 복수로부터 항체를 유도하였으며, AK3 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 의해 0.8 mg 항체/ml의 수율로 분리 정제하였다.

실시예 6; AK3 항체를 이용한 심근경색 진단과 심근경색에 대한 진단지표로서 AK3의 유용성

근육조직에 따른 AK3의 발현 양상은 심장근육에 특이적임을 도 13에서 확인 할 수 있었다. 심근의 상해에 의해 AK3가 혈액중에 방출될 수 있음을 예상하고,본 실시예에서는 대학병원의 응급실 외래 환자의 혈청 시료를 이용하여 AK3를 심근 경색 진단 지표로 활용할 수 있는지 여부를 실험하였다.

혈청시료는 30 개체로 하였으며, 케이스별 질환 명은 표 2에 나타내었다. 이중에 심근경색 환자는 급성 4명과 만성 1명을 포함하여 5명이었으며, 임상병리검사실에서 각 혈청의 CKMB 유니트를 측정하였다. 참고로 정상인의 혈청 CKMB 유니트는 7 이하이다.

앞 절에서 소개한 방법으로 29명의 환자 혈청을 항-AK3 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 수행하여 본 결과 심근경색증환자에 있어서는 CKMB의 농도와 일치하여 AK3의 검출이 확인되었다(도 16). 그러나, 다리골절수술 환자의 경우 CKMB가 44 단위로 위양성(false positive)이었으나 AK3는 검출되지 않았다(도 16. 패널 B, 레인 8). 또한, 뇌출혈 환자 22번(표 2)의 CKMB 수치는 56.3으로 매우 높은 수치였으나 심장이상은 확인되지 않았으며, 본 방법에서는 AK3가 검출되지 않았다(결과는 도시하지 않음). 이러한 결과는 항-AK3 항체를 이용한 AK3의 검출이 심근경색의 진단에 있어서 CKMB보다 정확성이 우수하다는 것을 입증한다. 따라서 심근경색(급성 또는 만성)의 진단에 있어서 항-AK3 항체를 이용한 면역학적 제제 또는 진단키트가 기존의 CKMB, 미오글로불린을 이용한 진단 수단 보다 정확도가 우수함을 확인하여 본 발명의 항체에 의한 진단키트는 임상적으로 심근경색 특이적임을 확인하였다.

환자번호	병명	성별/연령	CKMB 수치	AK3 검출유무
0	정상 대조 혈청	m/26		-
1	안정 협심증	m/62	2.7	-
2	불안정 협심증	m/53	4.6	-
3	복막염 수술	m/54	7.3	-
4	급성 심근경색	m/56	22.1	+
5	맹장염 수술	f/32	3.0	-
6	심방세동	m/45	3.3	-
7	허혈성 심근증, (심근경색병력자)	m/78	2.8	-
8	식도암	m/55	1.1	-
9	다리골절 수술	m/25	44.0	-
10	불안정 협심증	m/67	3.6	-
11	심실충격결손 수술	m/34	8.5	-
12	천식	m/76	9.2	-
13	급성 심근경색	m/40	40.4	+
14	불안정 협심증	m/67	2.5	-
15	불안정 협심증	m/58	5.8	-
16	심실충격결손 수술	m/34	12.8	-
17	복막염 수술	m/85	5.6	-
18	심근경색	m/41	18.0	+
19	중증 근무력증	f/45	6.2	-
20	불안정 협심증	m/67	0.7	-
21	폐암	m/79	2.7	-
22	뇌출혈 수술	m/25	56.3	-
23	장파열 수술	m/64	4.3	-
24	심근비대. 당뇨	m/67	2.9	-
25	부정맥	f/52	2.7	-
26	다발성 늑골 골절	m/18	3.9	-
27	당뇨, 고혈압, 심방세동	f/91	2.4	-
28	신체화 장애(정신병)	m/28	3.1	-
29	급성 심근경색	m/34	56.3	+

도 16은 환자의 혈청내에 있는 AK3의 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과도로, 도 16의 시험 혈청에 대한 정보는 아래 표 3 및 표 4에 나타내었다.

도 16의 시험 혈청에 관한 정보(패널 A의 설명)

레인 번호	병 명	CKMB 단위^a)	표2의환자 번호
1	급성심근경색	22.1	4
2	급성심근경색	40.4	13
3	급성심근경색	18	18
4	급성심근경색	56.3	29
s	사람 심장 조직 시료
n	정상 혈청
ak2	정제된 재조합 AK2
p	정제된 재조합 AK3

a) 정상 혈청의 CKMB 값은 7 단위 미만이었다.

도 16의 시험 혈청에 관한 정보(패널 B의 설명)

레인 번호	병 명	CKMB 단위	표 2의환자 번호
5	안정 협심증	2.7	1
6	식도암	1.1	8
7	심방세동	3.3	6
8	다리골절	44.0	9
9	심실충격결손수술	12.8	16
10	복막염수술	5.6	17
11	폐암	2.7	21
n	정상 혈청
p	AK3

실시예 7; AK3 항체를 이용한 심근경색 진단과 심근경색의 임상적 특이성 시험

심장질환 진단용 생물학적 마커로서의 AK3의 임상적 특이성(clinical specificty)을 확인하기 위하여, 고려대학교 부속 구로병원의 순환기 내과에 의뢰하여 심근 경색증으로 확진받은, 입원환자의 입원 당일의 혈청을 확보하여, CKMB 농도를 측정하고 ECL-웨스턴 블로팅 및 샌드위치 ELISA를 수행하였다.

ELISA는 친화성 정제된 토끼 항-AK3 다클론 항체를 바이오틴화(biotynlation)하여 동일한 바이오틴화 되지 않은(non-biotinylated) 항체(450ng/well)를 96 마이크로타이터 플레이트에 부착시킨 후 100㎕의 혈청을 가해 30℃에서 1시간 반응시킨 후 인산완충액생리식염수(PBS)로 충분히 세척하고, 바이오틴화 항체를 2차 반응시킨다음 스티랩트아비딘 접합된 HRP의 결합, 발색 기질처리 후 ELISA 판독기로 흡광도를 판독하였다. 이 때 기준 물질은 본 발명자들이 분리 정제한 유전자 재조합 AK3를 사용하였다. CKMB와 AK3항체를 이용한 급성심근경색(AMI)의 진단 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

	시료 ID	병 명	CKMB^a)(ng/ml)	AK3	비고(연령/성별
	시료 ID	병 명	CKMB^a)(ng/ml)	웨스턴블로팅^d)	비고(연령/성별	샌드위치^b)ELISA(㎍/㎖)
1	417	심근경색	406.6	++	2.0	75/M
2	436	'	123.8	++	10.0	58/M
3	464	'	230.9	+++	4.7	67/F
4	474	'	47.23	++	11.6	65/M
5	481	'	378.6	+	2.0	53/M
6	487	'		+	3.0
7	503	'	51.1	+	7.3	56/M
8	514	'	33.2	++	7.6	53/M
9	526	'	2.15	++	3.3	57/F
10	547	'	314.2	+++	7.0	60/M
11	548	'	71.79	+	4.2	63/M
12	553	'	175.4	+++	5.8	52/M
13	565(6)	'	500.0	+++	4.7	61/M
14	578	'	176.7	+	8.1	57/M
15	606	'	1.55	+	1.2	64/M
16	607	'		+++	10.0
17	614	'	19.84	+	n.d.^c)	62/M
18	616	'	97.93	++	n.d.	45/M
19	621	'	1.79	+	n.d.	66/M
20	625	'	1.85	+	n.d.	51/M
21	626	'	1.62	++	5.0	41/M
모두 AK3 양성

^a)CKMB 분석; 고려대학부속안산병원에서 실시

^b)샌드위치 ELISA 정상인 혈청의 흡광도 값 : A₄₉₀<0.02;

(정상인으로부터 분리한 6 개 시료의 경우 모두 AK3가 검출되지 않았다)

^c)혈청의 부족으로 실험값을 측정하지 못하였음.

ECL 기질을 이용한 AK3 웨스턴 블로팅 분석결과는 도 17a 및 b에 도시하였다.

상기 표 5의 결과를 통해서 확인되는 바와 같이, 고려대학 부속 구로병원 순환기 내과에서 심근경색으로 확진된 환자 21 시료와 한양대학부속병원에서 확보한 심근경색증 환자의 10개 시료를 포함 총 60명의 환자 혈청 시료에 대하여 CKMB 및 AK3 진단지표 분석 결과 AK3는 100%의 정확도로 탐지되었다. 이러한 결과는 현재 심근 경색 진단의 최선의 대표적인 지표로 사용하는 CKMB 테스트에서 위음성(false negative)으로 판정되었던 약 25%에 대하여도 양성으로 판정할 수 있었다. 따라서 본 발명의 면역학적 제제가 현재 사용되고 있는 CKMB 테스트 보다 정확성이 매우 우수할 뿐 만아니라 병리생화학적 분석의 특이성이 높고, 임상적 특이성이 높은 장점을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에서 심근경색의 진단에 특징적으로 사용되는 아데닐레이트 키나제 이소자임 3(AK3)는 (1) 심근세포 특이적 손상에 의해 순환 혈액내로 유출되고; (2) 심근 상해 즉시 방출되는 특성을 지니며; (3) 방출 후 빠른 시간에 제거되어 지속적 상승 수치가 심근 상해의 연속성을 나타내고(표 2의 시료 No.7의 경우 심근경색병력이 있으나 혈청중에서 AK3가 확인되지 않았음; 데이타 도시하지 않았음), (4) 흉부 통증이 발생한 후 2시간 이내의 혈청농도 상승이 확인(도 16, 레인 3)되는 이점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 면역학적 제제 또는 진단키트는 심근경색 등의심장질환의 조기 진단을 가능하게 하고, 적절한 임상적 분석결과를 얻는데 있어서 특별한 기술 혹은 훈련을 요하지 않고, 쉽게 자동화 분석이 가능하며, 분석시료는 안정하고, 가격도 저렴하며, 방해 및 간섭이 없고; 현재 모든 임상병리에서 기본적으로 사용되는 기존 진단지표인 CKMB보다 정확도가 높은 이점을 제공한다. 더나아가 진단 키트화할 경우 기존의 패치(patch)형 혹은 스트립(strip)형의 키트 모두에 동일하게 적용할 수 있으므로 검사의 신속성 및 간편성을 제공할 수 있다.

또한, 기존의 진단방법들은 고가의 장비와 고도의 진단기술의 습득이 전제되어야 시술할 수 있기 때문에, 제한된 소수의 종합병원에서만 수행할 수 있는데 반하여, 본 발명의 진단키트는 개인 또는 의원급의 소규모 의료기관에서도 널리 사용할 수 있고 가격도 저렴한 이점을 제공하며, 더나아가 고가의 수입 진단시약 및 진단키트를 국산 제품으로 대체할 수 있는 수입대체 효과도 제공할 수 있다.

Claims

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검출 표지체(label)와 결합된 항체를 함유하는 면역학적 제제에 있어서, 상기 항체가 아데닐레이트 키나제 이소자임 3와 선택적으로 결합하는 항체인 것임을 특징으로 하는 심장 질환 진단용 면역학적 제제.
제6항에 있어서, 상기 검출 표지체가 방사성동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민, 효소 보조인자, 스트렙토아비딘, 바이오틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 심장질환 진단용 면역학적 제제.
아데닐레이트 키나제 이소자임 3으로 이루어진 심장질환 지표(marker).
검출 표지체와 결합된 아데닐레이트 키나제 이소자임 3에 선택적으로 결합하는 항체를 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 심장 질환 지표(marker) 검출 방법.
검출 표지체와 결합된 아데닐레이트 키나제 이소자임 3에 선택적으로 결합하는 항체 및 상기 항체가 담지된 담체를 포함하는 심장 질환 진단 키트.
제10항에 있어서, 상기 검출 표지체가 방사성동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물, 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민, 효소 보조인자, 스트렙토아비딘, 바이오틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 심장 질환 진단 키트.
제 10항에 있어서, 상기 진단 키트가 양성 대조군(positive control) 또는 음성 대조군(negative control)을 추가로 포함하는 진단키트.
1) 검출 표지체와 결합된 아데닐레이트 키나제 이소자임 3에 선택적으로 결합하는 항체를 검체의 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계;

2) 검출 표지체와 결합된 아데닐레이트 키나제 이소자임 3에 선택적으로 결합하는 항체를 대조 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장과 접촉시키는 단계;

3) 상기 1), 2) 단계에서 수득된 면역복합체를 정량 검출하는 단계; 및

4) 상기 3)단계의 결과를 비교하는 단계를 포함하는, 심장 질환 지표(marker) 검출 방법.
삭제
제13항에 있어서, 상기 3) 단계의 정량 검출이 면역형광항체법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 금입자(gold particle) 착물법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 심장 질환 지표 검출 방법.
제13항에 있어서, 상기 대조 뇨, 혈액, 혈청 또는 혈장이 면역형광항체법, 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법, 금입자(gold particle)착물법중에서 선택되는 하나의 방법에 의해 양성으로 판명된 혈청임을 특징으로 하는, 심장 질환 지표 검출 방법.