CN108562748A - Orai1蛋白和/或STIM1蛋白作为脑卒中生物标志物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白，特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白和/或STIM1蛋白，作为脑卒中生物标志物的用途。具体地，本发明涉及Orai1蛋白和/或STIM1蛋白在制备用于脑卒中诊断、罹患风险评估、患病严重程度的诊断、治疗效果的评估、预后恢复的判断等的产品中的应用，不仅可以快速有效地进行脑卒中的早期诊断、风险评估和预警，还可以为后期患病严重程度及治疗效果的评估、预后的判断提供重要依据，辅助医生的治疗方案。另外，本发明所述Orai1、STIM1蛋白还可以为药物治疗等临床应用提供治疗靶点和重要依据。

Description

Orai1蛋白和/或STIM1蛋白作为脑卒中生物标志物的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白，特别是外周血血浆中的外泌体上的Orai1蛋白和/或STIM1蛋白，作为脑卒中生物标志物的用途。

背景技术

缺血性脑卒中(cerebral ischemic stoke)是指脑部血管狭窄或者闭塞导致供血障碍，从而导致脑组织缺血、缺氧，进一步导致局限性脑组织的缺血性坏死或软化。缺血性脑卒中主要包括脑血栓形成和脑栓塞两种，同时缺血性脑卒中也可由血管壁病变、血管压迫、心脏疾病、血流动力学改变以及血液成分的改变等条件引发。缺血性脑卒中的临床表现比较复杂，取决于梗死部位和梗死体积，不同类型的脑缺血有着不同的临床表现，主要以局灶性神经功能缺损的症状和体征为特征，如偏瘫、偏身感觉障碍、失语、共济失调等，还有部分可表现为头痛、呕吐、昏迷等全脑症状。2010年全球疾病负担研究(GBD 2010)(N Engl JMed,2013,369:448-457)，将脑卒中列为影响寿命、导致伤残的第三大原因，脑卒中已经成为一个全球性的健康问题。根据相关部门最新统计显示，脑卒中已成为中国第一致死原因，我国每年新发脑卒中患者250万人，目前脑卒中患者至少700万人，致残率高达75％。脑卒中主要分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类，根据我国卫生部统计，缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的45.5％-75.9％。由此可见，能够预防和及时诊断脑卒中有着积极的医学及社会意义。

经研究发现，基质相互作用分子1(Stromal interaction molecules 1，STIM1)和细胞膜蛋白Orai1所构成的库操控的钙通道(store-operated calcium channels，SOCC)存在于人外周血血浆中提取的外泌体中。STIM1蛋白和Orai1蛋白是血小板激活的主要通路之一(Progress in Physiological Sciences,2012,43:417-421)，且共同参与GPVI诱导的库操控的钙流入(store-operated Ca²⁺entry SOCE)、凝血酶源激活和血栓形成(J BiolChem,2010,285,23:629-23638)。Orai1是位于质膜上的四次跨膜蛋白，是钙释放激活钙通道(CRAC)的主要组成蛋白。Orai1高表达于血小板，研究发现，敲除Orai1后的小鼠与野生型小鼠相比，出现严重的CRAC通道缺陷，激动诱导性钙应答，活化受损和血栓形成(Blood,2009,113:2056-63)。Orail蛋白的变异会导致免疫力缺陷，肌肉发育不全。Orail蛋白敲除会在体外实验中导致血小板聚集降低和在体内导致血栓形成(Ann N Y Acad Sci.2015,1356(1):45-79)。同时STIM1也高表达于血小板，研究发现，敲除STIM1后的小鼠与野生型小鼠相比，表现出更高的出生后致死率和明显的发育迟缓(J Exp Med,2008,205,1583-1591)。在高剪切力下，与正常组小鼠相比敲除STIM1组小鼠的血小板表现出黏附能力减弱、血栓覆盖率减弱、血栓体积减小(J Exp Med,2008,205,1583-1591)。敲除STIM1的血小板可以显著抑制血小板胶原受体糖蛋白VI依赖性钙信号，导致磷脂酰丝氨酸(血小板凝血活性所必需成分)的暴露减少，从而抑制血栓形成(J Exp Med,2008,205,1583-1591)。由此可见，Orai1蛋白和STIM1蛋白在血小板的生物活动和血栓形成的过程中起着至关重要的作用。因此Orai1蛋白和STIM1蛋白有条件成为检测血小板活性的生物标记。

外泌体(exosome)，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/mL，是由细胞主动分泌的膜性囊泡，经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成，在细胞质内首先形成核内体(也称为多囊泡体)，后释放至细胞外环境。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、腹水和母乳。外泌体是重要的细胞间信使，可以携带蛋白，运送RNA，同时外泌体本身含有脂质，蛋白质以及RNA。研究表明，来源自不同细胞的外泌体会携带该细胞独特或关键的功能分子，携带不同的蛋白质及mRNA，导致不同来源的外泌体有不同的生物学功能。由于来源于细胞，外泌体所含的物质表征着来源细胞中的部分物质，也就给检测其来源细胞内的某些蛋白质与核酸的变化带来了可能性。目前，通过一定实验和数据分析方法研究样品中的蛋白质含量，对比正常个体的样品数据，为疾病的早期诊断、患病程度、预后情况等提供重要基础和依据。近年来，已经有许多疾病，包括某些肿瘤，可以通过对患者血浆中的外泌体的检测，实现早期诊断，同时为疗效判断和预后提供重要依据。

本发明经过研究发现，Orai1蛋白与STIM1蛋白皆表达于脑卒中患者血浆外泌体中，且其在脑卒中患者与健康个体的外泌体中表达具有差异性，因此Orai1蛋白与STIM1蛋白具有成为脑卒中早期生物标志物的可能，为早期脑卒中提供诊断，为患者的患病程度评估和预后治疗提供依据。

发明内容

本发明一方面提供一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在制备脑卒中相关产品中的应用。

优选地，所述脑卒中相关产品包括诊断脑卒中、评估罹患脑卒中的风险、评估脑卒中患病严重程度、评估对脑卒中治疗效果、判断脑卒中的预后等的产品。

优选地，所述应用是根据样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量或含量的变化来进行的；更优选地，所述应用是根据样品中Orai1蛋白和STIM1蛋白含量或含量的变化来进行的。

优选地，所述样品为外周血血浆中的外泌体。

优选地，所述样品来源于哺乳动物，如人类、大鼠、小鼠等，更优选为人。

在本发明的一个实施方案中，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体；优选为抗Orai1和STIM1蛋白的抗体。

优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

优选地，所述的产品选自：试剂、药物、试纸、试剂盒、芯片等中的一种或多种。

在本发明的一个实施方式中，所述产品为试剂盒。

在本发明的一个实施例中，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体；更优选地，所述试剂盒包括抗Orai1和STIM1蛋白的单克隆抗体和/或多克隆抗体。

在本发明的一个实施方式中，所述应用为Orai1蛋白和STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1和STIM1蛋白或其活性片段的物质在制备脑卒中相关产品中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述应用为Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在制备诊断脑卒中或评估罹患脑卒中的风险的产品中的应用；所述产品根据样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量或含量的变化来诊断脑卒中或评估罹患脑卒中的风险；当样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量升高或其含量高于正常值时，特别是样品中Orai1蛋白和STIM1蛋白含量均升高或其含量均高于正常值时，表明受试者患有脑卒中，或表明罹患脑卒中的风险较高，且样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量偏离正常值的程度与患病风险呈正相关。

在本发明的另一个实施方式中，所述应用为Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在制备评估脑卒中的治疗效果、判断脑卒中的预后的产品中的应用；所述产品根据样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量或含量的变化来评估脑卒中的治疗效果或判断脑卒中的预后；当样品中的Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量降低时，特别是样品中Orai1蛋白和STIM1蛋白含量均降低时，表明脑卒中的治疗有效或效果较好，或表明脑卒中的预后较好。

本发明另一方面还提供一种试剂盒，所述试剂盒用于诊断脑卒中、评估罹患脑卒中的风险、评估脑卒中患病严重程度、评估对脑卒中治疗效果、判断脑卒中的预后等，其包括检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质。

优选地，所述试剂盒中，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为检测哺乳动物外周血血浆中的外泌体上的Orai1和/或STIM1蛋白含量的物质。

优选地，所述哺乳动物选自：人类、大鼠、小鼠等，更优选为人。

优选地，所述试剂盒中，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体。优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

优选地，所述试剂盒包括检测Orai1和STIM1蛋白或其活性片段的物质。

在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒包括抗Orai1和STIM1蛋白的单克隆抗体和/或多克隆抗体。

优选地，所述试剂盒中还包括外泌体提取产品(特别是从哺乳动物外周血血浆中提取外泌体的产品)，如外泌体提取试剂盒，其可为市售产品，也可根据现有技术公开的方法制备得到。

本发明中所述的抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体可采用现有产品或已知方法制备，本发明对此不作具体限定。

本发明中所述酶联免疫试剂盒中还可包括其他成分，如包被缓冲液、洗涤液、稀释液、封闭液、终止液等，本领域技术人员可根据实际需要选择合适的组分和用量等，本发明对此不作具体限定。

本发明另一方面还提供一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1蛋白和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在筛选治疗和/或预防脑卒中的药物中的应用。

优选地，所述应用为Orai1蛋白和STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1蛋白和STIM1蛋白或其活性片段的物质在筛选治疗和/或预防脑卒中的药物中的应用。

本发明另一方面还提供一种能够降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质在制备用于治疗和/或预防脑卒中的药物中的应用。

优选地，所述能够降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质可以是任何物质，如小分子化合物、生物大分子如蛋白质(如抗体、配体等)、多肽或核酸等，所述物质可以通过与Orai1蛋白和/或STIM1蛋白的直接或间接作用来降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量。

优选地，所述物质能够同时降低Orai1蛋白和STIM1蛋白水平。

优选地，所述能够降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质为能够降低哺乳动物外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质。

本发明经过研究发现，在脑卒中病人的外周血血浆中的外泌体上，Orai1、STIM1蛋白表达量高于正常人群的表达量，且Orai1、STIM1蛋白表达量与病人的患病严重程度存在正相关的关系，提出Orai1、STIM1蛋白可以作为生物标志物，对其表达量定量用于脑卒中的诊断、罹患脑卒中的风险评估、患病严重程度的评估、其治疗效果的评估、预后的判断等中，不仅可以快速有效地进行脑卒中的早期诊断、风险评估和预警，还可以为后期患病严重程度及治疗效果的评估、预后的判断提供重要依据，辅助医生的治疗方案。另外，Orai1、STIM1蛋白还可以为药物治疗等临床应用提供治疗靶点和重要依据。

附图说明

图1所示为根据本发明的实施方案中所测定的标准蛋白1的OD值的标准曲线(y＝0.0013x+0.1533，R²＝0.9718)。

图2所示为根据本发明的实施方案中所测定的标准蛋白2的OD值的标准曲线(y＝0.0014x+0.0914，R²＝0.9475)。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

本发明中所述“脑卒中”是指由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循环障碍而引起脑组织损伤的一种疾病。在本发明的一个实施例中，所述脑卒中为缺血性脑卒中，所述缺血性脑卒中是指因脑部血液循环障碍(例如颈内动脉、颈外动脉、椎动脉、大脑中动脉因狭窄或闭塞引起的循环障碍)、缺血、缺氧导致的局灶性脑组织缺血性坏死或软化的总称，其为脑卒中的主要类型。

本发明中，所述Orai1、STIM1蛋白来源于哺乳动物，特别是人类，其序列分别可见GenBank：AAH13386、GenBank：AFZ76986.1。所述的“其活性片段”是指Orai1蛋白的活性片段或STIM1蛋白的活性片段，例如，所述Orai1蛋白的活性片段是指具有Orai1蛋白功能的片段，其可以为Orai1蛋白的一部分，也可以为Orai1蛋白的氨基酸序列经过缺失、添加或替换后得到的片段，例如该活性片段为包含Orai1蛋白与配体或受体结合的部分的片段，或者经过氨基酸缺失、添加或替换后仍保留Orai1蛋白功能的片段。

本发明中，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为本领域所公知，或者其制备方法或获得方法为本领域所公知，通常情况下，其可以和Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段特异性结合，通过检测该物质可以检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的存在或含量，例如，其可以为哺乳动物(如人类)体内天然存在的可以与Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段结合的配体、受体或抗体，也可以为本领域技术人员制备的能够与Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段特异性结合的抗体，如单克隆抗体和/或多克隆抗体。在本发明的一个实施例中，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为抗体，如单克隆抗体和/或多克隆抗体。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：外泌体提取

1工具

采血管、高速离心机、低温储存装置、SBI外泌体提取试剂盒。

2方法

分离富集血小板血浆，抽取静脉血8mL，用蓝色抗凝采血管(枸橼酸钠1：9)分装；在20℃、300g的条件下离心15min，收集沉淀(白细胞和红细胞)；将离心上清血浆转移至新的EP管中；在20℃、2400g的条件下离心15min，得到沉淀(血小板)以及去血小板血浆。即时提取的去血小板血浆，在4℃、13000g的条件下离心15min。取上清用SBI试剂盒提取外泌体。

实施例2：抗体制备

1材料

1.1试剂

BL21(DE3)原核表达宿主菌、LB培养基、卡那抗生素、高亲和性NI树脂、琼脂糖凝胶、咪唑、尿素、NaCl、SDS、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、考马斯亮蓝、BCA蛋白浓度测定试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等。

1.2仪器

高压灭菌锅、恒温摇床、冷冻离心机、超声破碎仪、蛋白纯化仪、恒温培养箱、蛋白电泳设备、恒温搅拌器、涡旋仪、酶标仪等。

2制备流程

根据要求设计得到Orai1和STIM1基因序列，构建至原核表达载体或者真核表达载体。所表达的STIM1蛋白氨基酸序列参见GenBank:AFZ76986.1；所表达的Orai1蛋白氨基酸序列参见GenBank:AAH13386。

2.1抗原制备(原核表达)

pET30a-STIM1和pET30a-Orai1阳性质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)，涂布于卡那固体培养基(卡那浓度100μg/mL)，挑取单菌落接种至液体培养基培养15h后，保存甘油菌于-80℃。实验前将冻存的菌种进行过夜培养活化，菌种以1：50扩大培养300mL，加入1mM的IPTG，37℃诱导表达6h。6000rpm、4℃离心10min，收集菌体。使用100mL破碎液对菌种进行超声波裂解，11000rpm、4℃离心13min，收集上清和沉淀，使用SDS-PAGE检测。

利用高亲和性NI树脂纯化蛋白，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果可行。变性条件下纯化所得的蛋白进行梯度尿素复性，SDS-PAGE检测，蛋白复性效果可行。最终所得的Orai1蛋白混合物纯度84.7％，蛋白浓度2mg/mL，蛋白量10.3mg。最终所得的STIM1蛋白混合物纯度80.7％，蛋白浓度1.87mg/mL，蛋白量9.4mg。

2.2多抗制备

将步骤2.1制备的两种蛋白分别与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫兔子。各免疫5只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔30天，最后经ELISA检测，抗血浆滴度>1:50000。

耳缘静脉加强免疫，加强免疫半个月后采集兔血(全部采集)。

兔血离心15min(7000rpm，室温)，提取抗体后，采用Protein A小柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再分别用7mL0.4M PB缓冲液(pH 7.0)、10mL 0.4M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱，后洗脱抗体，平衡pH值至中性保存。

2.3单抗制备

将步骤2.1制备的两种蛋白分别与等体积的弗氏佐剂、YOULONG佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，分别用于免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫三次，间隔30天，最后一次免疫14天。取出小鼠脾脏，得脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，2天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，将建株的阳性单克隆细胞扩大培养，冻存。

2.4腹水单抗制备

提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，9天左右收集腹水，7000rpm离心，取上清再次离心提取抗体，进行纯化，将纯化好的抗体进行过夜包被、封闭和洗板。纯化后的用抗体稀释液进行梯度稀释100μL/孔，在37℃下反应1h；洗板，加入100μL酶标二抗/孔，在37℃下反应1h；洗板，加入100μL显色剂/孔，室温避光反应25min，450nm读取OD值。以0.5作为截断值，得到抗体的效价。

2.5配对筛选

将步骤2.4制备的的两种鼠单抗(抗Orai1单抗和抗STIM1单抗)分别用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被过夜。洗液清洗包被板3次、封闭。Orai1蛋白STIM1蛋白溶液(高标)分别以浓度梯度1000、100、10和0ppb加入包被板，加入阴性对照，每孔100μL，30℃温育一个小时。

辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体作为检测抗体，洗板3次，加入每孔100μL 2MH₂SO₄，终止反应，在30分钟内于ELISA检测仪上读取波长450nm下的OD(吸光度)值。

2.6结果

将步骤2.4制备的单抗中，强阳性STIM1蛋白单抗与兔多抗进行配对或者强阳性单抗之间进行配对。根据最强结合信号，确定出最佳的包被抗体A和检测抗体B(酶标抗体B)。配对效果检测结果如表1所示。

表1 STIM1抗体配对效果检测结果

抗体编号	阳性	阴性
			1	2.478	0.19
2	2.434	0.126
			3	2.185	0.272
4	2.83	0.239
			6	2.556	0.274
7	2.4	0.27
			8	2.347	0.235
11	2.436	0.246
			12	2.174	0.273
13	2.224	0.283
			14	2.288	0.292
17	2.375	0.239
			18	2.434	0.237
19	2.367	0.154

将步骤2.4制备的单抗中，强阳性Orai1蛋白单抗与兔多抗进行配对或者强阳性单抗之间进行配对。根据最强结合信号，确定出最佳的包被抗体A和检测抗体B(酶标抗体B)。配对效果检测结果如表2所示。

表2 Orai1抗体配对效果检测结果

抗体编号	阳性	阴性
			1	2.566	0.19
2	2.347	0.126
			3	2.045	0.272
4	1.68	0.239
			6	2.698	0.274
7	2.164	0.27
			8	2.25	0.235
11	2.119	0.246
			12	2.646	0.273
13	2.366	0.283
			14	2.154	0.292
17	2.375	0.239
			18	2.4	0.237
19	2.587	0.154

2.7灵敏度确定

选取配对筛选阴性值低、阳性值高的一对STIM1包被抗体A和STIM1检测抗体B，按照前述方法，加入不同浓度的标品与酶标抗体B，确定灵敏度与酶标抗体B使用浓度。灵敏度检测结果如表3所示。

表3灵敏度检测结果

选取配对筛选阴性值低、阳性值高的一对Orai1包被抗体A和Orai1检测抗体B，按照前述方法，加入不同浓度的标品与酶标抗体B，确定灵敏度与酶标抗体B使用浓度。灵敏度检测结果如表4所示。

表4灵敏度检测结果

实施例3：建立并优化ELISA测试方法

包括试剂的组成成分的确定，捕获和检测抗体用量的确定，以及对特异性和灵敏度的测试，组间和组内误差的测试，样品回收率的确定。该STIM1蛋白检测方法的检测灵敏度为5.5ng/mL，标准曲线为50ng/mL到1600ng/mL；对于样品浓度为115-920ng/mL的STIM1蛋白溶液，回收率>90％。对于低浓度200ng/mL、中浓度500ng/mL和高浓度800ng/mL，其组内变异系数分别为3.63％、5.2％和5.89％，而组间的变异系数分别为6.42％、7.87％和9.43％。试剂盒的真阳性率为：84.4％；特异度(真阴性率)：85.5％；假阳性率：4％；假阴性率16％。

该Orai1蛋白检测方法的检测灵敏度为3.7ng/mL，标准曲线为50ng/mL到1000ng/mL；对于样品浓度为115-920ng/mL的STIM1蛋白溶液，回收率>90％。对于低浓度200ng/mL、中浓度500ng/mL和高浓度800ng/mL，其组内变异系数分别为2.94％、4.31％和5.54％，而组间的变异系数分别为5.8％、7.01％和9.26％。试剂盒的真阳性率为：85.94％；特异度(真阴性率)：85.73％；假阳性率：3.62％；假阴性率15.67％。

实施例4：根据本发明的诊断试剂盒及其示例性诊断应用

表5试剂盒的组分

1试剂

包被缓冲液，0.1M碳酸盐缓冲液(CB)，pH值为9.6；

稀释液，0.01mM磷酸盐缓冲液(PBS)，pH值为7.4；

洗涤液，含0.2％吐温-20的PBS；

封闭液，含1％BSA的CB；

终止液，2M H₂SO₄；

标准品1为Orai1蛋白标准品，酶标记抗体1包括Orai1包被抗体A和Orai1检测抗体B(实施例2步骤2.7筛选得到)各一瓶；

标准品2为STIM1蛋白标准品，酶标记抗体2包括STIM1包被抗体A和STIM1检测抗体B(实施例2步骤2.7筛选得到)各一瓶。

2ELISA板制备

大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的Orai1蛋白、STIM1蛋白，根据具体的灵敏度稀释成不同的浓度：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、50ng/mL、0ng/mL。取一定量的酶标记抗体B(实施例2制备)加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为3μg/mL，低温避光保存

移取一定量Orai1抗体和STIM1抗体(实施例2制备)于所需体积的包被液中，将包被工作液按每孔100μL加入酶标板微孔，4℃静置过夜。将封闭工作液按每孔150μL加入微孔，37℃温育3.5小时。弃去封闭液，真空热封。

使用本发明试剂盒(试剂盒组分如上表5所示)检测人体中的Orai1蛋白、STIM1蛋白标准品或外周血血浆中的外泌体未知浓度样品。加标准品或未知浓度样品：

100μL的样品稀释液(空白对照)/标准品/未知浓度样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应50min。检测蛋白浓度，低温储存。洗板3次，加入酶标抗体100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应50min，加入显色剂100μL/孔，置于25℃避光环境中反应25min。加入100μL终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔OD值。

计算：利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的OD值绘制标准曲线，如图1和图2所示；通过标准曲线和未知浓度样品的OD值就可计算出未知样品中Orai1蛋白、STIM1蛋白的浓度(需除以各样本蛋白浓度)。正常未患病人群和缺血性脑卒中患病人群的外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白、STIM1蛋白的结果如表6所示。

表6正常未患病人群和缺血性脑卒中患病人群的外周血外泌体中Orai1、

STIM1蛋白含量结果对比

从表6可见，在患病人群中，即使Orai1蛋白、STIM1蛋白表达量较低的低表达组，其平均Orai1蛋白和STIM1蛋白表达量也为正常人群表达量的5-8倍，因此可以通过将Orai1蛋白和/或STIM1蛋白的表达量定量来诊断受试者是否患有缺血性脑卒中，或者是否具有更高的发生脑卒中的风险。

分别将Orai1蛋白和STIM1蛋白表达低组和中组合并与高表达组进行三个月的出院后NIHSS评分的对比，Orai1蛋白和STIM1蛋白表达组的NIHSS评分明显差于低表达和中表达组(p<0.005)。NIHSS评分结果如表7所示。

表7 NIHSS评分对比

从表7中可知，患病严重程度不同的病人的外周血血浆中的外泌体内Orai1蛋白和STIM1蛋白表达量存在差异，或者说外周血血浆中的外泌体内Orai1蛋白和STIM1蛋白表达量与病人的患病严重程度存在正相关的关系，因此可以通过将Orai1蛋白和/或STIM1蛋白的表达量定量来诊断受试者的患病严重程度、预后恢复等等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在制备脑卒中相关产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是根据样品中Orai1蛋白和/或STIM1蛋白含量或含量的变化来进行的。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样品为外周血血浆中的外泌体。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑卒中相关产品包括诊断脑卒中、评估罹患脑卒中的风险、评估脑卒中患病严重程度、评估对脑卒中治疗效果、判断脑卒中的预后的产品。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的产品选自：试剂、药物、试纸、试剂盒和芯片中的一种或多种；优选地，所述产品为试剂盒。

7.一种用于诊断脑卒中、评估罹患脑卒中的风险、评估脑卒中患病严重程度、评估对脑卒中治疗效果、判断脑卒中的预后的试剂盒，其包括检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质为抗Orai1和/或STIM1蛋白或其活性片段的抗体；优选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

9.一种Orai1蛋白和/或STIM1蛋白及其活性片段、检测Orai1蛋白和/或STIM1蛋白或其活性片段的物质在筛选治疗和/或预防脑卒中的药物中的应用。

10.一种能够降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质在制备用于治疗和/或预防脑卒中的药物中的应用；优选地，所述能够降低Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质为能够降低哺乳动物外周血血浆中的外泌体上Orai1蛋白和/或STIM1蛋白水平的物质。