CN1910456B - 视神经脊髓炎的标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于诊断和治疗视神经脊髓炎及相关疾病的方法和材料。

Description

视神经脊髓炎的标记
技术领域
本发明一般性地涉及神经系统疾病，更具体地，涉及用于视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、复发性脊髓炎(relapsing myelitis)或视神经炎(optic neuritis)、和亚洲视神经脊髓形式的(Asian opticospinal form ofmultiple sclerosis(MS))的自体抗体标记。
背景
视神经脊髓炎(NMO)是一种神经系统疾病，在西方国家已知为Devic′s综合症，在亚洲已知为视神经脊髓多发性硬化(opticospinal multiplesclerosis)。据认为NMO是多发性硬化(MS)的一种严重的变种，占亚洲人MS病例的30％。在北美，非高加索人(non-Caucasians)表现出比典型MS患者频率更高的NMO患者频率。NMO的这种典型的炎症型神经脱髓鞘损害选择性和重复性地影响视神经和脊髓，因此引起失明和瘫痪。
发明概述
在视神经脊髓炎(NMO)和亚洲视神经脊髓形式的多发性硬化病患者的血清和脑脊髓液中鉴定出了一种特异标记。NMO-特异性抗体的存在可以用于区别NMO和MS，还可以在尚没有满足任何临床标准的疾病早期用于诊断NMO，从而使得早开始对NMO进行适宜的免疫抑制或免疫调节治疗。
一方面，本发明提供检测个体的生物样品中NMO-特异自体抗体的存在或不存在的方法。所述方法包括将生物样品与NMO抗原性多肽或其片段相接触，此处所述NMO抗原性多肽为水通道蛋白-4(aquaporin-4)或与星形胶质细胞肌营养蛋白复合体相互作用的蛋白；和检测NMO抗原性多肽与生物样品中NMO-特异性自体抗体的结合的存在或不存在。在一个实施方案中，所述NMO抗原性多肽是一种重组表达的NMO抗原性多肽。在另一个实施方案中，所述NMO特异性多肽是在一种固体组织中，所述固体组织选自于由下列组织组成的组：脑、脊髓、视神经、肾、或胃。
例如，生物样品中NMO-特异自体抗体的存在可以与个体的视力损害、衰弱、麻木、痉挛或异常或疼痛感觉、和/或膀胱和/或肠失控相关。另外，NMO-特异自体抗体的存在通常与个体的NMO相关。典型的生物样品选自于由血液、血清、血浆、和脑脊髓液组成的组。
另一方面，本发明提供检测个体的生物样品中NMO抗原性多肽的存在或不存在的方法。所述方法包括将生物样品与一种抗NMO抗原抗体相接触，此处的NMO抗原为水通道蛋白-4；和检测抗NMO抗原抗体与生物样品的结合，其中的结合是生物样品中存在NMO抗原性多肽的指示。一般地，生物样品中NMO抗原性多肽的存在是个体中NMO的指示。所述个体可能部分或完全失明。典型的生物样品包括血液、血清、血浆、和脑脊髓液、脑组织活检、和脊髓组织活检。
另一方面，本发明提供一种制品，其包括NMO抗原性多肽和应用所述NMO抗原性多肽检测个体中抗NMO抗原自体抗体的用法说明。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。所述制品可以用于在个体中诊断NMO。在一种实施方案，所述制品可以进一步包括一种单克隆抗体，其具有对NMO抗原性多肽特异接合的亲和力。
另一方面，本发明提供对患有NMO的个体的治疗方法。所述方法包括从个体抽出体液，其中的体液包含一种或多种与水通道蛋白-4结合的自体抗体；从体液中移出主要部分的所述自体抗体；和将所述体液返回受治疗者。
另一方面，本发明提供通过给个体施用一种NMO抗原性多肽治疗患有NMO的个体的治疗方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。一般地，施用是通过如口服、静脉注射、和肠胃外施用的方法进行。
另一方面，本发明提供通过给个体施用一种编码NMO抗原性多肽的核酸治疗患有NMO的个体的治疗方法。所述NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术工人常规理解相同的意思。尽管方法和材料与此处所述的方法和材料相似或等同，可以用于实践或测试本发明，下文仍对合适的方法和材料进行描述。另外，所述材料、方法和实例仅为举例说明，不是有意限制。此处提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考在此全部加入作为参考。一旦出现冲突，以本发明的包括定义在内的说明书为准。
本发明一个或多个实施方案的详情在下述附图和描述中阐明。其它本发明的特征、目的和优点将从附图和发明详述，以及权利要求中清楚地看出。
附图简述
图1是一个评分表，其用于评估与个体血清接触的组织密度和免疫组织化学染色模式。
图2是人水通道蛋白-4核酸的限制性图谱。
在各种附图中的相同的参考符号表示相同的要素。
发明详述
从视神经脊髓炎(NMO)和亚洲视神经脊髓性多发性硬化病(Asianopticospinal MS)(本申请中用NMO同义地指NMO和亚洲视神经脊髓性多发性硬化病)患者的血清和脑脊髓液中鉴定出一种特异的IgG自体抗体标记。另外，这种自体抗体可以在患有广谱炎症疾病的患者中发现，其中所述广谱炎症疾病包括迄今不被认为与NMO有关的脊髓、视神经、和更罕见地，脑干或脑的其它区域的炎症疾病。
NMO-特异性抗体的存在可以用于在尚没有满足任何临床标准的疾病早期用于诊断NMO，从而使得早开始对NMO进行适当的免疫抑制或免疫调节治疗，并且其还可以进一步用于区别NMO和MS。检测NMO-特异性抗体还能提供一种可以计量的生物标记，用于监测疾病进展和对治疗的反应。免疫染色的模式还能用于对与NMO相关的疾病进行分类，所述疾病包括各种多发性硬化病、分离的视神经炎、特定的脊髓病和全身性红斑狼疮和斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)的“视神经-脊髓”伴随症。另外，与NMO相关的抗体的识别提供一种有价值的IgG工具，用于开发动物模型(例如，通过NMO-特异抗体的被动转运，或者使用NMO抗原性多肽或编码此类抗原性多肽的DNA疫苗的主动免疫)，以研究NMO损伤的发病机理和测试对NMO的潜在的新治疗。
NMO抗原性多肽和NMO-特异性抗体
本发明提供使用NMO抗原性多肽检测个体中NMO-特异性自体抗体的方法。本发明所述方法可能应用的个体典型地表现出视力损伤和/或麻刺感、麻木、衰弱、四肢痉挛、膀胱和/或肠失控、或其它不明原因的神经症状。本发明的方法基于个体的异常神经症状和NMO-特异性自体抗体的存在之间的联系。
NMO抗原性多肽包括一个或多个抗原表位位点。本发明还提供NMO抗原性多肽的抗原表位，其与T细胞的激活和抑制有关。计算机运算可以用于预测结合的抗原表位，例如，MHC-I和MHC-II结合的抗原表位。例如，参见World Wide Web上的bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla bind/(Parker，J.Immunol.，152：163(1994)；Southwood等，J.Immunol.，160：3363(1998))。上下文中所述的术语“典型的(characteristic)”意为所述抗原表位位点允许对血清中NMO-特异性抗体进行合理可靠的免疫检测。通常地，所述抗原表位位点需要具有与其它紧密相关的抗原(如其它多肽家族成员)截然不同的抗原性。一种典型的抗原片段可能包括，例如，膜结合蛋白的细胞外域。
所述NMO抗原性多肽可以从表达核酸的细胞(如转染的宿主细胞)中获得，或者，该多肽可以是合成的。一种编码NMO抗原性多肽或其片段的DNA分子自身可以是天然的或用通过常规技术从人体组织中获得的天然基因合成的。
所述NMO抗原性多肽可以以一种基本上纯的形式获得。关于多肽，“纯化”是指多肽在混合成分中构成主要成分，例如，50重量％或更多，60重量％或更多，70重量％或更多，80重量％或更多，90重量％或更多，或95重量％或更多。纯化的多肽典型地通过从产生多肽的生物体纯化获得，尽管化学合成也是可行的。多肽可以用常规蛋白纯化方法纯化，包括亲和层析或免疫吸附亲和层析柱。
本发明的NMO抗原性多肽可以以修饰或不修饰形式用于NMO-特异性自体抗体的检测。多肽常常通过将所述多肽与提供可检测信号的第二种物质共价或非共价地结合进行标记。多种标记和共轭连接技术在本领域内已知，并在科学和专利文献中广泛报道。一些标记包括放射性同位素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性粒子，等等。
按照上述制备的NMO抗原性多肽可以用在多种免疫学技术中以检测如来自血清和脑脊髓液的生物样品中的NMO-特异性自体抗体。依据样品的本质，可以应用免疫测定和免疫细胞化学染色技术两者之一或全部。酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、和放射性免疫测定是本领域的常规方法，可以用于检测NMO-特异性自体抗体在血清中的存在。
本发明进一步提供包含一种或多种NMO抗原性多肽的试剂盒。所述试剂盒可以进一步包含提供可检测信号第二种物质。典型地，一种试剂盒还包括对使用所述NMO抗原性多肽和/或实践本发明所述方法(即，检测生物样品中的NMO-特异性自体抗体)的用法指导。
本发明还提供一种在来自个体的生物样品中检测NMO抗原性多肽的方法。所述方法描述NMO抗原性多肽异常表达水平或模式的存在，随后产生的NMO-特异性自体抗体，和在个体中导致的NMO三者之间的关联。所述检测最广泛地应用于那些表现出如失明的神经症状的患者，和那些怀疑患有MS或NMO的患者。多肽的检测典型地通过使用抗体进行，此处为抗NMO抗原抗体，以区别所述动物或重组产生的抗体和由个体免疫系统产生的NMO-特异性自体抗体。本发明还提供一种抗体，包括对NMO抗原性多肽具有特异结合亲和力的单克隆抗体。
一旦获得足够量的NMO抗原性多肽，可以通过本领域普通技术人员已知的技术生产对NMO抗原性多肽具有特异结合亲和力的单克隆或多克隆抗NMO抗原抗体。此处所用的对NMO抗原性多肽具有“特异结合亲和力”的抗NMO抗原抗体定义为那些与NMO抗原性多肽结合但不与其它多肽结合的抗体，例如，多肽家族的其它成员。此处所用的“抗NMO抗原抗体”引用任意种类的全部抗体，即，IgG，IgA，IgM，IgE，或其它已知的种类，还包括具有必要的特异结合亲和力的所有抗体的一部分或片段(如Fab或(Fab)2片段)，改造的单链Fv分子，或嵌合分子，如包含对一种抗体(如鼠源的)的结合特异性和另一种抗体(如人源的)保留部分的抗体。
本发明的抗NMO抗原抗体可以以修饰或无修饰形式用于NMO抗原性多肽的检测。抗NMO抗原抗体可以直接或间接地标记，并且在科学和专利文献中已知并广泛报道过多种标记和共轭结合技术，其中标记包括放射性同位素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂和磁性粒子。
如上述制备的抗NMO抗原抗体可以在多种免疫技术中应用，以检测样品中的NMO抗原性多肽。此处所用的“生物样品”通常为来自个体的样品。生物样品的非限制实例包括血液、血清、血浆、或脑脊髓液。另外，可以用固体组织，例如脊髓或脑组织活检。抗体在蛋白结合检验中的应用已经被很好地确立。依据样品的本质，可以应用免疫测定(如放射性免疫测定)和/或免疫组织化学/免疫细胞化学染色技术。液相免疫测定(如竞争抑制放射性免疫测定)或固相免疫测定(如抗原捕获或Western印迹分析)也可以用于检测生物样品中的NMO抗原性多肽。另外，酶联免疫吸附测定(ELISA)常在本领域实行，并且可以用于检测生物样品中NMO抗原性多肽的存在。
科学和专利文献中已经描述了许多竞争性和非竞争性的蛋白-结合测定，并且大量的此类测定商购可获得。一种所述的竞争性测定的实例，检测在如血清的生物样品中NMO抗原性多肽的存在，包括：将NMO抗原性多肽(标记或未标记)与抗NMO抗原抗体(标记或未标记)和生物样品相接触。所述NMO抗原性多肽可以，例如，附着到固体表面上。使用已知量的NMO抗原性多肽和标记的抗NMO抗原抗体以产生标准结合曲线，就可以确定生物样品中NMO抗原性多肽的相对量。
本发明进一步提供的是包含对NMO抗原性多肽或其片段具有结合亲合力的抗NMO抗原抗体的试剂盒。所述试剂盒还可以包括NMO抗原性多肽或其片段，以用作结合对照或产生标准的定量曲线。试剂盒进一步包括提供可检测标记的第二种物质。试剂盒典型地包含使用抗NMO抗原抗体和/或实行本发明方法(即检测生物样品中的NMO抗原性多肽)的操作说明。
本发明还提供的是对共轭结合到可检测标记上的NMO抗原性多肽具有特异结合亲和力的抗NMO抗原抗体。合适的可检测标记包括，但不局限于，酶、放射性同位素、染料和生物素。本发明还提供共轭结合到成像剂上的NMO抗原性多肽具有特异结合亲和力的抗NMO抗原抗体。合适的成像剂包括，但不局限于，放射性同位素，如32P、99Tc、111In和131I。
治疗NMO的方法
本发明进一步提供的治疗患有NMO的个体的方法。NMO的治疗需要调节个体因NMO-特异性免疫机制导致的神经症状。治疗患有NMO的个体的方法包括，但不限于，单采血液成分术和基于T细胞的免疫治疗。
本领域已知单采血液成分术(即，从个体抽取血液，从血液中移除成分，然后将剩下的血液，或缺乏一种或多种成分的血液输回个体)的方法和体外系统(参见，例如，U.S.专利Nos.4,708,713；5,258,503；5,386,734；和6,409,696)。本发明提供一种从个体的体液中分离NMO-特异性自体抗体的方法。所述方法包括抽取受试者体液；从所述液体中分离主要部分的NMO-特异性自体抗体；然后将体液输回给受试者。分离的抗体可以是任何种类，如IgG(如IgGI、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgD、IgA、或IgE抗体。
如此处所用，“主要部分(subtantial portion)”意指将分离前体液中存在的NMO-特异性自体抗体分离出至少20％(如，至少：20％；30％；40％；50％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；93％；95％；96％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％；或甚至100％)。所述体液可以是血浆或其它体液，如，淋巴液或脑脊髓液。按照本发明的方法，耗尽患有NMO的个体的NMO-特异性自体抗体将导致症状的减轻。
分离出NMO-特异性自体抗体通常通过将体液与NMO抗原性多肽接触来实现。NMO抗原性多肽可以结合到固体支持物上。此类固体支持物可以是，但不限于，膜、纤维、圆珠、或细粒，并且可以用不溶解于水的，优选多孔的、生物相容的材料，例如，如琼脂糖、糖苷的有机聚合体，和聚丙烯酰胺，或无机多孔材料，如多孔玻璃或多孔硅胶。此类材料适于或可以适合NMO抗原性多肽的附着。
当体液为血液时，血浆和/或白细胞可以与红细胞分离(如红血球)，并且可以将伴随或不伴随白细胞的红细胞输回个体。通常，将带有人造血浆而非其最初的血浆的血细胞输回给个体。“代替液体”(如生理盐水)可以在分离出所述液体后施用给个体。可选地，NMO-特异性自体抗体可以在单采血液成分过程中选择性地从血浆中分离出来，并且血细胞可以与耗尽NMO-特异性自体抗体的血浆相混合，然后作为混合物重新灌注回个体中。
所述系统可以是连续的系统，在其中，例如，将血液从经过衍生有NMO抗原性多肽的固体支持物的血管(如动脉或静脉)中泵出，并直接泵回给个受试者。当在非连续系统中时，在血浆流经固体支持物之前，将血细胞从血浆中分离出来。
T细胞受体治疗的方法在本领域内已知。参见，例如，U.S.专利No.5,614,192；Matsumoto等，2000，J.Immunol.，164：2248-54；和Mackay，2000，British Med.J.，321：93-6。具有对NMO抗原-受体表达的抗原的特异结合亲合力的单克隆或多克隆抗体，或其它能够减少并维持NMO-特异性自体抗体的生产的T细胞群标记，可以用于耗尽或抑制一种或多种病原T细胞。T细胞受体的CDR3光谱类型可以用于鉴定自体免疫疾病相关的T细胞受体(Matsumoto等，如前所述；Jambou等，2003，J.Clin.Invest.，112：254-74)。另外，在个体中，T细胞的激活可以通过施用细胞素或具有对细胞素特异结合亲和力的抗体进行抑制。例如，为减少Th1型免疫应答，可以给个体施用如白细胞介素(IL)-4、IL-10或IL-13的细胞素或对如IL-12或干扰素(IFN)-γ的细胞素特异的抗体。相似地，为抑制Th2型免疫应答，可以给个体施用如IL-12或IFN-γ的细胞素或对IL-4、IL-10、或IL-13特异的抗体。
另外，本发明的治疗方法包括给个体施用有效量的药物组合物(如NMO抗原性多肽，或核酸如反义寡核苷酸，或编码NMO抗原性多肽的核酸)。有效量是指能够偏离个体的NMO抗原性多肽介导的免疫应答由此调节个体的神经疾病的NMO抗原性多肽的量。如此处所用，“调节”神经疾病可以是指减少一种或多种症状的严重性，消除所有症状，或其间任何水平的症状。
“反义寡核苷酸”是一种可以特异性杂交到靶核酸上的寡核苷酸，并且通过反义寡核苷酸对靶核酸表达的调节通常称为“反义技术”。此处所用的关于反义技术的术语“杂交”是指靶核酸与反义寡核苷酸的互补区域的氢键键合，其可以为Watson-Crick、Hoogsteen、或反Hoogsteen氢键键合。“特异性杂交”用来指互补或精确匹对的充分程度，以致在反义寡核苷酸和靶核酸之间发生稳定和特异的键合。在本领域内知道反义寡核苷酸的序列不必与其特异性杂交的靶核酸序列100％地互补。
所述反义寡核苷酸与其靶核酸的特异性杂交可以干扰靶核酸的正常功能。对于靶DNA核酸，反义技术可能干扰复制和转录。对于靶RNA核酸，反义技术可能干扰如所述RNA到蛋白翻译位点的转运，剪切RNA以产生一种或多种mRNA，RNA的催化活性，和RNA的蛋白翻译。在编码NMO抗原性多肽的核酸的情况下，所述对靶核酸功能的干扰的全面作用是对与NMO相关的疾病症状的调节。在本发明的上下文中，反义技术可以用于减少编码NMO抗原性多肽的基因的表达(如，由于对转录的抑制)和/或减少NMO抗原性多肽的细胞水平(如，由于对翻译的抑制)。
反义寡核苷酸的优选的靶位点已经包含环绕所述靶基因的可译框(ORF)的翻译起始或终止密码子的区域。另外，在反义技术中，所述可译框已经被有效地靶向，5′和3′不翻译区也一样。并且，反义寡核苷酸已经被成功地导向内含子区域和内含子-外显子连接区域。此外，可以应用多条反义寡核苷酸，其每一条特异地杂交到靶基因的不同区域。
本发明方法中应用的反义寡核苷酸(如siRNA)长度通常从约10到约50个核苷(如长度为12到40，14到30，或15到25个核苷)，但是只要所述反义寡核苷酸能够调节与NMO相关的症状，其也可以长些或者短些。如此处所用，反义寡核苷酸包括由天然发生的核苷碱基、糖和共价核苷间(骨架)联接组成的寡核苷酸，以及包含修饰的骨架(如取代糖部分)或非天然的核苷间联接的寡核苷酸。反义寡核苷酸还包括如肽核酸(PNAs)的寡核苷酸类似物或嵌合寡核苷酸。并且，本发明的反义寡核苷酸可以通过化学联接到一个或多个提高所述寡核苷酸的活性、细胞分配或细胞吸收的糖部分或共轭物上进行修饰。参见，例如，美国专利Nos.5,218,105和5,214,136。
可以评估反义寡核苷酸对NMO抗原性多肽的表达和/或生产的抑制能力，例如，通过测量治疗前和治疗后个体中mRNA或蛋白的水平。测量组织中或生物样品中mRNA或蛋白水平的方法在本领域内广为人知。
通过给个体施用一种适当的表达编码NMO抗原性多肽的核酸的载体，NMO抗原性多肽还可以在体内运送。运送编码生物有用蛋白(如NMO抗原性多肽)的核酸到个体的载体在本领域内已知。目前基于病毒的核酸运送载体典型地源于动物病毒，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、和牛乳头瘤病毒。用于核酸运送的载体通常被进行遗传修饰以便改变或移除所述病毒的天然向性和病原性。还可以对病毒的基因组进行修饰，以增加它的传染性和适应核酸的包装，例如编码生物有用蛋白的核酸的包装。另外，非病毒载体和应用所述载体进行核酸运送的方法为本领域的技术人员所知。
如此处所用，“施用”意指将本发明的组合物(如，NMO抗原性多肽，特异性杂交到编码NMO抗原性多肽的核酸的一部分上的反义寡核苷酸，或编码NMO抗原性多肽的核酸)运送到患者的方法。所述方法广为本领域技术人员所知，其包括，但不限于，口服、鼻内、静脉内、肌肉、腹膜内、皮下、鞘内、皮内、或局部施用。施用的途径可能取决于各种因素，如治疗目的。本发明的组合物可以连续或间歇地施用。配制和随后施用治疗组合物的方法广为本领域的技术人员所知。参见，例如，Remington，2000，The Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.，Gennaro和Gennaro，eds.，Lippincott，Williams和Wilkins。施用的剂量将取决与许多因素，包括施用和配制的模式。典型地，单剂量的数量是有效减少个体中NMO抗原性多肽或NMO-特异性自体抗体水平而没有恶化疾病症状的数量。
另外，本发明范围内的NMO抗原性多肽可以包含用于体内施用给个体的药用载体，其包括，但不限于，无菌水或非水溶液、悬浮液、和乳剂。非水溶剂的实例包括，但不限于，丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有机酯。水相载体包括水、醇、盐、和缓冲的溶液。药用载体还可以包括生理学可用水载体(如，生理盐水或人造脑脊髓液)或其它已知的适合于具体施用途径的载体。其它的化合物可以与NMO抗原性多肽包含在一起，如类固醇、黏液溶解剂、消炎剂、免疫抑制剂、扩张剂、血管收缩药、或其组合。防腐剂、调味剂、和其它添加剂，如，例如，抗细菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等也可以加入其中。
运送组合物到大脑的方法在本领域内已知。例如，可以通过附着一个识别脑特异性或神经特异性受体的配基(如抗体或抗体片段)对本发明的组合物进行修饰。另外，提高分子转运通过血-脑屏障的方法已知，并且其利用被动扩散(如，应用电磁场、氧化一氮供体或癸酸钠)或受体介导的细胞内吞作用(如将病毒颗粒附着到，例如，抗铁传递蛋白抗体或腐胺上)。携带编码NMO抗原性多肽的核酸的病毒载体的表达还可以通过脑特异性或神经特异性启动子和/或转录调节元件(参见，例如，美国专利Nos.5,976,872或6,066,726)。一种用于编码NMO抗原性多肽的核酸的星形胶质细胞成足过程特异表达的特别有用的启动子是细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)，其为星形胶质细胞分化的标记。
本发明还提供的是在患者中表达NMO抗原性多肽的细胞成像的方法。所述方法包括给患者施用有效量的对NMO抗原性多肽具有特异性结合亲合力的抗NMO抗原抗体，以结合到释放自细胞或细胞中可及的NMO抗原性多肽上，其中NMO抗原性多肽用成像剂标记，例如，32P、99Tc、111In或131I，并且检测形成的任何复合体。如广为本领域的普通技术人员所知，合适量的抗NMO抗原抗体是有效使细胞成像的任意量，例如，约0.1mCi到约50.0mCi。另外，所述抗NMO抗原抗体的有效量可以是约0.01mg到约100mg。合适的施用成像剂的方法如上所述，并且可以按上述被靶向(如到大脑)。成像的方法取决于所应用的试剂，并且广为本领域的技术人员所知。
本发明还提供的是一种计数或分离个体中NMO抗原性多肽-特异的T淋巴细胞的方法。所述方法可以用于，例如，监控个体的免疫应答或用于使用NMO抗原性多肽特异的细胞毒T细胞的免疫治疗。所述方法包括将包含淋巴细胞的生物样品与可溶性四聚体I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)相接触，所述要组织相容性复合体(MHC)具有同样的NMO抗原性多肽片段。如抗生物素蛋白和生物素的连接分子用于生产NMO抗原性多肽-MHC四聚体复合物，其随后可以用指示分子标记，以便将那些识别NMO抗原性多肽-MHC四聚体复合物的T细胞进行计数或分离出来(如，应用FACS分析)。参见，例如，Schwartz，1998，New England J Med.，339：1076-8，及其参考文献。
核酸和构建体
此处公开的实验证据表明NMO抗原性多肽是水通道蛋白-4。术语“水通道蛋白-4”指水通道蛋白家族的一个成员。水通道蛋白家族具有10个已知成员。水通道蛋白-4在与中枢神经系统的毛细管接触的星型胶质细胞成足化过程膜上表达，还在肾末梢收集小管和胃上皮细胞的基底外侧膜上表达。编码人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列的实例在GenBank入藏登记号U63622和U63623中显示。典型的人水通道蛋白-4多肽的预测的氨基酸序列在GenBank入藏登记号Nos.AAG17964，AAB26957，AAB26958，和I39178中显示。其它生物体(如Mus musculus，Bos Taurus，Rattusnorvegicus，和Ovis aries)编码水通道蛋白-4的核酸和氨基酸序列可以通过使用“水通道蛋白-4”为搜索词搜索GenBank数据库(在环球网上网址为ncbi.nlm.nih.gov)找到。
如此处所用，核酸是指RNA或DNA。关于核酸，此处所用的“分离的(isolated)”是指(i)编码部分或全部的人水通道蛋白-4的核酸序列，但是没有通常位于人类基因组中编码水通道蛋白-4的核酸序列一侧或两侧的编码序列；或(ii)整合到载体中或生物体基因组DNA中的核酸，其使得获得的分子与任何天然发生的载体或基因组DNA没有同一性。
另一方面，本发明包括人水通道蛋白-4核酸和多肽的片段。如此处所用，片段是指与相应于小于全部的水通道蛋白-4序列的核酸或多肽。核酸片段可以包括那些长度约100个核苷酸的片段，和GenBank入藏登记号为U63622或U63623的长度为几百个核苷酸的片段；或GenBank入藏登记号为U63622或U63623的长度为约10-50个核苷酸的片段。本发明提供的片段包括，例如，GenBank入藏登记号为U63622或U63623的核苷酸166-266，283-306，404-1104，575-925，648-698，712-747，和891-906。所述片段可以，例如，编码水通道蛋白-4抗原性多肽片段，或具有作为杂交探针和扩增引物的用途。
图2显示人水通道蛋白-4核酸序列中的各种限制性内切酶酶切位点的相对位置，其通过实例的方式定义位点，所述位点通过各种连接可以用于产生有用的核酸片段。给出人水通道蛋白-4多肽的核苷酸序列，基本上任意核酸片段可以通过已知方法产生(如，限制性内切酶消化，聚合酶链式反应)并且，如果需要，可以表达以产生对应的多肽片段。可选地，人水通道蛋白-4多肽可以被剪切(如蛋白水解酶水解地)以直接产生多肽片段。
人水通道蛋白-4核酸或核酸片段可以具有GenBank入藏登记号为U63622或U63623显示的序列衍生来的序列。例如，一种核酸序列具有与GenBank入藏登记号为U63622或U63623显示的核苷酸序列至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核酸序列具有与GenBank入藏登记号为U63622或U63623显示的核苷酸序列至少85％的序列同一性，90％的序列同一性，95％的序列同一性，或至少99％的序列同一性。参见，例如，GenBank入藏登记号BC022286，NM004028，和NM-001650的水通道蛋白-4不同核酸序列。
序列同一性百分数通过下述方法计算：确定比对核酸或多肽序列中匹配的位点数目，用匹配的位点数目分别除以比对的核苷酸或氨基酸总数，然后乘以100。匹配的位点是指相同的核苷酸或氨基酸发生在比对序列中的相同位点的位点。比对核苷酸或氨基酸的总数是指与第二序列比对必需的水通道蛋白-4核苷酸或氨基酸的最小数目，并且其不包括与如那些融合到水通道蛋白-4上的非水通道蛋白-4序列的比对(如强迫的比对)。比对核苷酸或氨基酸的总数可以对应全部水通道蛋白-4序列或可以对应此处定义的水通道蛋白-4序列全长的片段。
序列可以应用Altschul等(1997，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)所述的并入到BLAST(基本的局部比对搜索工具)程序的运算法则进行比对，其中BLAST程序在环球网上可用，网址为ncbi.nlm.nih.gov。BLAST搜索或比对可以通过应用Altschul等的运算法则进行，以确定水通道蛋白-4核酸分子和任意其它序列或其部分序列之间的序列同一性百分比。BLASTN是用于比对和比较核酸序列之间的同一性的程序，而BLASTP是用于比对和比较氨基酸序列之间的同一性的程序。当应用BLAST程序来计算水通道蛋白-4与其它序列之间的同一性百分数时，应用每一程序的缺省参数。
编码人水通道蛋白-4多肽的核酸可以获得于，例如，从人细胞系制备的cDNA文库，或通过其它方法获得，包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR)。PCR是指一种扩增靶核酸的程序或技术。PCR可以用于从DNA和RNA扩增特异的序列，包括来自全基因组的DNA或全细胞的RNA。各种PCR方法例如在PCR Primer：ALaboratory Manual，Dieffenbach和Dveksler，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.中有描述。一般地，应用目的区域的两端或之外的序列信息来设计寡核苷酸引物，其在序列上与要扩增模板的对应链相同或相似。
人水通道蛋白-4核酸可以通过如各种杂交技术进行检测。核酸分子间的杂交在Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约；7.37-7.57，9.47-9.57，11.7-11.8，和11.45-11.57节)中有详细讨论。
对于少于约100个核苷酸的寡核苷酸探针，Sambrook等在11.45-11.46节公开适宜的Southern印迹条件。在长度少于100个核苷酸的序列和第二序列之间的Tm可以应用Sambrook等在11.46节提供的公式计算。Sambrook等还讨论了应用多于约100个核苷酸的寡核苷酸探针的Southern印迹的预杂交和杂交条件(参见9.47-9.52节)。使用多于100个核苷酸的寡核苷酸的杂交通常在低于Tm15-25℃的温度进行。在长度长于100个核苷酸的序列和第二序列之间的Tm可以应用Sambrook等在9.50-9.51节提供的公式计算。另外，Sambrook等推荐应用9.54节指示的条件来洗涤已用长于约100个核苷酸的寡核苷酸探测了的Southern印迹。
预杂交和杂交含有核酸的膜的条件，以及洗涤含有核酸的膜以去除剩余的和非特异性结合的探针的条件，在杂交的严谨性中起着重要作用。所述杂交可以在合适的中等的或高度严谨的条件下进行。例如，所述条件在Sambrook等的11.45-11.46节中描述。例如，洗涤条件可以通过减少洗涤溶液的盐浓度和/或提高洗涤进行的温度而更加严谨。另外，对杂交数量的解释可能受到下列因素的影响，例如，标记的寡核苷酸探针的特异活性、在探针杂交的模板核酸上探针结合位点的数目、和放射自显影或其它检测介质的曝光量。
本领域的普通技术人员应该认识到，尽管任意数目的杂交和洗涤条件可以用于检查探针核酸分子与固定的靶核酸的杂交，更重要的是检查在同样的杂交、洗涤、和曝光条件下探针与靶核酸的杂交。优选地，所述靶核酸位于同一张膜上。
如果与第一个靶核酸的杂交比与第二个靶核酸的杂交至少强5倍(如，至少6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍，或100倍)，就认为核酸分子杂交到第一个靶核酸上，而不杂交到第二个靶核酸上。杂交的数量可以直接在膜上或从放射自显影上进行定量，通过应用如感光成像仪(PhosphorImager)或显像密度计(Densitometer)(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加州)进行。
本发明还包括这样的载体，其包含人水通道蛋白-4核酸(参见，例如，GenBank入藏登记号U63622和U63623)或其补体，水通道蛋白-4核酸片段或其补体，和那些与水通道蛋白-4核酸或其产生的片段(或其补体)具有至少80％序列同一性的核酸。
适于用于本发明的克隆载体可以商购，并被那些普通技术人员常规应用。本发明的载体还包括表达必需的元件，其有效地与人水通道蛋白-4核酸序列连接。“表达必需的元件”包括启动子序列，并且还可能包括如增强子序列的调控元件，调节人水通道蛋白-4核酸序列表达的响应元件或可诱导元件。如此处所用，“有效地连接”指在人水通道蛋白-4核酸序列相关的构建体中布置启动子和/或其它调控元件，通过这种方式来引导或调控水通道蛋白-4核酸的表达。所述构建体可以商购(如表达载体)和/或用本领域常规的重组DNA技术生产。表达系统的选择取决于几个因素，包括但不限于，复制效率、选择性、可诱导性、靶向性、必要的表达水平、回收容易度和宿主进行翻译后修饰的能力。
如此处所用，术语“宿主”或“宿主细胞”意指不但包括如大肠杆菌(E.coli)的原核生物，还包括如酵母、昆虫、植物和动物细胞的真核生物。动物细胞包括，例如，COS细胞和HeLa细胞。宿主细胞可以被转化或转染DNA分子(如载体)，通过应用本领域普通技术人员常规所知的任何技术，如磷酸钙或醋酸锂沉淀，电穿孔，脂质转染和粒子轰击。包含本发明载体的宿主细胞可以用于下述目的：如繁殖载体、生产人水通道蛋白-4核酸(如DNA、RNA、反义RNA)、或者表达人水通道蛋白-4多肽或其片段。
本法明的另一方面，提供生产水通道蛋白-4多肽的方法。生产水通道蛋白-4多肽的方法包括，但不限于，在允许水通道蛋白-4表达的条件下培养包含水通道蛋白-4表达载体的宿主细胞，和回收水通道蛋白-4多肽。培养细菌和回收表达的多肽的方法广为本领域的普通技术人员所知。
另外，本发明的核酸可以通过如Southern或Northern印迹(即杂交)、PCR、或原位杂交分析进行检测。水通道蛋白-4蛋白典型地通过转染细胞系中的免疫细胞化学检测，或通过十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，紧接着进行考马斯兰染色或应用具有对人水通道蛋白-4多肽特异结合亲合力的抗体(单克隆或多克隆)的Western印迹分析，进行检测。
本发明还在下述实例中描述，其没有限制权利要求所述的本发明的范围。
实施例
实施例1-血浆预吸收
为将非特异性染色减到最少，每一个患者的血浆用肝抗原进行预吸收，通过将40mg商业豚鼠组织粉(Sigma Chemical Co.，St.Louis，密苏里州)与10μL稀释在590μL的含有1％牛血清蛋白的磷酸缓冲盐(PBS)中的血清混合以实现。室温下温和地混合1小时后，不溶的残渣通过离心(20,800xg，10分钟)去除。然后立即加入新鲜的肝粉(40mg)到血清的上层清液中，并且重复本步骤2次，一共3次连贯的吸收。
实施例2-底物制备
将3种常规哺乳动物组织(如鼠脑(小脑和中脑)、胃和肾)的冷冻复合块在8孔显微镜载玻片的单孔上进行冷冻切片(4μ厚度)。这些载玻片作为常规产品购买(购于MeDiCa，Encinitas，加州)，并在含有干燥剂的密封袋中保存于-70℃。在打开使用前，在室温下平衡每一个密封袋。将冷却的去垢剂(含1％CHAPS的PBS)涂在每一张切片上并在4分钟后吸走。在冷冻的PBS(每一次洗涤在摇床上持续5分钟)中洗涤3次后，涂上冷冻的10％磷酸缓冲的福尔马林，并在4分钟后吸走。3次在冷冻的PBS中多于5分钟的洗涤后，涂上含有10％的正常山羊血清的PBS(室温)，并在60分钟后吸走。
实施例3-免疫染色
将吸收的、稀释的患者和对照血清(40μL体积)分别涂到含有上述处理的组织切片的孔上。室温下40分钟后，每一个孔用冷却的PBS彻底地洗涤。然后在合适的稀释应用一种商业荧光染料-共轭的对人IgG特异的IgG(如，荧光标记的山羊抗人IgG，Southern Biotechnology Assoc.，Inc.，伯明翰，阿拉巴马州)。室温下35分钟后，用冷却的PBS彻底洗涤孔，并用玻璃条状盖板(#1厚度)在含有抗褪色剂的封固剂作用下将每一块载玻片盖好。通过荧光显微镜(20X目镜)评估与IgG结合的组织的典型的NMO模式。
在中枢神经系统(CNS)中，NMO抗原定位在小脑皮层、中脑和脊髓的毛细管的管腔壁上；在视神经中，NMO抗原与轴突柱间的毛细管区的软膜和星型胶质细胞进程相关。在CNS组织的最佳治疗切片中，免疫荧光共焦显微镜表明NMO抗原是血脑屏障的组成部分。在延伸到白质和灰质中微脉管的魏尔啸-罗宾隙(Virchow-Robin space)的星型胶质细胞-软膜连接处的神经胶质界膜中，免疫反应性是固有的。使用亲和纯化的具有确定特异性的抗体的双免疫染色显示出NMO抗原与水通道蛋白4共定位，其中水通道蛋白4是血脑屏障的一种汞不敏感的水通道蛋白组分。在脾或肝实质切片中检测不出NMO抗原，但是，同水通道蛋白4一样，它明显地与肾远曲收集小管的基底外侧膜和胃深黏膜上皮相关。
通过在竞争性抑制免疫荧光检测中应用限制稀释的NMO-IgG，演示了粗制膜级分(crude membrane fraction)的免疫反应性，其中粗制膜级分从通过差速离心移除组织碎片和核团后的匀浆的大鼠脑中制备。所述级分有效地终止NMO-IgG免疫荧光模式。胞质级分不吸收NMO-IgG的反应性。粗制膜级分的免疫反应性抵抗非离子去污剂CHAPS2％的溶液的萃取。这一观察结果导致了这样的发现：在磷酸缓冲的10％的福尔马林固定4分钟之前或之后，用1％CHAPS处理组织切片4分钟，保持了组织形态学并且在70％的临床诊断的NMO患者血清中增强了NMO表位对IgG的可接近性。
尽管不受任何具体理论的限制，NMO抗原对去污剂萃取的抵抗力是与水通道蛋白4的细胞质C末端到支架衔接蛋白α-肌养蛋白结合蛋白的PDZ区域的预定范围一致的，其中α-肌养蛋白结合蛋白是肌养蛋白复合体的组分(Neely等，PNAS98：14108，2001)。血脑屏障的肌养蛋白复合体的其它组分还可以是NMO自体抗体的相关靶点(Neely等，如前所述)。
实施例4-解释免疫组织化学染色结果
表1显示在每一种指示组织中评估的典型特征。
表1
 
小脑 软膜，白质和毛细管，颗粒层微脉管，和分子层微脉管
中脑 软膜，亚软膜，白质和微脉管
肾 远曲收集小管(与NMO-IgG结合最紧密)
胃 深黏膜的基上皮(与NMO-IgG结合最不紧密)
每一特征的染色强度在正式的记分表中(图1)用下述记分体系进行分级：
阴性：-或±/-
弱阳性，可能是不确定的(equivocal)：±
确定的阳性，强：±/+，+或2+
阳性结果要求最少赋值一个‘±’给肾的远曲收集小管和小脑或中脑软膜或微脉管。
记录任何核、细胞质、膜的或细胞外基质染色的存在和强度，其中所述染色可能潜在地干扰NMO-IgG解释。特别是，对每一个检查的组织切片，记录表2所示的任何组织的染色。
表2
 
小脑/中脑 神经元，髓磷脂，微动脉平滑肌
胃 黏膜上皮，肠神经元，和平滑肌
肾 皮层和中间区小管，神经纤维球，微动脉，交感神经，其它
实施例5-临床应用
对来自于分类为“确定的(definite)”NMO，MS的亚洲视神经形式，或通过临床、成像和脊髓液标准的诊断的典型MS的患者，和对照患者的血清进行自体抗体分析，其中自体抗体可以选择性地与CNS组织结合。此处所述式样表明血清阳性分析结果对于区分NMO和多发性硬化病(MS)的典型形式的价值。血清(在测试中编号)来自于用严谨度的各种等级诊断标准确定的NMO患者(n＝45)，典型的MS患者(n＝19)，认为高风险患MNO的患者(纵向延伸的脊髓炎的双边视神经炎或单边或复发性发作；与阴性脑相关的核磁共振成像(MRI)，即，没有达到“确定的”NMO分类的严谨标准)(n＝35)，和最终诊断为MS而最初表现为视神经炎或脊髓炎的患者(n＝22)。用鼠脑、胃和肾的标准组合底物进行间接的免疫荧光；血清用如上述实施例1所述的肝提取物进行预吸收。
在45名NMO患者中，33名患者(73％)的IgG产生与众不同的染色模式(＂NMO-IgG＂)，其与贯穿小脑皮层和中脑的微脉管相关，与软膜和软膜下“筛孔”(在中脑中显著)相关。在肠黏膜、肾、或肝中看不到所述微血管模式，并且在任何对照疾病组中没有记录到NMO-IgG。来自35名具有得NMO高风险的患者中的16名患者(46％)的血清产生与众不同的NMO-IgG染色模式。诊断为典型的MS的19名患者没有人具有可检测到的NMO-IgG染色模式，但是表现出视神经炎/脊髓炎的22名患者中有2名(9％)具有所述NMO-IgG。
另外，在递交到Mayo Clinic′s Neuroimmunology Laboratory进行基于服务性的不知情副肿瘤性自体抗体测试的85,000名患者的血清中，偶然地从14名患者中鉴定出了NMO-IgG。他们的后续病史记录表明3人达到了NMO诊断的临床标准，9人分类为高风险性得NMO(7人具有纵向延伸脊髓炎和2人具有复发性视神经炎)，1人具有新脊髓病发作，和1人具有未分类的类固醇-应答的CNS炎症疾病。
所述结果表明NMO-IgG自体抗体是NMO的第一特异的生物标记，并能够区分NMO和MS。
实施例6-Western印迹
一种包含重组大鼠水通道蛋白4(C末端残基249-323；Alamone Labs，Jerusalem，以色列)的GST融合蛋白在10％的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳缓冲液是含有巯基乙醇的标准Laemmli SDS缓冲液，并且使用NMO患者的和作为阳性对照的免疫兔的血清进行Western印迹，以确定患者的IgG是否将与38kDa的GST-水通道蛋白4融合蛋白结合。所述印迹与人血清接触(1：50稀释)，其中包括4名NMO患者，3名正常人，1名对照脊髓病患者，2名典型的MS患者，和3名具有混合的神经精神病的患者。来自4名NMO患者的血清和免疫兔的血清结合到8kDa的水通道蛋白4融合蛋白，然而来自对照患者或表现出其它疾病的患者的血清中没有一例与之结合。
其它实施方案
应该明白尽管本发明与其详细表述结合进行描述，在前描述是用来例证但不限制本发明的范围，其由附加权利要求的范围所确定。其它方面、优点、和修饰在下述权利要求的范围中。
Figure I2004800408513I20048004085131

Claims (13)

1.一种检测来自个体的生物样品中视神经脊髓炎-特异性自体抗体的存在或不存在的方法，其包括步骤：
将所述生物样品与视神经脊髓炎抗原性多肽或其片段接触，其中所述视神经脊髓炎抗原性多肽是水通道蛋白4，所述片段是水通道蛋白4抗原性多肽片段；和
检测所述视神经脊髓炎抗原性多肽与所述生物样品中的所述视神经脊髓炎-特异性自体抗体结合的存在或不存在。
2.权利要求1的方法，其中所述视神经脊髓炎抗原性多肽是重组表达的视神经脊髓炎抗原性多肽。
3.权利要求1的方法，其中所述视神经脊髓炎-特异性多肽是在选自于由脑、脊髓、视神经、肾、或胃组成的组的固体组织中。
4.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自于由血液、血清、血浆、和脑脊髓液组成的组。
5.权利要求1的方法，其中所述水通道蛋白4多肽的序列选自以下组成的组：GenBank保藏号Nos.AAG17964，AAB26957，AAB26958，和I39178。
6.一种检测来自个体的生物样品中视神经脊髓炎抗原性多肽的存在或不存在的方法，其包括步骤：
将所述生物样品与抗视神经脊髓炎抗原抗体接触，其中所述视神经脊髓炎抗原是水通道蛋白4；和
检测所述抗视神经脊髓炎抗原抗体与所述生物样品的结合，其中结合是所述生物样品中存在所述视神经脊髓炎抗原性多肽的指示。
7.权利要求6的方法，其中所述个体部分或完全失明。
8.权利要求6的方法，其中所述生物样品选自于由血液、血清、血浆、脑脊髓液、脑组织活检和脊髓组织活检组成的组。
9.一种用于在个体中诊断视神经脊髓炎的试剂盒，其包括视神经脊髓炎抗原性多肽和应用所述视神经脊髓炎抗原性多肽以检测所述个体中抗视神经脊髓炎抗原自体抗体的用法说明，其中所述视神经脊髓炎抗原性多肽是水通道蛋白4。
10.权利要求9的试剂盒，进一步包括对视神经脊髓炎抗原性多肽具有特异性结合亲和力的单克隆抗体。
11.视神经脊髓炎抗原性多肽在制备用于治疗患有视神经脊髓炎的个体的药物中的应用，其中
所述视神经脊髓炎抗原性多肽用于给所述个体施用，其中所述视神经脊髓炎抗原性多肽是水通道蛋白4。
12.权利要求11的应用，其中所述施用是通过选自于由下列方法组成的组的方法：口服、静脉注射、和经肠胃外。
13.编码视神经脊髓炎抗原性多肽的核酸在制备用于治疗患有视神经脊髓炎的个体的药物中的应用，其中
所述编码视神经脊髓炎抗原性多肽的核酸用于给所述个体施用，其中所述视神经脊髓炎抗原性多肽是水通道蛋白4。
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