CN112194719A

CN112194719A - Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用

Info

Publication number: CN112194719A
Application number: CN202010905644.0A
Authority: CN
Inventors: 卢昕; 杨衡; 张朴丽; 申雅文; 陈贺; 段利华; 彭清林
Original assignee: Suzhou Institute Of Systems Medicine; China Japan Friendship Hospital
Current assignee: Suzhou Institute Of Systems Medicine; China Japan Friendship Hospital
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明公开了CRT抗原和MAGE‑A1抗原的制备及其应用。本发明公开了的CRT抗原和MAGE‑A1抗原的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示，它们可以用于检测特发性炎性肌病(IIM)患者血清中的抗CRT抗体和抗MAGE‑A1抗体。结合临床试验结果表明：纵向监测血清抗CRT抗体滴度有助于评估IIM患者是否合并恶性肿瘤及预后，能够更好地对患IIM合并恶性肿瘤的患者进行早期诊断、辅助分型及评估脏器受累，抗MAGE‑A1抗体可能在预测IIM合并间质性肺疾病(ILD)及预后中发挥作用。本发明填补了IIM病人合并恶性肿瘤、间质性肺疾病的患者可检测抗体稀少的空白，并具有高度特异性和广阔的应用前景。

Description

CRT抗原和MAGE-A1抗原的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，主要涉及CRT抗原和MAGE-A1抗原的制备及其应用。

背景技术

特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，IIM)，统称为肌炎，是一组以慢性骨骼肌炎症和肌无力为主要表现的异质性非常强的系统性自身免疫性疾病，可累及皮肤粘膜、关节、消化道、肺脏、心脏等其他器官。目前成人IIM临床亚型主要分为多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)、无肌病性皮肌炎(amyopathicdermatomyositis，ADM)、包涵体肌炎(inclusion body myositis，IBM)、免疫介导坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)等。

近些年针对IIM的血清学研究取得了重大进展，许多新型自身抗体被识别和鉴定出来。传统上把这些自身抗体分为肌炎特异性自身抗体(myositis-specificautoantibodies，MSAs)和肌炎相关性自身抗体(myositis-associated autoantibodies，MAAs)，MSAs常为肌炎所特有，而MAAs亦可见于其他结缔组织病(connective tissuediseases，CTD)中。MSAs/MAAs对于支持肌炎诊断、区分临床亚型、提示脏器受累、评估治疗反应、预测疾病进展和判断预后方面具有极为重要的价值。某些MSAs与肌肉外表现具有密切关联，例如，新发病的抗转录中介因子1-γ(transcriptional intermediary factor 1-γ，TIF-1γ)抗体阳性的成人DM患者罹患恶性肿瘤的风险明显升高；而携带抗黑色素瘤分化相关基因-5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)抗体的ADM患者更有可能合并快速进展型间质性肺疾病。然而，目前已知的MSAs和MAAs只能分别在大约50％和20％的IIM患者中检测得到，这表明MSAs/MAAs检测阴性的患者可能具有未被识别的潜在自身抗体。因此，通过制备特异性抗原并用于检测新型肌炎自身抗体，探索其在疾病诊断分型、预后、脏器受累等的作用显得意义重大。

恶性肿瘤是肌炎患者常见且严重的并发症之一。既往国内外的研究显示IIM合并恶性肿瘤的发生率为6.7～32％，尤其是新近发病的成人皮肌炎(DM)患者，发生肿瘤的风险显著升高。恶性肿瘤严重影响了肌炎患者的预后及生存率，对肿瘤早期发现和干预是改善IIM患者预后的关键。

目前临床筛查肿瘤的手段主要包括血清肿瘤标记物检测和影像学检查。其中，血清肿瘤标记物检测的敏感度和特异度较差；B超、X线、CT、MRI等影像学检查只能发现已有一定体积的肿瘤，无法早期预测和诊断肿瘤；PET-CT的费用昂贵且受医疗场所的限制，不适合作为常规筛查肿瘤的手段。因此，临床上至今尚无简便、实用、敏感而又特异的指标能够早期诊断和预测肿瘤的发生。文献报道肌炎患者携带某些特定的MSAs，如抗TIF-1γ、抗核基质蛋白2(Nuclear matrix protein-2,NXP2)抗体，发生恶性肿瘤的风险高于一般人群。临床检测MSAs对判断新入院的肌炎患者肿瘤发生风险具有一定帮助。然而，许多研究报道MSAs检测阴性的肌炎患者也会发生恶性肿瘤。

间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是IIM最常见的并发症之一，其发生率在20％至80％之间(如先前报道，亚洲人群中ILD的发生率高于白种人)，并且是影响预后的重要因素之一。目前ILD的诊断主要依靠高分辨计算机断层扫描(high-resolutioncomputed tomography，HRCT)，实验室检查指标匮乏。现有文献表明，抗氨基酰tRNA合成酶(ARS)自身抗体是IIM患者发生ILD的最高危险因素之一，目前尚无其他血清学标志物预测肌炎病人肺部受累的可靠特异性的指标。

因此，寻找现今未被识别的、有助于疾病分型和判断进展、能早期预测和诊断肿瘤发生的血清学标志物，仍然是一个急待解决的临床问题。

钙网蛋白(calreticulin，CRT)是一种高度保守的多功能的钙结合伴侣蛋白，主要定位于内质网中。研究发现在许多类型的癌症患者的血清和肿瘤组织中CRT表达水平异常上调，而且在食管癌、胃癌、乳腺导管癌、肺癌患者中，CRT的过度表达与肿瘤浸润转移和不良预后相关，提示CRT作为一种肿瘤相关性抗原，在肿瘤发生、转移和侵袭中扮演者重要角色。此外，在多种实体瘤，包括肝癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌患者的血清中检测到以CRT为靶抗原的自身抗体(抗CRT抗体)存在。有趣的是，在包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome,pSS)和炎症性肠病等系统性自身免疫疾病患者的血清中也可以检测到抗CRT抗体。这些结果表明抗CRT抗体可能在抗肿瘤免疫应答和自身免疫应答中发挥着潜在作用。然而，据目前所知，抗CRT抗体及其作用在IIM中尚不清楚。

黑色素瘤相关抗原A1(melanoma-associated antigen A1,MAGE-A1)是一种癌症-睾丸抗原，存在于成年男性生殖细胞和胚胎细胞中，在肿瘤的检测和免疫治疗上具有重要作用。MAGE-A1基因属于MAGE家族，该家族可以分为两类：I类和II类，前者位于X染色体上，是肿瘤相关抗原的重要组成部分，包括MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C，其中MAGE-A1基因仅在基因组不稳定、容易发生去甲基化的组织如正常的睾丸组织和各种肿瘤组织中表达，并且该基因被认为与肿瘤的进展和不良的预后密切相关。研究结果表明，遗传易患自身免疫的个体中的肿瘤和/或肿瘤衍生因子可能引发肌病，对肌炎抗原的免疫反应可能与患者的初始或亚临床抗肿瘤有关反应。MAGE-A1在自身免疫疾病如幼年类风湿关节炎的滑膜组织中过表达，并且与疾病的严重程度相关，这些提示了MAGE-A1可能参与了自身免疫性疾病的发病过程。迄今为止，还没有研究来阐明抗MAGE-A1自身抗体与IIM之间的关系。

发明内容

发明要解决的问题

为了解决目前本领域中肌炎合并恶性肿瘤、间质性肺疾病(ILD)受累病人的筛查、预测手段繁琐复杂，缺乏敏感特异性血清学标志物等不足，克服现有技术中没有能够预测及高效诊断特发性炎性肌病分型及是否伴发恶性肿瘤的筛查手段的缺陷。本发明旨在提供一种相对敏感及高特异性的能够用于诊断特发性炎性肌病(IIM)合并恶性肿瘤、间质性肺疾病(ILD)的抗原抗体检测谱，并将其制成一种诊断试剂盒应用于临床诊断中。目前肌炎合并肿瘤或器官受累情况的评估，利用肌炎自身抗体检测水平还很受限，本发明旨在通过建立特异性抗原抗体检测方法，更有效的检测出肌炎合并肿瘤的病人，为临床诊断分型、预后等提供早期指导。

用于解决问题的方案

本发明人通过购买CRT抗原和制备MAGE-A1抗原，并检测肌炎病人血清中对应的抗体(即抗CRT抗体和抗MAGE-A1抗体)，同时基于上述抗原提供了一种检测试剂盒，从很大程度上提高及改进肌炎病人合并恶性肿瘤和间质性肺疾病检出率，有助于疾病分型和评估，从而完成了本发明。

具体来说，本发明人通过研究发现肌炎合并恶性肿瘤患者的抗CRT抗体阳性率显著高于不合并恶性肿瘤的患者，提示抗CRT抗体可以作为肌炎合并恶性肿瘤的新型血清学标记物。经过多年研究发现在肌炎患者体内可检测到抗CRT抗体，尤其多见于合并恶性肿瘤患者，因此，通过检测肌炎患者体内抗CRT抗体的存在能够对肌炎合并恶性肿瘤具有很好的诊断及预测价值；通过持续研究，进一步发现抗CRT抗体可能与发生实体瘤和恶性肿瘤处于复发状态有一定关联。通过对该抗CRT抗体的检测具有更高的阳性预测值，能够更好地对患肌炎合并恶性肿瘤的患者进行早期诊断和预测。

本发明人还调查了大量IIM患者的抗MAGE-A1自身抗体及其与IIM临床特征的关系。从而证明IIM中抗MAGE-A1自身抗体的检测是指导临床评估和治疗的有效生物标志物。

本发明主要涉及CRT、MAGE-A1这两种抗原的选用和制备，并用上述检测肌炎病人血清中对应的抗体(即抗CRT抗体和抗MAGE-A1抗体)。

本发明按照以下步骤设计实验：

i)选取研究对象(根据患者临床和实验室资料设计实验组、对照组)；

ii)根据相关标准对研究对象中肌炎组应用分类树对其临床亚型进行鉴定；

iii)IIM患者疾病活动度的评估；

iv)患者血清材料的采集及处理；

v)抗原制备；

vi)抗体检测体系建立；

vii)结果统计和分析；

并结合临床观察，从而完成了本发明。即本发明如下所述：

在本发明的第一方面，提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CRT抗原在制备疾病诊断和分型的试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)；更优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)合并恶性肿瘤。

在本发明的第二方面，提供了一种MAGE-A1抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。同时还提供了该MAGE-A1抗原在制备疾病诊断和分型的试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)；更优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)合并间质性肺疾病(ILD)。

在本发明的第三方面，提供了一种疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被有本发明第一方面所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CRT抗原的载体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG和阳性对照品；优选的，所述试剂盒中还包含包被缓冲液、封闭缓冲液、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、显色液和终止液；更优选的，所述阳性对照品为抗CRT抗体阳性的特发性炎性肌病(IIM)患者的血清。

在本发明的第四方面，提供了一种疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被有本发明第二方面所述MAGE-A1抗原的载体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG和阳性对照品；优选的，所述试剂盒中还包含包被缓冲液、封闭缓冲液、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、显色液和终止液；更优选的，所述阳性对照品为抗MAGE-A1抗体阳性的特发性炎性肌病(IIM)患者的血清。

在本发明的第五方面，提供了一种血清标志物在制备用于评估特发性炎性肌病(IIM)患者疾病分型及预后的试剂盒中的用途，其特征在于，所述血清标志物为IIM患者血清中的抗CRT抗原的抗体，所述CRT抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。在一些具体的实施方式中，所述特发性炎性肌病(IIM)患者合并恶性肿瘤。

在本发明的第六方面，提供了一种血清标志物在制备用于评估特发性炎性肌病(IIM)患者脏器受累及预后的试剂盒中的用途，其特征在于，所述血清标志物为IIM患者血清中的抗MAGE-A1抗原的抗体，所述MAGE-A1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。在一些具体的实施方式中，所述特发性炎性肌病(IIM)患者合并间质性肺疾病(ILD)。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1，利用CRT抗原对CRT抗体进行检测及其应用

通过实验研究，在成人IIM队列中，约17％的患者通过ELISA法检测对抗CRT抗体呈阳性，免疫沉淀条带分子量约为60kDa。临床表现上，该抗体阳性患者与阴性患者相比发生恶性肿瘤的比例更高(22.2％vs.11.9％，P＝0.013)，出现关节炎/关节疼痛的比例更低(17.3％vs.30.4％，P＝0.020)。抗CRT抗体阳性率因恶性肿瘤状态而变化，恶性肿瘤复发患者的抗体阳性率远高于恶性肿瘤处于缓解状态的患者。

在本研究中，通过横断面分析揭示了血清抗CRT抗体滴度与肌炎疾病活动度呈正相关。对16例抗CRT抗体阳性IIM患者(包括3例IIM-cancer患者，即IIM合并恶性肿瘤的患者)进行的纵向研究显示，随访期间抗CRT抗体滴度的变化与肌炎活动度视觉模拟评分(MYOACT)得分的变化显著正相关。研究结果提示血清抗CRT抗体滴度可以作为反映IIM患者疾病活动度的潜在标志物，纵向监测血清抗CRT抗体水平有助于评估IIM患者的病程和治疗反应，能够更好地对患IIM合并恶性肿瘤的患者进行早期诊断、辅助分型及评估脏器受累。

2，利用MAGE-A1抗原对MAGE-A1抗体进行检测及其应用

通过间接ELISA，测得在576名IIM患者和141名其他结缔组织病(CTD)患者中，抗MAGE-A1抗体在IIM患者以及其他CTD患者中的阳性率均显着高于健康志愿者(HC)(所有p均<0.05)。通过比较29名抗MAGE-A1抗体阳性患者和547名抗MAGE-A1抗体阴性患者的临床特点，两组患者在间质性肺疾病(ILD)的合并率上有显著的统计学差异，抗MAGE-A1抗体阳性患者的ILD发生率明显高于抗MAGE-A1抗体阴性的患者(82.8％vs 55.0％,p＝0.003)。在实验室检查结果中，抗MAGE-A1抗体的患者更易合并有抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)阳性(51.7％vs 28.9％,p＝0.009)。

综上所述，抗MAGE-A1抗体与ILD密切相关，且可能与更轻的ILD相关，此外，抗MAGE-A1自身抗体的滴度与疾病活动正相关，治疗后血清抗MAGE-A1抗体的滴度水平随着疾病的缓解而降低。上述结果表明，抗MAGE-A1抗体可能在IIM-ILD的发病机制中发挥一定的作用。提示该抗体在作为肌炎病人合并肺部受累分型方面有着重要的预测价值。

综上所述，本发明与现有技术相比，填补了IIM合并恶性肿瘤、间质性肺疾病的患者可检测抗体稀少的空白，并具有高度的特异性和广阔的应用前景等优点。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1示出了EULAR/ACR关于IIM亚型分类树示意图。其中，PM代表多发性肌炎、IMNM代表免疫介导坏死性肌病、IBM代表包涵体肌炎、ADM代表无肌病皮肌炎、DM代表皮肌炎、JDM代表幼年型皮肌炎；*代表手指屈肌无力且治疗后无改善；**代表镶边空泡；***代表依据专家意见。

图2示出了ELISA法检测四组患者血清抗CRT抗体；其中IIM表示特发性炎性肌病患者组，SLE表示系统性红斑狼疮患者组，RA表示类风湿性关节炎患者组、pSS表示原发性干燥综合征患者组，solid tumors表示肿瘤对照组，HC表示健康对照组。

图3示出了ELISA法检测不同试验组血清抗CRT抗体；其中，泳道1为健康志愿者(HC)血清的阴性对照；泳道2-4为ELISA法判定为3个抗CRT抗体阳性的IIM患者血清；泳道5为使用商业化兔抗CRT多克隆抗体的阳性对照。

图4示出了肌炎患者抗CRT抗体与恶性肿瘤的关联；其中，IIM表示特发性炎性肌病患者组，IIM without cancer表示IIM未合并恶性肿瘤患者组，IIM-cancer表示IIM合并恶性肿瘤患者组。

图5示出了抗CRT抗体阳性率与肿瘤状态的关系；其中，New onset表示肿瘤新发患者亚组，Remission表示肿瘤缓解患者亚组，Recurrent表示肿瘤复发患者亚组。。

图6示出了血清抗CRT抗体滴度(Serum anti-CRT Ab levels)与MYOACT得分之间的关系。

图7示出了血清抗CRT抗体滴度(Serum anti-CRT Ab levels)与PGA得分之间的关系。

图8示出了随访分析16例IIM患者抗CRT抗体滴度的变化与MYOACT评分关系。

图9示出了抗MAGE-A1抗体在IIM患者(IIMs)、其他CTD患者以及健康对照组(HCs)中的阳性率；其中，SLE表示系统性红斑狼疮患者，RA表示类风湿性关节炎患者，pSS表示原发性干燥综合征患者，SSc表示系统性硬化症患者，DM表示皮肌炎患者，ADM表示无症状皮肌炎患者，PM或IMNM示多发性肌炎或免疫介导的坏死性肌病患者。

图10示出了抗MAGE-A1阳性患者各自的血清抗MAGE-A1滴度水平和PGA VAS的纵向随访情况。

具体实施方式

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

本发明实施例中所使用的试验材料、试验试剂和仪器均可市购获得。

实施例1利用CRT抗原对CRT抗体进行检测

1.1选取研究对象并设计分组：选取2012年1月至2017年12月就诊于中日友好医院风湿免疫科的482例成人IIM患者(肌炎起病时年龄＞18岁)作为初始研究对象。对这些患者进行筛选，最终469例符合2017年IIM分类标准的患者被纳入后续研究。

根据患者临床和实验室资料设计以下试验组和対照组：

“特发性炎性肌病(IIM)试验组”：469例成人IIM患者分为298例皮肌炎患者(即DM)，53例无症状皮肌炎患者(即ADM)和118例多发性肌炎或免疫介导的坏死性肌病患者(即PM或IMNM)。

其中，对初次入院的IIM患者常规筛查恶性肿瘤，手段通常包括体格检查，计算机断层扫描(CT)，乳房钼靶检查，内窥镜检查，或必要时正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET-CT)检查。患者出院后通过门诊随访，再次住院和(或)电话随访监测是否发生恶性肿瘤。“随访观察期”定义为肌炎诊断与最后一次随访之间的间隔，本研究中位观察时间为22个月(IQR4-37)。截止至2019年6月，本队列中有64例患者确诊了癌症(IIM-cancer患者)。根据恶性肿瘤所处状态不同，把64例IIM-cancer患者进一步分为3组：肿瘤新发(new-onsetcancers,n＝34)，缓解(cancers in remission,n＝22)，和复发(recurrent cancers,n＝8)。

“其他结缔组织病对照组”：纳入72例系统性红斑狼疮患者SLE，70例类风湿性关节炎患者RA，54例原发性干燥综合征患者pSS。SLE诊断满足1997年ACR分类标准，RA诊断满足2010年EULAR/ACR分类标准，pSS诊断满足2002年美国欧洲协作组分类标准。

“健康对照组”(HC)：81例年龄、性别与IIM患者匹配的健康志愿者(HC)被纳入为健康对照组。

“肿瘤对照组”(solid tumors)：28例未经治疗的恶性肿瘤患者来自我院胸外科和胃肠外科，癌症类型包括肺癌，食管癌和胃肠癌，肿瘤诊断符合相应临床标准。

1.2根据相关标准对研究对象中的IIM组应用分类树对其临床亚型进行鉴定

EULAR/ARC关于IIM亚型的分类树如图1所示。

1.3 IIM患者疾病活动度的评估：评估方法依据国际肌炎评估和临床研究协作组(International Myositis Assessment and Clinical Studies Group,IMACS)提出的肌炎疾病活动度评估视觉模拟量表(myositis disease activity assessment visualanalog scales,MYOACT)，评估内容包括肌肉外器官(一般情况、皮肤粘膜、骨骼关节、肺脏、心脏、胃肠道)，肌肉，及医师对疾病活动度的整体评估(physician global assessment ofdisease activity,PGA)。

1.4研究对象血清材料的采集及处理

获得上述4组研究对象的血清，新鲜采集的全血标本在含分离胶的采血管中室温凝集30分钟，2500rpm离心10分钟，收集上层血清，分装冻存于-80℃冰箱，避免反复冻融。

1.5 CRT抗原选择

根据基因名称CALRETICULIN，在NCBI数据库中的GENE下找到对应人源的该基因，下载该基因编码的蛋白序列(SEQ ID NO：1)，具体为：

MLLSVPLLLG LLGLAVAEPA VYFKEQFLDG DGWTSRWIES KHKSDFGKFV LSSGKFYGDEEKDKGLQTSQDARFYALSAS FEPFSNKGQT LVVQFTVKHE QNIDCGGGYV KLFPNSLDQT DMHGDSEYNIMFGPDICGPG TKKVHVIFNY KGKNVLINKD IRCKDDEFTH LYTLIVRPDN TYEVKIDNSQ VESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWD ERAKIDDPTD SKPEDWDKPE HIPDPDAKKP EDWDEEMDGE WEPPVIQNPEYKGEWKPRQI DNPDYKGTWI HPEIDNPEYS PDPSIYAYDN FGVLGLDLWQ VKSGTIFDNF LITNDEAYAEEFGNETWGVT KAAEKQMKDK QDEEQRLKEE EEDKKRKEEE EAEDKEDDED KDEDEEDEED KEEDEEEDVPGQAKDEL

根据上述氨基酸序列，购买人Calreticulin重组蛋白(TP303222)，OrigeneTechnologies，USA

1.6 CRT抗体检测体系建立

1.6.1抗体检测中使用的试验材料相关信息

(1)试验试剂与耗材

Super Signal Maximum Sensitivity Substrate(34096)，Thermo Scientific,USA

NP-40裂解液，Beyotime,China

BCA蛋白定量试剂盒，Thermo Scientific,USA

Protein A agarose,Roche Diagnostics,Germany

RPMI培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素/链霉素双抗，Gibco,USA

牛血清白蛋白、脱脂奶粉、四甲基乙二胺(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine TEMED)，过硫酸铵(ammonium persulfate,APS)，Sigma-Aldrich,Germany

3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB显色液)、ELISA终止液，Solabio,China

96孔酶标板，Thermo Scientific,USA

各种规格吸头、EP管，Axygen,USA

细胞培养瓶、冻存管、移液管、离心管，Coring,USA

PVDF膜，Millipore,USA

(2)抗体和蛋白

兔抗人Calreticulin多克隆抗体(13684),Abcam,UK

辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗人IgG抗体,Abcam,UK

HRP标记的山羊抗兔IgG抗体,Abcam,UK

人Calreticulin重组蛋白(TP303222),Origene Technologies,USA

(3)细胞系

人慢性髓系白血病细胞(K562细胞系)，PUMC Cell Center,China

(4)仪器、设备

移液器，Eppendorf,Germany

纯水仪,Pall,USA

高速冷冻离心机,Beckman Coulter,Germany

超低温冰箱,Sanyo,Japan

超低温冰箱,Haier,China

细胞培养箱，Thermo Scientific,USA

酶标仪，Bio-Rad Laboratories,USA

电泳仪，Bio-Rad Laboratories,USA

半干转仪，Bio-Rad Laboratories,USA

凝胶成像仪，Bio-Rad Laboratories,USA

光学显微镜及成像系统,Olympus,Japan

光学显微镜及成像系统,Zeiss,Germany

摇床，Kylin-Bell,China

漩涡震荡器，Kylin-Bell,China

掌上离心机，Scilogex,USA

恒温水浴锅，Rong-Feng Scientific Instrument,China

恒温鼓风干燥箱，Rong-Feng Scientific Instrument,China

1.6.2建立ELISA体系检测血清抗CRT抗体

(1)试剂准备和标准品制备

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，调节pH至7.2,纯水定容至1L；

包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液Na₂CO₃ 0.75g，NaHCO31.465g,纯水定容至500mL；

封闭缓冲液：含5％脱脂奶粉的PBS溶液；

稀释缓冲液：含1％胎牛血清蛋白的PBS溶液；

洗涤缓冲液：含0.05％Tween 20的PBS溶液。

标准品制备：取一份经免疫沉淀验证抗CRT抗体阳性的血清，先将其按1：50稀释，人为设定此时抗体滴度效价为128U/mL(标准曲线最高浓度)后，再准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入100μL的标准品稀释液，依次倍比稀释成64U/mL、32U/mL、16U/mL、8U/mL、4U/mL和2U/mL，同时将标准品稀释液0U/mL作为空白管。为保证实验结果有效性，每次实验使用新的标准品溶液。

(2)ELISA体系检测抗CRT抗体

①包被蛋白：使用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液将纯化人重组CRT蛋白稀释至50ng/μL，在96孔酶标板中每孔加入100μL，4℃温育过夜。

②封闭：次日弃去孔内液体，甩干，用洗涤缓冲液洗板3次后每孔加入250μL封闭缓冲液，37℃温育2小时。

③洗涤：弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体。重复洗板3次。最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干。

④加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(见(1)试剂准备和标准品制备部分)。空白孔加100μL标准品稀释液(见(1)试剂准备和标准品制备部分的空白管)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

⑤弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤③。

⑥加入酶标抗体：每孔加入1:50000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG抗体100μL，室温育1小时。

⑦弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤③。

⑧显色：每孔加TMB显色液90μL，酶标板覆膜避光显色(反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。

⑨终止：每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

⑩读数：在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值(即OD值)。

1.6.3 K562细胞的复苏及培养

(1)细胞复苏：

i)配制细胞完全培养基：RPMI 1640培养液中加入胎牛血清(10％)及青霉素/链霉素双抗(1％)；

ii)细胞解冻：水浴箱恒温37℃，将K562细胞从液氮中取出，迅速置于水浴箱中轻轻搅动冻存管，使细胞均匀快速解冻。将解冻后的细胞接种至已加入完全培养基的T25培养瓶中，转移至37℃/5％CO₂培养箱中过夜培养，次日更换培养基以去除DMSO。

(2)细胞传代

当细胞汇合度达到90％时，可进行传代。首先将完全培养基平衡至室温，用移液器吹打培养瓶使细胞完全悬浮，将细胞悬液转移至离心管，室温1000rpm离心5分钟，去掉旧培养基，用新鲜的完全培养基重悬细胞后，转移至3-4个T75培养瓶继续培养，每2天换液1次。

(3)细胞计数和裂解：

当细胞进入对数生长期后，可收集细胞进行裂解。用移液器吹打培养瓶使细胞完全悬浮，将细胞悬液转移至离心管，室温1000rpm离心5分钟，后用无菌PBS溶液洗涤细胞沉淀，重复离心一遍。细胞计数后，按每10⁶个细胞加入100μL NP40裂解液(150mM NaCl，1.0％NP40，50mM Tris-HCl，pH 8.0，使用前立即加入蛋白酶抑制剂PMSF)，置于冰上充分裂解，裂解完成后4℃12000rpm离心5分钟，将上清转移至另一干净的1.5mL EP管中。

1.6.4使用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific,USA)对K562细胞裂解物的总蛋白进行定量：

1)取25μL不同梯度浓度的BCA标准品及细胞裂解物样品加入96微孔板中；

2)取反应液A和B以50:1的比例混合后，每孔加入200μL；

3)将微孔板置于37℃恒温箱反应30min，使用酶标仪读取570nm吸光度；

4)根据标准品的蛋白浓度和吸光度用软件作出标准曲线后，将1.6.3节中所述的K562细胞裂解物样品吸光度带入方程后计算其蛋白浓度；

5)分装细胞裂解物(50-100μL)，避免反复冻融循环，保存于-20℃冰箱备用。

1.6.5免疫沉淀试验(Immunoprecipitation assay)检测抗CRT抗体

(1)试剂准备

PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，调节pH至7.2,纯水定容至1L；

结合缓冲液：NP-40缓冲液(150mM NaCl，1.0％NP40，50mM Tris-HCl，调节pH8.0)；

洗涤缓冲液：含0.5％NP-40的PBS溶液。

(2)具体操作步骤如下：

①取适量的K562细胞裂解物，实验组加入IIM患者血清10μL，阳性对照组加入10μL兔抗人CRT多克隆抗体(1:100稀释)，阴性对照组加入HC血清10μL，后加入结合缓冲液将体系补至500μL，置于摇床4℃过夜孵育，以形成抗原抗体复合物。

②次日，将Protein A琼脂糖微珠摇匀后取30μL至一干净的EP管中，用预冷的PBS溶液洗涤，3000rpm离心3分钟，重复洗一遍后，用PBS把剩余微珠调整为50％混悬液。

③取出含细胞裂解物和血清的EP管并加入微珠，置于摇床4℃孵育3小时。

④用洗涤缓冲液洗涤珠子，3000rpm离心5分钟，弃去上清，重复5遍。

⑤弃上清，加入适量5×SDS上样缓冲液(使之终浓度调整为1×)，100℃加热5分钟使蛋白质变性，高速低温离心机12000g离心5分钟，等待上样。

1.6.6免疫印迹试验(Western blotting assay)检测抗CRT抗体

(1)试剂准备：

10×电泳缓冲液：Tris 30.3g,Glycine 188g,SDS 10g,加纯水定容至1L。使用时60mL母液加纯水稀释至600mL，配置成1×工作液；

转膜缓冲液：Tris 5.8g,Glycine 2.9g,SDS 0.37g，加纯水定容至800mL，后加入甲醇200mL；

1.0mol/L Tris HCL(pH 6.8):Tris 12.114g,溶解后用浓盐酸调节pH至6.8，纯水定容至100mL；

1.5mol/L Tris HCL(pH 8.8):Tris 18.171g,溶解后用浓盐酸调节pH至8.8，纯水定容至100mL；

10％SDS:SDS 10g,纯水定容至100mL；

10％过硫酸铵(APS):APS 0.1g,纯水定容至1mL；

10×Tris-HCl缓冲液(tris buffered saline,TBS)：Tris 24.2g，NaCl 80g，溶解后用浓盐酸调节pH至7.6，纯水定容至1L；

TBST缓冲液(含0.005％Tween 20的TBS溶液)：10×TBS母液100mL，纯水900mL，Tween 20 0.5mL混匀；

封闭液(一抗/二抗稀释液)：含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液；

显影液：Super Signal Maximum Sensitivity Substrate底物溶液A液及B液。

(2)具体操作步骤如下：

①制胶及灌胶：依据下表1分别配制10％分离胶及5％浓缩胶。将玻璃板洗净，最后用纯水冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。灌入2/3的分离胶后用异丙醇封胶，封胶后静置至胶凝固。待胶凝后将封胶液倒掉，用纯水洗涤一遍并吸干水分，然后灌浓缩胶。浓缩胶凝固后拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用纯水冲洗胶孔两遍以去除残胶。

表1分离胶和浓缩胶的制备

②电泳：将胶板固定于电泳槽，槽内灌入600mL电泳缓冲液，取出标准品(proteinladder)和待测样品进行上样，首先80V恒压电泳，带条带进入分离胶后将电压增至120V，溴酚蓝到达凝胶下缘时停止电泳。

③转膜：转膜前，PVDF膜应在甲醇溶液中浸泡5-10秒以活化，转膜用的夹子、海绵垫、滤纸、PVDF膜浸泡在转膜缓冲液中。取出凝胶，将浓缩胶轻轻刮去，切下含有目的分子量的胶并标记好顺序，将胶在转膜缓冲液中浸泡5分钟左右以平衡离子强度。按照“负极-海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极”的顺序夹好，注意用玻棒来回擀几遍排除所有气泡，将电转槽置于冰水中，恒压110V电转1小时。

④封闭：转膜结束后取出膜，将膜正面朝上在TBST溶液洗涤5分钟，移至含有封闭缓冲液的平皿中，室温下摇动封闭2小时。

一抗孵育：用含兔抗人CRT多克隆抗体(1:1000稀释)的封闭液4℃过夜孵育膜

二抗孵育：TBST洗膜4次，每次5分钟，用含HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1:5000稀释)的封闭液室温孵育膜1小时。

⑤显影：TBST洗膜4次，每次5分钟，取出显影液A液及B液，等比例混合后滴加至膜上，放入凝胶成像仪中观察目的条带。

1.7结果统计和分析

应用SPSS 23.0(IBM，USA)进行统计分析，并使用Prism 6.0(GraphPad,USA)绘图。P值(双侧)<0.05被认为差异具有统计学意义。具体试验、结果统计和分析如下所示：

(1)检测四组患者：特发性炎性肌病组、其他疾病对照组(包括其他结缔组织病对照组和肿瘤对照组)和健康对照组的血清中抗CRT抗体的阳性率：

通过按照本实施例1.6.2节中所述的ELISA法筛查结缔组织病(CTDs)患者和实体瘤(solid tumors)患者血清中的抗CRT抗体。

当临界值设定为健康对照组(HC)的平均值加上3倍标准差时，469例IIM患者中81例(17.3％)被判定为抗CRT抗体阳性(参见图2)。而抗CRT抗体在SLE、RA、pSS、solid tumors患者和HC中的阳性率分别为18.1％、17.1％、16.7％、25％和1.2％。IIM患者抗CRT抗体的阳性率显着高于HC(17.3％vs.1.2％，P＝0.008)，但与SLE、RA和pSS患者相比阳性率无显着差异(所有P>0.05)。

对经过ELISA法判定为抗CRT抗体阳性的IIM组患者的血清，进行了免疫沉淀(IP)分析。IP结果显示阳性血清识别的条带分子量约60kDa，与CRT蛋白相对应(具体参见图3)。

(2)对上述(1)检测后抗CRT阳性IIM患者的临床特征进行观察比较

依据血清中有无抗CRT抗体将IIM患者分为阳性组和阴性组，并对两组的人口学、临床特征和实验室结果进行了比较。81例抗CRT阳性患者中，52例(64.2％)被诊断为DM，10例(12.3％)为ADM，19例(23.5％)为PM(IMNM)。7例IIM患者只单纯抗CRT抗体阳性，其余74例患者伴有一个或多个MSAs/MAAs阳性。与抗CRT抗体阴性患者相比，抗CRT抗体阳性患者发生恶性肿瘤的比例更高(22.2％vs.11.9％，P＝0.013)，出现关节炎/关节疼痛的比例更低(17.3％vs.30.4％，P＝0.020)，而在其他临床表现(如肌无力、皮疹、间质性肺疾病)方面则无显著差异。

(3)探索抗CRT抗体与恶性肿瘤之间的关联

依据是否合并恶性肿瘤，将IIM患者分为未合并恶性肿瘤患者组(IIM withoutcancer)和合并恶性肿瘤患者组(IIM-cancer)。IIM合并恶性肿瘤组的抗CRT抗体阳性率显著高于未合并恶性肿瘤患者组(28.1％vs.15.6％，P＝0.013)(具体参见图4)。

依据肿瘤所处状态不同，将IIM-cancer组的患者进一步分为肿瘤新发(new-onsetcancers)，肿瘤复发(recurrent cancers)和肿瘤缓解(cancers in remission)三个亚组。我们观察到抗CRT抗体阳性率因肿瘤状态而异，肿瘤新发亚组、复发亚组和缓解亚组的抗体阳性率依次为26.5％、62.5％和18.2％。肿瘤复发亚组患者的抗CRT抗体阳性率较缓解亚组患者高得多(62.5％vs.18.2％，P＝0.032)，而肿瘤缓解亚组患者的抗体阳性率则与不合并肿瘤者接近(18.2％vs.15.6％，P＝0.763)(具体参见图4和图5)。

(4)从上述(3)中筛选出携带抗CRT抗体的IIM-cancer患者，观察临床特征

依据血清中有无抗CRT抗体把IIM-cancer患者分为阳性组和阴性组，并对他们的临床特征进行了比较。18例抗CRT抗体阳性患者中，11例(61.1％)为女性，平均年龄为58.9岁，14例(77.8％)诊断为DM。所有患者均患有实体瘤，最常见的癌症类型为肺癌、鼻咽癌和乳腺癌(均n＝3)；而抗CRT抗体阴性的IIM-cancer患者中最常见的癌症类型是卵巢癌(n＝9)，其次是肺癌(n＝6)和甲状腺癌(n＝6)。血液系统恶性肿瘤仅见于抗CRT抗体阴性患者。此外，抗CRT抗体阳性组和阴性组间MSA阳性率无显著差异。与抗CRT抗体阴性组相比，抗CRT抗体阳性组肿瘤处于复发状态的比例更大(27.8％vs.6.5％，P＝0.034)(如表2所示)。但是，在抗TIF-1γ抗体的患者中未观察到癌症状态与抗体谱之间的关联(所有P>0.05)。

表2癌症状态与自身抗体谱的关联

由此说明，对于IIM-cancer患者，抗CRT抗体阳性可能与发生实体瘤和肿瘤处于复发状态有一定关联。

(5)探索抗CRT抗体水平与疾病活动度的相关性

对81例抗CRT抗体阳性IIM患者作横断面分析时发现血清抗CRT抗体滴度与MYOACT得分(Spearman r＝0.28,P＝0.009)(具体参见图6)及PGA得分(Spearman r＝0.29，P＝0.008)呈显著正相关(具体参见图7)。

81例抗CRT抗体阳性的IIM患者中，16例有多次住院史，并有详细临床资料和对应的血清标本，因此，我们对这16例患者进行了纵向随访研究。纵向分析表明，随访期间IIM患者抗CRT抗体滴度的变化与MYOACT评分的变化呈正相关(β＝0.03，P<0.001)(具体参见图8)。

实施例2 MAGE-A1抗原的制备及MAGE-A1抗体的检测

1.1选取研究对象并设计分组：本研究回顾性地纳入2008年7月至2018年3月中日友好医院风湿免疫科收治的特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myositis,IIM)患者576例。

根据患者临床和实验室资料设计以下试验组和対照组：

“IIM试验组”：特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myositis,IIM)患者576例，其中390例皮肌炎(dermatomyositis,DM)，69例无症状皮肌炎(amyopathicdermatomyositis,ADM)和117例多发性肌炎(polymyositis,PM)或免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy,IMNM)患者；

“健康对照组(healthy controls,HCs)”：包括165名健康志愿者；

“其他结缔组织疾病(connective tissue disease,CTD)对照组”：包括141名CTD患者；其中，所述141名CTD患者包括：40例系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)患者、40例类风湿关节炎(systemic lupus erythematosus,RA)患者、40例原发性干燥综合征(primary

syndrome,pSS)患者和21例系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)患者。

他们的年龄性别均与IIM组患者无统计学差异。此外，部分抗MAGE-A1抗体阳性患者有多次随访血清和病历资料，对这部分患者进行了纵向随访，11例患者的中位随访时间为22.0个月，随访数据来自再次住院期间的医疗记录。

上述患者临床和实验室资料的采集方法如下：

患者首次及随访的临床资料包括症状、体征、辅助检查及检查结果、治疗方案以及医生对患者评估的总体疾病活动度，均通过患者住院期间的电子病历资料获得，所有临床表现、实验室检查结果以及疾病活动度评估均为血清留取当次的数据资料。

EULAR/ARC关于IIM亚型的分类树如图1所示。

1.3 IIM患者疾病活动度评价

患者疾病活动度的评价通过医师对病人疾病活动度的总体评估(physicianglobal assessment，PGA)获得，利用10cm的视觉模拟量表(visual analogue scale，VAS)记录评估。PGA VAS的评估依据参考了国际肌炎评估和临床研究协作组(InternationalMyositis Assessment and Clinical Studies group，IMACS)中对于医师对患者总体疾病活动度的评估方法。

1.4研究对象血清材料的采集及处理

实验开始前，患者的首次及再次入院就诊时的血清，均被离心后收集及储存在-80℃冰箱中，直至实验开始。

1.5 MAGE-A1抗原制备

根据基因名称MAGEA1，在NCBI数据库中的GENE下找到对应人源的该基因，下载该基因编码的蛋白序列为(SEQ ID NO：2)，具体为：

MSLEQRSLHCKPEEALEAQQEALGLVCVQAATSSSSPLVLGTLEEVPTAGSTDPPQSPQGASAFPTTIN FTRQRQPSEGSSSREEEGPSTSCILESLFRAVITKKVADLVGFLLLKYRAREPVTKAEMLESVIKNYKHCFPEIFGKASESLQLVFGIDVKEADPTGHSYVLVTCLGLSYDGLLGDNQIMPKTGFLIIVLVMIAMEGGHAPEEEIWEELSVMEVYDGREHSAYGEPRKLLTQDLVQEKYLEYRQVPDSDPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEYVIKVSARVRFFFPSLREAALREEEEGV

根据网站IEBD Analysis Resource(http://tools.immuneepitope.org/main/)在线预测B细胞表位，长度为25个氨基酸，肽段序列为FPTTINF TRQRQPSEGS SSREEEGP(SEQID NO：3)。委托金斯瑞生物科技公司合成该肽段的固体粉末，纯度≥85％，每管4mg，每1mg分装1管，保存于-30℃冰箱。

1.6 MAGE-A1抗体检测体系建立

1.6.1抗体检测中使用的试验材料等相关信息

(1)试验试剂与耗材

96孔酶标板(美国Corning公司)

碳酰二亚胺盐(EDC)(美国Thermo Fisher公司)

MES水合物(美国Sigma-Aldrich公司)

脱脂奶粉(美国BD公司)

PBS缓冲液干粉(SOLARBIO公司)

Tween20(SOLARBIO公司)

辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(美国Abcam公司)

TMB显色液(康为试剂公司)

终止液(SOLARBIO公司)

(2)仪器、设备

-80℃超低温冰箱(日本SANYO公司)

-30℃低温冰箱(日本SANYO公司)

4℃冰箱(日本SANYO公司)

37℃恒温温箱(上海一恒科技有限公司)

酸度计(美国Beckman公司)

纯水仪(德国Millipore公司)

高速离心机(德国Eppendorf公司)

低温高速离心机(美国Beckman公司)

电子移液枪(德国Eppendorf公司)

磁力搅拌器(常州国华电器公司)

摇床(上海琪特公司)

全自动酶标仪(美国Bio-rad公司)

(3)主要试剂溶液的配制

①MES缓冲液：MES水合物2.133g，溶于90ml双蒸水中，调节PH值至6.0，定容至100ml。

②MAGE-A1多肽母液：在每管MAGE-A1多肽粉末中加入1mlMES溶液，充分溶解，配制成浓度为4mg/ml的多肽母液，保存在-30℃冰箱。

③EDC溶液(现用现配)：称取粉末(易潮解，一次性称取，避免多次打开导)，用双蒸水溶解至10mg/ml。

④PBS溶液：取一袋PBS缓冲液干粉，用双蒸水溶解，定容至2L，常温保存。

⑤0.05％PBST溶液：在每1L配制好的PBS溶液中加入50μlTween20试剂，充分溶解混匀，常温保存。

⑥封闭液(含5％脱脂奶粉的PBS溶液，现用现配)：取脱脂奶粉2.5g，加PBS溶液充分搅拌至溶解，定容至50ml。

⑦稀释液(含2.5％脱脂奶粉的0.05％PBST溶液，现用现配)：取脱脂奶粉1.25g，加0.05％PBST溶液充分搅拌至溶解，定容至50ml。

1.6.2间接ELISA检测抗MAGE-A1抗体的存在

(1)标准品制备

取一份IMM患者的血清，以1：25开始，倍比稀释至1：400(即包含浓度梯度1：25、1：50、1：100、1：200和1：400)，加上空白对照(不含IMM患者的血清)，共6个浓度梯度，并设定1：25稀释比下患者的抗MAGE-A1抗体浓度为64U/ml，以此类推；根据浓度梯度的结果，在ELISACalc中拟合最佳标准曲线，并通过标准曲线计算获得待测血清的抗体滴度；若待测样品的OD值超出标准曲线的范围，则将血清再稀释后进行检测，直至其OD值落入标准曲线的检测范围内。

(2)ELISA体系检测MAGE-A1抗体

①包被

将MAGE-A1多肽母液用MES缓冲液稀释至4μg/ml的工作液，多肽溶液和EDC溶液按照5：1的体积混匀，获得混合液，在96孔酶标板的每个孔中加入EDC溶液和MAGE-A1多肽溶液的混合液60μl，4℃过夜。

②洗板

倒掉所有溶液，用双蒸水洗涤3次，每次每孔300μl，拍干96孔板。

③封闭

每孔加入200μl的5％脱脂奶粉封闭液，37℃恒温保温箱封闭2小时。

④洗板

⑤加样

在96孔板中加入标准品和待测患者血清(2.5％脱脂奶粉稀释液，1：50稀释)，每孔100μl，室温孵育1小时。

⑥洗板

倒掉所有溶液，用0.05％PBST溶液洗涤5次，每次每孔300μl，拍干96孔板。

⑦孵育二抗

用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(2.5％脱脂奶粉稀释液，1：2000稀释)检测血清中的抗体与多肽的结合，每孔100μl，室温孵育30分钟。

⑧洗板

重复上述PBST洗液洗板5遍，拍干。

⑨显色

每孔加入TMB底物显色溶液，每孔100μl，避光反应20分钟左右。

⑩终止

每孔加入终止液50μl，加入后要使液体混匀，可轻轻摇晃或抽吸，终止后10分钟内读数。

读数

将96孔板置于酶标仪中读数，读取检测波长450nm时的OD值。

重复

对所有血清样品进行的实验重复两次以上以确保一致性。

1.7结果统计和分析

连续变量用均值(mean)±标准差(standard deviation,SD)或中位数(四分位间距)【median(interquartile range,IQR)】描述，组间比较通过T检验、Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H test完成。对于分类变量，若用数值或百分数表示，则用Pearson'sChi-square或Fisher精确检验进行比较。Kaplan-Meier生存曲线被用于分析患者的生存情况。在横断面研究中使用Spearman相关分析来分析相关性，在纵向研究中应用广义估计方程(generalized estimating equation,GEE)分析病人多次随访资料，获得阳性血清抗MAGE-A1抗体的浓度滴度和疾病活动度在纵向随访上的关系。有数据的分析都通过SPSS25.0和GraphPad Prism 8.0完成。具体试验、结果统计和分析如下所示：

(1)检测抗MAGE-A1抗体在IIM和其他CTD中的阳性率

通过间接ELISA，测得在576名IIM患者和141名其他CTD患者中，抗MAGE-A1抗体的阳性率在IIM中为5.03％(29/576)、SLE为15.0％(6/40)、RA为12.5％(5/40)、pSS为27.5％(11/40)、SSc为38.1％(8/21)。ELISA检测结果提示抗MAGE-A1抗体在IIM以及其他CTD中的阳性率均显着高于HC(所有p均<0.05)(参见图9中的a)。

对IIM进一步的亚组分析显示，抗MAGE-A1抗体在DM、ADM和PM(IMNM)中的阳性率分别为4.6％(18/390)、7.2％(5/69)和5.1％(6/117),但在IIM的三个亚组之间抗MAGE-A1抗体阳性率无差异(p＝0.679)(参见图9中的b)。

(2)分析抗MAGE-A1抗体阳性IIM患者的临床特征

比较29名抗体MAGE-A1抗体阳性和547名抗MAGE-A1抗体阴性患者的临床特点，包括一般情况、临床表现和实验室检查结果。

如表3所示，在IIM患者中，在发病年龄上，抗MAGE-A1抗体阳性患者比抗体阴性患者的更大(中位数：55.0岁vs.47.0岁,p＝0.006)。

表3抗MAGE-A1抗体阳性和抗MAGE-A1抗体阴性IIM患者的一般情况

在临床特点上，两组患者在ILD的合并率上有显著的统计学差异，抗MAGE-A1阳性患者的ILD发生率明显高于抗体阴性的患者(82.8％vs55.0％,p＝0.003)(具体参见表4)。在实验室检查结果中，抗MAGE-A1抗体的患者更易合并有抗核抗体阳性(51.7％vs 28.9％,p＝0.009)(具体参见表4)。此外，在MSA的分布上，抗MAGE-A1抗体阳性的患者可以同时合并各种MSA同时存在，且合并的各MSA之间也无差异，同时，抗MAGE-A1抗体也可以不合并其他MSA而独立存在。

表4抗MAGE-A1抗体阳性和抗MAGE-A1抗体阴性IIM患者的临床特征和实验室检查结果

(3)分析IIM中抗MAGE-A1抗体阳性的ILD患者的临床特点

根据上述结果(2)得出抗MAGE-A1抗体与IIM合并ILD密切相关，在此基础上，继续分析了IIM中抗MAGE-A1阳性的患者的肺部临床表现，结果发现与抗MAGE-A1抗体阴性的ILD患者相比，抗MAGE-A1抗体阳性的ILD患者倾向于表现为无症状ILD的形式(75％vs 44％，p＝0.003)，而出现呼吸困难症状的比例较少(21％vs 47％，p＝0.013)(具体参见表5)。

表5合并ILD的IIM患者中抗MAGE-A1抗体阳性和阴性两组的临床特点

(4)分析抗MAGE-A1自身抗体血清水平与疾病活动性的关系

在29例抗MAGE-A1阳性患者中，血清抗MAGE-A1水平与PGA VAS无相关性(r＝-0.049，p＝0.800)。在29例抗MAGE-A1抗体阳性的患者中，对11例患者进行了随访，他们有至少两次以上的随访数据以及血清标本，11例患者的中位随访时间为22.0个月，随访数据来自再次住院期间的医疗记录。

在这11例患者中，他们的MSA类型分别为：4例抗MDA5阳性，2例抗ARS阳性，2例MSA阴性，分别由1例抗NXP2、-HMGCR和-SRP阳性。患者的血清抗MAGE-A1滴度会随着患者PGAVAS评分的变化而变化，通过GEE分析，发现患者的抗MAGE-A1水平与PGA VAS呈正相关(β＝1.071，p<0.0001)(具体参见图10)。

序列表

<110> 中日友好医院

苏州系统医学研究所

<120> CRT抗原和MAGE-A1抗原的制备及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val

1 5 10 15

Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly

20 25 30

Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys

35 40 45

Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys

50 55 60

Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser

65 70 75 80

Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr

85 90 95

Val Lys His Glu Gln Asn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu

100 105 110

Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr

115 120 125

Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val

130 135 140

His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp

145 150 155 160

Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val

165 170 175

Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu

180 185 190

Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile

195 200 205

Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys

210 215 220

Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu

225 230 235 240

His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu

245 250 255

Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys

260 265 270

Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr

275 280 285

Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser

290 295 300

Ile Tyr Ala Tyr Asp Asn Phe Gly Val Leu Gly Leu Asp Leu Trp Gln

305 310 315 320

Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu

325 330 335

Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala

340 345 350

Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp

370 375 380

Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp

385 390 395 400

Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu

405 410 415

Leu

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr

35 40 45

Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe

50 55 60

Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser

65 70 75 80

Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser

85 90 95

Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe

100 105 110

Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met

115 120 125

Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe

130 135 140

Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys

145 150 155 160

Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly

165 170 175

Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr

180 185 190

Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His

195 200 205

Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr

210 215 220

Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr

225 230 235 240

Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp

245 250 255

Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala

260 265 270

Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala

275 280 285

Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu

290 295 300

Glu Glu Glu Gly Val

305

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro

20 25

Claims

1.一种MAGE-A1抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.一种疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被有氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示的CRT抗原的载体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG和阳性对照品；优选的，所述试剂盒中还包含包被缓冲液、封闭缓冲液、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、显色液和终止液；更优选的，所述阳性对照品为抗CRT抗体阳性的特发性炎性肌病(IIM)患者的血清。

3.一种疾病检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被有权利要求1所述MAGE-A1抗原的载体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG和阳性对照品；优选的，所述试剂盒中还包含包被缓冲液、封闭缓冲液、稀释缓冲液、洗涤缓冲液、显色液和终止液；更优选的，所述阳性对照品为抗MAGE-A1抗体阳性的特发性炎性肌病(IIM)患者的血清。

4.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的CRT抗原在制备疾病诊断和分型的试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)；更优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)合并恶性肿瘤。

5.如权利要求1所述的MAGE-A1抗原在制备疾病诊断和分型的试剂盒中的用途，优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)；更优选的，所述疾病为特发性炎性肌病(IIM)合并间质性肺疾病(ILD)。

6.一种血清标志物在制备用于评估特发性炎性肌病(IIM)患者疾病分型及预后的试剂盒中的用途，其特征在于，所述血清标志物为IIM患者血清中的抗CRT抗原的抗体，所述CRT抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述特发性炎性肌病(IIM)患者合并恶性肿瘤。

8.一种血清标志物在制备用于评估特发性炎性肌病(IIM)患者脏器受累及预后的试剂盒中的用途，其特征在于，所述血清标志物为IIM患者血清中的抗MAGE-A1抗原的抗体，所述MAGE-A1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述特发性炎性肌病(IIM)患者合并间质性肺疾病(ILD)。