CN114276999A - 黑素瘤细胞株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑素瘤细胞株，黑素瘤细胞株内含有Rosa26‑Stop‑tdTomato报告基因、Tyr‑creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因，该黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP，已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C202233。同时提供了黑素瘤细胞株的制备方法。本发明能够制备出一种遗传功能稳定的可以表达红色荧光蛋白，且含有BrafV600E突变激活基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株，便于医学研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种黑素瘤细胞株及其制备方法。
背景技术
皮肤恶性黑素瘤（简称MM）是皮肤科最致命的恶性肿瘤，由位于表皮基底层的黑素细胞发生恶变形成的。MM的产生是由遗传因素和环境因素相互作用导致的，通常黑素细胞容易发生突变形成MM的基因为BRAF、NRAS、TP53、PTEN、CDKN2A和KIT等，其中，黑素细胞中BRAF发生突变的概率为63%，PTEN发生缺失的概率为25%。
为了研究MM的发展过程，评估肿瘤药物治疗效果以及耐药机制等，常使用MM转基因小鼠进行研究。但是现有MM转基因小鼠的繁殖周期长，并且经过繁殖后其体内的黑素瘤基因并不稳定，影响研究的进程。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种黑素瘤细胞株及其制备方法，能够制备出一种遗传功能稳定的可以表达红色荧光蛋白，且含有BrafV600E突变激活基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株，便于医学研究。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供一种黑素瘤细胞株，黑素瘤细胞株内含有Rosa26-Stop-tdTomato基因、Tyr-creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因，所述黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP，已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C202233。
黑素瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
S1、选取同时携带Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠A，以及携带Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠B，将所述小鼠A和所述小鼠B进行杂交，筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠C；
S2、将所述小鼠C饲养至成年后与携带Ptenf/f基因的小鼠D进行杂交，筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠E；
S3、通过对所述小鼠E进行诱导得到Rosa26-Stop-tdTomato表达、Tyr-creERT2激活、BrafV600E激活同时Pten基因缺失的小鼠F，所述小鼠F中即含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的黑素瘤细胞株。
优选的是，步骤S3中使用4羟基他莫昔芬对所述小鼠E进行诱导。
优选的是，步骤S3中在对所述小鼠E诱导之前将其背部的毛剔除。
优选的是，步骤S3中对所述小鼠E的诱导时间为30天。
优选的是，在制备步骤S1中的所述小鼠A时，先选取含有Tyr-creERT2基因的小鼠G，以及含有BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠H进行杂交，即可筛选得到所述小鼠A。
优选的是，制备所述小鼠G时，选取FVB/NJ小鼠，通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精卵细胞内，构建出所述小鼠G。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过先筛选后诱导的方法筛选出含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠F，即筛选得到了含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株，该细胞具有稳定的遗传功能，便于医学实验研究。
同时本发明筛选出的黑素瘤细胞株里面含有Rosa26-Stop-tdTomato基因，能够表达出红色荧光，为黑素瘤细胞株在研究中提供了便于识别的标记符号，进一步便于医学实验的研究。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述具有BrafV600E基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株传代至10代后的激光共聚焦显微镜下的10倍放大图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述具有BrafV600E基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株传代至10代后的激光共聚焦显微镜下的100倍放大图；
图3为本发明的其中一种技术方案所述黑素瘤细胞株移植成瘤图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
1、含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠的制备
首先选取FVB/NJ小鼠，通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精卵细胞内，构建出含有Tyr-creERT2基因的小鼠，即构建出一种黑素细胞特异的cre酶活性小鼠，让含有Tyr-creERT2基因的小鼠与可在体内条件性驱动BrafV600E突变激活和Pten基因缺失（Ptenf/f）的小鼠杂交，即得到含有Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠，将含有Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠与含有Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠进行杂交，通过筛选可获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠，其中，Ptenf/f基因为纯合子基因，Ptenf/+基因为杂合子基因，将含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠饲养到成年后与含有Ptenf/f基因的小鼠进行杂交，筛选获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠，将含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠的背部毛进行剔除后通过4羟基他莫昔芬诱导30天即获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的目标小鼠，通过4羟基他莫昔芬的诱导使目标小鼠体内的Rosa26-Stop-tdTomato表达出了红色荧光蛋白，激活了BrafV600E基因的表达，同时敲除了Pten基因。其中，该申请已将该小鼠的黑素瘤细胞株，其分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP于2022年2月9日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C202233，保藏中心的具体地址为：中国 武汉 武汉大学。
2、稳定遗传实验
1、通过上述制备得到了背部长有黑素瘤肿瘤的小鼠，将小鼠背部的肿瘤切除后浸泡在75%酒精中1min，得到浸泡后的肿瘤，将浸泡后的肿瘤用无菌PBS冲洗干净，利用眼科剪刀将该肿瘤剪碎成0.1cm x 0.1cm的肿瘤块，将肿瘤块放进裂解液中，并在裂解液中裂解2小时，裂解的过程是在37℃的水浴锅中与90rpm的震速中进行震荡，其中，裂解液包括1mg/mL胶原酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶Ⅳ、2U/mL DNaseⅠ、0.5%（wt）Trypsin-EDTA和0.4‰（wt）BSA HBSS溶液，完成裂解后加入与裂解液体积相等的10%FBS HBSS用以终止消化，终止消化后依次使用70μm和40μm的细胞筛网进行过滤，制得单细胞悬液。
2、利用1mg/mL 7AAD溶液对制备的单细胞悬液进行孵育10min，随后利用流式细胞仪分选出表达红色荧光蛋白的肿瘤细胞进行培养，培养液中含有10% FBS DMEM、青霉素/链霉素双抗，在含有5%CO2，温度为37℃培养箱内进行培养，肿瘤细胞贴壁生长，将贴壁生长的肿瘤细胞在0.5% Trypsin-EDTA溶液中37℃消化2min，随后利用安全培养基终止消化，将终止消化后的肿瘤细胞1000rpm，5min离心后用新鲜培养基进行重悬，并按照1：3比例进行传代培养，得到传代培养细胞。
3、成瘤能力的检测试验
将1x10^6个本发明制备的黑素瘤细胞株用100μl PBS重悬注射到裸鼠皮下，对照组100μl PBS注射到裸鼠皮下，饲养两个月后观察其身体特征。
结果
1、稳定遗传实验
经过传代至10代的细胞在显微镜下的形状呈长梭形，在荧光显微镜下可见红色荧光蛋白表达，图1为10倍显微镜下的细胞图，图2为100倍显微镜下的细胞图。
2、成瘤能力的检测试验
进过两个月的饲养实验组的小鼠的长出了2cm x 2cm大小的肿瘤，而对照组没有长出肿瘤，证明表明该黑素瘤细胞株具有明显的成瘤能力，结果如图3所示。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.黑素瘤细胞株，其特征在于，黑素瘤细胞株内含有Rosa26-Stop-tdTomato基因、Tyr-creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因，所述黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP，已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:C202233。
2.根据权利要求1所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选取同时携带Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠A，以及携带Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠B，将所述小鼠A和所述小鼠B进行杂交，筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠C；
S2、将所述小鼠C饲养至成年后与携带Ptenf/f基因的小鼠D进行杂交，筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠E；
S3、通过对所述小鼠E进行诱导得到Rosa26-Stop-tdTomato表达、Tyr-creERT2激活、BrafV600E激活同时Pten基因缺失的小鼠F，所述小鼠F中即含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的黑素瘤细胞株。
3.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S3中使用4羟基他莫昔芬对所述小鼠E进行诱导。
4.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S3中在对所述小鼠E诱导之前将其背部的毛剔除。
5.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，步骤S3中对所述小鼠E的诱导时间为30天。
6.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，在制备步骤S1中的所述小鼠A时，先选取含有Tyr-creERT2基因的小鼠G，以及含有BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠H进行杂交，即可筛选得到所述小鼠A。
7.根据权利要求6所述的黑素瘤细胞株的制备方法，其特征在于，制备所述小鼠G时，选取FVB/NJ小鼠，通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精卵细胞内，构建出所述小鼠G。
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