CN113960311A - 一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法，所属癌症试剂盒检测技术领域，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体，试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白。本发明针对胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白测试敏感度提高，建立了检测CRT最低量为0.2312ng/ml的高特异性和敏感性的试剂盒，能够更精确快速的测试胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白，更精确、敏感性更高。

Description

一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于癌症试剂盒检测技术领域，具体涉及一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法。
背景技术
胰腺癌被喻为21世纪“癌中之王”，是人类恶性程度最高的肿瘤之一。而钙网蛋白(Calreticulin,CRT)是一种高度保守的内质网钙结合蛋白(调控钙离子稳态)，与肿瘤的发生及预后密切相关。钙网蛋白在胰腺癌组织中呈明显高表达，并与肿瘤淋巴结转移、TNM分期呈正相关。钙网蛋白是影响胰腺癌预后的独立危险因素。此外，钙网蛋白与上皮细胞间质转化(EMT)相关蛋白Integrinβ1、Fibronectin及E-cad，与ERK/MAPK通路蛋白p-ERK和c-Myc在胰腺癌中表达显著相关，共同促进胰腺癌临床进展及预后。
钙网蛋白通过调控ERK/MAPK通路促进胰腺癌细胞的侵袭和迁移。Crispr-cas9介导CRT沉默能够抑制EGF诱导胰腺癌EMT发生，同时上调EMT上皮标志物E-cad、ZO-1及β-catenin，下调EMT间质标志物Fibronectin及Integrinβ1以及EGFR-ERK-MAPK通路。CRT沉默能够抑制裸鼠皮下成瘤以及远处肝转移，同时伴随EMT及Integrinβ1/EGFR-ERK-MAPK通路表达改变。因此，钙网蛋白通过调控Integrinβ1/EGFR-ERK-MAPK通路影响EGF诱导胰腺癌EMT发生。
钙网蛋白过表达促进了胰腺癌细胞增殖，反之亦然。CRT沉默依赖ERK/MAPK通路提高了吉西他滨及奥沙利铂细胞化疗敏感性。钙网蛋白依赖ERK/MAPK途径，而非p53途径调节胰腺癌细胞增殖及耐药；同时crisp-cas9介导钙网蛋白沉默通过Integrinβ1/EGFR-ERK-MAPK通路抑制裸鼠皮下成瘤。
但是目前的胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，检测限高、精度不高，敏感性不佳，导致不能及时有效的检测早期胰腺癌。
发明内容
针对现有技术的试剂盒存在检测不精确、检测限高、检测时间长，而导致不能够敏感的测试早期胰腺癌。本发明提供一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法，能够更精确的测试胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白，更精确、敏感性更高。其具体技术方案如下：
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体，所述试剂盒检测CRT最低量为0.2312ng/ml；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
鼠源单克隆抗体的制备具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.5～2％绵羊血清液，1.5～2％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭40～50min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色5～8min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本发明一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，与现有技术相比，有益效果为：
本发明利用鼠源单克隆抗体结合碱性磷酸酶抗体、经过辣根过氧化物酶促进更加敏感快速，针对胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白测试敏感度提高，建立了检测CRT最低量为0.2312ng/ml的高特异性和敏感性的试剂盒。通过制备的试剂盒，对收集的临床样品进行检测，结果发现病人血清中的CRT明显高于正常对照血清，统计学有显著差异(P<0.01)，为临床病人的诊断提供有效的支持。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.5％绵羊血清液，1.5％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭40min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色5min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2312ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例2
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和2％绵羊血清液，2％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭45min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色6min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2314ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例3
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.5％绵羊血清液，1.5％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭50min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色8min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2316ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例4
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.8％绵羊血清液，1.8％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭40min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色6min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2320ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例5
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.5％绵羊血清液，1.5％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭48min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色7min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2313ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例6
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和2％绵羊血清液，2％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭50min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色5min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2315ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例7
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.6％绵羊血清液，1.6％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭42min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色7min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2316ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例8
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.7％绵羊血清液，1.7％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭44min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色8min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2317ng/ml，快速、敏感、高效。
实施例9
一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体；
所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：使用纯化的小鼠重组钙网蛋白(即CRT抗原)作为免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，应用构建的重组质粒通过原核表达系统制备小鼠重组CRT蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)；经效价检测达标后，进行细胞融合；经筛选克隆获得分泌抗体的杂交瘤细胞，经杂交瘤细胞株分泌，得到鼠源单克隆抗体；
具体步骤为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞(即分泌鼠源单克隆抗体多，且细胞生长状态好的杂交瘤细胞)；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体；
所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液；
所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和2％绵羊血清液，2％绵羊血清液在封闭时加入；
所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存；
所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS；
所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4；
所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
所述试剂盒还包括包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶、标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105；
本发明一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭45min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色7min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
本实施例血清的收集与储存、使用：
49例肿瘤患者血清(男32，女17)收集来源于某肿瘤科，55例正常对照(男33，女22)来自于该医院体检科。肿瘤诊断标准是根据以往的临床诊断标准、放射及内窥镜检查，最后由病理检测确定，血清收集后放入-80℃备用。在使用时，用1×PBS5倍稀释，通过ELISA方法测定血清中CRT含量。
本实施例临床肿瘤病人血清CRT测定：
将临床样品在4℃融化，用样品稀释液5倍稀释肺癌与正常人血清作为双抗夹心检测抗原，根据测定的OD值，应用标准曲线，计算各样品中CRT蛋白含量，乘以稀释倍数，得到样品的实际CRT蛋白含量。
本实施例试剂盒检测CRT最低量为0.2314ng/ml，快速、敏感、高效。
Figure BDA0003269873400000201
Figure BDA0003269873400000211
序列表
<110> 中国医科大学附属第一医院
<120> 一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒及其方法
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> 重组小鼠钙网蛋白(Recombinant mouse reticulin)
<400> 1
Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys
1 5 10 15
Phe Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asp Lys Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp
20 25 30
Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Lys Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys
35 40 45
Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val Lys His Glu Gln Asn Ile
50 55 60
Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu Phe Pro Ser Gly Leu Asp Gln
65 70 75 80
Lys Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp
85 90 95
Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His Val Ile Phe Asn Tyr Lys
100 105 110
Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu
115 120 125
Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu
130 135 140
Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp
145 150 155 160
Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile Lys Asp Pro Asp Ala Ala Lys
165 170 175
Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser
180 185 190
Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu His Ile Pro Asp Pro Asp Ala
195 200 205
Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro
210 215 220
Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys Gly Glu Trp Lys Pro Ala Thr
225 230 235 240
Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Trp Ile His Pro
245 250

Claims (10)

1.一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括钙网蛋白(CRT)的特异性抗体；所述钙网蛋白的特异性抗体为以钙网蛋白为免疫原得到的鼠源单克隆抗体，所述试剂盒检测CRT最低量为0.2312ng/ml。
2.根据权利要求1所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述鼠源单克隆抗体的制备方法为：免疫Balb/c小鼠前，先获得大约100μl的血清-20℃保存，后以60μg纯化的CRT抗原与弗氏完全佐剂混合制成乳剂，经皮内背部多点注射进行免疫；25天后，用30μg的抗原加弗氏不完全佐剂经皮内注射进行加强免疫共4次，每次间隔3周；经效价检测达标后，将免疫获得的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，饲养层细胞为小鼠腹腔巨噬细胞，融合试剂为60％的PEG4000，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为5∶1.5，置于5％CO2饱和湿度的37℃温箱中培育，第5、10、15日换入含HAT的完全1640培养液，用有限稀释法将克隆分别稀释于5块96孔板中，至杂交瘤细胞长成后吸取上清，用ELISA检测上清抗体效价，筛选出阳性杂交瘤细胞；再经筛选获得的杂交瘤细胞株分泌，纯化后得鼠源单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液、样品稀释液、洗涤液、终止液和底物显色液。
4.根据权利要求3所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液的组分及配比为：封闭液含1％BSⅠ号液和1.5～2％绵羊血清液，1.5～2％绵羊血清液在封闭时加入。
5.根据权利要求3所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的组分及配比为：样品稀释液为氯化钠7g、氯化钾0.4g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾0.3g，溶于ddH2O中，调pH为7.2，定容至1L，过滤，4℃保存。
6.根据权利要求3所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的组分及配比为：洗涤液为含浓度为0.08％Tween-20的PBS。
7.根据权利要求3所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述终止液的组分及配比为：终止液为2mol/L H2SO4。
8.根据权利要求3所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液的组分及配比为：底物显色液包括Ⅰ号液和Ⅱ号液，Ⅰ号液的制备过程为：过氧化脲1g，磷酸氢二钠36g，柠檬酸10g，Tween-20100μL，将前三者加ddH2O避光溶解后加入Tween-20定容至1L，4℃避光保存；Ⅱ号液的制备过程为TMB0.8g，柠檬酸10g，DMSO40ml，先用DMSO避光溶解前两者后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存；使用前等体积混合Ⅰ号液和Ⅱ号液，避光显色。
9.根据权利要求1所述的一种胰腺癌早期诊断标志钙网蛋白快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包包被有所述鼠源单克隆抗体的微孔板、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶和标准对照钙网蛋白；通过方阵滴定法的测定，当CRT浓度为3ng/ml、OD值为1.0时的鼠源单克隆抗体包被浓度、碱性磷酸酶抗体、辣根过氧化物酶浓度为最佳浓度；分别为鼠源单克隆抗体1300倍稀释，碱性磷酸酶抗体7500倍稀释，辣根过氧化物酶5000倍稀释，阴性对照0.105。
10.权利要求1所述的一种胰腺癌标志钙网蛋白快速检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1：用碳酸盐缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3，pH9.6)包被1∶1300梯度稀释的鼠源单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被12h，洗涤液洗涤ELISA板1次；
步骤2：加入300μl封闭液37℃封闭40～50min，洗涤液洗涤1次；
步骤3：加入150μl1％BSA稀释的CRT抗原(0.5μg/ml，100μl/孔)37℃，50min后用洗涤液洗涤4次；
步骤4：加入100μl碱性磷酸酶抗体(7500×)，37℃孵育40min后用洗涤液洗涤2次；
步骤5：加入200μl辣根过氧化物酶(5000×)37℃孵育30min后用洗涤液洗涤2次；
步骤6：120μl/孔底物显色液(Ⅰ号液和Ⅱ号液)室温避光显色5～8min；
步骤7：加入50μl/孔的终止液终止反应；
步骤8：在450nm波长酶标仪上测定吸光度值。
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