CN103087195A - 抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该双特异性单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。该双特异性单克隆抗体制备方法如下：合成氯霉素和安普霉素的半抗原和人工抗原；利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株；利用安普霉素人工抗原制备分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株；抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗安普霉素的杂交瘤细胞株细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体。本发明得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了ELISA分析方法，为氯霉素和安普霉素的快速检测提供技术基础。

Description

抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

免疫分析方法(Immunoassay，IA)是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的一门技术，是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应，具有特异性强、灵敏度高、方便快速、高通量、检测成本低、安全可靠等特点。该方法一般不需要贵重仪器，使用人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。

免疫分析法起始于20世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，创立了放射免疫分析技术。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。

由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、酶标记、荧光标记、金标记、化学发光等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物既保持了抗体或抗原的活性，也不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析技术的敏感性。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。

目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有两种方法，一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类农药具有特异性识别反应的广谱抗体，如Alococer等用有机磷的通用结构膦酸作为半抗原，成功制备了广谱性的多克隆抗体，且对10种以上的有机磷农药有特异性识别；骆爱兰等用拟除虫菊酯类农药的共有结构间苯氧基苯甲酸（PBA）为半抗原，也成功制备了广谱性的多克隆抗体，并对5种菊酯有特异性识别。另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特异性抗体（broad specificity antibody）”，如王姝婷等通过对人工抗原的设计，将克百威、三唑磷、毒死蜱和甲基对硫磷半抗原偶联到一个载体蛋白分子上制备出了多抗原决定簇的人工抗原并获得了能同时识别上述四种农药的“宽谱特异性”多克隆抗体，达到多残留检测的目的。

抗体在多残留免疫分析中的作用非常关键，抗体质量的好坏直接影响免疫分析的准确性和灵敏度，因此获得好的抗体是多残留免疫分析技术的首要工作，已报道的药物多残留免疫检测的抗体均为多克隆抗体，由于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化，生产数量上也会受到一定的限制，制备的抗体可重复性差，在应用中会受到一定的限制，随着单克隆抗体技术的出现，解决了抗体制备过程中抗体性状不稳定的问题，并且单克隆抗体技术获得的杂交瘤细胞在体外能无限量分泌性状稳定的抗体，因此，在小分子药物免疫分析中单克隆抗体已逐渐取代多克隆抗体。

传统的免疫快速诊断技术中使用的抗体不论是多克隆抗体还是普通单克隆抗体，一个抗体分子均只识别一种或者一类抗原，使检测范围受到很大的限制，随着单克隆杂交瘤技术的发展和不断完善， Milstein等首次报道了一株能分泌双特异性单克隆抗体（Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb）的杂交-杂交瘤（Hybrid Hybridomas）细胞，标志着双特异性单克隆抗体技术的创立。双特异性单克隆抗体是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。其基本结构中两个Fab端的结构和功能不相同，能分别结合两种不同抗原。由于双特异性单克隆抗体在结构上的特殊性，具有两个不同的抗原识别位点，如果能把该抗体技术引入到药物残留快速诊断技术中来，特别是在面临多残留快速检测技术需求的背景下，在一定程度上能满足多残留检测所面临的新的要求，该技术从抗体的结构和特性上入手，区别于传统的多残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行一系列的改造，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别两种同类药物甚至是结构差异大得两类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，为探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。

氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素，对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用，是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏病的首选药物，对乳房炎也有很好的疗效，广泛应用于动物各种传染性疾病的治疗，造成在动物组织的残留。其毒副作用表现为抑制骨髓造血功能，引起人类的早产儿灰色综合症，再生障碍性贫血等，因此动物组织中氯霉素的残留对人类健康产生严重的威胁。许多国家严禁将氯霉素用于食品动物(特别是鸡蛋和奶牛)，并规定氯霉素的MRL 为0-0.01mg/kg。我国和美国均规定在动物性食品中不得检出氯霉素（含量在1ng/mL 以下）。欧盟不允许氯霉素用于产奶母牛和产蛋鸡，严格规定肉中的氯霉素残留量不得检出，所以发展适宜的方法以快速、灵敏的检测动物组织中的氯霉素残留就显得非常重要。目前，氯霉素残留分析方法主要有微生物检测法、理化检测法和免疫检测法等。微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留检测，它易受组织中其他抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便，样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。理化检测法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。 

安普霉素(Apramycin，Apra)又名暗霉素、阿泊拉霉素、阿布拉霉素，是氨基糖苷类抗生素的典型代表药物。安普霉素是美国礼来公司于1985年开发的新产品，目前我国也可生产，它是由黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)突变株发酵产生的。饲料中使用的多为安普霉素的硫酸盐(Apramycin sulphate)，其为棕褐色结晶粉末或暗淡的黄色粉末，极性强，易溶于水，微溶于乙醇。氨基糖苷类抗生素使用不当，会对动物的肾脏及听觉产生毒副作用。因此，国内外相继规定了氨基糖苷类抗生素在动物食品中的最高残留限量。1996年欧盟确定了庆大霉素、新霉素、链霉素和双氢链霉素在奶和组织中的最高残留限量为100-5000ng/ml。2000年欧盟规定，链霉素和双氢链霉素在牛奶中的最高残留限量是200ng/ml，在肌肉、肝脏、脂肪组织中是500ng/ml，在肾脏中则不能超过1000ng/ml。我国农业部于2002年12月14日235号公告发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，链霉素和双氢链霉素在牛、绵羊、猪、鸡等的肌肉、脂肪和肝脏组织中残留限量为600ng/ml，肾脏中为1000ng/ml，牛奶中则为200ng/ml。安普霉素只规定在猪的脂肪、肌肉中最高残留限量为0.1μg/kg。

目前国内外关于氨基糖苷等残留的检测方法主要有微生物法、仪器分析和免疫分析三种。微生物法是是目前公认而又广为应用的测定抗生素的方法，也是目前我国药典中引用的标准方法。这种方法虽然原理简单，操作方便，但测定所需的时间太长，灵敏度不高。理化检测法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，而免疫分析技术因其具有快速、方便、廉价等优点，成为新的发展趋势。

目前虽然有氯霉素和安普霉素的免疫分析技术报道，但均局限于单一的分析技术和手段，在面临多残留分析需求的背景下，建立能同时检测两种或者两类目标化合物的免疫分析技术就显得尤为迫切，而制备优质的双特异性单克隆抗体是建立免疫多残留分析技术的新的手段和方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法的技术方案。

所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。

所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成氯霉素和安普霉素的半抗原和人工抗原；

2）利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株；

3）利用安普霉素人工抗原制备分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株；

4）抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗安普霉素的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体。

所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：以琥珀酸氯霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，获得HGPRT酶或者TK酶缺陷的分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株。

所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：以安普霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞，然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，获得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株。

本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了ELISA分析方法，为氯霉素和安普霉素的快速检测提供技术基础。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

1. 免疫原的制备

1.1     氯霉素半抗原、人工抗原和包被抗原的的制备

1.1.1  琥珀酸氯霉素的合成  

称取氯霉素2.0 g和丁二酸酐0.75 g，置于100 mL 三口烧瓶中，回流冷凝管接氯化钙干燥管或抽真空充氮气保持反应过程无水无氧。注入15-30 mL 经无水无氧处理的吡啶，搅拌溶解后60-90 ℃反应2-12 h，待反应液(深玫瑰红色)自然冷却至室温后，加入50 mL 水，用6 mol/L盐酸调节混合液pH值为5，用乙酸乙酯30 mL提取3 次，用1 mol/L碳酸氢钠水溶液3 ×25 mL 提取有机相，收集水相，用乙醚3 ×15 mL，洗涤水相，弃去乙醚层，再以6 N 盐酸调节水相pH值约为5， 以乙酸乙酯3 ×30 mL 提取水相，收集乙酸乙酯层，以少量水洗涤乙酸乙酯,经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得少量红色粘稠液体，将其冷冻干燥，用体积分数95％乙醇将固体重结晶，晶体真空干燥后得到产物即为琥珀氯霉素。

1.1.2 免疫原的合成与纯化

将80 μmol 氯霉素半抗原溶解在1 mL DMF 中，然后加入等当量的DCC 和NHS，让其在室温下搅拌反应过夜，反应液经4000 r/ min 离心10 min后，吸取上清液500 μL缓慢滴加到6 mL溶于0.01 mol/L，pH9.6 碳酸盐缓冲溶液的20 mg/mL牛血清蛋白(BSA) 溶液中，磁力搅拌反应6-10 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2-4次，然后用0.01 mol/L，pH7.4 的PBS透析3 d，取出分装，于- 20 ℃保存。

1.1.3 包被抗原的合成

取氯霉素半抗原80 μmol 用1 mL DMF 溶解，然后加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下搅拌反应1 h，取反应液400 μL 缓慢加入到6 mL pH 9.0，0.2 mol/L的碳酸盐缓冲溶液溶解的20 mg/ mL的OVA 溶液中，室温下搅拌反应2 h 后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2 次，然后用PBS透析3d后，取出分装，于- 20 ℃保存。

1.2 安普霉素人工抗原的制备

1.2.1 安普霉素免疫原的制备与纯化

取145 mg安普霉素溶于5 mL 0.01 M PBS，25 mg BSA溶于2 mL PBS，885 mg EDC溶于l mL PBS，将安普霉素溶液缓慢加入蛋白溶液中，再缓慢加入0.8mL EDC溶液(上述反应于磁力搅拌器上进行)，室温反应2-4 h，再缓慢加入0.2 mL EDC溶液，室温反应18-24 h。反应结束后，以4000 rpm离心10 min，上清液装入透析袋，用0.0l MPBS(pH 7.4) 4 ℃搅拌透析72 h后，- 20 ℃保存备用。

1.2.2 安普霉素包被抗原的制备与纯化  

取25 mg安普霉素和25 mg OVA，溶于10 mL 0.01 M PBS中，搅拌溶解，逐滴加入1.5 mL 1％戊二醛；4 ℃下避光、搅拌反应2 h，再缓慢加入100 mg硼氢化钠，搅拌反应l h。反应结束后，以4000 rpm离心分离10 min，上清液装入透析袋，用0.01 M PBS(pH 7.4) 4 ℃搅拌透析72 h后，- 20 ℃保存备用。

2. 免疫动物

实验选用6-10周龄的BALB/C小鼠，20-22 g，免疫5-10只小鼠。取6－8周龄体重18-20 g BALB/C 雌性小鼠，将制备的CAP-HS-BSA交联物和Apra-BSA交联物分别与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经腹部皮下多点注射，剂量为50-100 μg/只，以后每隔3周，取抗原（与一免等剂量）和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次，末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3 d后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-12：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma）作为融合剂，在37 ℃下水浴下加入0.5-0.7 ml，使其融合2 min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37 ℃，5 % CO2的细胞培养器皿中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆细胞在细胞培养板中培养5 d后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。氯霉素筛选共获20多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中12个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选6个较理想的阳性孔，这6个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌抗氯霉素的特异性抗体的杂交瘤细胞6D9，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。安普霉素筛选共获30多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中15个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选5个较理想的阳性孔，这5个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌抗安普霉素的特异性抗体的杂交瘤细胞2H10，经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体的特异性检测

阳性孔的特异性检测采用间接ELISA方法，用包被液稀释成1－10 ug/mL的包被抗原(CAP-HS-OVA、Apra-OVA)100 uL/孔包被ELISA板，37 ℃ 2 h，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min；加入阳性孔培养上清100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。

6. 四体杂交瘤细胞的制备

对6D9细胞株用含8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)浓度为100-300 μg/mL的RPMI1640培养基培养3-6周，使6D9细胞HGPRT酶缺失；对2H10细胞株采用含5-溴-2-脱氧尿苷(5-BrdU)浓度为50-300 μg/mL的RPMI1640培养基中培养4-8周，使2H10细胞胸苷激酶(TK)缺失；将上述两种酶缺陷型细胞进行再融合制备杂交-杂交瘤细胞，以氯霉素包被抗原和安普霉素包被抗原进行阳性和灵敏度筛选，以对氯霉素和安普霉素具有较好的特异性和灵敏度为筛选依据，最终筛选获得2株四体杂交瘤细胞7B2和9E6，经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

7. 双特异性单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁶个7B2杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000 rpm离心3 min，收集上清液，即为双特异性单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加4倍体积0.06 M pH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30 μl/mL腹水），室温下边加边搅拌，4 ℃澄清 1 h，12000 rpm离心20 min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4 ℃放置2 h，3000 rpm离心20 min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4 ℃流动透析24 h后即获纯化的腹水抗体，-70 ℃保存。

8.双特异性单克隆抗体ELISA分析方法的建立

8.1氯霉素ELISA分析方法的建立

采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下：

1. 确定工作浓度。采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为0.125-8 μg/mL于ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min，加入浓度梯度为0.5-16 ng/mL酶标半抗原CAP-HS-HRP，100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，OD值在1.0左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min；加入梯度稀释的氯霉素标准溶液50 μl，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μl，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：抑制率（%）＝                                                

×100%

式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。由上述公式计算得氯霉素各浓度的抑制率，作图。以抑制浓度最低的组合为最佳工作浓度，从数据分析可知，氯霉素最佳工作浓度(Ab:CAP-HS-HRP)为3.2 ug/mL和4 ng/mL。

2. 筛选最佳反应缓冲体系。在工作浓度基础上，分别对有机溶剂、离子强度和pH值等参数进行优化筛选，筛选以ELISA检测灵敏度最佳为最优条件的确定依据。分别选用离子强度为0.01 M、0.02 M、0.05 M、0.1 M、0.2 M五个梯度；pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.4和8.0为筛选条件进行筛选，根据研究数据，氯霉素反应体系最佳离子强度为0.02 M，pH值为7.4作为最佳反应体系，并在此优化反应体系的基础上，得出氯霉素的抑制中浓度（IC₅₀）为1.28 ng/mL，检测灵敏度（IC₂₀）为0.16 ng/mL，抑制率与氯霉素浓度的对数值呈显著的线性关系，线性相关系数达到0.99以上，与甲砜霉素、青霉素、链霉素、红霉素、新霉素和四环素等的交叉反应率均低于1%。

8.2安普霉素ELISA分析方法的建立

采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下：

1.确定工作浓度。采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为0.125-8 ug/mL于ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-6 0min，加入浓度梯度为0.125-4 ng/mL 酶标半抗原CHBu-HRP，100 ul/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，OD值在1.0左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min;加入梯度稀释的氯霉素标准溶液50 μl，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μl，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：抑制率（%）＝

×100%

式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。由上述公式计算得安普霉素各浓度的抑制率，作图。以抑制浓度最低的组合为最佳工作浓度，从数据分析可知，安普霉素最佳工作浓度(Ab:Apra-HRP)为1.0 ug/mL和0.25 ng/mL。

2. 筛选最佳反应缓冲体系。在工作浓度基础上，分别对离子强度和pH值等参数进行优化筛选，筛选以ELISA检测灵敏度最佳为最优条件的确定依据。分别选用离子强度为0.01 M、0.02 M、0.05 M、0.1 M、0.2 M五个梯度；pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.4和8.0为筛选条件进行筛选，根据研究数据，安普霉素反应体系最佳有离子强度为0.02 M，pH值为7.0作为最佳反应体系，并在此优化反应体系的基础上，得出安普霉素的抑制中浓度（IC₅₀）为0.84 ng/mL，检测灵敏度（IC₂₀）为0.06 ng/mL，抑制率与氯霉素浓度的对数值呈显著的线性关系，线性相关系数达到0.99以上，与庆大霉素、青霉素、链霉素、卡那霉素、新霉素和四环素等的交叉反应率均低于1%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。

2.抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成氯霉素和安普霉素的半抗原和人工抗原；

2）利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株；

3）利用安普霉素人工抗原制备分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株；

4）抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗安普霉素的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：以琥珀酸氯霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，获得HGPRT酶或者TK酶缺陷的分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株。

4.如权利要求2所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：以安普霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞，然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，获得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株。