CN101307303B - 检测盐酸克伦特罗残留的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了能够分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞系，以及用该杂交瘤细胞系所制备的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。本发明还公开了一种检测盐酸克伦特罗残留的试剂盒，该试剂盒包括：用CL-BSA预包被的发光黑色检测板，盐酸克伦特罗标准液，酶标抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，化学发光液，洗涤液。本发明盐酸克伦特罗残留的试剂盒，其特异性、灵敏度和稳定性较现有的检测试剂盒都有质的提高，盐酸克伦特罗(CLB)残留最低检出值为0.02ng/L，完全满足CLB残留量的检测要求。

Description

检测盐酸克伦特罗残留的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种检测猪肉中克伦特罗的试剂盒及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

盐酸克伦特罗(clonbuterol，CLB)，俗称“猪肉精”，对人的肝、肾及神经有毒副作用。目前，检测CLB的方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和ELISA方法。曾有人研究过采用固相萃取GC-MS检测肉类样品中盐酸克伦特罗的残留量和采用HPLC手性固定相分析克伦特罗对映体。HPLC-MS和GC-MS两种方法所需的设备昂贵、操作复杂，通常作为大规模筛选样品。但目前常用的显色ELISA的检出限一般在0.1ug/L左右，而CLB的允许的最大残留量也在0.1ug/L，因此，显色ELISA的方法难以达到检测要求。目前，国内外尚没有开发生产猪肉精定量化学发光检测试剂盒，所存在的主要技术难点是化学发光新技术的掌握和应用，如何提高灵敏度和特异性等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够高灵敏、特异的检出猪肉中盐酸克伦特罗残留的试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

首先，本发明提供了一种能够分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系的微生物保藏号：CGMCC NO.2017；保藏时间是：2007年4月25日；分类命名为：Bal b/c杂交瘤细胞；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

用上述的杂交瘤细胞系注射2-4月龄的雌性裸鼠或同系小鼠(优选为BALB/c小鼠)腹腔，收集腹水，离心，收集上清液，纯化、鉴定即得抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体。

用上述所制备的抗盐酸克伦特罗的单克隆抗体用酶标记后，与其它必要试剂相组合，即得到可检测动物肉中盐酸克伦特罗残留的试剂盒，该试剂盒主要包括以下组分：

用CL-BSA预包被的发光黑色检测板；盐酸克伦特罗标准液；

酶标抗盐酸克伦特罗抗体；化学发光液；洗涤液。

其中，所述的CL-BSA预包被发光黑色检测板可按本领域常规方法制备，作为参考，可参照以下方法制备得到：将CL-BSA稀释到200ug/L，将发光黑色检测板的每孔加100ul200ug/L的CL-BSA稀释液，4℃过夜；用pH7.2的10mmPBS包被液加0.02％TWeen-20洗一遍；10mmPBS包被液(pH7.2)+0.5％BSA封闭，37℃2小时；再用水和保护剂的混合液吸干封闭液；37℃干燥，即得。

所述的盐酸克伦特罗标准液为10个不同浓度梯度的溶液，其浓度分别为0.0ng/ml，0.01ng/ml，0.02ng/ml，0.04ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，分别分装为10瓶，每瓶6ml；盐酸克伦特罗可通过商业途径购买得到，例如购自Sigma等；

上述的试剂盒中，用以标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP，纯度为A430/A275>3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶(AKP)，或大肠干菌β—D—半乳糖苷酶，以HRP最为常用。

所述的化学发光液可以从商业途径购买得到，例如可以购自Sigma公司。

所述的洗涤液可以是ELISA试剂盒中常用的洗涤液，例如可以是100mM PBST洗涤液。

本发明试剂盒的使用方法如下：

1、向CL-BSA预包被的发光黑色检测板的孔中加入待检测样品(猪的尿液)和盐酸克伦特罗标准液(稀释一系列克伦特罗标准液0.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml)50ul，同时做空白对照；

2、加入酶标标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体50ul，37℃湿盒中孵育30分钟；

3、用洗涤液洗涤每孔3次，加入化学发光液；

4、化学发光检测仪检测吸光度。

本发明盐酸克伦特罗残留的试剂盒，其特异性、灵敏度和稳定性较现有的检测试剂盒都有质的提高，其最低检出值为0.02ng/L，可完全满足盐酸克伦特罗残留量的检测要求。

附图说明

图1敏感度和线性范围的检测结果。

图2稳定性的检测结果。

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

具体实施方式

一、分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞系和酶标单克隆抗体的制备

1.完全抗原体的制备

1.1试验材料

1.1.1盐酸克伦特罗(购自Sigma)

1.1.2牛血清白蛋白(BSA)

1.1.3冷盐酸

1.1.4NaNO₃

1.2制备过程

取1.0mg/ml的盐酸克伦特罗的溶液660ul，用冷盐酸调至pH2.5，加入NaNO₃，使盐酸克伦特罗偶氮化，将偶氮化的盐酸克伦特罗加入BSA、OVA溶液中，置4℃冰箱过夜，次日取透析，以上操作都在4℃避光阴暗的环境下进行，透析结束后，测定浓度，稀释至1.0mg/ml分装，置一20℃冻存备用，其中CLB-BSA包被抗原，CLB-OVA为免疫抗原用。克伦特罗加入亚硝酸钠后发生偶氮化反应，溶液颜色变黄，与载体蛋白反应经后透析，黄色不褪去说明偶氮化克伦特明偶联获得成功

2、免疫方案

2.1试剂与仪器

2.1.170％乙醇

2.1.2生理盐水(90g/L NaCl)

2.1.3注射器(小鼠1ml，家兔2-5ml)

2.1.4针头(小鼠：26-G)

2.1.5聚丙烯离心管

2.1.6束缚固定装置

2.2操作步骤

免疫抗原的处理：将CLB-OVA抗原与福氏佐剂等量混合，混合物通过不同注射方法来免疫动物。所有的给药方法都使用26-G针头。

2.2.1第一次对每一小鼠注射500μl抗原与完全福氏佐剂1：1的混和液(ip)。共注6支BALB/c雌性小鼠(抗体的实际需用量见表2)；

2.2.2第14天后，再次注射，但改用抗原与不完全福氏佐剂混合液；

2.2.3第24天，从免疫小鼠尾静脉取血，血清经PBS1：5稀释，以同样稀释的正常血清为对照，用点杂交(Dot blot)法进行测定；

2.2.4第35天，所有小鼠均经腹腔再注射抗原与不完全福氏佐剂混合液；

2.2.5第45天，取尾静脉血，用点杂交法再次检测。所有血清样品均通过与在体同位素标记的抗原进行免疫沉淀法检测；

2.2.6第56天，对免疫应答最好的小鼠再静脉注射100μl及腹腔注视100μl不完全福氏佐剂抗原混合液，而对所有其余小鼠仅腹腔注射不完全福氏佐剂抗原混合液；

3.单克隆抗体的制备

3.1有关实验动物所需条件

1.免疫用注视器和针头

2.通风橱

3.湿度维持5-8％、37℃的CO₂孵箱

4.倒置显微镜(具有×10及×20物镜，×10-15目镜)用于细胞记数的光学显微镜

5.红细胞记数器

6.37℃水浴箱

7.洗细胞用低温离心机

8.一次性塑料培养板(24孔和96孔)及培养瓶15及50ml消毒的聚丙烯锥形管消毒1，2，5及10ml的吸管及吸液器低温冰箱(-80℃)及液氮罐。

3.2试剂和设备

1.生长培养基RPMI 1640或DMEM+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L丙酮酸钠+1mmol/L非必需氨基酸+10％FCS(要测试可支持克隆生长)，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml

2.选择培养基生长培养基+1×HAT*(购自GIBCO)

3.50×HAT溶液或粉剂(购自GIBCO)

4.4g/L台酚蓝PBS液

5.*HAT培养基中有三种特殊成分：次黄嘌呤(Hypoxanthine，H)；氨基喋呤(aminopterin，A)；胸腺嘧啶(Thymidine，T)，HAT即代表三个成分的字头

6.培养基A：RPMI1640+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L丙酮酸钠+1mmol/L非必需氨基酸+青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml(有的实验室也加入10％NCTC109培养基)

7.培养基B：培养基A+3％FCS(见后说明)

8.培养基C：培养基A+1×HAT+20％FCS(500ml)

9.50×HAT液或粉剂

10.PEG1500(有商品，可即用)

11.1mol/L硫酸铜液

12.17mol/L NH₄Cl水溶液(消毒，用于红细胞溶解)

13.培养皿(直径100或60mm)

14.细胞粗滤器(筛孔：40μm)

3.3.操作步骤

3.3.1脾细胞及骨髓瘤细胞制备

第59天由免疫应答最好的小鼠取脾细胞进行细胞融合

3.3.1.1脾细胞制备

1.分离取出脾脏，置于含7ml培养基B的培养皿中(在动物房进行)，将培养皿移入垂直气流的通风橱中；

2.将脾脏移入另一含7ml培养基A的培养皿中，用镊子撕开脾脏，使大多数脾细胞释出；

3.用吸管吹打细胞团块，将混合液移入50ml聚丙乙烯管中，4℃沉降5min；

4.将细胞悬液移入另一50ml聚丙乙烯管，200×g离心12min，弃上清；

5.用冰冷的0.17mol/L NH4Cl水溶液(2-3ml/每个脾脏)悬起沉淀，在室温下培养5-10min，以溶解红细胞，然后缓慢加入45ml培养基A；

6.200×g离心7min，弃上清；

7.沉淀再悬入10ml培养基A中。

3.3.1.2骨髓瘤细胞的制备

1.在对数生长期收获107-108的骨髓瘤细胞；

2.200×g离心7min，弃上清；

3.轻轻震动试管以松动沉淀，将细胞悬于20ml培养基A中；

4.200×g离心7min，弃上清；

5.细胞悬于10ml培养基A中，取适量进行细胞计数；

6.200×g离心7min，弃上清；

7.沉淀再悬于10ml培养基A中。

3.3.2细胞融合

1.以2：1混合脾细胞与骨髓瘤细胞；

2.加入培养基A到25ml；

3.在室温下，200×g离心7min，弃上清；

4.轻轻震动试管使松动沉淀，后置入37℃水浴；

5.用1000μl的加样器，缓慢(超过1min)逐滴加入700μl经37℃预温的PEG1500，并用吸头搅拌；

6.经过1min后，缓慢(超过3min)加入5ml培养基A；

7.再过1min，加入7ml37℃预温的培养基A；

8.隔1min，再加入7ml37℃预温的培养基A(以达逐步稀释)；

9.室温下，200×g离心10min，弃上清；

10.再将沉淀小心地悬浮于培养基C，使细胞终浓度为1×10⁶脾细胞/ml；

11.在已加100μl培养基C/孔的2-3块96孔板中，再加入100μl/孔细胞悬液；

12.置入含5-8％CO₂的37℃培养箱中；

13.一周后，每孔吸出100μl上清，再加入100μl培养基C，继续每周换液1-2次；

3.3.3阳性杂交瘤克隆的筛选及通过有限性稀释法再克隆

3.3.3.1试剂与设备

一般设备见前第一部分；

1.培养基A：ROMI1640+20％FCS+2mmol/L谷氨酰胺+1mmol/L非必需氨基酸+100U/ml丙酮酸钠+100μg/ml链霉素

2.培养基B：培养基A+1×HAT

3.培养基C：培养基A+1×HT(有商品供应)

4.50×HAT溶液或粉剂(有商品供应)

5.50×HT溶液或粉剂(有商品供应)

6.4g/L台盼蓝PBS液

7.1mol/L硫酸铜液

8.选择的筛选实验所需的试剂和仪器设备

9.为收集上清需用的96孔组织培养板

10.24孔组织培养板

11.如果需要克隆和亚克隆，可准备3个含有饲养细胞(巨噬细胞，见前)的96孔组织培养板

3.3.3.2操作步骤

3.3.3.2.1继续细胞融合实验

1.细胞融合后1周，在倒置显微镜下确定含有生长中杂交瘤的孔，用细头标记笔做好记号；

2.每孔吸出一半体积并加入2滴培养基B；

3.细胞融合后第12-14天，当孔中细胞长满，培养基变成黄色时，从每孔吸出100μl，注意不要影响孔底的杂交瘤细胞。将上清移入包被CI-BSA的96孔板，检测有无分泌抗体存在；如果有多个杂交瘤生长的孔，对各孔有无抗体生成及是否污染都进行测定，这样能更快得以判断以确保安全；

4.各孔加入2滴培养基C；

5.将阳性细胞移入24孔板，并加入1ml培养基A；

6.一般细胞在48小时后长满，每孔取出100μl或更多上清，进行第二次筛选试验；

7.每孔加入3-4滴培养基A；

8.如果阳性孔已确定，立即进行第一次克隆；

9.尽快将其余的阳性细胞孔进行扩增并将其冻存(方法见前---)。这可避免在克隆过程中遇困难，而失去需要的杂交瘤细胞。

3.3.3.2.2用限定性稀释法进行克隆

1.在进行克隆的前一天，准备3个含有100μl饲养细胞的96孔板。如不用饲养细胞(参照后述实验要点及说明)，则在加入种植细胞前每孔先加100μl培养基A；

2.将细胞再悬浮，用血细胞计数器计数，并用苔酚蓝法计算细胞死亡率；

3.加入培养基A制备含200个细胞/ml的细胞悬液15ml；

4.用此上清进行一定倍比稀释(见图2-3-2)。即三培养块板，各板以六条(列)为单位，逐次进行1：1稀释，在第一板第一单位(前六列)每孔加入含200个细胞/ml的培养液100μl，其它各单位每孔均加入含不同稀释度细胞的培养液100μl；

5.在含5-8％CO²的37℃湿性孵箱中培养10-12天，注意观察；

6.大约第五天开始在倒置显微镜镜下可见单个克隆(1克隆/孔)；

7.大约7-10天可见克隆长满；

8.如下测定20-40孔：

(1)稀释度为1，2，及3的单位测定2-10个孔；

(2)稀释度为4的单位测定10-15个孔；

(3)稀释度为5的单位测定5-10个孔；

(4)稀释度为6的单位测定5孔；

9、重复克隆操作，直至每孔均测出阳性。

3.3.4细胞的冻存和复苏

1.阳性杂交瘤细胞同时双分传代，并尽早液氮冻存(将所得到的阳性杂交瘤细胞系提交保藏，微生物保藏号是：CGMCC NO.2017；保藏时间是：2007年4月25日；分类命名为：Bal b/c杂交瘤细胞)，每种细胞株至少冻存5-10支管。

2.定期(如一年)进行复苏检查其再生情况，传代后再冻存。

3.冻存细胞保护剂可参照第一章细胞培养的冻存和复苏方法部分。

3.4腹水法规模的抗体制备

3.4.1试剂及设备

1.2-4月龄的雌性裸鼠或同系小鼠(常用BALB/c)

2.PBS

3.降植烷(Prisane，2，6，10，14-tetramethylpentadecane)

4.1ml注射器

5.20-22G注射用针头

6.18G针头用于抽取腹水

3.4.2在体内产生腹水：

1.动物按正规要求饲养；

2.在细胞注入前1-2周，通过腹腔注射0.5ml降植烷免疫小鼠(裸鼠或具有与杂交瘤同样H-2型单原型B细胞的小鼠)；

3.杂交瘤细胞在其培养基中生长(用25ml或75m的培养瓶)；

4.在细胞的对数生长期收获细胞，通过苔酚蓝排除实验检测细胞的成活率，需达>90％。

5.1000×g在20℃离心10min。用PBS洗两次，并调节到细胞数为2-10×107/ml；

6.腹腔注射0.5ml PBS(含1-5×10⁶细胞)/小鼠，1-2周后发展成癌性腹水；

7.用18号针头插入腹腔、用15ml试管接取腹水，如有凝块形成，可用消毒牙签挑出，弃之；

8.在37℃培养1小时，置4℃过夜；

9.腹水3000×g在4℃离心10min，除去细胞及碎片，收集澄清的上清液(弃除油脂)，

10.每3-4天一次，此小鼠在死前可放腹水2-3次；

11.加入0.05％叠氮钠，分装小管，为长期保存可迅速冻存于-70℃，在应用中可置4℃保存。

3.5单克隆抗体纯化

3.5.1初纯硫酸铵沉淀法

3.5.1.1试剂及仪器

·组织培养上清液、血清样品或腹水等

·硫酸铵(NH₄)SO4

·饱和硫酸铵溶液(SAS)

·蒸馏水

·PBS(含0.2g/L叠氮钠)

·透析袋

·超速离心机

·pH计

·磁力搅拌器

3.5.1.2实验步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33％—50％。

1.配制饱和硫酸铵溶液(SAS)

将767g(NH4)₂SO₄边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100％的硫酸铵溶液(4.1mol/L，25°C)；

2.沉淀

1)、样品(如腹水)20000×g离心30min，除去细胞碎片；

2)、保留上清液并测量体积；

3)、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1(v/v)；

4)、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜(4℃)，使蛋白质充分沉淀。

3、透析

1)、蛋白质溶液10000×g离心30min(4℃)。弃上清保留沉淀；

2)、将沉淀溶于少量(10-20ml)PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L叠氮钠透析24-48小时(4℃)，每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

3)、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

3.5.2精纯亲和层析纯化法(蛋白A或蛋白G法)

3.5.2.1试剂及仪器

含IgG的样品

PBS缓冲液

装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应)

透析袋(MWCO10,000)

结合缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl pH7.5+0.15mol/L NaCl

分步收集器(可按需要选用)

洗脱缓冲液：0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCl

中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl pH8.0

蠕动泵(可按需要选用)

UV监测器

pH计

3.5.2.2操作步骤

*样品(可为血清、腹水、含有IgG的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液)。

1.样品在4℃，对结合缓冲液透析过夜，或将其与至少1：1稀释的结合缓冲液混合；

2.如果条件充许，将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连；

3.至少用10ml结合缓冲液，以1ml/min速度，洗涤柱中的2ml亲和层析介质；

4.上样；

5.一旦样品进入凝胶，用结合缓冲液洗柱(至少10个柱体积)，直至A280nm小于0.03；

6.用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG，分布收集2ml/管；

7.收集过程中，每管立即加入0.1ml中和缓冲液，以中和洗脱所得的IgG液。

8.含IgG的各管对PBS透析，其后根据抗体的稳定性，加入防腐剂(0.020g/L叠氮钠)，置4℃或冷冻保存。

4.抗体的酶标记

4.1试剂及仪器

1.亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体(5mg/ml PBS液或0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8)

2.用以标记的酶(EIA级，有商品供应)：辣根过氧化物酶(HRP，纯度为A430/A275>3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶(AKP)，或大肠干菌β—D—半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。

3.25％戊二醛液(电镜级)

4.0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)

5.PBS

6.2mol/L甘氨酸液

7.蒸溜甘油

8.透析袋(分子量6000-8000)

9.电磁搅拌器和搅拌棒

4.2操作步骤

4.2.1抗体与过氧化物酶偶联

1.将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)混合；

2.在4℃对0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)透析过夜；

3.用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)稀释戊二醛至1％；

4.向透析混合液中加入50μl稀释过的戊二醛，在室温下轻轻搅拌3小时；

5.加入2mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基

6.混合液在4℃对PBS透析过夜；

7.10000×g4℃离心30分；

8.将上清移入另一管中，按体积1：1加入甘油，使终浓度达50％；

9.置-20℃保存。

4.2.2酶标物的纯化

二、试剂盒制备和检测方法的优化

1.试剂盒的制备

1.1材料和设备

盐酸克伦特罗，Sigma产品

发光黑色检测板(购自Seebio)

化学发光检测仪(美国Maxwell)

10mmPBS包被液pH7.2

PBST洗涤液100MM，pH7.4，0.02％TWeen-20

化学发光液(Sigma)

1.2试剂盒制备

1.2.1CLB-BSA包被发光黑色检测板的制备

1.2.1.1CLB-BSA包被发光黑色检测板

将CLB-BSA稀释到浓度200ug/L，每孔加100ul CLB-BSA稀释液，4℃过夜；

1.2.1.2洗涤

10mmPBS包被液PH7.2+0.02％TWeen-20洗一遍；

1.2.1.3封闭

10mmPBS包被液PH7.2+0.5％BSA封闭，37℃，2小时；

1.2.1.4保护

加入5％蔗糖溶液，吸干液体；

1.2.1.537℃干燥

1.2.1.6内包装

1.2.2酶标抗盐酸克伦特罗单克隆抗体分装

按4000倍稀释，稀释液为10mMPBS包被液PH7.2+20％小牛血清+防腐剂+稳定剂

1.2.3化学发光液分装

每瓶6ML

1.2.4盐酸克伦特罗标准液

0.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml分装，每瓶6ML。

3.本发明试剂盒的制备或检测条件的优化

3.1最佳竞争时间的确定

竞争时间分别10、20、30、40、50、60，测定光强度。CLB标准溶液和一抗添加到酶标板后，测定不同竞争时间(10～60min)下的标准曲线。ED50(medianeffect dose)和最大光强度(LUmax)等参数值随竞争时间的变化。可以看到，反应时间在10～30min内，LUmax随时间延长而增大，而ED50随时间延长而减小；反应时间超过30min，LUmax变化趋于平稳，而ED50却增加；因此，本系统的最佳竞争反应时间为30min，此时，ED50最小，LUmax/ED50最大。

3.2最佳TWeen-20最优浓度的确定。

0.001％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％分别测定光强度。Tween220浓度小于0.05％时，LUmax和ED50均减小；大于0.05％时，LUmax减小，而ED50变化不大；等于0.05％时，ED50较小，LUmax/ED50最大，另外，此时测定非特异吸附也比较小，因此选择0.05％为Tween220的最优浓度

3.3最佳PBS离子强度的确定

10、50、100、200、500、1000MM分别确定光强度PBS的离子强度对ic2CLEIA的影响结果。可以看到，PBS浓度对CLB的ic2CLEIA的影响明显。LUmax和ED50均随着PBS溶液的离子强度增加而减小。PBS浓度为200mmol/L时，LUmax/ED50最大，所以选择0.2mol/L为PBS的最佳浓度。

3.4最佳PBS的pH值得确定

pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5分别测定光强度，由于pH可以影响CLB标准溶液和其它试剂的离子化，因此，pH对非共价结合的抗原抗体反应和ELA测定灵敏度有影响。图4为不同pH对i c2CLE IA影响的曲线。从图中可以看到，pH小于8.5时，随pH增大，ED50下降很快(从3.1下降到1.25)，LUmax有下降趋势，但下减幅度不是很大。pH小于6.0时，反应被完全抑制。pH等于8.5时，LUmax为1.02，同时LUmax/ED50最大，8.5为PBS和CLB标准溶液的最佳pH。

三、试剂盒的检测方法及检定

1.试剂盒的检测步骤

瘦肉精克伦特罗化学发光检测试剂盒

【使用目的】检测标本中的瘦肉精克伦特罗

【试验原理】本试剂盒采用采用偶联到BSA包被板化学发光板，并配以辣根过氧化物酶标记瘦肉精克伦特罗，采用竞争法，与同样处理的瘦肉精克伦特罗标准比较，通过化学发光仪测定光强度，计算标本中瘦肉精克伦特罗的含量

【主要组成】

CLB-BSA预包被板1块(8×12)；

克伦特罗标准液0.00，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml分装，每瓶6ml。

酶标抗体6ml

化学发光液6ml

10x浓缩洗涤液50ml

【适用仪器】

1化学发光仪428nm波长。

2微孔板清洗器(也可手工洗板)。

【样本要求】新鲜。如果样本不立即使用，置4℃保存7日内应用。

【检测步骤】

(1)向CLB-BSA预包被的发光黑色检测板的孔中加入待检测样品(猪的尿液)和盐酸克伦特罗标准液(稀释一系列克伦特罗标准液0.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml)50ul，同时做空白对照；

(2)、加入酶标标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体50ul，37℃湿盒中孵育30分钟；

(3)、用洗涤液洗涤每孔3次，加入化学发光液；

(4)、化学发光检测仪检测吸光度。

(5)、采取方阵滴定，见表1。

CLB-BSA包被：由A-D和由1-4包被浓度20ug/L；由A-D和由58包被浓度200ug/L；由E-H和由1-4包被浓度400ug/L，由E-H和由5-8包被浓度800ug/L，

克伦特罗1-4和5-8分别浓度0.01ng/L-0.08ng/L；

酶标抗体的稀释浓度A-D和E-H分别为1：500、1000、2000、4000；

表1    方阵滴定

 

		1	2	3	4	5	6	7	8
											ng/L	0.01	0.02	0.04	0.08	0.01	0.02	0.04	0.08
500	A	2.19	1.91	1.42	1.04	2.4	2.15	1.81	1.41
										1000	B	1.89	1.54	1.24	0.87	2.15	1.90	1.45	1.14
2000	C	1.57	1.02	0.91	0.53	1.92	1.71	1.34	0.98
										4000	D	1.20	0.84	0.62	0.42	1.57	1.40	0.84	0.50
500	E	2.81	2.34	2.01	1.79	3.05	2.78	2.34	1.84
										1000	F	2.58	2.01	1.73	1.43	2.74	2.43	1.89	1.46
2000	G	2.13	1.68	1.42	1.12	2.30	1.98	1.43	1.00
										4000	H	1.79	1.17	1.02	0.72	1.99	1.56	1.00	0.81

(6)数据处理

采用四参数方程拟合标准曲线

公式：Y＝(a—d)/(1+(x/c)^b]+d

Y各标本拟合的吸光度

A为0标准时的吸光度

D为空白对照的吸光度

X各标准的浓度

c ED₅₀的浓度

b为ED₅₀的斜率

【注意事项】

1、试剂盒2～8℃保存，有效期内使用。

2、严格按说明书操作，反应温度和时间必须严格控制，不同批号试剂请勿混用。

3、请将拆封后未用完的包被板放人塑料袋内封紧保存。

【包装、规格】盒装，96人份/盒

【贮存】冷藏2～8℃

【有效期】12月

2.半成品检定

2.1包被黑色发光板的检测

取正常猪尿稀释100μg/L CLB标准储液，配成0.1ng/ml(低浓度)，2ng/ml(中浓度)和8ng/ml(高浓度)。以质量已确定的酶标抗体进行每个浓度6次重复，分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。批内批间的变异系数CV％都小于10％，说明本发光板的准确性在实验误差范围之内。而平均回收率在98～120％之间也表明本发光板的平行性和准确性较高，能够用于实际尿样的检测

2.2酶标抗体的检测

取正常猪尿稀释100μg/L CLB标准储液，配成0.1ng/ml(低浓度)，2ng/ml(中浓度)和8ng/ml(高浓度)。以质量已确定的发光板进行每个浓度6次重复，分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。批内批间的变异系数CV％都小于10％，说明酶标抗体的准确性在实验误差范围之内。而平均回收率在98～120％之间也表明ic2CLEIA的平行性和准确性较高，能够用于实际尿样的检测

2.3标准液的检测

取正常猪尿稀释100μg/L CLB标准储液，配成0.1ng/ml(低浓度)，2ng/ml(中浓度)和8ng/ml(高浓度)。以质量已确定的发光板和酶标抗体进行每个浓度6次重复，分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。批内批间的变异系数CV％都小于10％，说明自行配制的标准在实验误差范围之内。而平均回收率在98～120％之间也表明自行配制的标准的平行性和准确性较高，能够用于实际尿样的检测

2.4化学发光液的检测

四、本发明试剂盒各项性能的检测结果

1精确性和准确性的检测

取正常猪尿稀释100μg/L，将CLB标准储液配成0.1ng/ml(低浓度)，2ng/ml(中浓度)和8ng/ml(高浓度)。每个浓度6次重复，分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。批内批间的变异系数CV％都小于10％，说明本ic2CLEIA的准确性在实验误差范围之内。而平均回收率在98～120％之间也表明ic2CLE IA的平行性和准确性较高，能够用于实际尿样的检测。

2敏感度和线性范围的检测

稀释一系列克伦特罗标准液0.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml，按常规方法操作，检测发光强度分别为0.001、0.001、0.002、0.003、0.006、0.029、0.302、0.612、

1.205、1.76；

在0.02ng/L和30ng/L，成线性范围y＝0.0593x R2＝0.9997，最小检测值为0.02ng/L(图1)。

3稳定性的检测

37℃，7天检测敏感度和线性范围。

稀释一系列克伦特罗标准液0.0，0.01，0.02，0.04，0.1，0.5，5，10，20，50ng/ml，按常规方法操作，发光强度分别为0.0010.0010.0020.0030.0060.03

0.2990.6011.1881.54

在0.02ng/L和28ng/L，成线性范围y＝0.0568x，R²＝0.9977，最小检测值为0.02ng/L(图2)。

4阳性和阴性标本的符合率

将本发明试剂盒与国外知名厂家的化学电发光试剂盒分别检测98份临床样品。其中63份瘦肉精的尿(其中包括添加瘦肉精10ng/L的5份)，应用本发明化学发光试剂盒检测阳性为62份，符合率98.4％(62/63)，35份阴性尿样检测全部阴性，符合率为100％。本试剂盒检测上述样品，阳性和阴性符合率分别为98.4％和100％。统计学显示相关性好，r＝0.995。

Claims (1)

1.一种检测猪肉中盐酸克伦特罗残留的方法，包括：(1)向CL-BSA预包被的发光黑色检测板的孔中加入待检测样品和盐酸克伦特罗标准液各50ul，同时做空白对照；(2)、加入酶标标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体50ul，37℃湿盒中孵育30分钟；(3)、用洗涤液洗涤每孔3次，加入化学发光液；(4)、化学发光检测仪检测吸光度；其中，所述的用CL-BSA预包被的发光黑色检测板按照以下方法制备得到：将CL-BSA稀释到200ug/L，将发光黑色检测板的每孔加100ul 200ug/L的CL-BSA稀释液，4℃过夜；用pH7.2的10mmol/l PBS包被液加0.02％TWeen-20洗一遍；pH 7.2的10mmol/l PBS包被液加0.5％BSA封闭，37℃2小时；再用水和保护剂的混合液吸干封闭液；37℃干燥，即得；所述的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体由微生物保藏号为CGMCC NO.2017的杂交瘤细胞系所分泌；所述的盐酸克伦特罗标准液为10个不同浓度梯度的溶液，单独分装，其浓度分别为0.0ng/ml，0.01ng/ml，0.02ng/ml，0.04ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，其pH值为8.5。

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