CN104678093A - 一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，包括抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水的制备、含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水的纯化、固定化载体预处理和抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定等4个步骤，最终得固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。该制备方法的制备过程简单，成本低，易于实现规模化生产，在对含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水进行纯化的同时，实现了分散于PEG相中含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定及PEG的再利用；制得的固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体柱在免疫传感器中能快速装卸，可快速检测肉及肉制品中盐酸克伦特罗的残留量。

Description

一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法。
背景技术
盐酸克伦特罗（CL）俗名“瘦肉精”，可显著提高胴体的瘦肉率，因而被滥用于饲养业，并通过食物链在人体内富集，对人体造成多种毒副作用，甚至死亡。基于抗原抗体特异识别的免疫检测技术因其具有高度特异性、敏感性和稳定性等优点，已成为较常用的CL残留的检测方法。但这种方法存在检测时间长、需要专业人员操作等缺点，不能用于现场和快速检测。
免疫传感器是一种将固定化抗体与换能器密切配合，对特定目标分析物具有选择性和响应的分析装置。该装置既具有免疫检测技术的优点，又具有传感器操作简单、方便、快捷的特点，已成为CL快速检测领域的研究开发热点。
在免疫传感器制备过程中，固定化抗体的稳定性和活性是保证该法测定CL灵敏度与特异性的关键因素。目前对抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（以下简称CL mAb）的固定方式主要为物理吸附或化学交联法，采用物理吸附方式制备的固定化抗体在使用过程中存在不稳定、容易脱落和渗漏等技术问题，而通过化学交联方式制备的固定化抗体虽稳定，但存在活性损失严重等技术问题。为了保证固定化抗体的生物活性，固定前一般需采用色谱联用技术对含抗体的小鼠腹水进行分离纯化，整个分离过程繁琐耗时，难以实现快速、高通量分离目。这些都严重限制了以固定化抗体为敏感元件的免疫传感器在CL检测中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决固定化抗体在免疫传感器的应用中存在不稳定、容易脱落、渗漏或活性较低的技术问题，而提供一种固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法。
本发明的技术原理
双水相萃取技术是依据物质在两相间的选择性分配对进入体系的物质进行分离。具有分离时间短（一般只需30-60min）、选择性好、易于实现放大和进行连续性操作等优点。但经双水相系统提纯富集后，对分散于PEG相中抗体的进一步分离及PEG的回收是目前存在的技术难点。采用原位固定的方式将分散于PEG相中的抗体直接固定于载体上，可同时实现抗体的固定和PEG相的回收再利用，同时由PEG形成的网络结构可防止固定化抗体的渗漏，增加了固定化抗体的稳定性和活性。
本发明的技术方案
一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（CL mAb）的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）、含CL mAb腹水的制备，即通过细胞融合技术及间接酶联免疫法筛选出  稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株；然后进行扩增培养，每隔24h传代一次，使其处于对数生长期；然后将处于对数生长期的稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞注射于用石蜡初步免疫过的小鼠腹部，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水，步骤如下；
①、将25mg盐酸克伦特罗（以下简称CL）溶解于10mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中，向其中缓慢滴加0.27mol/L的亚硝酸钠溶液，直至淀粉KI试纸颜色变为深紫色后停止滴加，并继续反应45min，再加入0.1mL质量百分比浓度为5%的氨基磺酸铵水溶液终止反应，即得重氮化的CL；
将上述所得的重氮化的CL加入到5mL浓度为100mg/mL的牛血清白蛋白（以下简称BSA）水溶液中，4℃下缓慢搅拌反应24h，反应过程中以1mol/L的NaOH溶液维持pH为9.0-9.5，反应完毕后，对反应液进行透析，得到CL-BSA偶联物；
②、对6-8周龄、体重18-22g的雌性纯系Balb/C小鼠进行腹腔注射免疫；
        初次免疫采用充分乳化的等体积的CL-BSA偶联物与福氏完全佐剂，剂量为50μg/只；
        2周后加强免疫，每隔两周一次，加强免疫以福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，剂量为100μg/只；
        从第三次加强免疫开始，每次加强免疫后第三天进行眼眶采血，通过间接酶联免疫法（以下简称IELISA）测定其血清中抗体活性，直至血清OD450nm大于1.0时停止免疫；
③、停止加强免疫后，取出小鼠脾脏破碎成单个的细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞按照3-10：1的比例混匀，得到混悬液；
向所得的混悬液中加入1ml质量百分比浓度为50%的PEG4000水溶液，缓慢摇匀融合1min后，得到融合细胞，将所得的融合细胞放入96孔细胞培养板中，加入100μL/孔的HAT培养基，并控制温度为37℃，CO2和空气按体积比计算，CO2：空气为5:100的环境下培养两周，得到融合细胞；
向上述所得的融合细胞中加入100μL/孔的HT培养基进行培养24h，所得的细胞培养液离心，所得的上清液进行IELISA检测，最终筛选到能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞株，其效价大于3×106；
、取6-8周的Balb/C小鼠，按照1mL/只的量，向Balb/C小鼠腹腔注射液体石蜡，七天后腹腔接种上述处于对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞，每只注射1×106个对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水，记为含有CL mAb的腹水；
（2）、含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水的纯化
①、配制PEG6000/磷酸盐双水相体系，所述的PEG6000/磷酸盐双水相体系，按重量百分比计算，含15%的分子量为6000的PEG，15%的磷酸氢二钾（K2HPO4）/磷酸二氢钠（NaH2PO4）溶液（pH8.0）、15%的NaCl和余量的去离子水构成；
②、将步骤（1）所得的含有CL mAb的腹水置于PEG6000/磷酸盐双水相体系中，混合均匀后，于4℃静置60min；
③、将②中静置60min后的体系4000r/min离心10min，收集上相即得到纯化后的含有CL mAb的PEG相；
（3）、聚苯乙烯小球的预处理
①、将直径为3mm的聚苯乙烯小球浸入质量百分比浓度为0.01%的新洁尔灭水溶液中，4℃搅拌过夜；
②、依次采用去离子水和0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液清洗聚苯乙烯小球，然后在控制温度为35℃的烘箱中烘干，即得预处理后的聚苯乙烯小球；
（4）、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定
①、按聚苯乙烯小球：纯化后的含有CL mAb的PEG相为1粒聚苯乙烯小球：0.65 mL 纯化后的含有CL mAb的PEG相的比例，将步骤（3）中预处理后的聚苯乙烯小球完全浸没于步骤（2）中所得的纯化后的含有CL mAb的PEG相中，4℃条件下缓慢搅拌吸附90min，即得固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球，记为固定化CL mAb的微球；
②、用双蒸水对①中获得的固定化CL mAb的微球进行清洗，直到清洗液中检不出CL mAb活力为止；
③、将②中清洗后的固定化CL mAb的微球控制在4℃的条件进行脱水，脱水完成后，即完成了CL mAb的固定化，得到固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，即为固定化的CL mAb。
上述所得的固定化的CL mAb置于0.02M、pH9.6的碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液中，控制温度为4℃贮存备用。
将上述所得的固定化的CL mAb充满到干净的两端带筛网的柱式壳体中，即得固定化CL mAb的小柱，在4℃贮藏30天后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的95%，用恒流泵以1ml/min的流速连续冲刷30ml的0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液后，固定化CL mAb的小柱仍保留初始活性的98%。
本发明的有益效果
本发明的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由于采用操作条件温和的PEG6000/磷酸盐双水相体系纯化和原位固定结合的方法，因此不仅能够更高效的对小鼠腹水中的CL mAb进行分离纯化，CL mAb的回收率达85%以上。还能获得活力较高的固定化的CL mAb，其OD450nm为1.8。同时也实现了PEG相的再利用。
本发明提供的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由于形成PEG6000/磷酸盐双水相体系的相组分价格较低，且PEG6000/磷酸盐双水相体系纯化和原位固定方法操作简便，因此其制备成本低廉，可适用于规模化生产。
进一步，本发明提供的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，由于直接在含有CL mAb的PEG相中进行原位固定，因此PEG形成的网络结构增加了固定化的CL mAb的稳定性。固定化的CL mAb柱在4℃贮藏30天后，固定化的CL mAb仍保留初始活性的95%。用恒流泵以1mL/min的流速连续冲刷30mL后，固定化的CL mAb仍保留初始活性的98%。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明所用的HAT培养基、HT培养基、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（免疫球蛋白）、福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自于生工生物工程（上海）股份有限公司；
本发明中的效价定义，即在96孔板内使CL-BSA偶联物与倍比稀释的CL mAb发生特异性结合，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，根据显色反应来鉴定抗体与抗原的结合情况，并且以吸光度值大于阴性对照2.1倍时的稀释倍数作为CL mAb的效价。
实施例1
一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体在双水相体系中的原位固定方法，具体包括如下步骤：
（1）、含CL mAb腹水的制备
①、将25mg CL溶解于1mol/L的盐酸溶液中，向其中缓慢滴加0.27mol/L的亚硝酸钠溶液，直至淀粉KI试纸颜色变为深紫色后停止滴加，并继续反应45min，再加入5%氨基磺酸铵终止反应，得到重氮化的CL；
        将该重氮物滴入100mg/mL的BSA溶液中，4℃下缓慢搅拌反应24h，反应过程中以1mol/L的NaOH溶液维持pH为9.0-9.5，反应完毕后，对反应液进行透析即获得CL-BSA偶联物；
②、对6-8周龄、体重18-22g的雌性纯系Balb/C小鼠进行腹腔注射免疫，初次免疫采用充分乳化的等体积的CL-BSA偶联物与福氏完全佐剂，剂量为50μg/只；
2周后加强免疫，加强免疫时以福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，剂量为100μg/只；
从第三次免疫开始，每次免疫后第三天进行眼眶采血，通过IELISA法测定其血清中抗体活性，直至血清OD450nm大于1.0时停止免疫；
③、停止免疫后，取出小鼠脾脏破碎成单个的细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞按照3-10：1的比例混匀，向其中加入质量分数为50%的PEG4000溶液进行缓慢摇匀融合。融合1min后，将融合细胞放入96孔细胞培养板中，加入HAT培养基，并置于5%CO2、37℃培养箱培养两周；两周后再用HT培养基进行培养，并对细胞培养液的上清进行IELISA检测，最终筛选到能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞株，其效价大于3×106；
、将③中获得的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株接种于80% DMEM高糖培养基（含20% 胎牛血清），并置于37℃，5% CO2培养箱内进行扩增培养，每隔24h传代一次，使其处于对数生长期；
       取6-8周的Balb/C小鼠，按照1ml/只向其腹腔注射液体石蜡，七天后腹腔接种上述处于对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞，每只注射1×106个；
两周后采集腹水，即得含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水，记为含有CL mAb的腹水；
（2）、含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水的纯化
①、配制PEG6000/磷酸盐双水相体系，所述的PEG6000/磷酸盐双水相体系，按重量百分比计算，含15%的分子量为6000的PEG，15%的磷酸氢二钾和磷酸二氢钠磷酸盐（pH8.0）、15%的NaCl和余量的去离子水构成；
②、将步骤（1）所得的含有CL mAb的腹水置于PEG6000/磷酸盐双水相体系中，混合均匀后，于4℃静置60min；
③、将②中静置60min后的体系控制4000r/min离心10min，收集上相即得到纯化后的含有CL mAb的PEG相；
（3）、聚苯乙烯小球的预处理
①、将直径为3mm聚苯乙烯小球浸入质量百分比浓度为0.01%的新洁尔灭水溶液中，4℃搅拌过夜；
②、依次采用去离子水和0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液清洗聚苯乙烯小球，然后置于35℃烘箱中烘干，即得预处理后的聚苯乙烯小球；
（4）、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定
①、按聚苯乙烯小球：纯化后的含有CL mAb的PEG相为1粒聚苯乙烯小球：0.65 mL 纯化后的含有CL mAb的PEG相的比例，将步骤（3）中预处理后的聚苯乙烯小球完全浸没于步骤（2）中所得的纯化后的含有CL mAb的PEG相中，4℃条件下缓慢搅拌吸附90min，即得固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球，记为固定化CL mAb的微球；
②、用双蒸水对①中获得的固定化CL mAb的微球进行清洗，直到清洗液中检不出CL mAb活力为止；
③、将②中清洗后的固定化CL mAb的微球控制在4℃的条件进行脱水，脱水完成后，即完成了CL mAb的固定化，得到固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，即为固定化的CL mAb。
将固定化的CL mAb置于0.02M、pH9.6的碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液中，控制温度为4℃贮存备用。
固定化的CL mAb柱的制备，具体包括如下步骤：
（1）、将干净的两端带滤网的柱壳的上盖打开；
（2）、用吸管吸取碳酸钠和碳酸氢钠缓冲液中的固定化的CL mAb，从柱壳的上端口注入，这时，固定化的CL mAb会均匀地沉降在柱壳的底部；
重复上述步骤，直至将上述所得的固定化的CL mAb充满到干净的两端带筛网的柱式壳体中，即得固定化的CL mAb柱；
将上述所得的固定化的CL mAb柱在4℃贮藏30天后，仍保留初始活性的95%。用恒流泵以1mL/min的流速连续冲刷30mL的0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液后，仍保留初始活性的98%。
应用实施例1
将上述实施例1所得的固定化的CL mAb柱作为免疫传感器的敏感元件对CL进行检测，步骤如下：
（1）、20 μL溶于双蒸水中的CL（浓度分别为0.05 ng/mL、0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL）与20μL、双蒸水稀释40倍的辣根过氧化物酶标记的CL溶液混合，得到的混合溶液注入免疫传感器；
混合溶液流经固定化的CL mAb柱的时候，样品溶液中的CL与辣根过氧化物酶标记的CL(以下简称CL-HRP)竞争性的与固定化的CL mAb柱中的CL mAb结合；
采用0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液洗去未结合于固定化的CL mAb柱的CL；
（2）、20 μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺注射入固定化的CL mAb柱，与固定化的  CL mAb柱中CL mAb结合，进行CL-HRP进行反应，于450 nm波长处测定吸光值。
根据以上步骤，以固定化的CL mAb柱为敏感元件的免疫传感器对CL的线性检测范围为0.24-28.61 ng/mL，检测限为0.0859 ng/mL。
5个标准浓度CL（0.25 ng/ml、0.5 ng/ml、1.00 ng/ml、5 ng/ml、25 ng/mL）的重复检测的批次内变异系数均小于10%，批次间变异系数均小于15%。表明本发明采用ATPS纯化与原位固定结合的方法获得的固定化的CL mAb因其具有活力高、耐冲刷的优点，可提高CL检测的灵敏度和稳定性。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于具体包括  如下步骤：
（1）、含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水的制备
①、通过细胞融合技术及间接酶联免疫法筛选出稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
②、将①中获得的稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行扩增培养，每隔24h传代一次，使其处于对数生长期；
③、将②中处于对数生长期的稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞注射于用石蜡初步免疫过的小鼠腹部，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水；
（2）、含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水的纯化
①、配制PEG6000/磷酸盐双水相体系，所述的PEG6000/磷酸盐双水相体系，按重量百分比计算，含15%的分子量为6000的PEG，15%的pH8.0的磷酸氢二钾/磷酸二氢钠溶液、15%的NaCl和余量的去离子水构成；
②、将含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水置于PEG6000/磷酸盐双水相体系中，混合均匀后，于4℃静置60min；
③、将②中静置后的体系4000r/min离心10min，收集上相即得到纯化后的含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的PEG相；
（3）、固定化载体预处理
①、将聚苯乙烯小球浸入质量百分比浓度为0.01%的新洁尔灭水溶液中，4℃搅拌过夜；
②、依次采用去离子水和0.01mol/L、pH7.2的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾缓冲液清洗聚苯乙烯小球，然后置于35℃烘箱烘干，得到预处理后的聚苯乙烯小球；
（4）、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的原位固定
①、按聚苯乙烯小球：纯化后的含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的PEG相为1粒聚苯乙烯小球：0.65mL 纯化后的含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的PEG相的比例，将步骤（3）中预处理后的聚苯乙烯小球完全浸没于步骤（2）中所得的纯化后的含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的PEG相中，4℃条件下缓慢搅拌吸附90min，即得固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球；
②、用双蒸水对①中获得的固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球进行清洗，直到清洗液中检不出抗盐酸克伦特罗单克隆抗体活力为止；
③、将②中清洗后的固定化抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的微球控制在4℃的条件进行脱水，脱水完成后，即得固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤（1）中含抗盐酸克伦特罗单克隆抗体腹水的制备，步骤如下：
①、将25mg盐酸克伦特罗溶解于10mL的浓度为1mol/L的盐酸水溶液中，向其中缓慢滴加0.27mol/L的亚硝酸钠溶液，直至淀粉KI试纸颜色变为深紫色后停止滴加，并继续反应45min，再加入0.1mL质量百分比浓度为5%的氨基磺酸铵水溶液终止反应，即得重氮化的盐酸克伦特罗；
将上述所得的重氮化的盐酸克伦特罗特加入到5mL的浓度为100mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中，4℃下缓慢搅拌反应24h，反应过程中以1mol/L的NaOH溶液维持pH为9.0-9.5，反应完毕后，对反应液进行透析，得到盐酸克伦特-牛血清白蛋白偶联物；
②、对6-8周龄、体重18-22g的雌性纯系Balb/C小鼠进行腹腔注射免疫；
        初次免疫采用充分乳化的等体积的盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物与福氏完全佐剂，剂量为50μg/只；
        2周后加强免疫，每隔两周一次，加强免疫以福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，剂量为100μg/只；
        从第三次加强免疫开始，每次加强免疫后第三天进行眼眶采血，通过间接酶联免疫法测定其血清中抗体活性，直至血清OD450nm大于1.0时停止免疫；
③、停止加强免疫后，取出小鼠脾脏破碎成单个的细胞悬液，并与SP2/0骨髓瘤细胞按照3-10：1的比例混匀，得到混悬液；
向所得的混悬液中加入1mL质量百分比浓度为50%的PEG4000水溶液，缓慢摇匀融合1min后，得到融合细胞，将所得的融合细胞放入96孔细胞培养板中，加入100μl/孔的HAT培养基，并控制温度为37℃，CO2和空气按体积比计算，CO2：空气为5:100的环境下培养两周，得到融合细胞；
向上述所得的融合细胞中加入100μL/孔的HT培养基进行培养24h，所得的细胞培养液离心，所得的上清液进行IELISA检测，最终筛选到能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞株，其效价大于3×106；
、取6-8周的Balb/C小鼠，按照1ml/只的量，向Balb/C小鼠腹腔注射液体石蜡，七天后腹腔接种上述处于对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞，每只注射1×106个对数生长期的能稳定分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的高特异性的杂交瘤细胞，两周后采集腹水，即得到含有抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的腹水。
3.如权利要求1或2的制备方法所得的固定化的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体装  填到干净的两端带筛网的柱式壳体中作为免疫传感器的敏感元件对瘦肉精进行检测。
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