CN101936984A

CN101936984A - 一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒

Info

Publication number: CN101936984A
Application number: CN2010102441871A
Authority: CN
Inventors: 程林丽; 沈建忠; 张素霞; 王战辉; 史为民; 吴聪明; 曹兴元; 汤树生
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2030-08-03
Also published as: CN101936984B

Abstract

本发明公开了一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明所提供的检测克伦特罗的专用化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物。本发明的检测方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测克伦特罗的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。

背景技术

目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析(Chemiluminescence analysis，CLlA)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。

克伦特罗(Clenbuterol，CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂，具有松弛支气管平滑肌的作用，主要用于治疗猪、牛等的支气管哮喘等疾病。当使用量为临床治疗剂量的5-10倍时，具有促进蛋白质合成和脂肪分解的作用，可显著体高胴体瘦肉率和饲料报酬，且对猪的饲养效应尤为明显。但是，克伦特罗毒副作用较大，欧盟和中国等国家均禁止其作为饲料添加剂使用，一些不法分子不顾消费者的健康安全，仍将其利用于畜牧生产中，导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。动物组织中克伦特罗残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-联质谱法、酶联免疫法等。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测克伦特罗的专用化学发光免疫试剂盒。

本发明提供的一种检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；其结

(式I)。

所述试剂盒还包括发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；

所述试剂盒由克伦特罗特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。

所述克伦特罗特异性抗体为克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗多克隆抗体，所述克伦特罗单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的抗体。

所述标准品溶液中标准品的浓度为0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、10μg/L或100μg/L，所述标准品为克伦特罗；

所述发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢；发光液B液为鲁米诺溶液；

所述浓缩洗涤液是将0.05g叠氮化钠和100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到溶液；

所述浓缩复溶液是将0.1g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到的溶液；

所述包被缓冲液是pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液；

所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4磷酸盐溶液混合得到的溶液。

所述包被原是按照如下方法制备得到的：a、将每5mg克伦特罗半抗原加入2mL0.5M的硫酸水溶液中，得到的溶液称为A液；将每50mg的载体蛋白溶于4mL浓度为100mg/mL的碳酸钠水溶液中，得到的溶液称为B液；将每30mg亚硝酸钠溶于1mL水得到的溶液称为C液；在0℃条件下，将C液加入到A液中得到的混合物称为D液；

b、将D液逐滴加入到B液中，得到D液和B液的混合液；逐滴加入的方式为从开始加入时计起，6min后开始搅拌混合液，并使混合液的pH保持在9-10之间，滴加完毕后，继续搅拌反应4h，将得到的产物透析，得到所述包被原；

所述克伦特罗半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

所述克伦特罗半抗原为克伦特罗。

所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；

所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体。

本发明的另一个目的是提供一种检测克伦特罗的方法。

本发明提供的方法包括以下步骤：

1)样品前处理：

将每2g动物组织匀浆后，加入10mL 0.1M高氯酸水溶液，振荡混合10min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液的pH值调至11，加入2mL乙酸乙酯与异丙醇混合液混匀，3000g离心5min，取上层有机相氮气吹干，加入1mL复溶液溶解残留物，获得待测样本溶液；所述乙酸乙酯与异丙醇混合液是由体积比为8∶2的乙酸乙酯与异丙醇混合得到的；所述动物组织为猪肉或猪肝；

或：取每10mL猪尿以3000g离心5min；取200μl上清液，用复溶液稀释5倍后获得待测样本溶液；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；

2)利用上述的检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒检测步骤1)中的样本溶液。

由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的克伦特罗单克隆抗体也是本发明保护的范围。

保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE也是本发明保护的范围。该细胞株为对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE，均于2010年4月12日保藏保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO.3777。

克伦特罗的通用名称为克伦特罗，化学名称为4-氨基-α-[(叔丁胺基)甲基]-3，5-二氯苯甲醇。

本发明的实验证明，本发明制备的化学发光免疫试剂盒主要采用间接竞争CLIA方法定性或定量检测克伦特罗的残留量，该试剂盒的主要内容物采用了方便使用的工作液形式，工作液保存性及稳定性好；利用本发明试剂盒检测克伦特罗的残留量的方法，可用于检测动物组织如猪肉、猪肝、猪尿等样品中克伦特罗的残留量，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。因此本发明检测方法及其专用试剂盒将在动物源性食品中克伦特罗的残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为克伦特罗标准曲线图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中各试剂盒的检测原理如下：

当在化学发光板微孔上预包被克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入克伦特罗抗体溶液，样本中残留的克伦特罗或克伦特罗标准品与化学发光板上包被的克伦特罗偶联抗原竞争克伦特罗抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，加入发光液反应，样本发光强度值与样本中克伦特罗的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中克伦特罗的残留量。

实施例1、化学发光免疫试剂盒的制备及其检测方法

一、化学发光免疫试剂盒包括：

(1)包被原溶液：将包被原溶解于包被缓冲液中得到的，其中包被原在包被原溶液中的浓度为0.08μg/mL；包被原为克伦特罗半抗原与卵清蛋白的偶联物。

(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液：

用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体得到的，稀释度为1∶2000；

稀释液为50mL牛血清白蛋白和950mL磷酸盐缓冲液混合得到；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02M，pH值为7.4。

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.产品目录号为115-035-003

(3)克伦特罗标准品溶液：将标准品溶于稀释液中得到的，其中标准品在克伦特罗标准品溶液的浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，0.5μg/L，1μg/L，10μg/L，100μg/L；

克伦特罗标准品为克伦特罗，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH，产品货号为C11668550，批号60309。

稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液。

(4)发光液：发光液由A液和B液组成，发光液A液为过氧化氢，8mL/瓶，1瓶；发光液B液为鲁米诺溶液，8mL/瓶，1瓶。

(5)克伦特罗单克隆抗体工作液：

将单抗溶于稀释液中得到的，单抗与稀释液的配比为1∶5000；

单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE产生。

稀释液为25g酪蛋白、0.03g叠氮化钠和1000mL磷酸盐缓冲液混合得到。

(6)浓缩洗涤液：将0.05g叠氮钠化钠与100mL浓度为0.02M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液混合得到。

(7)浓缩复溶液：将0.1g牛血清白蛋白与100mL浓度为0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液混合而成。400mL/瓶，1瓶。

(8)包被缓冲液：pH值为9.6的浓度为0.03mol/L的碳酸盐缓冲液。

(9)封闭液：将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L、pH值为7.4的磷酸盐溶液混合而成。

二、试剂盒的制备

其中，包被有克伦特罗半抗原与卵清蛋白偶联物的化学发光板、克伦特罗抗体工作液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液的制备方法如下：

1、化学发光板的制备：

(1)克伦特罗半抗原的合成：

克伦特罗结构中含有氨基，可以与载体蛋白质直接偶联，因此不用进行结构改造，可以直接作为半抗原。

所述克伦特罗半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

(2)包被原的制备：采用重氮化法将克伦特罗半抗原和卵清蛋白偶联得到包被原。

a、将5mg克伦特罗加入2mL 0.5M的硫酸中，在4℃放置12h，得到的溶液称为A液；将50mg的卵清蛋白OVA溶于4mL的碳酸钠水溶液中(其中碳酸钠的浓度为100mg/mL，pH＝10)在4℃放置12h，得到的溶液称为B液；将30mg亚硝酸钠溶于1mL水得到的溶液称为C液；将C液缓慢加入到4℃的A液中得到的混合物置于0℃冷却15min；

b、将冷却后的混合物缓慢加入到B液得到混合液，混合的条件为：先摇动烧杯6min，再磁力搅拌4h，pH保持在9-10之间，再将混合液用生理盐水4℃透析得到包被原。

包被原结构式如式I所示：

(式I)。

(3)化学发光板的制备：

用包被缓冲液将步骤(2)得到的包被原(即克伦特罗半抗原和卵清蛋白偶联物)稀释成0.08μg/mL，每孔加入100μl，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封闭液，37℃温育1h，倾去孔内液体，干燥后获得包被有包被原的化学发光板，用铝膜真空密封保存。

2、克伦特罗单克隆抗体的制备：

(1)免疫原合成：

将克伦特罗半抗原和牛血清白蛋白通过重氮化法偶联得到免疫原。

具体制备过程如下：与包被原的制备方法相同，不同的是将卵清蛋白替换为牛血清白蛋白BSA。

(2)动物免疫与细胞融合

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以克伦特罗半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5∶1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合。采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为CLE。

经筛选得到能稳定分泌克伦特罗单克隆抗体的对地西泮的单克隆杂交瘤细胞株CLE，已于2010年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3777。

(3)细胞冻存和复苏：将上述单克隆杂交瘤细胞株CLE CGMCC No.3777用冻存液制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将上述单克隆杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用下述辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠得到的细胞培养基，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(体积百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

辛酸-饱和硫酸铵法1)50％饱和度盐析：取上述细胞培养液5mL，加等量0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)混匀，然后逐渐滴加等体积的饱和硫酸铵(pH7.4)溶液(使硫酸铵溶液的饱和度达到50％)，边加边搅拌，室温放置30min，3000g离心30min，弃上清液留沉淀。2)33％饱和度盐析：在步骤1)得到的沉淀中分别加入5mL 0.01mol/LPBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)溶解沉淀，再加饱和硫酸铵溶液达到33％饱和度，边加边搅拌，室温放置30min，弃上清液留沉淀。重复操作2次。3)脱盐：取0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)溶解步骤2)得到的沉淀，装于透析袋中，悬于盛有0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氢钾0.27g，12水合磷酸氢二钠2.86g，氯化钾0.2g，氯化钠8.8g)的烧杯中脱盐，放置于4℃，每天换液3-4次，1％BaCl₂检测直至透析液中无硫酸根离子为止。4)透析完毕，3000g离心5min，取上清液得到纯化的克伦特罗单克隆抗体，-20℃冰箱保存。

三、用步骤一所述试剂盒检测样品中残留的克伦特罗的方法

方法如下：

1、样品前处理

样品为猪肉、猪肝、猪尿等组织样本。

将2g动物组织匀浆后，加入10mL 0.1M高氯酸水溶液，振荡混合10min，以3000g的速度离心5min，将2mL上清液用1M NaOH溶液调pH值至11，加入2mL乙酸乙酯与异丙醇混合液混匀，3000g离心5min，取上层有机相氮气吹干，加入1mL复溶液溶解残留物，获得待测样本溶液，进行试验分析。所述乙酸乙酯与异丙醇混合液是由体积比为8∶2的乙酸乙酯与异丙醇混合得到的。

或：取10mL猪尿以3000g离心5min；取200μl上清液，用复溶液稀释5倍后获得待测样本溶液，进行试验分析；所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的。

2、检测

向步骤一获得的包被有包被原(克伦特罗半抗原与卵清蛋白偶联物)的化学发光板微孔中加入克伦特罗标准品溶液或样本溶液50μl，再加入克伦特罗单克隆抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min；倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干；每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100mL，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤；每孔加入发光液A液过氧化氢，发光液B液鲁米诺溶液，用化学发光免疫分析仪，测定每孔发光强度值。

3、结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的发光强度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的发光强度值(B0)再乘以100％，即百分发光值。计算公式为：

百分发光值(％)＝(B/B0)×100％

以克伦特罗标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分发光值为Y轴，绘制标准曲线图(图1)。用同样的办法计算样品溶液的百分发光值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中克伦特罗的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需1.5小时可以完成。

按照上述方法获得三批试剂盒(01批、02批、03批)。

实施例2、试剂盒灵敏度、准确度和保存期试验

一、试剂盒灵敏度实验

对零标准溶液(即稀释液为pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液)进行20次检测，测定结果的平均值加上3倍标准差作为试剂盒的最低检测限。

表1零标准测定结果统计表 μg/L

由表1可知，试剂盒的最低检测限为0.1μg/L。

二、标准品精密度试验：

从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取10个试剂盒，测定1μg/L标准品溶液的发光强度值，计算变异系数。检测方法与实施例1中实验三所述一致。

实验设3次重复，结果如表2所示，表明变异系数范围在5.7％～11.4％之间，符合精密度小于或等于20％的规定。

表2标准可重复性试验(CV％)

三、样本精密度和准确度试验

1、样品精密度试验：

将不含克伦特罗的猪肉、猪肝、猪尿按照实施例1的方法进行样品前处理后，添加克伦特罗标准品，使其终浓度为2μg/kg(L)。从实施例1中所述的三批试剂盒(01批、02批、03批)中每批抽取3个试剂盒，进行实验，每个实验重复5次，分别计算变异系数，结果如表3-5所示。结果表明猪肉、猪肝、猪尿样本的变异系数均小于20％，符合了《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度和准确度的精密度标准。

表3猪肉样本可重复性试验

表4猪肝样本可重复性试验

表5猪尿样本可重复性试验

2、样本准确度试验

将不含克伦特罗的猪肉、猪肝、猪尿按照实施例1中所述的样品前处理方法进行处理，然后向每种组织中加入克伦特罗标准品溶液，使其终浓度分别为2μg/kg和10μg/kg；然后用实施例1中所述的试剂盒检测猪肉、猪肝、猪尿中克伦特罗，每个浓度做4个平行，分别计算准确度(准确度＝实测值/添加值)。结果如表6所示，表明各样本以2μg/kg(L)、10μg/kg(L)克伦特罗添加回收率均在73.9％-93.4％之间。

表6试剂盒的准确度

四、交叉反应率试验

选择与克伦特罗有类似结构和类似功能的13种药物测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应越小，那么此试剂盒对克伦特罗的检测特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(抑制50％克伦特罗的浓度/抑制50％的克伦特罗类似物浓度)*100％

表7试剂盒的特异性

实验结果表明，本发明所研制的试剂盒对克伦特罗特异性好，对沙丁胺醇也有较高的特异性。

五、试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定试剂盒的50％抑制浓度、克伦特罗实际添加测定，结果表明试剂盒的50％抑制浓度均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。

Claims

1.一种检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒，包括克伦特罗特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为克伦特罗半抗原与载体蛋白的偶联物；其结构式如式I所示：

(式I)。

2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括发光液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；

3.根据权利要求1或2所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：所述克伦特罗特异性抗体为克伦特罗单克隆抗体或克伦特罗多克隆抗体，所述克伦特罗单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的抗体。

4.根据权利要求1-3中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：所述标准品溶液中标准品的浓度为0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、10μg/L或100μg/L，所述标准品为克伦特罗；

5.根据权利要求1-4中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：

所述克伦特罗半抗原的结构式如式II所示：

(式II)。

6.根据权利要求1-5中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：所述克伦特罗半抗原为克伦特罗。

7.根据权利要求1-6中任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于：

所述酶标抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体。

8.一种检测克伦特罗的方法，包括以下步骤：

1)样品前处理：

或：取每10mL猪尿以3000g离心5min；取上清液，用复溶液稀释5倍后获得待测样本溶液；

所述复溶液为将所述浓缩复溶液用0.05mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；

2)利用权利要求1-7中任一所述的检测克伦特罗的化学发光免疫试剂盒检测步骤1)中的样本溶液。

9.由保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE分泌的克伦特罗单克隆抗体。

10.保藏号为CGMCC No.3777的对克伦特罗的单克隆杂交瘤细胞株CLE。