CN101446587A - 一种盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的测定方法，在包被了盐酸克伦特罗的全抗原的酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入盐酸克伦特罗抗体；洗涤，加入酶标二抗，洗涤后加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；或者在包被了盐酸克伦特罗抗体的酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入酶标盐酸克伦特罗全抗原；洗涤，加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；根据酶促反应的强度，绘制标准曲线，依所述标准曲线推算出盐酸克伦特罗的浓度。本发明的方法灵敏度高，检测范围宽、操作简便快速、稳定性好，因而具有广阔的应用前景。

Description

一种盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的测定方法

技术领域

本发明属于化学发光免疫检测技术领域，具体涉及一种用于饲料、尿样、动物源食品尤其是动物组织制品和动物尿液中盐酸克伦特罗的检测方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(clenbuterol，CL)：又称瘦肉精、氨哮素、克喘素，是β2-肾上素受体激动剂(简称β-兴奋剂)。化学名称为羟甲叔丁肾上腺素，白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃。该药物可选择性地作用于肾上腺素受体，是一种强效激动剂，可引起交感神经兴奋，动物食了含有盐酸克伦特罗的饲料，能够改善营养的代谢途径，促进动物肌肉，特别是骨骼肌蛋白质的合成，抑制脂肪合成的积累，从而加速动物生长速度，瘦肉相对增加。一般来说，饲料中添加适量的盐酸克伦特罗以后，可使猪等畜禽生长速度、饲料转化率、酮体瘦肉率提高10％以上。因此，习惯上称其为“瘦肉精”。在体内代谢慢，当给动物用药90天，宰前停药5天，仍在尿液、血液、肌肉、和肝脏检出克伦特罗。其化学结构稳定，在体内不会破坏分解，以原药形式排出体外。研究显示克伦特罗完全耐受100℃高温。要经过126℃油煎5分钟才会破坏减半。因此，常规烹调对肉食品克伦特罗残留不起破坏作用。人食入克伦特罗后发生中毒。临床表现为心跳加速、四肢颤抖、腹痛头晕，同时伴有呼吸困难、恶心呕吐等症状。长期食用，可致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。

近年来，动物性产品中盐酸克伦特罗残留对人类健康造成的危害以及对生态食物链的破坏，已逐渐引起人类的高度重视。自1986年开始，欧美等发达国家已严禁畜牧业中应用CL，我国农业部、对外经济贸易合作部、国家出入境检疫局也多次发文严厉打击非法使用CL的行为。但仍有人在偷偷使用，市场调查结果显示：CL的检出率仍很高，个别地区达20％以上。由此可见，开展瘦肉精残留检测技术的研究及产业化的势在必行。

目前，检测盐酸克伦特罗残留的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱(GC-MS)，毛细管区带电泳法(CE)，免疫技术法等。高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱(GC-MS)，虽然灵敏度高，特异性好，但是操作繁琐且费用高。目前用的较多的免疫技术方法为ELISA方法和化学发光免疫分析(CLIA)方法，ELISA可检测多个样品，但是灵敏度和分辨率满足不了日益提高的检测要求，酶促化学发光免疫吸附测定法是将特异性的抗体或包被抗原包被成酶促化学发光载体，加入待检样品，然后加入酶标抗原或者抗体，样品中的待检物质与酶标抗原或者抗体竞争性的与发光载体上的抗体或者抗原结合，经洗涤去除未结和的游离物，加入酶标二抗，洗涤后加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液。根据酶促反应的强度和结合在载体上的抗原或抗体的量成正相关，和样品中待检物质的含量呈负相关，绘制标准曲线，依标准曲线推算出样品中待检物质的浓度。CLIA具有ELISA高通量的优点同时弥补了ELISA灵敏度分辨率低的缺点，是一种更理想的检测方法。目前市场上尚无该方法的检测试剂盒，利用CLIA研制克伦特罗的检测方法，具有更好的经济和社会意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高，检测范围宽、操作简便快速、稳定性好的盐酸克伦特罗检测方法。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

本发明的一种盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的测定方法，首先制备盐酸克伦特罗的全抗原或盐酸克伦特罗的抗体，然后制备酶促化学发光载体，封装后贮存备用；

检测时，在所述酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入相对应的盐酸克伦特罗的抗体；洗涤去除未结合的游离物后，加入酶标二抗，洗涤后加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；根据酶促反应的强度，绘制标准曲线，依所述标准曲线推算出盐酸克伦特罗的浓度；或者

检测时，在所述酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入相对应的酶标盐酸克伦特罗得到的盐酸克伦特罗全抗原；洗涤去除未结合的游离物后，加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；根据酶促反应的强度，绘制标准曲线，依所述标准曲线推算出盐酸克伦特罗的浓度。

所述的制备酶促化学发光载体，具体如下：

用0.05M pH9.5的碳酸盐缓冲液为包被所述的盐酸克伦特罗的全抗原的稀释液，或用0.05M pH9.5的碳酸盐缓冲液为包被所述的盐酸克伦特罗的抗体的稀释液，将所述的稀释后的盐酸克伦特罗的全抗原或所述的稀释后的盐酸克伦特罗的抗体包被在所述微孔板上，于4℃放置24h，再用0.05M pH7.2的磷酸缓冲液配制的1％牛血清白蛋白溶液进行封闭。

所述的制备酶促化学发光载体，进一步包括如下步骤：在经过封闭拍干后37℃干燥箱两小时烤干后，加干燥剂真空包装制备而成。

所述的酶标二抗为酶标抗盐酸克伦特罗抗体。

所述的酶促化学发光液为鲁米诺、异鲁米诺或鸟嘌呤-过氧化氢-钴(II)。

所述的酶促化学发光液为辉光型。

所述的酶促化学发光液进一步含有相应的增强剂。

所述的酶促化学发光底物为过氧化氢或过氧化脲溶液。

所述的过氧化脲溶液是将过氧化脲溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，其中，过氧化脲和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的质量体积比为0.3g：1000ml。

本发明采用竞争性的固相酶促化学发光免疫吸附检测原理，通过化学交联的方法将盐酸克伦特罗半抗原与具有免疫原性的蛋白载体交联形成人工合成全抗原作为包被抗原，或者与具有催化作用的酶交联形成酶标抗原。将盐酸克伦特罗特异性的抗体或包被抗原包被酶促化学发光载体，加入待检样品，然后加入酶标抗原或者抗体，样品中的克伦特罗与酶标抗原或者抗体竞争性的与发光载体上的抗体或者抗原结合，经洗涤去除未结合的游离物，再加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液。根据酶促反应的强度和结合在载体上的抗原或抗体的量成正相关，和样品中克伦特罗的含量呈负相关，绘制标准曲线，依标准曲线推算出CL的浓度。

本发明方法灵敏度高，检测范围宽、操作简便快速、稳定性好，因而具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的检测方法的原理图；

图2是本发明的盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的检测方法的一个优选实施例的检测标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例以及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一：各种原料的制备

(1)免疫抗原的制备：

采用重氮偶合反应，CL分子上的氨基在亚硝酸钠与盐酸的作用下形成重氮盐，此重氮盐在碱性条件下与牛血清白蛋白(BSA)上的酚羟基反应，形成以偶氮键相联的结合物免疫原；同法合成酶标抗原。然后将合成产物置入pH7.410mM磷酸盐缓冲液4℃搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的CL和其它小分子物质，透析后真空冷冻干燥，-20℃密闭保存。采用紫外分光光度法扫描测定CL-BSA中的CL浓度以及BSA浓度进行鉴定。半抗原与蛋白质分子的结合比计算公式为：结合比＝(OD值偶联物-OD值蛋白质)/OD值CL分子量。

(2)特异性抗体的制备：

①动物免疫：选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将CL-BSA重氮偶联抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，进行基础免疫。4周后进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。8周后，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7～10天，测定抗体效价，取脾细胞。

②细胞融合：脾细胞按10:1比例与Sp2/0瘤细胞进行细胞融合，培养

③杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法分别与CL-OVA呈阳性反应的杂交瘤细胞株进行3次克隆，选取ELISA筛选阳性率达到100％的细胞株且OD450最高的细胞株。

④细胞的保存：在克隆和扩增时及时地将细胞株冻存在液氮罐中。细胞按原始细胞库，种子细胞库和生产细胞库三级管理办法保存。每株细胞均做备份分别冻存在不同的液氮罐中。

⑤腹水制备：将细胞株复苏后，培养于含15％胎牛血清的DMEM培养液中进行扩增。然后接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注射0.5×107细胞/ml。7天后小鼠开始产生腹水。采用单次处死采集的方法收集腹水，保证腹水的均一性。最多从一只小鼠中可以获得6ml左右的腹水。

⑥抗体的分离纯化：利用饱和硫酸胺分段盐析法对腹水进行粗纯。粗纯的抗体经透析除盐后过Protein G柱子纯化。先用结合缓冲液平衡Protein G层析柱然后加入混合有结合缓冲液的粗纯抗体溶液，经结合、洗涤和洗脱收集洗脱样品中和后，将样品放在0.02PB，pH7.4的缓冲液透析过夜，透析液再离心12000rpm，20min。取上清即为纯化抗体。

(3)酶促化学发光载体的包被：选用0.05M pH9.5碳酸盐缓冲液为包被抗原稀释液，4℃24h包被于微孔板，0.05M pH7.2的PBS配制的1％BSA溶液进行封闭，抗体稀释液选用Tris-HCl缓冲体系加入10％小牛血清。

(4)酶促化学发光液的制备：选用鲁米诺溶液中添加有相应的增强剂制备而成。

(5)酶促化学发光底物的制备：称取0.3g过氧化脲溶于1000ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，充分溶解。

实施例二：包被盐酸克伦特罗全抗原的酶促化学发光免疫吸附的检测方法

如图1A所示，包被盐酸克伦特罗全抗原的酶促化学发光免疫吸附的检测方法的原理为将盐酸克伦特罗抗原包被为酶促化学发光载体，加入待检样品，然后加入酶标抗体，样品中的克伦特罗抗体与酶标抗体竞争性的与发光载体上的抗原结合，经洗涤去除未结和的游离物，加入酶标二抗，洗涤后加入酶促化学发光底物，加入酶促化学发光液。根据酶促反应的强度和结合在载体上的抗原的量成正相关，和样品中克伦特罗的含量呈负相关，绘制标准曲线，依标准曲线推算出CL的浓度。具体操作如下：

1)量取所需体积的包被液，按比例加入所需的抗原，摇匀；取所需数量未使用过的发光板，拍板一次；将多道加样器调整至100微升，装上枪头，每孔100微升进行包被；加完包被液的板子封上封板胶，置于4℃冰箱中过夜；次日用洗液洗板一次，拍干；每孔加入120微升封闭溶液，封上封板胶，置于4℃冰箱中过夜；次日拍干，置于37℃恒温箱中2小时；将包被好的微孔板放入铝箔袋中，放干燥剂封口。制得发光板。

2)抗体稀释液选用Tris-HCl缓冲体系加入10％小牛血清。量取所需体积的抗体稀释液加入所需量的克伦特罗抗体摇匀即制得克伦特罗抗体工作液；

3)量取所需量的酶标二抗稀释液，加入所需量的酶标抗体摇匀即制得酶标抗体工作液；

4)去克伦特罗纯品使用0.01M PH7.0的PB配制成0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/ml的溶液作为标准品。

5)往发光板微孔中加入标准溶液或试样液20μl/孔，然后加入克伦特罗抗体工作液100μl/孔，用盖板膜封板，37℃恒温反应30min。

6)倒出孔中液体，将发光板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。加满洗液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

7)酶标记物：加入酶标记物100μl/孔，用盖板膜封板，37℃恒温反应30min。取出发光板，如前述洗板5次；

8)每孔加入过氧化氢、鲁米诺各50μl，轻轻振荡混匀，置于化学发光仪器上5～10min内读数；

9)结果判定：所获得的每个浓度标准溶液和样本发光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的发光度值(B0)再乘以100％，即百分发光度值。

百分吸光度值(％)＝B/B0×100％

B—标准溶液或样本溶液的平均发光度值

B0—0ng/ml标准溶液的平均发光度值

以标准品百分发光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度(ng/ml)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分发光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。

实施例三：包被盐酸克伦特罗抗体的酶促化学发光免疫吸附的检测方法

如图1B所示，为包被盐酸克伦特罗抗体的酶促化学发光免疫吸附的检测方法的原理，将盐酸克伦特罗特异性的抗体包被为酶促化学发光载体，加入待检样品，然后加入酶标抗原，经洗涤去除未结合的游离物，加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液。根据酶促反应的强度和结合在载体上的抗原的量成正相关，和样品中克伦特罗的含量呈负相关，绘制标准曲线，依标准曲线推算出CL的浓度。具体操作如下：

1)量取所需体积的包被液，按比例加入所需的抗体，摇匀；取所需数量未使用过的发光板，拍板一次；将多道加样器调整至100微升，装上枪头，每孔100微升进行包被；加完包被液的板子封上封板胶，置于4℃冰箱中过夜；次日用洗液洗板一次，拍干；每孔加入120微升封闭溶液，封上封板胶，置于4℃冰箱中过夜；次日拍干，置于37℃恒温箱中2小时；将包被好的微孔板放入铝箔袋中，放干燥剂封口。制得发光板。

2)酶标抗原稀释液选用Tris-HCl缓冲体系加入10％小牛血清。量取所需体积的抗原稀释液加入所需量的酶标抗原摇匀即制得酶标抗原工作液；

3)克伦特罗纯品使用0.01M PH7.0的PB配制成0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/ml的溶液作为标准品。

4)往发光板微孔中加入标准溶液或试样液20μl/孔，然后加入酶标工作液100μl/孔，用盖板膜封板，37℃恒温反应30min。

5)倒出孔中液体，将发光板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。加满洗液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

6)每孔加入过氧化脲、异鲁米诺各50μl，轻轻振荡混匀，置于化学发光仪器上5～10min内读数

7)结果判定：所获得的每个浓度标准溶液和样本发光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的发光度值(B0)再乘以100％，即百分发光度值。

百分吸光度值(％)＝B/B0×100％

B—标准溶液或样本溶液的平均发光度值

B0—0ng/ml标准溶液的平均发光度值

如图2所示，以标准品百分发光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，得到的标准曲线为y＝-38.79x+37.36，R²＝0.999。将样本的百分发光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1、一种盐酸克伦特罗的酶促化学发光免疫吸附的测定方法，其特征在于，首先制备盐酸克伦特罗的全抗原或盐酸克伦特罗的抗体，然后制备酶促化学发光载体，封装后贮存备用；

检测时，在所述酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入相对应的盐酸克伦特罗的抗体；洗涤去除未结合的游离物后，加入酶标二抗，洗涤后加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；根据酶促反应的强度，绘制标准曲线，依所述标准曲线推算出盐酸克伦特罗的浓度；或者

检测时，在所述酶促化学发光载体上加入待检样品，然后加入相对应的酶标盐酸克伦特罗得到的盐酸克伦特罗全抗原；洗涤去除未结合的游离物后，加入酶促化学发光底物，再加入酶促化学发光液；根据酶促反应的强度，绘制标准曲线，依所述标准曲线推算出盐酸克伦特罗的浓度。

2、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的制备酶促化学发光载体，具体如下：

用0.05M pH9.5的碳酸盐缓冲液为包被所述的盐酸克伦特罗的全抗原的稀释液，用0.05M pH9.5的碳酸盐缓冲液为包被所述的盐酸克伦特罗的抗体的稀释液，将所述的稀释后的盐酸克伦特罗的全抗原或所述的稀释后的盐酸克伦特罗的抗体包被在所述微孔板上，于4℃放置24h，再用0.05M pH7.2的磷酸缓冲液配制的1％牛血清白蛋白溶液进行封闭。

3、根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述的制备酶促化学发光载体，进一步包括如下步骤：在经过封闭拍干后，37℃干燥箱两小时烤干后，加干燥剂真空包装制备而成。

4、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的酶标二抗为酶标抗盐酸克伦特罗抗体。

5、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的酶促化学发光液为鲁米诺、异鲁米诺或鸟嘌呤-过氧化氢-钴(II)。

6、根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述的酶促化学发光液的发光类型为辉光型。

7、根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述的酶促化学发光液进一步含有相应的增强剂。

8、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的酶促化学发光底物为过氧化氢或过氧化脲溶液。

9、根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述的过氧化脲溶液是将过氧化脲溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，其中，过氧化脲和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的质量体积比为0.3g:1000ml。

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