CN102464719A - 鼠抗克伦特罗单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供鼠抗克伦特罗单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其制备方法及其用途。本申请也涉及含有该单克隆抗体的试剂盒。本申请的抗体经过亲和层析纯化后，效价可以达到一万六，而且抗体纯度高、特异性强，亲和力高。本申请的试剂盒灵敏度高，稳定性好、精密度高，可用于克伦特罗的快速检测、测定。

Description

鼠抗克伦特罗单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗克伦特罗的单克隆抗体的制备、特异性单克隆抗体及其应用。

背景技术

克伦特罗(Clenbuterol)是一类动物用药，将克伦特罗添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。但因为考虑对人体会产生副作用，各国开放使用的标准不一。目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β-兴奋剂(β-agonist)的药物，比如在中国造成中毒的克伦特罗和美国允许使用的雷托巴胺(Ractopamine)。克伦特罗在家畜和人体内吸收好，而且与其它β-兴奋剂相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克伦特罗的猪肉会出现中毒。

应用盐酸克伦特罗作饲料添加剂来提高瘦肉率和减少脂肪沉积，曾经是一种有效的方法，但近年来研究证明它对动物和人体有残留危害。我国政府也明令禁止生产、销售、使用盐酸克伦特罗药物，但仍有少数生产厂家在进行违法操作。FDA和WHO规定了盐酸克伦特罗在动物体内的最高残留为：肉0.2μg/kg(ppb)、肝0.6μg/kg、肾0.6μg/kg、脂肪0.2μg/kg、奶0.05μg/kg。

由于越来越多的国家对进出口食品中残留药物的检测越来越严格，开发灵敏的检测方法已成为当务之急。所以本发明开发了特异性抗克伦特罗的单克隆抗体，以及检测克伦特罗残留的有效方法。

发明内容

本申请提供一种克伦特罗单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201085的杂交瘤细胞株产生。

本申请提供保藏号为CCTCC NO：C201085的杂交瘤细胞株。

本申请提供一种细胞培养物，所述培养物含有本申请的杂交瘤细胞株。

本申请提供一种组合物，该组合物含有本申请的克伦特罗单克隆抗体。

本申请提供一种检测试剂盒，该试剂盒含有本申请的克伦特罗单克隆抗体。

在一个具体实施方式中，本申请的试剂盒还包括用CLB-BSA预包被的检测板、盐酸克伦特罗标准液、化学发光液和洗涤液。

在一个具体实施方式中，本申请试剂盒中的克伦特罗单克隆抗体是酶标抗体。

在一个具体实施方式中，所述克伦特罗单克隆抗体经选自辣根过氧化物酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶、小牛肠碱性磷酸酶和大肠干菌β-D-半乳糖苷酶的酶标记。

本申请提供一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：

(a)将克伦特罗与牛血清蛋白化学连接，制出免疫复合物；

(b)用所述免疫复合物免疫小鼠；

(c)取所述小鼠脾细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基选择性培养所得融合细胞，选择阳性克隆株；

(d)将步骤(c)所得的阳性克隆株注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养；

(e)纯化所述腹水或体外细胞培养物，从而获得所述克伦特罗单克隆抗体。

本申请涉及本申请的克伦特罗单克隆抗体在检测生物样品中克伦特罗残留量中的用途。

本申请还提供一种检测生物学样品中克伦特罗存在或浓度的方法，所述方法包括使所述样品与本申请的抗体或其具有免疫活性的抗体片段、细胞培养物、或组合物接触的步骤。

附图说明

图1显示克伦特罗mAb与抗原亲和力常数检测。

图2显示了克伦特罗的标准曲线。

具体实施方式

单克隆抗体及杂交瘤细胞系

本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即，组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。

本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备，例如，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

具体而言，本申请首先将盐酸克伦特罗偶氮化，然后将偶氮化的盐酸克伦特罗加入含有BSA和OVA的溶液中，制备CLB-BSA复合物作为免疫原。偶氮化盐酸克伦特罗可采用本领域常规的方法进行，例如，可将盐酸克伦特罗加到NaNO₂中来实现。

可将由此获得的CLB-BSA免疫小鼠，然后可取免疫的小鼠的脾细胞，使其与骨髓瘤细胞融合。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk Institute Cell DistributionCenter，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)，单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体：原则和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，IMDM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约10⁶-10⁷个杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

在获得克伦特罗单克隆抗体后，可对其进行标记或进一步修饰，例如可采用胶体金标记、荧光标记、同位素标记、酶标记等进行标记，优选所述酶标记为辣根过氧化物酶(HRP)酶标(朱立平、陈学清《免疫学常用实验方法》人民军医出版社2000年3月；Ed Harlow，David Lane，UsingAntibodies：A Laboratory Manual.1999)。

还可使用选自黑曲霉葡萄糖氧化酶、小牛肠碱性磷酸酶和大肠干菌β-D-半乳糖苷酶的酶对本申请的克伦特罗单克隆抗体进行标记。

因此，本申请包括保藏号为CCTCC NO：C201085的杂交瘤细胞株及采用该杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体，还包括该单克隆抗体的具有免疫活性的抗体片段：Fab或(Fab’)2、抗体重链、抗体轻链。本申请的单克隆抗体针对克伦特罗的特异性强、亲和力高。

本申请还提供了上述单克隆抗体或其片段的DNA分子，利用小鼠杂交瘤细胞系1G7(CCTCC NO：C201085)，以常规方法对抗克伦特罗单克隆抗体重链和轻链基因序列进行了测序，结果显示其重链和轻链的可变区包括完整的框架区和互补决定区。还可将重链和轻链的编码序列连接在一起，形成单链抗体。

检测板或检测试剂盒

可将本发明的单克隆抗体用于制备检测克伦特罗存在或浓度的检测板或检测试剂盒。

本发明的检测板或试剂盒可采用本领域常用的检测板或检测试剂盒材料，采用常规的检测板或试剂盒制备方法制成。

例如，本发明的检测板，可包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被带有有色标记或其它可观测标记(例如胶体金标记)的本发明抗克伦特罗单克隆抗体。硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；所述的检测线为克伦特罗单克隆抗体，检测线所在的区域为检测区；所述的质控线为羊抗鼠多克隆抗体，质控线所在的区域为质控区。因此，测试条上的检测物依次为：预包被的单克隆抗体、检测线和质控线。

本申请的试剂盒可含有用CLB-BSA预包被的检测板，盐酸克伦特罗标准液、本申请的抗盐酸克伦特罗抗体、化学发光液和洗涤液等。可根据多种检测原理和方法，按照需要在试剂盒中配备检测所需的试剂或试剂组。所述CLB-BSA预包被的检测板可按本领域常规方法制备，例如作为参考，可参照以下方法制备得到：将CLB-BSA稀释到200ug/L，将发光黑色检测板的每孔加100μl、200μg/L的CLB-BSA稀释液，4℃过夜；用pH7.2的10mm PBS包被液加0.02％TWeen-20洗一遍；10mm PBS包被液(pH7.2)+0.5％BSA封闭，37℃2小时；再用水和保护剂地混合液吸干封闭液；37℃干燥，即可获得该检测板。

盐酸克伦特罗标准液可为10个不同浓度梯度的溶液，其浓度分别为0.0ng/ml、0.01ng/ml、0.02ng/ml、0.04ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、和50ng/ml，分别分装为10瓶，每瓶6ml；盐酸克伦特罗可通过商业途径购买得到，例如购自Sigma等。

试剂盒中，用以标记抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的酶可以是辣根过氧化物酶(HRP，纯度为A430/A275＞3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶(AKP)，或大肠干菌β-D-半乳糖苷酶，以HRP最为常用。

所述的化学发光液可以从商业途径购买得到，例如可以购自Sigma公司。

所述的洗涤液可以是ELISA试剂盒中常用的洗涤液，例如可以是100mM PBST洗涤液。

本发明的检测板或检测试剂盒所针对的生物样品可以是获自患者的新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织、体液、血液、或细胞等，优选为新鲜组织、福尔马林固定或石蜡包埋组织。这些样品可为切片、涂片、悬液、溶液等适于检测的各种形式存在。生物样品还包括各种食品。

此外，本发明的试剂盒还可根据需要包括：容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂、免疫助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。

或者，检测板也可存在于检测试剂盒中，或者独立包装。检测板或检测试剂盒还可包括指导技术人员使用该检测板或检测试剂盒进行检测的说明书。

本申请试剂盒可按以下方法进行检测：

(1)向CLB-BSA预包被的检测板的孔中加入待检测样品(例如，猪的尿液)和盐酸克伦特罗标准液(稀释一系列克伦特罗标准液0.0、0.01、0.02、0.04、0.1、0.5、5、10、20、50ng/ml)50μl，同时做空白对照；

(2)加入酶标标记抗的盐酸克伦特罗单克隆抗体50μl，37℃湿盒中孵育30分钟；

(3)用洗涤液洗涤每孔3次，加入化学发光液；

(4)化学发光检测仪检测吸光度。

本发明的单克隆抗体特异性强、亲和力高，检测灵敏度为0.001ng/ml，准确度较高，回收率比较好，精密度也比较高。

而采用本发明的单克隆抗体的试剂盒进行检测，检测特异性强、灵敏度高、稳定性好、简并快捷，完全能够满足食品的检测需求。

组合物

本申请也包括含有本申请抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的组合物。该组合物还含有，例如PBS溶液(pH7.2)和防腐剂(0.1％叠氮钠)。

组合物中的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体可以是酶标的单抗，例如，该单抗可经HPR、黑曲霉葡萄糖氧化酶、小牛肠碱性磷酸酶和大肠干菌β-D-半乳糖苷酶的酶对本申请的克伦特罗单克隆抗体进行标记。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》ewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

本发明通过重氮偶联法将克伦特罗与牛血清白蛋白偶联，具体实施步骤如下：

1)称取5mg克伦特罗(购自Dr.Ehrenstorfer GmbH.Cat.NO：11668500)，1mol/l HCl调PH到1～2.0，0～5℃预冷；

2)20mg的NaNO₂溶于1ml水中，4℃连续加NaNO₂溶液，每次200μl，4℃孵育4小时；

3)加4～5滴氨基磺酸胺以除去游离的NO^2-，直至不产生气泡；

4)将50mg BSA蛋白分别溶于1ml 0.1mol/L的PB缓冲液中，PH8.0，4℃预冷；

5)将重氮化的克伦特罗逐滴加入牛血清白蛋白(BSA)和OVA蛋白溶液中，同时用0.2M的NaOH调PH至7.5～8.0，4℃反应过夜；

6)0.01mol/l PH7.4的PBS透析过夜，期间多次换液，得CLB-BSA复合物。以此复合物作为免疫原，免疫Balb/c小鼠：

a)第一次免疫，将CLB-BSA复合物与福氏完全佐剂等比例混合，小鼠皮下注射，注射3只，每只剂量200μg；

b)14天后第二次免疫，将CLB-BSA复合物与福氏不完全佐剂等比例混合，小鼠腹腔注射；

c)两星期后，第三次免疫，将CLB-BSA复合物小鼠腹腔注射；

d)10天后，小鼠尾部取血，分离血清，ELISA检测血清中抗体的效价，抗体效价最高为1∶64000。

单克隆抗体的制备：

1)细胞融合

将免疫克伦特罗的小鼠拖颈处死，无菌条件下取其脾细胞，在50ml离心管中混合10⁸小鼠脾细胞和2×10⁷SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤细胞)，并加入40mlIMDM培养基(GIBCO)。室温1000rpm离心8分钟，去上清。轻敲试管底部使沉淀流动，细胞分散。把离心管放于37℃水浴中，使融合过程一直保持在37℃水浴中。加预热至37℃的50％ PEG-4000 0.8ml，用吸管慢慢滴加，边加边摇离心管，肉眼观察有颗粒出现。滴加过程要求持续2分钟。加2ml IMDM培养基，边加边摇动，持续2分钟。加2ml IMDM培养基，边加边摇动，持续1分钟。加15ml IMDM培养基，室温1000rpm离心8分钟，去上清。加入30ml含2％HAT和20％FBS的IMDM培养基，重悬细胞，加入96孔培养板中，每孔100μl，放在5％CO₂ 37℃培养箱中培养。融合后第5天每孔加入HAT培养基150μl。第10天换入含1％HT和20％FBS的IMDM培养基，并在镜下观察，挑出有杂交瘤细胞生长的孔，将孔内细胞上清用间接ELISA法检测克伦特罗抗体。即以CLB-OVA复合物为抗原检测，将有克伦特罗抗体分泌的细胞扩大培养并克隆、冻存。

2)克隆化

取出抗体阳性孔细胞，用含20％FBS的IMDM培养基制成细胞悬液，取出样品台盼蓝染色后，计数。用含1％HT和20％FBS的IMDM培养基将细胞梯度稀释成300、30、3个/20ml悬液，接种于带有饲养细胞的96孔板中，每孔接种200μl，细胞含量约为3个/孔、0.3个/孔、和0.03个/孔，放在5％CO2、37℃培养箱中培养。用显微镜观察克隆生长情况，选出只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

克隆大量繁殖后，布满孔底1/3-1/2时，以CLB-OVA复合物为抗原，用ELISA法检测克伦特罗抗体。将阳性孔的细胞扩大培养并继续克隆。经过三次克隆，至100％的孔抗体反应均为阳性。克隆化完成后，逐渐去掉培养基中的HT。经过筛选获得分泌抗克伦特罗的特异性强、效价高的一株细胞株(1G7)。

采用上述方法制备得到的杂交瘤细胞株已于2010年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏编号为CCTCC NO：C201085。

3)取Balb/C小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml降植烷。一周后，取对数欺生长的1G7细胞，离心弃上清。用生理盐水反复冲洗3次后，将细胞数调至2×10⁶/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。接种7-10天后，可见小鼠腹部明显膨大，用注射器(接8号针头)抽取腹水。间隔2、3天，待腹水再生积聚后，同法再抽。腹水收集后，以CLB-OVA为包被抗原，以间接ELISA法检测腹水克伦特罗抗体的效价。将呈明显阳性的腹水在4℃下4500rpm离心30分钟，取上清，用0.22μm滤膜过滤后，加入1/1000叠氮钠，-20℃保存备用。

4)抗体纯化

配制饱和硫酸铵(SAS)：取100ml蒸馏水，加热至70-80℃，将80g硫酸铵溶于水中，搅拌20分钟，冷却，加入终浓度为1mmol/L的EDTA-Na₂。并用28％氨水将饱和硫酸铵调节为pH7.0-7.2。

33％饱和硫酸铵提取抗体：取一份腹水加一份PBS(0.02M)，滴加一份饱和硫酸铵，边加边搅拌，4℃过夜，13000rpm离心20分钟，除去上清，用少量PBS溶解沉淀，装入透析袋中，4℃下对PBS透析过夜。脱盐后的抗体溶液用GE Protein A/G亲和层析柱进一步纯化，得到抗克伦特罗的抗体，并用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度。

实施例2：单克隆抗体的特性鉴定

(1)亚型鉴定

采用分型二抗进行ELISA亚型鉴定，亚型测定结果为IgG1(κ)。

(2)效价和亲和力常数的测定

以克伦特罗偶联复合物包被酶标板，以纯化抗体做效价检测，结果显示纯化的克伦特罗的抗体效价能达到1∶20000。

利用SPR技术测定单克隆抗体与克伦特罗的亲和力常数。结果：结合常数为：1.00E+06，解离常数为：1.58E-04，亲和力常数为：1.57E-10。

(3)特异性测定

以不同的农药偶联复合物包被酶标板，以纯化的抗体做交叉反应，结果发现抗体特异性非常好。结果见表1。

表1Mab与相关的农药小分子的交叉反应

(4)竞争ELISA实验的建立

竞争ELISA的建立：分别取20μl克伦特罗标准液(10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002ng/ml)和180μl克伦特罗单抗(1∶10000稀释用)混合，使标准品终浓度为5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.0025、0.001ng/ml，与酶标板上包被的克伦特罗进行竞争，37℃孵育30min，加入HRP标记的鼠二抗，37℃孵育30min，TMB-H₂O₂显色，450nm测定吸收值，绘制标准曲线。

结果：

标准曲线和灵敏度：检测范围为0.001-5ng/ml，结果显示随着浓度递增光密度呈递减状态，标准曲线见图2，检测限可达0.001ng/ml，IC₅₀为0.0504ng/ml。

表2克伦特罗竞争ELISA检测最低检测限

CT标准品浓度(ng/ml)	OD值
		5	0.0835
2	0.1015
		1	0.102
0.5	0.1615
		0.2	0.2285
0.1	0.4335
		0.05	0.747
0.02	0.978
		0.01	0.867
0.005	0.8755
		0.002	1.084
抗体(NO CT)	1.143

重复性试验

重复标准曲线4次，每次标准点3复孔。经计算批内CV值是0.1-15％，平均值为4.27％；批间CV值是1-15％，平均值为8.4％。

回收率试验

样品处理前步骤：

用高速捣碎机将猪肉样品，捣碎混合均匀，称取3.0±0.05g组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入9ml乙腈-0.1mol盐酸，用振荡器振荡10min匀质；

室温下，离心机预热半小时以上，3000r离心10min分离上清液；

取上清4ml至另一洁净的50ml离心管中，加入4ml 0.1mol/l氢氧化钠混合，加入8ml乙酸乙脂，用振荡器振荡15min，离心机3000r，离心15min；

取6ml上层液(即样品0.5g)至10ml干净的玻璃管或聚苯乙烯离心管中于50-60℃下氮吹仪吹干；

加入1ml ddH₂O溶解残留物；

取20μl用于间接ELISA检测样品浓度。

实验结果表明，本提取方法具有很好的回收率，用本发明的单抗进行样品中克伦特罗含量的检测是完全可行的。检测结果如下表：

表3克伦特罗回收率试验

应理解，上述实施例仅仅是阐述性的。在不偏离本申请范围和精神的情况下，本领域技术人员可对本发明做出各种修改和变动，这些修改和变动都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种克伦特罗单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C201085的杂交瘤细胞株产生。

2.保藏号为CCTCC NO：C201085的杂交瘤细胞株。

3.一种细胞培养物，其特征在于，所述培养物含有权利要求2所述的杂交瘤细胞株。

4.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体。

5.一种检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用CLB-BSA预包被的检测板、盐酸克伦特罗标准液、化学发光液和洗涤液。

7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述克伦特罗单克隆抗体经选自辣根过氧化物酶、黑曲霉葡萄糖氧化酶、小牛肠碱性磷酸酶和大肠干菌β-D-半乳糖苷酶的酶标记。

8.一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将克伦特罗与牛血清蛋白化学连接，制出免疫复合物；

(b)用所述免疫复合物免疫小鼠；

(c)取所述小鼠脾细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，以选择性培养基选择性培养所得融合细胞，选择阳性克隆株；

(d)将步骤(c)所得的阳性克隆株注入同系小鼠腹腔诱生腹水或通过体外细胞培养；和

(e)纯化所述腹水或体外细胞培养物，从而获得所述克伦特罗单克隆抗体。

9.权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体在检测生物样品中克伦特罗残留量中的用途。

10.一种检测生物学样品中克伦特罗存在或浓度的方法，其特征在于，所述方法包括使所述样品与权利要求1所述的抗体、权利要求3所述的细胞培养物、或权利要求4所述的组合物接触的步骤。

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