CN108623662A - 植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用。具体地，本发明提供了一种植物病原菌抗原复合物，包括：(1)抗原蛋白R1，所述的抗原蛋白R1具有来源于植物病原菌的具有免疫原性的表位；(2)脂质结合蛋白R2；和(3)脂质分子R3；其中，所述的脂质结合蛋白围绕所述的脂质分子，而所述的脂质分子形成脂质层，而所述的抗原蛋白嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。本发明还提供了采用本发明抗原复合物制得的抗体，所述抗体可用于制备检测植物病原菌的试剂盒，用于实地检测植物病原菌。

Description

植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和植物疾病检测领域。具体地，本发明涉及植物病原菌抗体制备方法、抗体、检测试剂盒及其应用，尤其在在植物疾病检测中的应用。

背景技术

在自然界中，植物疾病可依造成因素分为两类，一是寄生性疾病，是由病原菌感染引起的疾病；二是非寄生性疾病，如养分缺乏，矿物类的毒害，光线不足或过多等原因造成的植物伤害。前者的可怕之处是传染性。当无法大量施用农药时，少数被感染的植物可以在短时间里传染大批的植物，疾病蔓延很难控制。受病原菌感染的植物不仅对人类和动物有毒害，更会使粮食的质量降低和产量减少。目前，每年全世界大约有25％的农作物因病害和虫害而损失，且有数以万计的植物疾病会影响所栽培的作物。柑橘黄龙病就是一个经典的例子。

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害，是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物。目前，该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区，中国19个柑橘生产省(市、自治区)中已有11个受到该病危害，严重制约柑橘产业的健康发展。

目前控制植物寄生性疾病的主要方法是早期鉴定疾病和相应的防治措施。以柑橘黄龙病为例，如果等一颗柑橘树的叶子已经明显变黄了再除去就太晚了，因为它很可能已经严重感染周边的一批柑橘树了。因此预防大面积感染必须用高灵敏度的手段频繁的检测黄龙病菌，鉴定早期被感染的柑橘树。目前能达到此灵敏度要求的是以PCR为主的分子生物学诊断方法。但是PCR方法的缺陷是需要专业人员操作，一般情况要把树叶样品带回实验室做实验。这个缺陷大大限制了农民进行普遍的和频繁的实地检测。

因此，本领域亟待开发高灵敏度的便于实地检测的植物疾病检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏、快速、可靠、特异性佳、便于实地使用的植物病原菌检测技术，包括植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种植物病原菌抗原复合物，所述的抗原复合物包括：

(1)抗原蛋白R1，所述的抗原蛋白R1具有来源于植物病原菌的具有免疫原性的表位；

(2)脂质结合蛋白R2；和

(3)脂质分子R3；

其中，所述的脂质结合蛋白围绕所述的脂质分子，而所述的脂质分子形成脂质层，而所述的抗原蛋白嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。

在另一优选例中，所述的抗原蛋白R1为重组蛋白。

在另一优选例中，所述的抗原蛋白R1为植物病原菌膜蛋白。

在另一优选例中，所述的抗原蛋白R1为植物病原菌全长膜蛋白和/或膜蛋白片段。

在另一优选例中，所述的膜蛋白片段为膜蛋白胞外区片段。

在另一优选例中，所述的抗原蛋白R1包括嵌入所述的脂质层的嵌入部(或跨膜部)、露出于所述脂质层的第一主表面的第一外露部(或对应于原抗原的胞外域)、以及露出于所述脂质层的第二主表面的第二外露部(或对应于原抗原的胞内域)。

在另一优选例中，所述的抗原蛋白R1为植物病原菌的具有免疫原性的表位与载体蛋白融合所形成的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的具有免疫原性的表位选自下组：位于第一外露部的表位、位于所述第二外露部的表位、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体蛋白选自：血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA。

在另一优选例中，所述的脂质层为双层结构。

在另一优选例中，所述双层结构中，亲水部分朝向外，而疏水部分朝向内。

在另一优选例中，所述的复合物中，R1与R2的重量比(或摩尔比)为1:2。

在另一优选例中，所述的复合物中，R3与R2的重量比(或摩尔比)为75-80:1。

在另一优选例中，所述的复合物中，R1与R3的重量比(或摩尔比)为1:150-160。

在另一优选例中，所述的复合物的分子量为150,000-180,000道尔顿。

在另一优选例中，所述的复合物的粒径为10-12nm。

在另一优选例中，所述的复合物中，所述的露出的具有免疫原性的表位的具有与所述植物病原菌中所述表位相同的空间结构和/或构象。

在另一优选例中，所述的复合物用于制备检测植物感染的抗体试剂。

在另一优选例中，所述脂质结合蛋白R2选自：膜支架蛋白(MSP)、鞘脂激活蛋白(Saposin)、双性链去污剂(amphipol)、苯乙烯马来酸链(SMALP)。

在另一优选例中，所述脂质R3选自：POPC/POPG组合、DMPC/DMPG组合、POPC/POPE、POPC/POPE/POPG。

在本发明的第二方面，提供了一种制剂，包括：

(1)本发明的第一方面所述的植物病原菌抗原复合物；和

(2)任选的缓冲溶液或缓冲剂。

在另一优选例中，所述的制剂为农用制剂。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体，所述抗体通过将本发明的第二方面所述的制剂施用于待免疫的动物来制备。

在另一优选例中，所述的抗体选自：单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、纳米抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为抗血清。

在另一优选例中，所述抗体是通过将本发明的第二方面所述的制剂免疫待免疫的动物，获得的针对该抗原复合物的多克隆抗体。

在另一优选例中，所述待免疫的动物选自：新西兰大白兔、小鼠。

在另一优选例中，所述抗体是通过将本发明的第二方面所述的制剂免疫小鼠，获取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选表达高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后表达和制备的针对该抗原复合物的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体是通过将本发明的第二方面所述的制剂作为筛选抗原，结合酵母展示技术筛选，得到的针对该抗原复合物的单链抗体。

在本发明的第四方面，提供了一种偶联物，所述偶联物包括本发明的第三方面所述的抗体以及与所述抗体相连的可检测标记物。

在另一优选例中，所述的可检测标记物包括生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、纳米金、量子点、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述酶选自：辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶。

在本发明的第五方面，提供了一种检测制品，所述检测制品含有本发明的第三方面所述的抗体或本发明的第四方面所述的偶联物。

在另一优选例中，所述检测制品用于检测植物病原菌。

在另一优选例中，所述的检测制品包括：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板、测试片。

在另一优选例中，所述的测试片包括：检测区，所述检测区固定有抗原生抗原的另一种抗体(抗体二)，所述抗体二用于捕获所述植物病原菌。

在另一优选例中，所述的测试片包括：质控区，所述质控区固定有与针对植物病原菌抗原复合物的抗体(一抗)结合的抗体(二抗)，所述二抗用于捕获所述针对植物病原菌抗原复合物的抗体(一抗)。

在另一优选例中，所述检测片选自：多孔板，较佳地为96孔板、PVDF膜。

在另一优选例中，所述与针对植物病原菌抗原复合物的抗体(一抗)结合的抗体(二抗)选自：羊抗鼠抗体、羊抗兔抗体、羊抗人抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含本发明的第一方面所述的复合物，本发明的第二方面所述的制剂，本发明的第三方面所述的抗体，本发明的第四方面所述的偶联物和/或本发明的第五方面所述的检测制品。

在本发明的第七方面，提供了本发明的第一方面所述的复合物，本发明的第二方面所述的制剂、本发明的第三方面所述的抗体和/或本发明的第四方面所述的偶联物的用途，用于制备检测植物病原菌的检测制品或试剂盒。

在本发明的第八方面，提供了一种制备如本发明的第一方面所述复合物的方法，包括以下步骤：

(1)制备抗原蛋白R1；

(2)表达纯化脂质结合蛋白R2；

(3)利用脂质分子R3与步骤(1)中的抗原蛋白R1、步骤(2)中的脂质结合蛋白R2混合，用分子筛纯化得到组装好的复合物；或利用脂质分子R3与步骤(2)中的脂质结合蛋白R2混合，用分子筛纯化得到空的纳米碟，再加入棕榈酰化的抗原蛋白R1，继续利用分子筛纯化得到组装好的复合物。

在本发明的第九方面，提供了一种制备如本发明的第三方面所述抗体的方法，用本发明的第一方面所述的复合物或本发明的第二方面所述的制剂，免疫待免疫的动物，从而获得抗体。

在另一优选例中，用本发明的第一方面所述的复合物或本发明的第二方面所述的制剂，免疫兔子获得兔多抗。

在另一优选例中，用本发明的第一方面所述的复合物或本发明的第二方面所述的制剂，免疫小鼠，获取脾细胞与骨髓瘤细胞融合、筛选单克隆细胞，获得鼠单抗。

在另一优选例中，用本发明的第一方面所述的复合物或本发明的第二方面所述的制剂，用于酵母展示技术筛选，从全人源单链抗体文库中筛选得到高亲和力的单链抗体。

在本发明的第十方面，提供了一种检测植物病原菌的方法，包括以下步骤：

(a)提供待检测的样品；

(b)将该样品与本发明的第三方面所述的抗体或本发明的第四方面所述的偶联物混合，形成混合物；

(c)检测所述混合物中“抗体-植物病原菌复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在植物病原菌；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在植物病原菌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1植物病原菌抗原复合物示意图，其中R1可为全长膜蛋白、膜蛋白胞外区片段；R2可为MSP、Saposin等结合脂质的蛋白；R3可为脂质，比如POPC/POPG、DMPC/DMPG等脂质混合物。

图2显示了将病原菌膜蛋白(BamA)组装进MSP纳米碟的SDS-PAGE结果。泳道1为纯化后的病原菌膜蛋白(BamA)，泳道2为MSP蛋白，泳道3为组装好的包含病原菌膜蛋白(BamA)的MSP纳米碟。

图3显示了抗BamA抗体检测柑橘叶中黄龙病病菌结果。叶子一到五是疑似感染黄龙病的柑橘叶；阳性对照为用全长膜蛋白BamA及其胞外区片段制备混合的原生抗原(见实施例6)；阴性对照为未感染的其他种类叶子。

图4显示了本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构，其中，1样品垫，2抗体释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了利用植物病原菌抗原蛋白(如细菌表面的膜蛋白)、脂质结合蛋白和脂质分子构建植物病原菌抗原复合物的方法，使用所构建的植物病原菌抗原复合物制备了多种抗体(如多抗、单抗、单链抗体、纳米抗体)，并使用所述抗体制备检测植物病原菌的检测制品(如测试片)以及试剂盒，实现了植物病原菌(例如柑橘黄龙病)的快速、灵敏、特异性佳的实地检测。在此基础上完成本发明。

术语

植物病原菌抗原复合物

如本文所用，“植物病原菌抗原复合物”、“膜蛋白原生抗原”、“原生抗原”、“抗原复合物”可以互换使用，指抗原蛋白R1、脂质结合蛋白R2、脂质分子R3形成的复合物，其中所述的抗原蛋白R1具有来源于植物病原菌的具有免疫原性的表位；所述的脂质结合蛋白围绕所述的脂质分子，而所述的脂质分子形成脂质层，而所述的抗原蛋白嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。

纳米碟(Nanodisc)

根据本发明，Nanodisc是指磷脂双分子层被脂质结合蛋白(如apolipoproteinA1，也称为membrane scaffold protein，MSP)圈住所形成的圆盘状复合物，由于没有detergent的参与，可高度模拟细胞膜。它的直径可由所使用的MSP蛋白长度决定，常见的为10.6nm和12.9nm，因此也被称为纳米碟。它由大约150个磷脂分子和两个MSP蛋白分子组成。

鞘脂激活蛋白(Saposin)

根据本发明，Saposin是指能同样结合脂质分子的Saposin A蛋白质，可替代MSP蛋白包裹磷脂双分子层，从而形成另一种形式的纳米碟。

脂质分子

在本发明中，脂质分子主要为类似于细胞膜上磷脂双分子层中的双亲磷脂分子，例如常见的有POPC/POPG组合、DMPC/DMPG组合、POPC/POPE组合、POPC/POPE/POPG组合。其中POPC为1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，POPG为1-棕榈酰基-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)，POPE(1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺)。DMPC为1,2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，DMPG为1,2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol)。

检测制品

本发明还提供了可用于检测植物病原菌的检测制品。

在本发明中，代表性的检测制品包括(但并不限于)：检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板。

在本发明中，检测试剂的形式没有特别限制，可以是固态、或液体，也可以是微球、胶体等形式。

一类特别有用的检测试剂是本发明抗体与可检测标记物形成的偶联物。

在本发明中，可检测标记物的种类没有特别限制，代表性的可检测标记物包括(但并不限于)：生物素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、放射性同位素、乳胶颗粒、抗体、配体、抗原、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的化学荧光基团包括Eva Green、罗丹明、FITC、TRITC、或其组合。

在另一优选例中，放射性同位素包括³²P、¹²⁵I、³⁶S等。

在另一优选例中，所述的化学发光基团包括鲁米诺等。

在本发明中，一类特别优选的检测制品是免疫/抗体芯片。在所述免疫/抗体芯片上，通常特定有多种探针，其中，所述芯片包括本发明的特异性针对植物病原菌的抗体，利用本发明抗体与植物病原菌可形成“抗体-植物病原菌”二元复合物的原理，可检测样本中所含植物病原菌的存在与否以及含量。

一种优选的检测植物病原菌的芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的抗体。其中，所述固相载体没有特别限制，可采用抗体芯片领域的各种常用材料，代表性的固相载体包括但不限于：尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

层析侧流片

一种优选的便于现场快速检测的检测制品是利用本发明抗体所制备的层析侧流片。

在本发明中，一种优选的检测试剂是利用侧流原理的层析侧流片(板)或层析试纸条。

本发明的一种层析侧流片(或试纸条)的结构如图4所示，其中包括：1样品垫，2抗体释放垫，3检测线，4反应膜，5对照线，6吸收垫，和7背衬。

在本发明中，所述侧流片的各组成元件(或组件)可选用本领域已有的材料制成。

为了便于理解本发明，给出本发明层析侧流片的检测原理。应理解，本发明的保护范围并不受该原理的影响或限制。

如果待测样品中含有植物病原菌，则植物病原菌将与本发明抗体结合形成“抗体-植物病原菌”复合物，一起沿硝酸纤维膜向前流动，到达检测区位置时，被固定在膜上的捕获剂捕获。例如可将抗体用胶体金标记，置于抗体释放垫(例如胶金垫)，而检测区固定有抗原生抗原的另一种抗体(抗体二)，所述抗体二用于捕获所述植物病原菌；质控区固定有与针对植物病原菌抗原复合物的抗体(一抗)结合的抗体(二抗)，所述二抗为羊抗鼠或羊抗兔或羊抗人二抗(视胶体金标记的抗体来源而定)，用于捕获所述针对植物病原菌抗原复合物的抗体(一抗)。检测线和质控线都呈现红色，意味着检测结果为阳性。检测线无颜色，质控线呈红色，表示结果为阴性。此外，质控区用于说明检测系统工作正常。

当然，也可以采用其他方式来检测“抗体-植物病原菌”复合物的形成与否和/或数量。

本发明的检测板结构简单、轻便，易于携带，可以现场检测，而且不需要昂贵的设备。使用本发明的检测板检测所述植物病原菌，整个测试可在10-20min内完成，检测的灵敏度可达约1-20ng/ml，与其他干扰物质如植物细菌蛋白没有交叉反应。

检测时，可平放检测板，将试样滴在滤样纸上，适量试样，10～20min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果，

阳性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阳性；

阴性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阴性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

如果检测区较浅于质控区说明待检测植物感染所述植物病原菌较少，所以质控区也是检测板判别植物感染所述植物病原菌状况的标准。

检测试剂盒

本发明还提供了可用于检测植物病原菌的检测试剂盒。

在本发明中，检测试剂盒中可含有本发明的抗体、偶联物、复合物(作为对照品或标准品)、检测试剂、和/或检测芯片。

所述的试剂盒可用于检测本发明的抗体-植物病原菌复合物，从而用于检测植物病原菌。

此外，所述的试剂盒中还可包括任选的用于检测的其他试剂，例如用于显色等所需的各种试剂，包括但不限于：酶、对照液、显色液等。

所述的试剂盒中还可包括使用说明书。优选地，所述说明书中可包括标准曲线等信息。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明检测植物病原菌的方法成本低，便于推广应用；

(2)本发明检测植物病原菌的方法可在果园等野外场地实施检测，相比传统的PCR法更为简单易行；

(3)本发明检测植物病原菌的方法可由任何人施行，无需PCR技术等所需的专业技术人员。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

通用方法

1 植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的制备方法

根据本发明，植物病原菌抗原复合物(原生抗原)是通过Nanodisc、Saposin等纳米碟技术以及棕榈酰化等方法赋予全长膜蛋白抗原或部分胞外区媲美真实细胞膜膜环境。

对于可在大肠杆菌内表达的细菌膜蛋白：构建表达植物病原菌表面的膜蛋白的原核表达载体；在大肠杆菌细胞内内表达膜蛋白，由于膜蛋白中信号肽、跨膜区的存在，膜蛋白将表达在大肠杆菌细胞的内膜或外膜上；将纯化后的膜蛋白置于Nanodisc、saposin等脂质结合蛋白形成的“纳米碟”中央，此时膜蛋白所处的膜环境与其原本的细胞膜环境相似，因此可成为植物病原菌抗原复合物(原生抗原)；

对于无法在大肠杆菌内可溶表达的膜蛋白：体外化学合成植物病原菌表面膜蛋白上的胞外区片段，将其偶联至蛋白载体上或经棕榈酰化(十六烷酰化)将它的两端插入到上述Nanodisc或saposin形成的“纳米碟”膜上，形成植物病原菌抗原复合物(原生抗原)。

图1为植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的结构示意图，其中，抗原蛋白R1可为全长膜蛋白、膜蛋白胞外区片段；脂质结合蛋白R2可为MSP、Saposin等结合脂质的蛋白；脂质分子R3可为POPC/POPG、DMPC/DMPG等脂质混合物。

本发明植物病原菌抗原复合物(原生抗原)基本上可通过如下四种方法制备。

1.1 第一种制备植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的方法

将表达在大肠杆菌膜上的膜蛋白纯化；利用MSP蛋白制备空的Nanodisc样品；将膜蛋白和空的Nanodisc混合均匀，快速脱盐除去detergent等杂质，使膜蛋白能够迅速进入Nanodisc中，从而制备成原生抗原。

根据本发明一个优选的实施方式，将表达在大肠杆菌膜上的带有纯化标签(如HIS-tag，Strep-tag等)的膜蛋白在温和detergent(如2％n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside,2％DDM)存在下溶解，用Ni-NTA亲和柱进行纯化，得到的膜蛋白用缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,5％glycerol,0.4％N-Nonyl-b-D-Maltopyranoside(NM))溶解。将一定量的脂质(lipid，如DMPC，brain lipids等)与DDM孵育使前者溶解，再加入一定量纯化好的膜蛋白，混合均匀后在37℃孵育10min，孵育结束后加入MSP蛋白继续在37℃孵育5min。然后用Biobeads或凝胶过滤柱(Superdex200)分离含有膜蛋白的Nanodisc，即得到膜蛋白原生抗原。

1.2 第二种制备植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的方法

将表达在大肠杆菌膜上的膜蛋白纯化；利用Saposin蛋白制备空的“纳米碟”；将膜蛋白和空的纳米碟混合均匀，快速脱盐除去detergent等杂质，使膜蛋白能够迅速进入Saposin纳米碟中，从而制备成原生抗原。

根据本发明一个优选的实施方式，将表达在大肠杆菌膜上的带有纯化标签(如HIS-tag，Strep-tag等)的膜蛋白在温和detergent(如2％n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside,2％DDM)存在下溶解，用Ni-NTA亲和柱进行纯化，得到的膜蛋白用缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,5％glycerol,0.4％N-Nonyl-b-D-Maltopyranoside(NM))溶解。将一定量的脂质brain lipids(Sigma)与DDM孵育使前者溶解，再加入一定量纯化好的膜蛋白，混合均匀后在37℃孵育10min。孵育结束后加入Saposin蛋白继续在37℃孵育5min。然后用Bio-beads或凝胶过滤柱(Superdex200)分离含有膜蛋白的Saposin纳米碟，即得到膜蛋白原生抗原。

1.3 第三种制备植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的方法

对于无法在大肠杆菌膜上表达的病原菌膜蛋白，则通过将其与已知同源蛋白结构进行比对，得到胞外区片段的氨基酸序列。然后将胞外区片段的两端或其中一端进行棕榈酰化(pami ltoylation)修饰。再将经棕榈酰化修饰的胞外区片段插入到上述两种制备方法中所述的Nanodisc或Saposin纳米碟的膜内。如此，胞外区片段所形成的抗原表位即可被递呈，原生抗原得以制备。

根据本发明一个优选的实施方式，对于无法在大肠杆菌膜上表达的病原菌膜蛋白，则通过将其与已知同源蛋白结构进行比对，得到胞外区片段的氨基酸序列。然后将胞外区片段的两端或其中一段进行棕榈酰化(pamiltoylation)修饰。由于棕榈酰的疏水端可插入到磷脂双分子层中，经棕榈酰化修饰的胞外区片段可插入到上述方法一和方法二中所述的Nanodisc或Saposin纳米碟的膜内。如此，胞外区片段所形成的抗原表位即可被递呈，且处于类似细胞膜的环境中，起到原生靶点的效果。

1.4 第四种制备植物病原菌抗原复合物(原生抗原)的方法

将对于无法在大肠杆菌膜上表达的病原菌膜蛋白，则通过将其与已知同源蛋白结构进行比对，得到胞外区片段的氨基酸序列。然后将胞外区片段的两端或其中一端偶联至大蛋白载体表面(如KLH和BSA)。如此，胞外区片段所形成的抗原表位即可被递呈，模拟胞外区片段在细胞膜表面上的结构。

根据本发明一个优选的实施方式，将对于无法在大肠杆菌膜上表达的病原菌膜蛋白，则通过将其与已知同源蛋白结构进行比对，得到胞外区片段的氨基酸序列。然后利用固相法化学合成胞外区片段，并在胞外区片段的两端或其中一端添加半胱氨酸，使其能够通过半胱氨酸的巯基偶联至蛋白载体(如KLH和BSA)的巯基上。如此，胞外区片段所形成的抗原表位即可被递呈，模拟胞外区片段在细胞膜表面上的结构。

本领域技术人员可以理解，按照上述反应路线以及优选的实施方式中所描述的方法，可以类似地制备本发明里提到的其它植物病菌膜蛋白的原生抗原，并不具有局限性。

2 抗体的制备方法

用本发明植物病原菌抗原复合物(原生抗原)筛选和制备高亲和力抗体。

2.1 多克隆抗体的制备方法

用Nanodisc、Saposin纳米碟等方式制备的膜蛋白原生抗原免疫新西兰大白兔，获得针对该抗原的多克隆抗体。

2.2 单克隆抗体的制备方法

用Nanodisc、Saposin纳米碟等方式制备的膜蛋白原生抗原免疫小鼠，获取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选表达高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后表达和制备高亲和力抗体。

2.3 单链抗体的制备方法

将Nanodisc、Saposin纳米碟等方式制备的膜蛋白原生抗原作为筛选抗原，结合酵母展示技术筛选针对该抗原的单链抗体，筛选得到高亲和力的单链抗体。利用酵母表达制备该高亲和力单链抗体。

3 使用抗体检测植物病原菌的方法

3.1 方法一 直接ELISA

利用尿素、detergent等蛋白变性剂提取待检测植物叶子总蛋白，将总蛋白稀释后铺96孔板，使得总蛋白均被吸附在96孔板底部。然后利用本发明第三方面中所述的抗体作为一抗和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，通过ELISA法检测总蛋白中的病原菌特异性膜蛋白抗原。

3.2 方法二 Dot-ELISA

取植物叶子待检测部位(如叶脉，叶肉部分)，将它按压在PVDF膜上，使得汁液在膜上留下印迹。然后利用本发明第三方面中所述的抗体作为一抗和辣根过氧化物酶(HRP)或荧光标记的二抗，通过Dot-ELISA法检测印在PVDF膜上的病原菌特异性膜蛋白抗原。

3.3 方法三 胶体金试纸条

将通过膜蛋白原生抗原制备的抗体用胶体金标记，同时利用对应的膜蛋白原生抗原作为对比抗原，制作免疫胶体金试纸条，用于检测待检植物样本中病原菌特定蛋白是否为阳性，从而判断植物中病原菌的存在情况。具体的免疫胶体金试纸条制备方法参考中国发明专利：早孕检测试纸条及其检测方法(申请号：CN 201210408690)。主要设计为胶体金标记的抗原生抗原的抗体一置于胶金垫，抗原生抗原的另一种抗体(抗体二)刻于硝酸纤维膜(NC)的检测线上，羊抗鼠或羊抗兔或羊抗人二抗(视胶体金标记的抗体来源而定)则刻于质控线处。检测线和质控线都呈现红色，意味着检测结果为阳性。检测线无颜色，质控线呈红色，表示结果为阴性。

4 柑橘黄龙病的检测抗体的制备方法

以柑橘中的黄龙病为例，黄龙病由细菌Candidatus liberibacter感染柑橘导致，在中国黄龙病细菌为Candidatus Liberibacter asiaticus，属于亚洲常见的亚种。因此我们选取该细菌亚种中的细胞外膜常见膜蛋白BamA作为抗原。将BamA全长蛋白表达在大肠杆菌膜上，同时通过已知同源结构比对找到BamA的胞外区片段(loop)进行化学合成，然后按照本发明内容的第八方面制备膜蛋白原生抗原，按照本发明内容的第九方面制备高亲和性抗体。得到的多抗、单抗或单链抗体即为柑橘黄龙病的检测抗体。

5 柑橘黄龙病的检测方法

以柑橘黄龙病基于抗体的实地检测为例，将本发明第一方面的膜蛋白原生抗原和第三方面的抗体制备成免疫胶体金试纸条。采集可疑的柑橘黄龙病感染树叶，剪取叶脉部分，剪成小段并捣成汁液。取少许汁液滴入胶体金试纸条检测区，10～20分钟后观察试纸条上检测线和质控线颜色变化。

实施例1：植物病原菌膜蛋白的制备和纯化

细菌膜蛋白均有较大概率表达在大肠杆菌细胞膜上，因此在这个实施例中以黄龙病菌靶点抗原BamA的制备和纯化为例，说明植物病原菌膜蛋白一般的制备和纯化过程。

选择黄龙病菌中含量丰富的外膜蛋白Outer membrane protein assemblyfactor BamA[Candidatus Liberibacter asiaticus]作为免疫检测黄龙病菌的靶点抗原。将BamA的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)的基因优化为大肠杆菌偏爱的密码子序列(见Seq ID No 1)，委托Genescript合成优化后的基因并在3’端加上His-Tag(六个组氨酸序列，Ni-NTA亲和纯化标签)的基因序列，并放入pET28a质粒的NcoI和XhoI酶切位点之间。将合成好的pET28a-BamA-His转化BL21(DE3)感受态细胞，铺LB琼脂板。挑取BL21(DE3)单菌落，加入至LB培养基中(卡那霉素抗性，50ug/mL)，37度培养至OD600为0.5～0.8，加入0.1mM的IPTG表达诱导剂，并将温度调低至16度，继续培养过夜。第二天，4000rpm离心30min收集细胞，加入50mL 40mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，200mM NaCl，1：100稀释蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)，然后通过超声破碎的方法裂解菌体。裂解后，10000g转速4度离心30分钟，收集含有细胞膜的上清。然后用Beckman超高速离心机SW28转头以27000rpm的转速，在4度条件下高速离心2小时，去除上清，收集沉淀(细胞膜碎片)。加入30mL 2％的DDM重悬细胞膜碎片，在4度搅拌溶解过夜。再次用Beckman超高速离心机SW28转头以27000rpm的转速，在4度条件下高速离心2小时，收集上清，即为溶解在DDM中的细胞膜总蛋白。

SEQ NO 1：BamA基因序列

将上述溶解在2％DDM中的细胞膜总蛋白用Ni-NTA亲和纯化填料纯化出带有Hig-Tag的BamA膜蛋白。具体步骤如下：亲和填料用5倍柱体积(填料体积)的40mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，200mM NaCl，0.2％DDM平衡，然后将细胞膜总蛋白样品与平衡后的填料混合，室温孵育半小时。利用重力让蛋白样品流穿填料形成的柱床，再用10倍柱体积含有50mM咪唑的40mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，200mM NaCl，0.2％DDM洗涤，最后用5倍柱体积含有500mM咪唑的40mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，200mM NaCl，0.2％DDM洗脱Ni-NTA亲和填料上BamA-His蛋白，用PD10脱盐柱或超滤管(Millipore，10kDa)除去咪唑，至此完成BamA膜蛋白的纯化。

实施例2：制备纳米碟“框架蛋白”MSP和Saposin

对于MSP，其氨基酸全长序列为：M H H H H H H L V P R G S P L K L L D N WD S V T S T F S K L R E Q L G P V T Q E F W D N L E K E T E G L R Q E M S K DL E E V K A K V Q P Y L D D F Q K K W Q E E M E L Y R Q K V E P L R A E L Q EG A R Q K L H E L Q E K L S P L G E E M R D R A R A H V D A L R T H L A P Y SD E L R Q R L A A R L E A L K E N G G A R L A E Y H A K A T E H L S T L S E KA K P A L E D L R Q G L L P V L E S F K V S F L S A L E E Y T K K L N T Q(SeqID No2)。基因序列经大肠杆菌表达密码子优化，克隆进pET21b质粒，构建pET28a-HIS-MSP表达载体。取1ul表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后的BL21(DE3)单菌落至LB培养基中(含50ug/mL卡那霉素)，37度培养至OD600＝0.7，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37度继续培养3到4小时。离心收集表达完成后的菌体，重悬于50mM Tris-HCl，pH8.0 500mMNaCl,1％TritonX-100,1mM EDTA，1:100稀释蛋白酶抑制剂cocktai l(Sigma)，利用超声破碎。加入DNaseI水解酶在冰上孵育1小时。孵育结束后，菌液在17000rpm离心20分钟收集上清。利用Ni-NTA亲和纯化HIS-MSP蛋白，先将Ni-NTA填料用上样缓冲液平衡，上样缓冲液为：50mM Tris,pH8.0 500mM NaCl,1％TritonX-100。然后加入上述破碎后菌液上清，使其缓慢流穿Ni-NTA亲和柱，再用10倍柱体积上样缓冲液洗涤、平衡柱子。紧接着用10倍柱体积洗涤缓冲液一(50mM Tris-HCl，pH8.0 500mM NaCl，50mM Cholate)冲柱子。然后用10倍柱体积50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl洗柱。加入10倍柱体积洗涤缓冲液二(50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl，20mM咪唑)洗去非特异性结合在柱子上的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0 500mM NaCl，500mM咪唑)洗脱HIS-MSP。利用透析法将HIS-MSP的缓冲液置换成50mM Tris pH8,20mM NaCl,1mM EDTA,2mM DTT。加入HIS-TEV酶除去HIS-MSP中的His-Tag，酶解完成后再利用透析法将缓冲液换成50mMTris pH8.0,500mM NaCl，然后用Ni-NTA纯化，收集流穿柱子的MSP蛋白，浓缩至1mM，至此得到纯化后的MSP蛋白。

对于Saposin蛋白的制备、纯化，可参考论文：Frauenfeld J,Loving R,ArmacheJP,Sonnen AF,Guettou F,Moberg P,等人A saposin-lipoprotein nanoparticle systemfor membrane proteins.Nature methods.2016；13:345-51.

实施例3：纳米碟制备

本实施例中纳米碟的制备包含空的纳米碟和已与原生抗原组装好的纳米碟制备过程。其中纳米碟的框架蛋白可为MSP或Saposin蛋白。纳米碟中的脂质(lipid)包括POPC/POPG组合、DMPC/DMPG组合。其中POPC为1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine，POPG为1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol。DMPC为1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine，DMPG为1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-Glycerol)](Sodium Salt)。POPC/POPG的加入量摩尔比为3:2，DMPC/DMPG的加入量摩尔比3:1。

3.1对于MSP为框架蛋白的纳米碟制备

A.制备空的MSP纳米碟：将POPC/POPG(3:2)或DMPC/DMPG(3:1)用SodiumCholate溶解，再与实施例二中的纯化好的MSP混合，在冰上孵育1～3小时，然后加入Bio-Beads(Bio-Rad)在4度孵育过夜。孵育后利用0.22um孔径的滤膜过滤除去Bio-Beads。过滤后的反应液用分子筛纯化，分离出组装完成的空MSP纳米碟。

B.制备包含病原菌膜蛋白原生抗原的MSP纳米碟：将实施例一中纯化后的病原菌膜蛋白原生抗原用Bio-Beads快速除去变性剂(detergent)(如DDM)，然后与本实施例中的空纳米碟混合，在冰上孵育1～3小时。利用分子筛除去空的纳米碟，分离出组装了病原菌膜蛋白原生抗原的MSP纳米碟，其SDS-PAGE结果如图2所示，泳道1为纯化后的病原菌膜蛋白(BamA)，泳道2为MSP蛋白，泳道3为组装好的包含病原菌膜蛋白(BamA)的MSP纳米碟，结果表明病原菌膜蛋白(BamA)已成功组装进MSP纳米碟。

3.2对于Saposin为框架蛋白的纳米碟制备

A.制备空的Saposin纳米碟：首先将Type I brain lipid extract from bovinebrain(I型小牛脑脂质提取物)(Sigma-Aldrich)用溶解缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5,150mMNaCl,1％DDM)配制成25mg/mL的脂质储存液，并将其在37度孵育1小时。用稀释缓冲液(50mMHEPES,pH 7.5,150mM NaCl,0.03％DDM)将脂质储存液的脂质浓度稀释至5mg/mL，并与两倍体积的纯Saposin蛋白(约1mg/mL，溶解于20mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl)在37度孵育5～10分钟，然后反应溶液等体积的分子筛上样缓冲液(20mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl)在室温条件下孵育10～30分钟。孵育完成后，反应溶液用分子筛纯化，分离出组装完成的空Saposin纳米碟。

B.制备包含病原菌膜蛋白原生抗原的Saposin纳米碟：取40ul的Type I brainlipid(I型小牛脑脂质提取物)溶液(5mg/ml brain lipids(Sigma-Aldrich),50mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,0.28％DDM)与5ul蛋白酶抑制剂Cocktail(商品化的各类抑制剂混合物，直接稀释使用)在37度孵育5分钟。再加入20ul纯的病原菌膜蛋白原生抗原(10mg/mL)继续在37度孵育5～10分钟。孵育完成后加入140ul纯的Saposin蛋白(1mg/mL，20mM HEPES,pH7.5,150mM NaCl)在37度孵育5分钟。接着加入145ul PBS(pH 7.4)孵育5分钟，最后继续加入150ul PBS(pH 7.4)。反应溶液用分子筛纯化，分离出组装了病原菌膜蛋白原生抗原的Saposin纳米碟。

实施例4：制备植物致病菌膜蛋白胞外区片段

在此实施例中继续以黄龙病菌靶点抗原BamA的胞外区为例，借此说明植物病原菌膜蛋白胞外区的选择、制备。

通过与大肠杆菌BamA已知晶体结构的同源序列比对，找到黄龙病菌靶点抗原BamA的胞外区序列(如loop序列)。然后列出多个包含BamA胞外区序列的片段序列(见表1)，利用固相合成法合成所有片段。

表1多个包含BamA胞外区序列的片段序列

名称	氨基酸序列	氨基酸数目
			BamA 1	EKEKIPSIYTTLIEHGKFSSHS	25
BamA 2	GAISEKEKIPSIYTTLIEHGKFSSHS	29
			BamA 3	EKEKIPSIYTTLIEHGKFSSHSISQS	29
BamA 4	GPRVDKKYAIGGK	16
			BamA 5	GPRVDKKYAIGGKIYSSA	21
BamA 6	AYKGIGPRVDKKYAIGGK	21
			BamA 7	ANHVALGADKLEGNDSFW	21
BamA 8	ATLYANHVALGADKLEGNDSFWRVST	29
			TolC 1	SLSLNGSIALTHDNS	18
TolC 2	DLYPSLSLNGSIALTHDNS	22

实施例5：利用植物致病菌膜蛋白胞外区片段制备原生抗原

A.将植物致病菌膜蛋白胞外区片段装入空的纳米碟

由于植物致病菌膜蛋白胞外区没有疏水的跨膜区，无法装入空的纳米碟中。因此，将实施例4中制备的植物致病菌膜蛋白胞外区片段进行棕榈酰化(十六烷酰化)。

将棕榈酸的羧基端用马来酰亚胺基团活化，需要进行棕榈酰化的膜蛋白胞外区在其两端均引入半胱氨酸残基。先用4倍摩尔比过量的还原剂TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)还原膜蛋白胞外区片段两端的半胱氨酸残基，在37度孵育2小时；孵育结束后，加入4～10倍摩尔比过量的马来酰亚胺活化棕榈酸，在冰上反应1小时；反应结束，用PD10脱盐柱除去未反应的棕榈酸、TCEP等小分子，得到棕榈酰化的植物致病菌膜蛋白胞外区片段；然后以摩尔比1:2～1:5的比例将其与空的纳米碟混合，室温孵育1～3小时；孵育结束后，用分子筛收集最先出峰的膜蛋白胞外区与纳米碟复合物，即组装了植物致病菌膜蛋白胞外区片段的纳米碟，该片段的N末端和C末端均利用棕榈酸的脂肪链插入纳米碟的磷脂双分子层中，模拟它在完整膜蛋白中的构象。

B.将植物致病菌膜蛋白胞外区片段与大蛋白载体偶联

以KLH作为大蛋白载体为例说明。

将需要进行偶联的膜蛋白胞外区在其N末端或C末端引入半胱氨酸残基。用少量DMF溶解多肽，静置半小时，待溶液中无颗粒状不溶物，加适量缓冲液配制成6mg/ml的多肽母液备用；根据质量比，偶联多肽总量：纯KLH＝1：1，计算出纯KLH的量，按照质量比，纯KLH：Sulfo-SMCC＝10：1，计算出Sulfo-SMCC的量；将称取的KLH溶于适量的缓冲液配置成终浓度10mg/ml，Sulfo-SMCC用DMSO溶解成100mg/ml的溶液，将二者混合摇匀，室温反应4h并间断混摇使其充分反应，用层析柱分离样品；向每一管偶联多肽中加入相应量KLH与Sulfo-SMCC反应物，室温反应2h或室温过夜，并用垂直混合仪混匀，将偶联好的多肽至于-20℃保存，得到偶联在大蛋白载体(KLH或BSA)上的植物致病菌膜蛋白胞外区片段。

实施例6：将植物病原菌膜蛋白原生抗原免疫动物获得抗体

用实施例3～5中的原生抗原混合物作为免疫抗原，免疫新西兰大白兔或小鼠；第一次免疫，将原生抗原混合物(每种抗原200ug左右)与弗氏完全佐剂混合均匀，在兔子或小鼠的背部多点皮下注射；两周后进行第二次免疫，将原生抗原混合物(每种抗原200ug左右)与弗氏不完全佐剂混合均匀，在兔子或小鼠的背部多点皮下注射；距离第二次免疫四周后进行第三次免疫，将原生抗原混合物(每种抗原100ug)与弗氏不完全佐剂混合均匀，在兔子或小鼠的背部多点皮下注射。

对于兔多抗的制备，用ELISA检测动物血清的效价，当效价达到1:32000时，收集免疫动物血清，用辛酸沉淀法和Protein A亲和层析柱纯化血清中的抗体。

对于鼠单抗的制备，用ELISA检测动物血清的效价，当效价达到1:32000时，收集免疫动物脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选效价高的单克隆细胞，放大培养后收集表达上清，用ProteinA亲和纯化单克隆抗体。

实施例7：酵母展示技术筛选针对植物病原菌膜蛋白原生抗原的单链抗体

将MSP或Saposin的N末端用NHS-Biotin修饰，然后用Biotin-MSP或Biotin-Saposin制备实施例3和5中的原生抗原纳米碟。用该Biotin标记的原生抗原纳米碟作为酵母展示技术筛选过程的抗原，同时利用空纳米碟作为抗原对照，用细胞分选仪筛选时间隔加入空纳米碟作为抗原的筛选，最终目的在于筛选出只针对原生抗原中病原菌膜蛋白部分的单链抗体。其他流程参考Ginger Chao等人,Isolating and engineering humanantibodies using yeast surface display.Nature Protocols.1,755-768(2006)中描述的筛选流程。

将筛选到的高亲和力酵母单克隆扩增培养，利用试剂盒提取酵母基因组。通过PCR的方式获得高亲和力酵母单克隆细胞中单链抗体的基因序列，并将之亚克隆到pRS314载体中，构建单链抗体分泌表达质粒。将该质粒通过电转转入酵母表达宿主YVH10感受态中，在URA+SDCAA平板上挑取阳性单克隆。利用URA+SDCAA液体培养基扩增用于分泌表达单链抗体的酵母单克隆，当OD600达到3～8时，换成URA+SGCAA培养基，20～30度继续表达2到4天。收集表达上清，脱盐后用离子交换柱纯化得到针对特定病原菌膜蛋白的高亲和力单链抗体。

实施例8：提取待检测植物组织总蛋白

以黄龙病为例，提取待检测柑橘树叶子总蛋白，以此阐述本实施例技术内容。

(1)将250mg左右的树叶在研钵中加液氮研磨成粉末状，然后转移至2mL的EP管内，并放置于-20度；

(2)每管加入1.5mL的甲醇工作液(含有蛋白酶抑制剂cocktail的100％甲醇，-20度预冷)，vortex震荡混匀30秒，置于-20度5分钟，期间偶尔混匀；

(3)在4度以16000g的转速离心样品5分钟，去除上清；

(4)重复步骤(2)和(3)三次；

(5)去除上清后，将EP管倒置于纸上去除残留的甲醇；(6)加入1.5mL的丙酮(-20度预冷)，vortex震荡混匀30秒，置于-20度孵育5分钟，期间偶尔混匀；

(7)在4度以16000g的转速离心样品5分钟，去除上清后，在室温条件下静置10分钟，除去剩余的丙酮溶剂，再用泵吹气2分钟干燥样品；

(8)重复步骤7一次；

(9)称取干燥后样品的重量，以每mg加4uL的量加入Reagent Type 4 WorkingSolution(Sigma)，利用Vortex彻底混匀、溶解样品，然后在室温孵育15分钟；

(10)孵育结束后16000g离心30分钟，收集上清即为植物样本总蛋白。

实施例9：利用植物病原菌膜蛋白原生抗原制备的抗体检测植物样品中的病原菌

以黄龙病病原菌全长膜蛋白BamA制备的MSP纳米碟为例，BamA置于MSP纳米碟中作为原生抗原，其胞外区片段同样以实施例5中的方法制备成原生抗原。针对BamA的抗体以实施例6中的方法制备。

将实施例8中得到的待检测植物组织总蛋白提取物用PBS(pH 7.4)稀释1000倍，取100uL铺96孔板，4度过夜；用PBST洗板4次，拍干后加入200uL封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST)，37度孵育2小时；加入不同浓度的抗BamA抗体(用含2％脱脂奶粉的PBST稀释)100uL，37度孵育2小时；用PBST洗板4次，拍干；加入1：1000稀释的HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(视一抗来源而定)100uL，37度孵育1小时；用PBST洗板4次，拍干；加入100uL ABTS，37度继续孵育至部分孔颜色变深蓝；用酶标仪在405nm处读取96孔板的各孔度数，绘制OD405-抗体浓度曲线图。结果如附图3和表2所示，相比文献(Yuan Q.等人.Development of singlechain variable fragment(scFv)antibodies against surface proteins of'Ca.Liberibacter asiaticus'.J Microbiol Methods.2016Mar；122:1-7.)中取叶子的叶脉搅碎成汁，然后取5ul直接点在硝酸纤维素膜上用Dot-ELISA方法检测，本发明中的方法只需一片叶子，且最终检测时稀释了1000倍，相当于将灵敏度提高了1000倍左右。

表2抗BamA抗体检测柑橘叶中黄龙病病菌的酶标仪读取结果

注：用96孔板酶标仪对ELISA结果进行检测，检测波长为405nm。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 周, 界文

潘, 利强

<120> 植物病原菌抗原复合物、抗体、检测试剂盒及其应用

<130> P2017-0006

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2361

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcacaaaa gcaccgaaga ctttcgccgt atcaagcgtt tattagaaaa gtatttccct 60

cgctctttcc agatgggatt catcatcttg ttctatgcaa ttttcggtct gtcggcagtt 120

tacggttcta ataccagtat cgtgcgtcgt attgaaattc gtggggcgac caacgtagga 180

aaggaggtca ttcttagtcg cattcccgtg gtggtcggtc agtcaatcag cgatgctgac 240

ctggaccacg ctgttaaaaa tatctacgcc atggggtatt tttctaacgt caaaatcaag 300

attgttgata gtgtcttgat cattgacctt attgaacgca aaattattaa tcaccttttt 360

ttctctggaa acaacaacct gaaagatgat cagttgaaaa tgattgtacg ctcacgctct 420

gcagctgctt acgatgaaga cacagtcaat gcggatgttc acaatatcaa gcaagcatat 480

gcctctatcg gttacttgaa tgtgatggtc aaggtccagc atcactctat ctccccgaca 540

actttaaaca tcacgtatgt gattgaagag ggcgttaagg caaaaatcaa ctctattcgt 600

tttgtcggaa acaaaaacta ctcacacgcg cgtcttgagc gtgtaatttc gattcgtacg 660

tcaggttact ttagttttgg gaagacagac gtctattcta aggagcgcat gtcattcgac 720

gaggaggcaa ttcgcgcctt ctatcacgat cgtggctacg cagccgtaaa ggttagtagt 780

caagtattat tcgacaagca gaaatccgga tatgtattaa ttttccaaat cgacgaaggc 840

gagatctaca ctgtgggtaa catttcgatc cagtcgacac ttcaggagat tcaaaaaaaa 900

acgttgctgt cattgatccg tattcgttct gggaacctgt ataatccgca ggagatcaaa 960

gaatcttccg aaaaaattag caagtatttt ttttcgggtg agcgtccgtt tgttcgcgtt 1020

aaaacacgca ttaaccgcga ttttgctaag cgtatcgtag acattgaata cctgattgat 1080

caaggttcac ctttgtacgt caaacgtatc gagatcgagg gtaatgatca gagttatgac 1140

agcgtaatcc gccgtgagtt agaattgtca gaaggcgatc caatcaacta cagcatgatt 1200

gagcgtgcta aacgccgtat catggcgaca ggctattttt cagaagtaaa tatttctcaa 1260

ttacctgcaa acgatgtctc tgactacgtc atcttacgtg tcagcgtgaa gcaactttcc 1320

gcaggctcgg tcggcattgc gacaaactac gaggttgata agggcatggg cgtcgaggga 1380

catattgacg ataacaattt ttttggccag ggctatcgcg ctcgcttagc tgcggggttc 1440

ggtcgtcatg cggtgcagaa ctatactttc agcgttgagg atccctactt tcttggttca 1500

cctatcagtg ccggatttga tttacagaag acgcatttgg aggatggcag tttagatatc 1560

aatgatgaga gtgcggctgt tcgcatgatc gtaccgatca ctgagtccat tagcacttct 1620

tttaagtacg acctgcgttt cctgcaatac ggggcgatct cggagaaaga gaaaattccc 1680

agcatttata caacattaat tgaacatggt aagttctcct cacactctat ctctcagagc 1740

attatttata acactcttga taatccaatc gtaccgcgta aggggatgtt gatcagctct 1800

tcttatgatt acgctggttt tggcggagac tcacagtacc atcgtatcgg gtcccgcgcg 1860

tcctactttt atttattgtc cgatgactca gatatcgtcg gatcgcttcg cttcggatat 1920

ggatgcgtaa tcccgtccaa taaaaacctt cagttgttcg atcaattttc tgtcagcagc 1980

aattactacc tgcgtggatt cgcgtacaag gggattggtc cccgcgtcga caagaaatac 2040

gcgattggcg ggaaaatcta ttcatctgcg tcggccgcag tctctttccc aatgccgtta 2100

gttcctgaac gcgcgggcct gcgtggggcg ttttttgtgg attccgcgac attgtatgct 2160

aaccatgttg ctttaggtgc agacaaattg gaagggaatg actcgttctg gcgtgtatcc 2220

actggtgtcg agatcatgtg gaacagtcca cttggcatga tgggcgttta ttacgggatc 2280

ccactgcgtc atcgcgaagg agataaaatt cagcagttcg gctttcgtat tggaaatcgc 2340

atgcaccacc accaccacca c 2361

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Leu Lys

1 5 10 15

Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg

20 25 30

Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys

35 40 45

Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val

50 55 60

Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln

65 70 75 80

Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu

100 105 110

Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp

115 120 125

Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg

130 135 140

Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu

145 150 155 160

Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu

165 170 175

Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val

180 185 190

Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr

195 200 205

Lys Lys Leu Asn Thr Gln

210

Claims (10)

1.一种植物病原菌抗原复合物，其特征在于，所述的抗原复合物包括：

(1)抗原蛋白R1，所述的抗原蛋白R1具有来源于植物病原菌的具有免疫原性的表位；

(2)脂质结合蛋白R2；和

(3)脂质分子R3；

其中，所述的脂质结合蛋白围绕所述的脂质分子，而所述的脂质分子形成脂质层，而所述的抗原蛋白嵌入所述的脂质层，并露出所述的具有免疫原性的表位。

2.一种制剂，其特征在于，包括：

(1)权利要求1所述的植物病原菌抗原复合物；和

(2)任选的缓冲溶液或缓冲剂。

3.一种抗体，其特征在于，所述抗体通过将权利要求2所述的制剂施用于待免疫的动物来制备。

4.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求3所述的抗体以及与所述抗体相连的可检测标记物。

5.一种检测制品，其特征在于，所述检测制品含有权利要求3所述的抗体或权利要求4所述的偶联物。

6.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1所述的复合物，权利要求2所述的制剂，权利要求3所述的抗体，权利要求4所述的偶联物和/或权利要求5所述的检测制品。

7.权利要求1所述的复合物，权利要求2所述的制剂、权利要求3所述的抗体和/或权利要求4所述的偶联物的用途，其特征在于，用于制备检测植物病原菌的检测制品或试剂盒。

8.一种制备如权利要求1所述复合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备抗原蛋白R1；

(2)表达纯化脂质结合蛋白R2；

(3)利用脂质分子R3与步骤(1)中的抗原蛋白R1、步骤(2)中的脂质结合蛋白R2混合，用分子筛纯化得到组装好的复合物；或利用脂质分子R3与步骤(2)中的脂质结合蛋白R2混合，用分子筛纯化得到空的纳米碟，再加入棕榈酰化的抗原蛋白R1，继续利用分子筛纯化得到组装好的复合物。

9.一种制备如权利要求3所述抗体的方法，其特征在于，用权利要求1所述的复合物或权利要求2所述的制剂，免疫待免疫的动物，从而获得抗体。

10.一种检测植物病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提供待检测的样品；

(b)将该样品与权利要求3所述的抗体或权利要求4所述的偶联物混合，形成混合物；

(c)检测所述混合物中“抗体-植物病原菌复合物”的存在与否，其中如果存在所述复合物，则表明所述样品中存在植物病原菌；如果不存在所述复合物，则表明所述样品中不存在植物病原菌。