CN111518176B

CN111518176B - 一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法

Info

Publication number: CN111518176B
Application number: CN202010637857.XA
Authority: CN
Inventors: 陈蕾; 于在江; 卢帅; 焦新安; 陈祥; 孙宇天; 李月; 朱琳
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Taizhou Leiling Baiao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-07-06
Also published as: CN111518176A

Abstract

本发明提供一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法，配对抗原包括捕获抗原和检测抗原；捕获抗原和检测抗原相同或不同的选自NP1抗原、NP2抗原和NP抗原；NP1抗原具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；NP2抗原具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；NP抗原具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。该配对抗原及检测试纸用于双抗原夹心法检测血清总抗体，经验证，采用该配对抗原比单独或联合检测IgM、IgG抗体的方法具有更低的漏检、错检可能性和更高的灵敏度，且还可检测除人以外的其他动物种属的血液样本，用于兽类新型冠状病毒抗体的筛查和检测，适用范围广。

Description

一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法。

背景技术

自2019年12月以来，全球爆发了新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的肺炎，截止目前，全球累计确诊600多万例，已导致37万余人死亡，但目前尚无特异性的新冠肺炎抗病毒治疗药物，给全球健康带来巨大的威胁。目前，新型冠状病毒感染的肺炎疫情在我国已经得到了有效的防控，抗疫工作进入了“外防输入，内防反弹”的关键阶段，国家已经要求最好常态化防控，常态化防控疫情就需要加快提升对新型冠状病毒的检测能力，大规模开展核酸和抗体检测。现阶段无症状感染者对疫情防控带来了巨大的挑战，所以在这种背景下核酸和抗体检测显得十分紧迫和必要。

目前用于新冠肺炎检测的方法主要有核酸检测法和免疫学检测法，核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，是确诊新冠肺炎的“金标准”。但是受样本采集、RNA提取及检测设备条件要求较高的影响，容易出现假阴性，因此急需快捷的免疫学检测方法作为核酸检测的补充。有研究表明，新冠总抗体和核酸协同检测可显著提高新冠病毒感染早期诊断的敏感性，可以有效弥补核酸检测阴性容易造成漏诊的缺点。

研究表明，新型冠状病毒在侵入人体后，首先在5-7天出现IgM抗体，随后在10-15天出现IgG抗体。因此，IgM抗体增高提示近期急性感染，IgG抗体增高提示既往感染。目前市面已有单独或联合检测新冠IgG或IgM抗体的试剂，多为间接法或捕获法，而双抗原夹心法相比间接法或捕获法在检测人血清时可不受类风湿因子等因素的干扰，能有效的减少假阳性。因此，需要提供一种用于检测新型冠状病毒抗体双抗原夹心法的试纸，克服间接法和捕获法的缺陷，并且通过对双抗原夹心法中配对抗原的合理设计，降低检测漏检、错检的可能性，提高检测灵敏度。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法，根据新型冠状病毒N抗原蛋白质序列设计出几个截短的N抗原，并将截短的N抗原进行配对，作为双抗原夹心检测的捕获抗原和检测抗原，获得了适用于检测血清总抗体的双抗原夹心法配对抗原，采用该配对抗原的双抗原夹心检测方法经验证比单独或联合检测IgM、IgG抗体的方法具有更低的漏检、错检可能性和更高的灵敏度。

为了解决上述问题，本发明的一方面提供一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原，包括捕获抗原和检测抗原；所述捕获抗原和所述检测抗原相同或不同的选自NP1抗原、NP2抗原和NP抗原；所述NP1抗原具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；所述NP2抗原具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；所述NP抗原具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

所述SEQ ID No.1的序列结构如下：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSR。

所述SEQ ID NO：2的序列结构如下：

ALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

所述SEQ ID NO：3的序列结构如下：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

其中，所述的新型冠状病毒指世界卫生组织命名为SARS-CoV-2的病毒。

双抗原夹心法的原理是将特异性抗原结合到固定载体上，形成固相抗原，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，再与加标记物标记的抗原结合形成标记的抗原-抗体-固相抗原复合物，通过标记物判断抗体含量。其中，捕获抗原即结合到固定载体上，用于捕获抗体的抗原，检测抗原即标记有标记物的抗原。

本发明首先利用软件BepiPred对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的N蛋白的氨基酸序列进行抗原表位预测，设计出2段与新型冠状病毒抗体具有强结合力的优势抗原表位，分别为N蛋白的NP1（1-185aa）、NP2（220-419aa），将NP1、NP2和N全长蛋白（NP）分别配对作为捕获抗原、检测抗原，由于该方法基于病毒特异性的两个抗原检测抗体，从机制上可以有效减少假阳性；且相比于单独或联合检测新冠IgG或IgM抗体，该双抗原夹心法检测的是包含IgM、IgG、IgA的总抗体，不存在检测窗口期，可比单独检测IgM抗体和IgG抗体提前1-3天诊断出新冠感染，并且阳性结果更为明显。

优选地，所述捕获抗原为所述NP1抗原；所述检测抗原为所述NP抗原。经过对重组蛋白NP1、NP2和N全长蛋白配对筛选，发现NP1抗原作为捕获抗原、NP抗原作为检测抗原时，可更好的区分样品的阴阳性，具有更低的漏检、错检可能性和更高的灵敏度。

本发明的另一方面提供一种新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸，包括上述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原；所述捕获抗原包被于固相载体上；所述检测抗原上偶联有标记物。

其中，标记物可以是胶体金、荧光素标记物、酶标物；优选地，所述检测抗原上偶联有胶体金标记物。与其他标记方法相比，胶体金标记具有灵敏度高、染色步骤简单等优点。

优选地，还包括背板及所述背板上依次排列设置的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫；所述结合垫上负载有所述检测抗原；所述包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫一侧，所述质控线靠近所述吸水垫一侧；所述检测线上包被有所述捕获抗原，所述质控线上包被有质控物。

优选地，所述质控线上包被的质控物为兔抗所述NP抗原多克隆抗体。

优选地，包被膜为硝酸纤维膜。

本发明的再一方面提供一种制备上述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的方法，包括：

S1. 制备所述捕获抗原、所述检测抗原、质控物；

S2. 在所述检测抗原上偶联标记物，得到标记的检测抗原；

S3. 将所述标记的检测抗原负载于结合垫上，得到负载检测抗原的结合垫；

S4. 在包被膜上设置检测线和质控线，并在所述检测线上包被所述捕获抗原，在所述质控线上包被所述质控物，得到包被后的包被膜；

S5. 将样品垫、所述负载检测抗原的结合垫、所述包被后的包被膜和吸水垫依次排列设置在背板上，所述检测线靠近所述结合垫一侧，所述质控线靠近所述吸水垫一侧，得到所述新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸。

优选地，所述标记物为胶体金，步骤S2具体包括：

S201. 配制氯金酸溶液，并加热煮沸，然后加入柠檬酸三钠，得到胶体金颗粒溶液；

S202. 将所述检测抗原加入所述胶体金颗粒溶液中搅拌反应，然后向反应液中加入PEG20000进行混合；

S203. 将步骤S202的混合液进行固液分离，得到胶体金标记的检测抗原。

优选地，步骤S4具体包括：

S401. 在包被膜上喷涂所述捕获抗原，形成所述检测线；在包被膜上喷涂所述质控物，形成所述质控线；

S402. 用BSA的PBS溶液喷涂所述包被膜进行封闭，得到所述包被后的包被膜。

本发明的再一方面提供一种新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试剂盒，包括上述的用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原，或包括上述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.本发明首先利用软件BepiPred对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的N蛋白的氨基酸序列进行抗原表位预测，设计出2段与新型冠状病毒抗体具有强结合力的优势抗原表位，分别为N蛋白的NP1（1-185aa）、NP2（220-419aa），将NP1、NP2和N全长蛋白分别配对作为捕获抗原、检测抗原，由于该方法基于病毒特异性的两个抗原检测抗体，从机制上可以有效减少假阳性；且相比于单独或联合检测新冠IgG或IgM抗体，该双抗原夹心法检测的是包含IgM、IgG、IgA的总抗体，不存在检测窗口期，可比单独检测IgM抗体和IgG抗体提前1-3天诊断出新冠感染，并且阳性结果更为明显；

2.本发明还进一步对上述配对抗原用于双抗原夹心法检测效果进行了筛选，发现NP1抗原作为捕获抗原、NP抗原作为检测抗原时，可更好的区分样品的阴阳性，具有更低的漏检、错检可能性，并且经验证，该配对抗原用于双抗原夹心法具有较高的灵敏度，还可检测除人以外的其他动物种属的血液样本，可应用于动物新型冠状病毒抗体的筛查和检测，适用范围广。

附图说明

图1是本发明实施例1中制备并纯化后的NP1、NP2 2段氨基酸片段的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；

图2是本发明实施例1中制备并纯化后的NP抗原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；

图3是本发明实施例2中制备并纯化后兔抗NP抗原多克隆抗体的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；

图4是本发明实施例2中3种抗原NP1、NP2、NP与兔抗NP抗原多克隆抗体的WesternBlot结果图；

图5是本发明实施例3中新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的结构示意图；

图6是本发明实施例4中NP1抗原、NP2抗原、NP抗原分别作为捕获抗原和检测抗原配对对阳性、阴性样品检测结果图；

图7是本发明实施例5中双抗原夹心检测试纸对阳性样本检测显色图；

图8是本发明实施例5中双抗原夹心检测试纸对健康动物血样本检测显色图；

图9是本发明实施例5中双抗原夹心检测试纸对健康人血样本检测显色图；

图10是本发明实施例5中双抗原夹心检测试纸敏感性验证结果图。

其中：1-背板；2-样品垫；3-结合垫；4-包被膜；5-吸水垫；6-检测线；7-质控线。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 新型冠状病毒N蛋白优势表位的选择及制备

1.1 新型冠状病毒N蛋白优势表位的选择

根据新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白基因序列(Genbank: NC045512)，利用软件BepiPred进行抗原表位预测，共设计出2段氨基酸片段，分别为N蛋白1-185位氨基酸（记为NP1），NP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；N蛋白220-419位氨基酸（记为NP2），NP2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；N蛋白全长记为NP，NP的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

所述SEQ ID NO：1的序列结构如下：

所述SEQ ID NO：2的序列结构如下：

所述SEQ ID NO：3的序列结构如下：

1.2 新型冠状病毒N蛋白优势表位的原核表达

对上述NP1、NP2 2段氨基酸片段和NP进行原核表达密码子优化，得到表达上述蛋白的核苷酸序列，NP1的密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，NP2的密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，NP的密码子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

所述SEQ ID NO：4的序列结构如下：

ATGAGCGATAACGGTCCGCAAAACCAGCGTAACGCGCCGCGTATTACCTTCGGTGGTCCGAGCGATAGCACCGGTAGCAACCAAAACGGCGAACGTAGCGGTGCGCGTAGCAAACAACGTCGTCCGCAAGGTCTGCCGAACAACACCGCGAGCTGGTTTACCGCGCTGACCCAGCACGGTAAAGAAGACCTGAAGTTCCCGCGTGGTCAGGGCGTGCCGATTAACACCAACAGCAGCCCGGACGATCAAATTGGTTATTACCGTCGTGCGACCCGTCGTATCCGTGGCGGTGATGGCAAAATGAAAGATCTGAGCCCGCGTTGGTACTTCTATTACCTGGGTACCGGCCCGGAAGCGGGTCTGCCGTACGGTGCGAACAAGGATGGCATCATCTGGGTTGCGACCGAAGGTGCGCTGAACACCCCGAAAGACCACATTGGTACCCGTAACCCGGCGAACAACGCGGCGATTGTTCTGCAGCTGCCGCAAGGTACCACCCTGCCGAAAGGTTTCTATGCGGAGGGTAGCCGTGGTGGTAGCCAAGCGAGCAGCCGT。

所述SEQ ID NO：5的序列结构如下：

GCGCTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAACCAACTGGAGAGCAAGATGAGCGGCAAGGGTCAGCAACAACAGGGTCAAACCGTTACCAAAAAGAGCGCGGCGGAAGCGAGCAAGAAACCGCGTCAGAAACGTACCGCGACCAAGGCGTACAACGTGACCCAGGCGTTTGGTCGTCGTGGTCCGGAACAAACCCAGGGCAACTTTGGTGACCAAGAACTGATCCGTCAAGGCACCGACTACAAACACTGGCCGCAGATCGCGCAATTCGCGCCGAGCGCGAGCGCGTTCTTTGGTATGAGCCGTATTGGTATGGAAGTGACCCCGAGCGGTACCTGGCTGACCTACACCGGTGCGATCAAACTGGACGATAAGGACCCGAACTTCAAAGACCAAGTGATCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCGTACAAAACCTTTCCGCCGACCGAGCCGAAGAAAGACAAGAAGAAAAAGGCGGATGAAACCCAGGCGCTGCCGCAACGTCAGAAAAAGCAACAGACCGTGACCCTGCTGCCGGCGGCGGATCTGGACGATTTCAGCAAACAGCTGCAGCAAAGCATGAGCAGCGCGGATAGCACCCAAGCG。

所述SEQ ID NO：6的序列结构如下：

ATGAGCGATAACGGTCCGCAAAACCAGCGTAACGCGCCGCGTATTACCTTCGGTGGTCCGAGCGATAGCACCGGTAGCAACCAAAACGGCGAACGTAGCGGTGCGCGTAGCAAACAACGTCGTCCGCAAGGTCTGCCGAACAACACCGCGAGCTGGTTTACCGCGCTGACCCAGCACGGTAAAGAAGACCTGAAGTTCCCGCGTGGTCAGGGCGTGCCGATTAACACCAACAGCAGCCCGGACGATCAAATTGGTTATTACCGTCGTGCGACCCGTCGTATCCGTGGCGGTGATGGCAAAATGAAAGATCTGAGCCCGCGTTGGTACTTCTATTACCTGGGTACCGGCCCGGAAGCGGGTCTGCCGTACGGTGCGAACAAGGATGGCATCATCTGGGTTGCGACCGAAGGTGCGCTGAACACCCCGAAAGACCACATTGGTACCCGTAACCCGGCGAACAACGCGGCGATTGTTCTGCAGCTGCCGCAAGGTACCACCCTGCCGAAAGGTTTCTATGCGGAGGGTAGCCGTGGTGGTAGCCAAGCGAGCAGCCGTAGCAGCAGCCGTAGCCGTAACAGCAGCCGTAACAGCACCCCGGGTAGCAGCCGTGGTACCAGCCCGGCGCGTATGGCGGGTAACGGTGGCGATGCGGCGCTGGCGCTGCTGCTGCTGGATCGTCTGAACCAACTGGAGAGCAAGATGAGCGGCAAGGGTCAGCAACAACAGGGTCAAACCGTTACCAAAAAGAGCGCGGCGGAAGCGAGCAAGAAACCGCGTCAGAAACGTACCGCGACCAAGGCGTACAACGTGACCCAGGCGTTTGGTCGTCGTGGTCCGGAACAAACCCAGGGCAACTTTGGTGACCAAGAACTGATCCGTCAAGGCACCGACTACAAACACTGGCCGCAGATCGCGCAATTCGCGCCGAGCGCGAGCGCGTTCTTTGGTATGAGCCGTATTGGTATGGAAGTGACCCCGAGCGGTACCTGGCTGACCTACACCGGTGCGATCAAACTGGACGATAAGGACCCGAACTTCAAAGACCAAGTGATCCTGCTGAACAAGCACATCGACGCGTACAAAACCTTTCCGCCGACCGAGCCGAAGAAAGACAAGAAGAAAAAGGCGGATGAAACCCAGGCGCTGCCGCAACGTCAGAAAAAGCAACAGACCGTGACCCTGCTGCCGGCGGCGGATCTGGACGATTTCAGCAAACAGCTGCAGCAAAGCATGAGCAGCGCGGATAGCACCCAAGCG。

将优化的密码子分别克隆至Pet32a、Pet28a得到重组质粒，由安徽通用生物公司合成。

合成的重组质粒Pet32a-NP1、Pet32a-NP2按常规方法转化BL21（DE3）感受态细胞（《分子克隆》第三版，科学出版社），转化菌涂布于LB琼脂平板（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃过夜培养。挑取单菌落接入5mL LB培养基（含100μg/mL氨苄青霉素）中，37℃，220转/分振荡培养过夜。经测序鉴定正确后冻存甘油菌待用。

用接种环钓取适量保存菌种在LB琼脂平板（含100 μg/mL氨苄青霉素）上划线，37℃培养12小时，作为一级种子。将一级种子（单菌落）接种于3 mL的LB培养基（含100 μg/mL氨苄霉素）中，37℃培养10小时，作为生产用种子。取生产用菌种，按培养基总体积的1%的量接种到LB培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中，37℃，220转/分振荡培养3小时左右，至OD₆₀₀为0.5，于16℃降温1.5小时，加终浓度为0.1 mM IPTG，16℃，220转/分诱导16小时后收集菌体。

合成的重组质粒Pet28a-NP按照常规方法转化BL21（DE3）感受态细胞，并按上述的操作方法，在含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基中进行诱导表达。

1.3 新型冠状病毒N蛋白优势表位重组蛋白的纯化

因上述表达的重组蛋白均带有组氨酸标签，用GE公司的AKTA Start和HisTrapTMHP层析柱进行纯化。A缓冲液为50mM Tris-Hcl PH 8.0，B缓冲液为50mM Tris-Hcl PH 8.00.5M咪唑，层析柱用A缓冲液平衡，然后将发酵好的菌液8000rpm离心20min，沉淀用A液重悬，在冰水中超声破碎30min，间隔5秒超声5秒，12000rpm离心30min，上清用0.22微米滤器过滤，上样，层析柱用A缓冲液洗涤，最后用B缓冲液梯度洗脱，通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳观察纯化情况。选择目的蛋白收集峰，用0.01M PBS透析换液，Nanodrop 测定蛋白浓度，分装成1mL/管，-20℃保存。

1.4 优势表位重组蛋白的鉴定

SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度：

a) 蛋白样品前处理

分别留样加同等体积的2×SDS loading buffer，置于沸水浴中煮10min，12000rpm离心3min，取上清加至加样孔。

b) SDS-PAGE电泳胶的配制

垂直电泳玻璃板洗净晾干，垂直放于制胶架上，按照要求配好分离胶体系，加入玻璃板间隙，至胶面达到所要求的高度后，加入无水乙醇密封；室温凝固30min-1h后，弃去胶上层密封液体，并用吸水纸吸干，按比例配制浓缩胶，并插入适合的梳子，室温凝固30min-1h。

c) SDS-PAGE电泳

将5×甘氨酸缓冲液稀释至工作浓度，加入电泳槽至合适液面高度，将梳子从凝固凝胶中轻轻拔出。在加样孔内加入蛋白marker和10μL处理过的蛋白样品。接通电源，调整电压80V恒压电泳至分离胶，再改为120V直至溴酚蓝至凝胶底部。

d) 染色及脱色

将胶从玻璃板上切下，置于考马斯亮蓝染液，微波加热1min，摇床上染色30min。脱色时取出凝胶，清水冲洗，置于脱色液中，微波加热1min，摇床上反复脱色至背景无色。配制12%分离胶注入玻璃板间隙内，加入纯水隔离空气，室温凝固30~60min，弃去上层水，用吸水纸吸干残留液体。配制浓缩胶，注入分离胶上端，小心插入梳子，避免气泡产生，室温凝固30~45 min。20μL样品加入等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸5 min。每孔上样10μL，首先以80V进行，待样品进入分离胶后调整为120 V，直至溴酚蓝抵达分离胶底部。考马斯亮蓝染色：将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染液中，振荡染色4 h，后脱色液脱色至条带清晰。在16℃，220转/分诱导16小时后 NP1、NP2、NP均可溶表达，大小分别约为34KD、36KD、50 KD，纯化后条带单一，纯度较高，纯化结果如图1、图2所示。

ELISA 鉴定重组蛋白的活性：

用纯化的重组蛋白包被，ELISA方法鉴定其与SARS-CoV-2抗体质控品的反应，SARS-CoV-2抗体质控品购自厦门万渤生物。

先在微孔板中分别包被重组蛋白（包被缓冲液碳酸盐缓冲液碳酸钠1.59g 碳酸氢钠2.93g 定容至1L纯水中），包被浓度为1μg/mL，4℃过夜；1%明胶封闭,每孔150 微升，37°C2小时,用洗涤液洗板1次，拍干；将SARS-CoV-2抗体质控品按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000的梯度进行（PBS）稀释，加入50μL到已包被抗原的微孔板中，37℃反应30min。甩出孔中液体，PBST洗液洗板4次，拍干后加入HRP标记的羊抗人二抗（以PBS按照1:10000稀释）50μL/孔，37℃反应30min，再洗板4次，拍干后加入TMB显色液100μL/孔室温显色10min，最后加入0.5M硫酸，终止反应，用酶标仪测定OD₄₅₀值。结果如下表1，测定结果发现3种抗原均能与质控品反应，但亲和力有差异。

表1

	NP1(1μg/mL)	NP2(1μg/mL)	NP(1μg/mL)
				质控1:1000	1.986	1.278	2.016
质控1:2000	1.690	0.965	1.687
				质控1:4000	1.423	0.637	1.341
质控1:8000	1.185	0.456	1.106
				阴性对照	0.179	0.187	0.183

实施例2 兔抗NP抗原多克隆抗体的制备

2.1 兔抗NP抗原多克隆抗体的制备

免疫取充分乳化的弗氏完全佐剂抗原（弗氏完全佐剂（Sigma，USA）3 mL加上述的重组蛋白NP 1mg再加生理盐水至6mL），于每只兔两后腿足部皮下，腘淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，14日后以弗氏不完全佐剂抗原（弗氏不完全佐剂（Sigma，USA）3mL加上述的重组蛋白NP 1mg再加生理盐水至6 mL）由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉两点，背部皮下多点接种，接种总量为2 mL，为其第三次免疫。

试血7~14日后由耳缘静脉采血分离血清，以ELISA 试验试血，将免疫血清从1:1000开始梯度稀释，若免疫兔血清ELISA 效价达1:8000或以上，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第三次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，7～14日再进行试血，如免疫兔血清效价达到要求，可按前述方法制备高免血清。

新型冠状病毒NP抗原免疫兔血清效价测定

上述得到的新型冠状病毒NP抗原免疫兔血清效价测定结果如下表2所示，三免后兔血清效价可达160000以上，表明免疫后兔血清新型冠状病毒NP抗原免疫兔多克隆抗体滴度较高。

表2

稀释倍数	二免兔血清	三免兔血清	空白兔
				1:1000	1.965	2.323	0.201
1:2000	1.797	2.034	0.202
				1:4000	1.403	1.876	0.183
1:8000	1.225	1.655	0.162
				1:16000	0.938	1.239	0.155

纯化采用硫酸铵沉淀法纯化新型冠状病毒NP抗原免疫兔血清IgG。

溶液配制：

硫酸铵饱和溶液硫酸铵800～850g溶于1L H₂O，加热至绝大部分溶解为止，趁热过滤，室温过夜，28%NH₄OH调pH值至7.0。

0.01mol/L pH 7.4 PB液取A液19mL，B液81mL加水至1000mL，0.22 μm的滤膜过滤备用。

A液（0.01mol/L NaH₂PO₄液） NaH₂PO₄·2H₂O 15.6g加H₂O至1000mL；

B液（0.01mol/L Na₂HPO₄液） Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g加H₂O至1000mL。

纳氏液 HgI 115g，KI 80g，加H₂O至500mL，溶化后过滤，加20%NaOH 500mL，混合备用。

免疫达到效价后，经心脏采集兔血，待自然凝固后，离心分离血清。取20mL血清，加生理盐水20mL，再逐滴加入(NH₄)₂SO₄饱和溶液10mL，使成20% (NH₄)₂SO₄饱和溶液，边加边搅拌，4℃静置30min；4000rpm，4℃离心20min，弃沉淀，除去纤维蛋白；在上清液中再加入(NH₄)₂SO₄饱和溶液30mL，使成50% (NH₄)₂SO₄饱和溶液，充分混合，4℃静置30min；4000rpm，4℃离心20min，弃上清；于沉淀中加20mL生理盐水，使之溶解，再加(NH₄)₂SO₄饱和溶液10mL，使成33%(NH₄)₂SO₄饱和溶液，充分混合，4℃静置30min；4000rpm，4℃离心20min，弃上清，除去白蛋白。10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。在超纯水中4℃透析过夜，再在生理盐水中4℃透析24h，中间换液数次。以1%BaCl₂检查透析液中的SO₄ ^2-，或者以纳氏试剂检查NH₄ ⁺（取3～4mL透析液，加试剂1～2滴，出现砖红色即认为有NH₄ ⁺存在），直至无SO₄ ^2-或NH₄ ⁺出现为止。4000rpm，4℃离心20min，上清液即为粗提IgG。按常规法过DEAE-纤维素层析柱，以0.01mol/L pH 7.4 PB液（0.3 mol/L的NaCl液）洗脱，收集洗脱液。将洗脱液装入透析袋中，埋入PEG3500，4℃透析。收集浓缩后的洗脱液，得到纯化后的兔抗NP抗原多克隆抗体，分装小管-70℃保存备用。

2.2 兔抗NP抗原多克隆抗体的鉴定

兔抗NP抗原多克隆抗体纯度鉴定

按实施例1中采用的纯度鉴定方法，用12%的SDS-PAGE电泳，鉴定纯化后的兔抗NP抗原多克隆抗体的纯度，结果如图3所示，纯化后的NP抗原免疫兔多克隆抗体可见清晰的重链和轻链条带，没有杂带，纯度较高条带单一，纯度较高。

兔抗NP抗原多克隆抗体反应性鉴定

重组蛋白NP1、NP2经12% SDS-PAGE电泳分离后，半干转至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉（PBS）室温封闭2h，TBST洗3次后，加入纯化的兔抗NP抗原多克隆抗体（1:1000 封闭液稀释），4℃过夜，TBST 洗3次后加入荧光标记的二抗，室温避光反应1h，充分洗涤后，红外扫描仪扫膜，结果如图4所示，3种重组蛋白NP1、NP2、NP均能与兔抗NP抗原多克隆抗体反应，Western Blot显示在对应位置有特异条带。

实施例3 新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的制备

S1. 制备NP1抗原、NP2抗原、NP抗原作为捕获抗原、检测抗原（见实施例1）；制备兔抗NP抗原多克隆抗体作为质控物（见实施例2）；

S2. 检测抗原的胶体金标记：

S201. 取0.01%的氯金酸溶液100mL，加热煮沸，然后快速加入1%的柠檬酸三钠溶液1mL，直至溶液颜色呈酒红色，继续煮沸5分钟，待胶体金颗粒稳定后冷却至室温备用；

S202. 分别取制备好的胶体金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的NP1抗原、NP2抗原、NP抗原3种抗原以PBS稀释按照0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的终浓度后加入胶体金溶液中搅拌反应30分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1%；

S203. 将混合液置于在4℃冷冻离心机上以12000rpm离心10分钟后弃去上清液，将下层沉淀以1/10体积的PBS缓冲液重悬，即为制备好的金标抗原。

S3. 结合垫的制备：

采用6mm × 300mm玻璃纤维膜，经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记蛋白按照200μL/条喷涂，完毕，37℃烘干2h备用，得到负载金标抗原的结合垫。

S4. 包被膜划膜：

分别在不同的硝酸纤维（20mm×300mm）膜上，用划膜仪横向线状以1.0μL/cm分别喷涂纯化的NP1抗原、NP2抗原、NP抗原3种抗原，0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL形成检测线。间隔8mm，以1.0μL/cm横向线状喷涂兔抗NP抗原多克隆抗体，浓度为1mg/mL，形成质控线。用含10%BSA的0.02mol/L pH7.2的PBS对喷涂的NC膜进行封闭、洗脱，室温晾干，得到包被膜。

S5. 检测试纸的组装：

以60mm ×300mm PVC背板为支撑，在其上依次排列粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水垫，包被膜上包被有两条线，检测线靠近结合垫一侧，质控线靠近吸水垫一侧，40℃烘干12h备用。组装好的大板用切条机切成4.05mm的裸条，用胶体金塑料卡壳包裹，使样品垫暴露于塑料卡壳的加样孔位置，质控线、检测线暴露于结果观察孔的位置，至此，胶体金检测试纸条组装完毕。

新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的结构如图5所示，包括背板1，及背板1上依次排列设置的样品垫2、结合垫3、包被膜4和吸水垫5；结合垫3上负载有检测抗原；包被膜4上设有检测线6和质控线7，检测线6靠近结合垫3一侧，质控线7靠近吸水垫5一侧；检测线6上包被有捕获抗原，质控线7上包被有质控物。如前所述，结合垫3为玻璃纤维膜，包被膜为硝酸纤维膜。

实施例4 新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸配对抗原的筛选

将上述NP1抗原、NP2抗原、NP抗原分别作为捕获抗原和检测抗原进行配对，考察各配对抗原对阴性、阳性样本的显色情况。

阳性样本为：SARS-CoV-2抗体质控品（购自厦门万渤生物技术有限公司）、兔抗NP抗原多克隆抗体；

阴性样本为：健康人血清、免疫前兔血清、胎牛血清、马血清、山羊血清、健康猪血清、健康宠物猫血清、健康宠物犬血清。

样本稀释液为：0.01mol/L pH7.4 PBS 含有0.1% Tween 20。

检测方法为：取待检血清样品10μL加入试纸条样品孔（S孔），再滴入80μL样本稀释液，当液体全部浸湿NC膜后，20min内观察结果。

结果判定：T检测线和C质控线都出现清晰可见的红色条带，判为阳性，T线颜色越深，阳性越强；只有C质控线出现清晰可见的红色条带，判为阴性；若C质控线不出现红色条带，判为无效。

如图6所示，采用NP1抗原划膜作为捕获抗原，与NP1抗原、NP2抗原、NP抗原标金作为检测抗原配对，分别检测阳性（SARS-CoV-2质控品、NP兔多抗）和阴性（健康人和兔）血清，发现：NP1作捕获抗原、NP作检测抗原能很好地区分阴阳性。

采用NP2抗原划膜作为捕获抗原，与NP1抗原、NP2抗原、NP抗原标金作为检测抗原配对，分别检测阳性（SARS-CoV-2质控品、NP兔多抗）和阴性（健康人和兔）血清，发现：NP2作捕获抗原、NP1作检测抗原组合均不显色，NP2作捕获抗原、NP1作检测抗原组合与NP2作捕获抗原、NP作检测抗原组合检测阴性血清显色。

采用NP抗原划膜作为捕获抗原，与NP1抗原、NP2抗原、NP抗原标金作为检测抗原配对，分别检测阳性（SARS-CoV-2质控品、NP兔多抗）和阴性（健康人和兔）血清，发现：NP作捕获抗原、NP2作检测抗原组合均不显色；NP作捕获抗原、NP1作检测抗原组合与NP作捕获抗原、NP作检测抗原组合检测阴性血清显色。

经过筛选，得到最优配对组合：NP1抗原作为捕获抗原、NP抗原作为检测抗原，其中NP1抗原的划膜浓度为1mg/mL；NP标金浓度为2μg/mL。

实施例5 NP1抗原、NP抗原配对的双抗原夹心检测试纸性能验证

1.特异性验证

组装好的试纸条分别用SARS-CoV-2质控品、兔抗NP抗原多克隆抗体、健康人及动物（马、山羊、牛、兔、猪、犬、猫）血清进行测试，结果如图7、图8、图9所示，发现该试纸条能有效的检测出阳性质控品和兔多抗血清，且阴性的人及动物血清均为阴性，特异性较好。

2.敏感性验证

用SARS-CoV-2阳性质控品倍比稀释测试双抗原夹心试纸条的检测敏感性，如图10所示，结果发现：当阳性质控品稀释64倍时，仍能显色，因此，该试纸条的检测灵敏度高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 北京金智准科技有限公司

<120> 一种用于新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测的配对抗原、检测试纸及其制备方法

<130> 2020

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg

180 185

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser

1 5 10 15

Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala

20 25 30

Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala

35 40 45

Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln

50 55 60

Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys

65 70 75 80

His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe

85 90 95

Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu

100 105 110

Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys

115 120 125

Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe

130 135 140

Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr

145 150 155 160

Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu

165 170 175

Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met

180 185 190

Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

195 200

<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 4

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagcgata acggtccgca aaaccagcgt aacgcgccgc gtattacctt cggtggtccg 60

agcgatagca ccggtagcaa ccaaaacggc gaacgtagcg gtgcgcgtag caaacaacgt 120

cgtccgcaag gtctgccgaa caacaccgcg agctggttta ccgcgctgac ccagcacggt 180

aaagaagacc tgaagttccc gcgtggtcag ggcgtgccga ttaacaccaa cagcagcccg 240

gacgatcaaa ttggttatta ccgtcgtgcg acccgtcgta tccgtggcgg tgatggcaaa 300

atgaaagatc tgagcccgcg ttggtacttc tattacctgg gtaccggccc ggaagcgggt 360

ctgccgtacg gtgcgaacaa ggatggcatc atctgggttg cgaccgaagg tgcgctgaac 420

accccgaaag accacattgg tacccgtaac ccggcgaaca acgcggcgat tgttctgcag 480

ctgccgcaag gtaccaccct gccgaaaggt ttctatgcgg agggtagccg tggtggtagc 540

caagcgagca gccgt 555

<210> 5

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgctgctgc tgctggatcg tctgaaccaa ctggagagca agatgagcgg caagggtcag 60

caacaacagg gtcaaaccgt taccaaaaag agcgcggcgg aagcgagcaa gaaaccgcgt 120

cagaaacgta ccgcgaccaa ggcgtacaac gtgacccagg cgtttggtcg tcgtggtccg 180

gaacaaaccc agggcaactt tggtgaccaa gaactgatcc gtcaaggcac cgactacaaa 240

cactggccgc agatcgcgca attcgcgccg agcgcgagcg cgttctttgg tatgagccgt 300

attggtatgg aagtgacccc gagcggtacc tggctgacct acaccggtgc gatcaaactg 360

gacgataagg acccgaactt caaagaccaa gtgatcctgc tgaacaagca catcgacgcg 420

tacaaaacct ttccgccgac cgagccgaag aaagacaaga agaaaaaggc ggatgaaacc 480

caggcgctgc cgcaacgtca gaaaaagcaa cagaccgtga ccctgctgcc ggcggcggat 540

ctggacgatt tcagcaaaca gctgcagcaa agcatgagca gcgcggatag cacccaagcg 600

<210> 6

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagcgata acggtccgca aaaccagcgt aacgcgccgc gtattacctt cggtggtccg 60

agcgatagca ccggtagcaa ccaaaacggc gaacgtagcg gtgcgcgtag caaacaacgt 120

cgtccgcaag gtctgccgaa caacaccgcg agctggttta ccgcgctgac ccagcacggt 180

aaagaagacc tgaagttccc gcgtggtcag ggcgtgccga ttaacaccaa cagcagcccg 240

gacgatcaaa ttggttatta ccgtcgtgcg acccgtcgta tccgtggcgg tgatggcaaa 300

atgaaagatc tgagcccgcg ttggtacttc tattacctgg gtaccggccc ggaagcgggt 360

ctgccgtacg gtgcgaacaa ggatggcatc atctgggttg cgaccgaagg tgcgctgaac 420

accccgaaag accacattgg tacccgtaac ccggcgaaca acgcggcgat tgttctgcag 480

ctgccgcaag gtaccaccct gccgaaaggt ttctatgcgg agggtagccg tggtggtagc 540

caagcgagca gccgtagcag cagccgtagc cgtaacagca gccgtaacag caccccgggt 600

agcagccgtg gtaccagccc ggcgcgtatg gcgggtaacg gtggcgatgc ggcgctggcg 660

ctgctgctgc tggatcgtct gaaccaactg gagagcaaga tgagcggcaa gggtcagcaa 720

caacagggtc aaaccgttac caaaaagagc gcggcggaag cgagcaagaa accgcgtcag 780

aaacgtaccg cgaccaaggc gtacaacgtg acccaggcgt ttggtcgtcg tggtccggaa 840

caaacccagg gcaactttgg tgaccaagaa ctgatccgtc aaggcaccga ctacaaacac 900

tggccgcaga tcgcgcaatt cgcgccgagc gcgagcgcgt tctttggtat gagccgtatt 960

ggtatggaag tgaccccgag cggtacctgg ctgacctaca ccggtgcgat caaactggac 1020

gataaggacc cgaacttcaa agaccaagtg atcctgctga acaagcacat cgacgcgtac 1080

aaaacctttc cgccgaccga gccgaagaaa gacaagaaga aaaaggcgga tgaaacccag 1140

gcgctgccgc aacgtcagaa aaagcaacag accgtgaccc tgctgccggc ggcggatctg 1200

gacgatttca gcaaacagct gcagcaaagc atgagcagcg cggatagcac ccaagcg 1257

Claims

1.一种新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸，其特征在于：

包括背板及所述背板上依次排列设置的样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫；所述结合垫上负载有胶体金标记的检测抗原；所述包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫一侧，所述质控线靠近所述吸水垫一侧；所述检测线上包被有捕获抗原，所述质控线上包被有质控物；

所述捕获抗原的划膜浓度为1mg/mL；所述检测抗原的金标浓度为2μg/mL；

所述捕获抗原为NP1抗原；所述检测抗原为NP抗原；所述NP1抗原的氨基酸序列如SEQID No.1所示；所述NP抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸，其特征在于：

所述质控线上包被的质控物为兔抗所述NP抗原多克隆抗体。

3.一种制备如权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的方法，其特征在于，包括：

S1. 制备捕获抗原、检测抗原、质控物，所述捕获抗原为NP1抗原；所述检测抗原为NP抗原；所述NP1抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述NP抗原的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；

S2. 在所述检测抗原上偶联胶体金，得到胶体金标记的检测抗原，所述检测抗原的金标浓度为2μg/mL；

S3. 将所述胶体金标记的检测抗原负载于结合垫上，得到负载检测抗原的结合垫；

S4. 在包被膜上设置检测线和质控线，并在所述检测线上包被所述捕获抗原，在所述质控线上包被所述质控物，得到包被后的包被膜，所述捕获抗原的划膜浓度为1mg/mL；所述质控物为兔抗所述NP抗原多克隆抗体；

4.根据权利要求3所述的制备新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：

5.根据权利要求3所述的制备新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸的方法，其特征在于，步骤S4具体包括：

6.一种新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的新型冠状病毒抗体双抗原夹心检测试纸。