CN112098656A - 用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条及其制备方法 - Google Patents

用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人SARS‑CoV‑2的HRP免疫层析试剂条及其制备方法，属于生物医药技术领域，包括PVC底板，所述PVC底板上从下向上依次首尾相接设有样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述标记垫上喷有新型冠状病毒N蛋白抗原‑HRP复合物，所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C和检测线T；所述质控线C包被有抗新型冠状病毒N蛋白单抗；所述检测线T包被有新型冠状病毒N蛋白抗原；并通过新型冠状病毒N蛋白‑HRP复合物的制备，包被质控线C、检测线T，样品垫的预处理，以及切割与组装制备得到。本发明能够有效提高对人SARS‑CoV‑2检测的灵敏度和准确性，并且相比常规方法能够在更早期检出该病毒的特异性抗体。

Description

用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体属于一种用于检测人 SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条及其制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属，是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，膜表面分别有三种糖蛋白：刺突糖蛋白、小包膜糖蛋白、膜糖蛋白。其中刺突糖蛋白(S蛋白)以及与RNA结合的N蛋白是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的主要抗原。人感染后新型冠状病毒可出现发热、寒战、呕吐等症状，引起病毒性肺炎。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染后机体在一定时间内先出现IgM抗体，但抗体效价较低维持时间短；随病程进展后出现IgG抗体，抗体效价较高且维持时间长。因此，检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体水平，可辅助判断人体是否感染SARS-CoV-2，是核酸检测之外的重要补充检测手段。
目前，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)流行在世界范围内广受关注，针对病毒类抗体的检测，也一直是检测的重点和难题之一。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体检测试剂盒市面上多以间接法为主，尚未有应用HRP标记双抗原夹心法的免疫层析试纸条的试剂盒，对型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测的方法和方式相对单一，难以满足现在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在全球肆虐的情况，而缺乏相应的辅助检测手段，也导致缺乏对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测准确性的验证或者确认，而只以间接法进行检测的检测灵敏度不够高，还可能出现无法检测出部分无症状感染者体内的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性抗体。
因此，亟需设计出相关辅助检测并方便使用的试剂盒，以提高对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测的准确性和灵敏度。
发明内容
针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了用于检测人 SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，能够有效提高对人SARS-CoV-2 检测的灵敏度和准确性，并且相比常规方法能够在更早期检出该病毒的特异性抗体。
本发明的目的之二是提供用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，使得制备出的试纸条能够有效提高对人 SARS-CoV-2检测的灵敏度和准确性，并且比常规方法能够在更早期检出该病毒的特异性抗体，使用方便。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，包括PVC底板，所述PVC底板上从下向上依次首尾相接设有样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述样品垫上设有样品滴入区；所述标记垫上喷有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物，所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C和检测线T，所述质控线C与检测线T沿水平方向平行设置；所述质控线C包被有抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白单抗；所述检测线T包被有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原。
进一步所采取的措施是：所述样品滴入区设置于样品垫靠近底端处；所述样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫均固接在所述 PVC底板上；所述吸水纸的一端搭设在硝酸纤维素膜的上面。
进一步所采取的措施是：所述新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原与HRP 之间的分子比为1：1的复合物。
进一步所采取的措施是：HRP标记所述新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原的浓度为1-2mg/ml，所述标记垫上的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物的喷量为2～4μl/cm。
进一步所采取的措施是：所述硝酸纤维素膜上的检测线T包被的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原的浓度为0.5～1.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。
进一步所采取的措施是：所述硝酸纤维素膜上的质控线C包被的抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白单抗的浓度为1.0～2.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。
用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，包括以下步骤：
(1)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白-HRP复合物的制备：
取1ml新配制的HRP-NHS溶液(1mg/ml)，与1ml新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原(0.9mg/ml)混匀，4℃反应过夜，反应产物过兔抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱，去除未标记的N蛋白，收集N蛋白-HRP复合物，以PBS透析后进行浓缩、调整，使得浓缩后的溶液中含有0.1％BSA、0.1％Casein、0.3％PVP40和5％海藻糖，且N 蛋白-HRP的浓度为1-2mg/ml，得到新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N 蛋白抗原-HRP复合物；
(2)包被质控线C、检测线T：
①质控线C、检测线T包被液的制备：取抗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白单抗，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白抗原，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml 的检测线T溶液；
②划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室，湿度＜30％，干燥10-14h后，加入干燥剂封口备用；
(3)样品垫的预处理：
①将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
②所述样品垫预处理液含有pH7.4的0.01mol/lPBS缓冲液、 0.5％吐温20；
(4)切割与组装：将吸水垫、样品垫、HRP酶标垫经过切割后和划过膜的PVC底板进行组装，得到成品。
进一步所采取的措施是：所述步骤(1)中制得新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物后，使用三维喷金划膜仪将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物喷至标记垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的标记垫置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用。
进一步所采取的措施是：所述步骤(4)中具体包括：取吸水垫、已处理的样品垫和HRP酶标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫分别加入干燥剂封口备用；再取已切割好的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫和划过膜的PVC底板，贴上HRP酶标垫，使HRP酶标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压在HRP酶标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～ 4mm，得到用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条。
进一步所采取的措施是：还包括步骤(5)在得到的检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条的样品滴入区中滴入检测样，检测样扩散完成后15-20分钟，在结果观察窗口滴加1 滴45-55ul单组分沉淀型TMB底物，1-5分钟后读取结果。
本发明利用双抗原夹心法，运用特异性抗原进行包被和制备抗原标记物，以检测相应的抗体，特异性高，并通过采用HRP-NHS高效标记试剂，进过一系列的研究试验，克服其他蛋白的干扰，最终得到以抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化HRP-N蛋白复合物，制备成标记分子比1:1的高活性HRP-N蛋白复合物的检测灵敏度最高，以及采用单组分沉淀型TMB底物，最终使得HRP酶促反应在T和C线集中显现，肉眼可见，方便观察，结果明显。
而且，此法中受检标本不需稀释，可直接测定，检测起来更加便捷，降低工作量，加快检测进度，再加上HRP的酶促放大效应，因此其敏感性远高于常规间接法抗体检测；同时也能在特异性抗体处于初始较低的水平时也能检测出来，从而还可以在更早期检出特异性抗体进行，方便即使进行确认和治疗，挽救更多COVID-19患者的生命，避免发现过晚，使得治疗难度提高，同时也填补了目前还没有出现的 HRP标记新冠病毒蛋白的方法或者将其应用在病毒蛋白的免疫层析试纸条中的技术空白。
通过本发明辅助检测SARS-CoV-2病毒，不但提高了检测的准确性和灵敏度，也丰富了对SARS-CoV-2病毒的检测手段，方便对 SARS-CoV-2病毒的检测手段的相互验证，以及为以后对SARS-CoV-2 病毒的检测手段的进一步研究提供技术支持。
通过上述技术方案，本发明与现有技术相比，所具有的有益效果如下：
1、本发明免疫层析试剂条，能够有效提高对人SARS-CoV-2检测的灵敏度和准确性，而且受检标本不需稀释，可直接测定，加快检测进度，检测起来更加便捷。
2、本发明通过HRP进行标记和酶促放大效应，以及相关制备方法条件的控制，填补了HRP标记新冠病毒蛋白的技术空白，并使得制备出的免疫层析试纸条相比常规方法能够在更早期检出SARS-CoV-2 病毒的特异性抗体。
3、本发明免疫层析试剂条使用操作简便，制作成本相对较低，方便推广应用，并未后续的辅助检测手段提供更多的技术支持。
附图说明
图1为本发明一种实施例的主视结构图。
图中：1、样品垫；2、标记垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水垫； 5、样品滴入区；6、检测线T；7、质控线C。
具体实施方式
为了更清楚的了解本发明所采用的技术方案，下面对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明，本说明书中所引用的如“上”、“内”、“中”、“左”、“右”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1-3：用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，包括PVC底板，PVC底板上从下向上依次首尾相接设有样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜3以及吸水垫4；样品垫1上设有样品滴入区 5；标记垫2上喷有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物，硝酸纤维素膜3上包被有质控线C7和检测线T6，质控线C7 与检测线T6沿水平方向平行设置；质控线C7包被有抗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白单抗；检测线T6包被有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原。通过在PVC底板上从下向上依次首尾相接设有样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜3以及吸水垫4，并在标记垫2上喷有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物，以及设置相应的单抗和抗原等，从而实现利用HRP标记对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进行检测，填补了HRP标记新冠病毒蛋白的技术空白，丰富了对SARS-CoV-2病毒的检测手段，并通过HRP酶促放大效应，使得检测灵敏大大增高，相比常规方法能够在更早期检出该病毒的特异性抗体，及早检测，有助于及时提供相应治疗和措施。
样品滴入区5设置于样品垫1靠近底端处；样品垫1、标记垫2、硝酸纤维素膜3以及吸水垫4均固接在PVC底板上；吸水纸的一端搭设在硝酸纤维素膜3的上面。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原与HRP之间的分子比为1：1的复合物，经过长期研究，该配比能够保持检测性能最高，且稳定性最佳。HRP标记新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原的浓度为1-2mg/ml，标记垫2上的新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白抗原-HRP复合物的喷量为2～4μl/cm，硝酸纤维素膜3上的检测线T6包被的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原的浓度为 0.5～1.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm，硝酸纤维素膜3上的质控线C7包被的抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白单抗的浓度为 1.0～2.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。从而保证结果显示快速且明显，同时不浪费过多的资源。
上述实施例1-3用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条分别通过以实施例1-3的制备方法制得。
实施例1用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条通过以下制备方法得到：包括以下步骤：
(1)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白-HRP复合物的制备：
取1ml新配制的HRP-NHS溶液(1mg/ml)，与1ml新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原(0.9mg/ml)混匀，4℃反应过夜，反应产物过兔抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱，去除未标记的N蛋白，收集N 蛋白-HRP复合物，以PBS透析后进行浓缩、调整，使得浓缩后的溶液中含有0.1％BSA、0.1％Casein、0.3％PVP40和5％海藻糖，且N蛋白 -HRP的浓度为1mg/ml，得到型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原 -HRP复合物；然后载使用三维喷金划膜仪将新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物喷至标记垫上，喷量为2μ l/cm；将喷好的标记垫置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用。
(2)包被质控线C、检测线T：
①质控线C、检测线T包被液的制备：取抗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白单抗，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白抗原，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml 的检测线T溶液；
②划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室，湿度＜30％，干燥10h后，加入干燥剂封口备用；
(3)样品垫的预处理：
①将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
②样品垫预处理液含有pH7.4的0.01mol/lPBS缓冲液、0.5％吐温20；
(4)切割与组装：取吸水垫、已处理的样品垫和HRP酶标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、 HRP酶标垫分别加入干燥剂封口备用；再取已切割好的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫和划过膜的PVC底板，贴上HRP酶标垫，使HRP酶标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压在HRP 酶标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～4mm，得到实施例1用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条。
(5)在得到的检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP 免疫层析试剂条的样品滴入区中滴入检测样，检测样扩散完成后 15-20分钟，在结果观察窗口滴加1滴45ul单组分沉淀型TMB底物，1-5分钟后读取结果。
实施例2用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条通过以下制备方法得到：包括以下步骤：
(1)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白-HRP复合物的制备：
取1ml新配制的HRP-NHS溶液(1mg/ml)，与1ml新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原(0.9mg/ml)混匀，4℃反应过夜，反应产物过兔抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱，去除未标记的N蛋白，收集N 蛋白-HRP复合物，以PBS透析后进行浓缩、调整，使得浓缩后的溶液中含有0.1％BSA、0.1％Casein、0.3％PVP40和5％海藻糖，且N蛋白 -HRP的浓度为1.5mg/ml，得到型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物；然后载使用三维喷金划膜仪将新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物喷至标记垫上，喷量为3μ l/cm；将喷好的标记垫置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用。
(2)包被质控线C、检测线T：
①质控线C、检测线T包被液的制备：取抗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白单抗，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白抗原，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml 的检测线T溶液；
②划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
(3)样品垫的预处理：
①将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
②样品垫预处理液含有pH7.4的0.01mol/lPBS缓冲液、0.5％吐温20；
(4)切割与组装：取吸水垫、已处理的样品垫和HRP酶标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、 HRP酶标垫分别加入干燥剂封口备用；再取已切割好的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫和划过膜的PVC底板，贴上HRP酶标垫，使HRP酶标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压在HRP 酶标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～4mm，得到实施例2用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条。
(5)在得到的检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP 免疫层析试剂条的样品滴入区中滴入检测样，检测样扩散完成后 15-20分钟，在结果观察窗口滴加1滴50ul单组分沉淀型TMB底物， 1-5分钟后读取结果。
实施例3用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条通过以下制备方法得到：包括以下步骤：
(1)新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白-HRP复合物的制备：
取1ml新配制的HRP-NHS溶液(1mg/ml)，与1ml新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原(0.9mg/ml)混匀，4℃反应过夜，反应产物过兔抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱，去除未标记的N蛋白，收集N 蛋白-HRP复合物，以PBS透析后进行浓缩、调整，使得浓缩后的溶液中含有0.1％BSA、0.1％Casein、0.3％PVP40和5％海藻糖，且N蛋白 -HRP的浓度为2mg/ml，得到型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白抗原 -HRP复合物；然后载使用三维喷金划膜仪将新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白抗原-HRP复合物喷至标记垫上，喷量为4μ l/cm；将喷好的标记垫置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用。
(2)包被质控线C、检测线T：
①质控线C、检测线T包被液的制备：取抗新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)N蛋白单抗，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取新型冠状病毒(SARS-CoV-2) N蛋白抗原，用pH7.4的0.01mol/LPBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml 的检测线T溶液；
②划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室，湿度＜30％，干燥10-14h后，加入干燥剂封口备用；
(3)样品垫的预处理：
①将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室，湿度＜30％，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
②样品垫预处理液含有pH7.4的0.01mol/lPBS缓冲液、0.5％吐温20；
(4)切割与组装：取吸水垫、已处理的样品垫和HRP酶标垫，按照(15-20mm)*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、 HRP酶标垫分别加入干燥剂封口备用；再取已切割好的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫和划过膜的PVC底板，贴上HRP酶标垫，使HRP酶标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压在HRP 酶标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～4mm，得到实施例3用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条。
(5)在得到的检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP 免疫层析试剂条的样品滴入区中滴入检测样，检测样扩散完成后 15-20分钟，在结果观察窗口滴加1滴55ul单组分沉淀型TMB底物， 1-5分钟后读取结果。
对上述实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 总抗体的HRP免疫层析试剂条进行性能测试。
一、准确性考察
对国家颁布的SARS-CoV-210个IgG和10个IgM阳性参考品，使用上述实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条进行检测。
检测结果发现：实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条对10个IgG和10个 IgM阳性参考品的检测结果均为阳性。阳性参考品符合率达到100％，因此，实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条符合检测要求。
二、特异性考察
采用实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条分别检测国家颁布的SARS-CoV-2阴性参考品甲型流感病毒IgM阳性血浆、甲型、乙型流感病毒IgM阳性血浆、甲型流感病毒IgM阳性血浆、噬肺军团菌IgM阳性血浆、肺炎衣原体 IgM阳性血浆、肺炎支原体IgM阳性血浆、腺病毒IgM阳性血浆、呼吸道合胞病毒IgM阳性血浆、肺炎衣原体IgG阳性血浆、麻疹病毒 IgG阳性血浆和腮腺炎病毒IgG阳性血浆，检测结果见下表1。
表1：特异性考察结果
Figure BDA0002649402420000151
Figure BDA0002649402420000161
由上表检测结果可知，实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条进行检测的阴性参考品符合率达到100％，符合试剂条检测要求，由此可知，本发明检测试条的特异性良好，符合要求。
三、灵敏度考察
对国家颁布的SARS-CoV-2IgM和IgG最低检测限参考品，分别进行2倍稀释，依次完成9个稀释系列，分别标记为L1-L10；将IgM 和IgG最低检测限参考品等体积混合，按照上述方法稀释，标记为 H1-H10，使用本实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条进行灵敏度考察。
结果显示，本实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条对IgM的最低检测限为 L1-L4均为阳性，L5-L10均为阴性；对IgG的最低检测限为L1-L3均为阳性，L4-L10均为阴性。混合的检测限参考品的最低检测限为 L1-L5均为阳性，L6-L10均为阴性。由此可知，本实施例1-3得到试纸条的灵敏度均超过了国家对IgM和IgG最低检测限的要求，灵敏度较好，符合试纸条检测要求。
四、精密度考察
对用本实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 总抗体的HRP免疫层析试剂条检测精密度参考品，平行检测10次，检测结果均为阳性，由此可知，本实施例1-3的到的试纸条均符检测要求。
五、稳定性考察
将本实施例1-3得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条在37℃下分别放置5天、10天、15天、 20天、30天进行加速破坏性试验，然后分别检测实施例1-3试纸条对应的5份阳性参考品，测试结果见表2-4。
表2：实施例1试纸条稳定性考察结果
Figure BDA0002649402420000171
Figure BDA0002649402420000181
表3：实施例2试纸条稳定性考察结果
Figure BDA0002649402420000182
表4实施例3试纸条稳定性考察结果
Figure BDA0002649402420000183
由上表2-4可知，放置15天的实施例1-3的试纸条均为阳性， 20天后，试纸条的阳性率检测结果开始下降，其中实施例2得到的试纸条的阳性率下降最慢，稳定性最强。综合，可以，本实施例1-5 得到的试纸条的加速稳定性大于15天，稳定性良好。
六、临床样本考察
对确诊的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染者阳性血清样本136 例，未感染过新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的阴性血清150例，采用本发明实施例1-3的试纸条进行检测。
检测结果发现：本发明实施例1-3的试纸条对136个阳性样品检测结果均为阳性；150个阴性样本检测结果均为阴性，与临床结果相符，可用于临床样本检测。
七、与核酸检测方法比较
对23例临床待检样本分别采用核酸检测试剂盒(RT-PCR法)和本发明实施例1得到的用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)总抗体的HRP免疫层析试剂条(本HRP法)进行检测，再用SPSS软件进行卡方检验，检验结果如下表5所示。
表3本发明HRP法和RT-PCR法的卡方检验结果
Figure BDA0002649402420000191
结果显示：配对卡方检验(McNemartest)的P值为1.000，一致性检验(kappatest)的Kappa值为0.913。卡方检验结果说明了本HRP法与RT-PCR法在临床样本检测上无显著性差异，准确性较好。
综上可知，本发明不同于传统的间接法抗体检测，而是直接运用了特异性抗原进行包被和制备抗原标记物，以检测相应的抗体，并通过通过HRP进行酶促放大效应，以及相关制备方法条件的控制，得到本发明试纸条，填补了HRP标记新冠病毒蛋白的技术空白，并使得制备出的免疫层析试纸条相比常规方法能够在更早期检出SARS-CoV-2 病毒的特异性抗体，而且此法中受检标本不需稀释，可直接测定，因此其敏感度相对高于间接法抗体检测。
以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通人员对本发明的技术方案所做的均等修饰与变化，只要不脱离本发明创造整体构思的情况下，均仍属于本发明创造涵盖的范围之中。

Claims (10)

1.用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：包括PVC底板，所述PVC底板上从下向上依次首尾相接设有样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述样品垫上设有样品滴入区；所述标记垫上喷有新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物，所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C和检测线T，所述质控线C与检测线T沿水平方向平行设置；所述质控线C包被有抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白单抗；所述检测线T包被有新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：所述样品滴入区设置于样品垫靠近底端处；所述样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫均固接在所述PVC底板上；所述吸水纸的一端搭设在硝酸纤维素膜的上面。
3.根据权利要求1所述的用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：所述新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原与HRP之间的分子比为1：1的复合物。
4.根据权利要求1所述的用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：HRP标记所述新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原的浓度为1-2mg/ml，所述标记垫上的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物的喷量为2～4μl/cm。
5.根据权利要求1所述的用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上的检测线T包被的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原的浓度为0.5～1.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。
6.根据权利要求5所述的用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上的质控线C包被的抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白单抗的浓度为1.0～2.0mg/ml，划线量为1.0～2.0μl/cm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白-HRP复合物的制备：
取1ml新配制的HRP-NHS溶液（1mg/ml），与1ml 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原(0.9mg/ml)混匀，4℃反应过夜，反应产物过兔抗HRP-琼脂糖凝胶亲和层析柱，去除未标记的N蛋白，收集N蛋白-HRP复合物，以 PBS透析后进行浓缩、调整，使得浓缩后的溶液中含有0.1%BSA、0.1%Casein、0.3%PVP40和5%海藻糖，且N蛋白-HRP的浓度为1-2mg/ml，得到型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物；
（2）包被质控线C、检测线T：
①质控线C、检测线T包被液的制备：取抗新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白单抗，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成1.0～2.0mg/ml的质控线C溶液；取新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原，用pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液稀释成0.5～1.0mg/ml的检测线T溶液；
②划膜：使用三维喷金划膜仪将质控线C、检测线T包被液分别包被至硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置，C、T线间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室，湿度＜30%，干燥10-14h后，加入干燥剂封口备用；
（3）样品垫的预处理：
①将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室，湿度＜30%，干燥12h后，加入干燥剂封口备用；
②所述样品垫预处理液含有pH7.4的0.01mol/l PBS缓冲液、0.5%吐温20；
（4）切割与组装：将吸水垫、样品垫、HRP酶标垫经过切割后和划过膜的PVC底板进行组装，得到成品。
8.根据权利要求7所述用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中制得新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物后，使用三维喷金划膜仪将新型冠状病毒（SARS-CoV-2）N蛋白抗原-HRP复合物喷至标记垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的标记垫置于干燥室，湿度＜30%，干燥12h后，加入干燥剂封口备用。
9.根据权利要求7所述用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中具体包括：取吸水垫、已处理的样品垫和HRP酶标垫，按照（15-20mm）*300mm尺寸进行切割，切割好后的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫分别加入干燥剂封口备用；再取已切割好的吸水垫、样品垫、HRP酶标垫和划过膜的PVC底板，贴上HRP酶标垫，使HRP酶标垫压在硝酸纤维素膜1～2mm，再贴上样品垫，使样品垫部分压在HRP酶标垫3～5mm，最后贴上吸水垫，吸水垫压在硝酸纤维素膜1～2mm；组装好的PVC底板切割成3～4mm，得到用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）总抗体的HRP免疫层析试剂条。
10.根据权利要求7所述用于检测人SARS-CoV-2的HRP免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于：还包括步骤（5）在得到的检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）总抗体的HRP免疫层析试剂条的样品滴入区中滴入检测样，检测样扩散完成后15-20分钟，在结果观察窗口滴加1滴45-55ul单组分沉淀型TMB底物，1-5分钟后读取结果。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201218

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