CN111474354A - 2019-nCoV新型冠状病毒检测层析试纸条、检测卡和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种2019‑nCoV新型冠状病毒检测层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次相互搭接地粘结在底板上，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的2019‑nCoV新冠病毒表面抗原和胶体金标记的兔IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被小鼠抗人IgM抗体的M检测线和包被小鼠抗人IgG抗体G检测线、以及包被抗兔IgG抗体的质控线，所述M检测线、G检测线、质控线之间相互间隔。本发明还提供了相应的检测卡和试剂盒。本发明所述的检测试剂盒具有很好的灵敏度和特异性，以及稳定性高。

Description

2019-nCoV新型冠状病毒检测层析试纸条、检测卡和试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及免疫诊断技术，具体涉及一种2019-nCoV新型冠状病毒快速检测层析试纸条、检测卡和试剂盒。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。其直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。

冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显差异。

目前确认能够感染人的有7种病毒，其中6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)以及新发现的新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)。

2019-nCoV感染导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一种急性感染性肺炎，该病潜伏期一般为3-7天，最短的潜伏期为一天发病，最长潜伏期为14天，潜伏期具有传染性，主要通过飞沫传播和接触传播。人群普遍易感，老年人及有基础疾病感染后病情较重，儿童及婴幼儿也有发病。患者初始症状多为发热、乏力和干咳，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。

目前我国通过采取一系列预防控制和医疗救治措施，中国境内疫情已得到明显遏制和缓解，但境外发病人数呈明显上升态势。为有效降低病毒感染风险，最大可能避免医院感染，除了确保严格按照标准正确防护以外，加大对2019-nCoV感染者的早期诊断和持续监测十分重要；只有进一步加强对该病的早诊早治，才能有效提高治愈率，降低病亡率，逐步减少病毒的继续蔓延。考虑到感染和潜在感染的人群巨大，运用一种快速、简便、有效、安全的抗体检测方法非常必要。IgM、IgG类抗体是人体感染新冠病毒后产生的免疫防御蛋白，部分病人在核酸检测阴性时即可发现IgM抗体阳性，是新冠病毒诊断的有效方法之一。IgG是感染14天左右后出现的抗体，产生后持续存在，可作为既往感染的指标，有效帮助筛选识别自愈者或者少数无症状者。同时监测IgM和IgG抗体，新型冠状病毒的诊断更加准确，可辅助医生快速鉴别出新型冠状病毒疑似患者。而且与核酸检测试剂盒联合检测，可有效提高疑似患者确诊率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种2019-nCoV新型冠状病毒检测层析试纸条(免疫层析试纸条)。

一种2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次相互搭接地粘结在底板上，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的2019-nCoV新冠病毒表面抗原和胶体金标记的兔IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被小鼠抗人IgM抗体的M检测线和包被小鼠抗人IgG抗体G检测线、以及包被抗兔IgG抗体的质控线，所述M检测线、G检测线、质控线之间相互间隔。

在其中一个实施例中，所述M检测线上包被的IgM抗体的浓度为0.5±0.05mg/ml.

在其中一个实施例中，所述G检测线上包被的IgG抗体的浓度为1±0.05mg/ml。

在其中一个实施例中，所述质控线包被抗兔IgG抗体的浓度为1±0.1mg/ml。

在其中一个实施例中，胶体金标记的2019-nCoV重组蛋白的浓度为1±0.1mg/mL，划膜仪以1.8μL/cm的用量喷涂在结合垫上。

本发明还提供了一种2019-nCoV新型冠状病毒检测卡。

一种2019-nCoV新型冠状病毒检测卡，包括塑料外壳和组装在塑料外壳内的上述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成，所述塑料上壳设有加样孔和显示窗，所述加样孔对应于所述层析试纸条的样品垫，所述显示窗对应于所述层析条的M检测线、G检测线及质控线。

本发明还提供了一种2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒。

一种2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒，包括有上述2019-nCoV新型冠状病毒检测卡和样品稀释液，所述样品稀释液的组成包括：PBS缓冲液中20±1mM酪蛋白、0.2±0.02g/ml海藻糖、10±0.1mMEDTA、0.1±0.01％体积比吐温-80、0.03±0.001％CMIT、0.05±0.001％MIT。

本发明所述试纸条运用捕获法同时检测2019-nCoV病毒特异性抗体IgM和IgG，当待检测的样品加载到样品垫上，若检测样品中有2019-nCoV病毒特异性抗体IgM或IgG，则其与结合垫中的胶体金标记的新冠病毒表面抗原结合，形成IgM或IgG-新冠病毒表面抗原-胶体金的结合物，其与胶体金-兔IgG抗体一起通过毛细作用向前层析当达到检测区，结合物再分别与检测线上固定的小鼠抗人IgG抗体或小鼠抗人IgM抗体结合，形成胶体金-抗原-抗体-抗抗体复合物并被固定在检测线上，阳性时胶体金大量聚积，形成肉眼可见红色。而胶体金-兔IgG抗体继续向前层析，与固定在质控线上的抗兔IgG抗体结合并反应在质控线上形成肉眼可见的红色。

本发明所述新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，具有以下有益效果：

1、本发明所述新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，能够同时得到IgM和IgG的检测结果，且通过优化所述试纸条的工艺参数，使得检测灵敏度和特异性都很好。

2、针对现有的新型冠状病毒检测免疫层析试纸条常存在检测不准确以及不稳定的情况下，经发明人大量的试验探索，精益求精，最终创造性地产生了适合本发明的新型冠状病毒检测免疫层析试纸条的样本稀释液的最优的组分和配比，其对所示层析条的检测的准确性，稳定性有较大的帮助，从而使得本申请所述新型冠状病毒检测免疫层析试纸条具有较高的准确率，且稳定性也较好。

3、本发明所述新型冠状病毒检测免疫层析试纸条，其操作便捷，样本兼容血清/全血/血浆，以及指尖末梢血检测，所需样本量低且易操作，极大降低了医护人员的感染风险，无需任何设备，适合下沉到基层医疗机构。所述新型冠状病毒检测免疫层析试纸条还具有快速筛查的优点，帮助快速锁定疑似患者，减轻工作量。同时还可应用于筛选无症状2019-nCoV携带者，减少无症状携带者对病毒的传播，便于进一步更为有效地控制COVID-19的爆发。

附图说明

图1为新冠病毒检测试纸条结构示意图。

图2为新冠病毒检测试纸条的检测结果判读示意图。

图3为实施例2的新冠病毒检测试纸条生产工艺优化检测结果图。

图4为实施例4实验组13样本检测结果示意图，其中，A：实验组13的1-28天阳性样本检测结果；B：实验组13的1-28天阴性样本检测结果。

图5为实施例5中试剂盒灵敏度部分检测结果对比图。

图6为实施例6中试剂盒特异性检测部分结果对比图。

图7为实施例7中本发明试剂盒(B)与市售新冠病毒检测试纸条(A)检测结果对照图。

附图标记：1、样品垫；2、金标垫；3、硝酸纤维素膜；4、M检测线；5、G检测线；6、质控线C；7、吸水垫；10、检测试纸条。

具体实施方式

本发明为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本申请实施例的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本文中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

实施例1试纸条及检测卡的制备

本实施例提供2019-nCoV IgM和IgG联合检测试纸条的制备方法以及2019-nCoVIgM和IgG联合检测试纸条。

一、所述2019-nCoV IgM和IgG联合检测胶体金层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1、抗原、抗体来源

2019-nCoV重组抗原(杭州启泰生物技术有限公司，NCP01和NCP05，工作浓度1mg/mL)、小鼠抗人IgG抗体(杭州启泰生物技术有限公司，HG01，工作浓度1mg/mL)和小鼠抗人IgM抗体(杭州启泰生物技术有限公司，HM01，工作浓度1mg/mL)、兔IgG(杭州启泰生物技术有限公司，RG01，工作浓度1mg/mL)和山羊抗兔IgG抗体(杭州启泰生物技术有限公司，GRI06，工作浓度1mg/mL)。

模拟阳性对照：

(1)IgG：GBW(E)091110新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)人源IgG单克隆抗体溶液标准物质，浓度为85.3μg/g。

(2)IgM+IgG：Holmes，霍尔姆斯(北京)诊断技术有限公司，浓度为1mg/mL。2、胶体金结合物的制备

为制备AuNP结合物，将溶于PBS的2019-nCoV重组蛋白(1mg/mL)加入1mL AuNP胶体(直径40nm，OD＝1)和0.1mL硼酸盐缓冲液(0.1M，pH8.5)的混合物中。室温孵育30min后，加入0.1mL的牛血清白蛋白溶液(BSA，10mg/mL)，封闭AuNP表面。室温孵育15分钟后，4℃、10000rpm/min下离心20分钟，弃去上清液，加入1mL BSA(1mg/mL)至AuNP偶联物中，重新悬浮。离心和悬浮过程重复两次，最后将AuNP偶联物悬浮于PBS中。

同理制备及纯化AuNP-rabbit-IgG结合物。

3、检测试纸条的制备

样品垫：样品垫为滤血垫，具有过滤血细胞的作用，可减少检测过程中的干扰。用预处理液[BSA(3％，w/v)和Tween-20(0.5％，w/v)]对样品垫进行预处理。

结合垫：使用喷金划膜仪以1.8μL/cm的用量将AuNP-2019-nCoV和AuNP-rabbit-IgG混合液(体积比1:1)喷洒结合垫。喷好的底板放入37℃的烘箱中干燥24h，烘干后放入防潮柜中静置保存。

硝酸纤维素膜的制备：将抗人IgM(0.5mg/mL)、抗人IgG(1mg/mL)和山羊抗兔IgG(1mg/mL)分别固定在硝酸纤维素层析膜上的IgM检测区(M检测线)、IgG检测区(G检测线)和质控线(C线)上。使用喷金划膜仪以1μl/cm将三者分别喷于硝酸纤维素膜上，37℃烘干，加入干燥剂封存备用。组装：在干燥好的底板(粘有硝酸纤维素膜的PCV胶板)靠近检测线一端依次粘贴上结合垫、样品垫，在靠近质控包被线一端粘贴上吸水垫(滤纸纤维)。即将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠置，搭接粘贴到PVC底板上，得到检测试纸条，备用。

4、切条、包装

用切条机将大板切成单个人份，每份3mm宽，得到2019-nCoV新型冠状病毒胶体金检测免疫层析试纸条，并将其保存在密封的铝质包装袋中保存。

所得到的新型冠状病毒检测的层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、结合垫(金标垫)、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次相互搭接地粘结在底板上，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的2019-nCoV新冠病毒表面抗原和胶体金标记的兔IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被小鼠抗人IgM抗体的M检测线和包被小鼠抗人IgG抗体G检测线、以及包被山羊抗兔IgG抗体的质控线，所述M检测线、G检测线、质控线之间相互间隔。其示意图请参见附图1。

二、制备新型冠状病毒检测卡：按照常规，装入塑料卡壳内，所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳，所述试纸条组装于所述塑料外壳中得检测卡，所述塑料上壳设有样品孔和显示窗，所述样品孔对应于所述试纸条的样品垫，所述显示窗对应于所述试纸条的质控线、检测线，示意图请见图2。将每一检测卡置于铝箔袋中，加入干燥剂1包，热合封口备用。

三、制备新型冠状病毒检测试剂盒：包括有上述新型冠状病毒检测卡和样品稀释液，所述样品稀释液的组成为：20mM酪蛋白(CS)、0.2g/ml海藻糖、PBS、10mMEDTA、0.1％体积比吐温-80、0.03％CMIT、0.05％MIT。

四、检测方法：检测步骤如下所示：

1、打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡；

2、检测时取一滴血(约50μL)样本滴加到所述检测卡的圆形样品孔中，再加70～100μl(或2-3滴)样品稀释液，室温放置15分钟内观察结果。本申请在检测模拟阳性对照时，取模拟阳性对照10μL，上样，进行后续检测步骤。

五、检测结果判读：

1.新型冠状病毒IgG和IgM阳性：质控区(C)、IgM和IgG检测区都出现沉淀(红色)线。

2.新型冠状病毒IgG阳性：质控区(C)和IgG检测区都出现沉淀线，IgM检测区不出现沉淀(红色)线。

3.新型冠状病毒IgM阳性：质控区(C)和IgM检测区都出现沉淀线，IgG检测区不出现沉淀(红色)线。

4.阴性：质控区(C)出现沉淀线，IgM和IgG检测区不出现沉淀(红色)线。

5.无效：判读窗口C线位置无条带，不论IgM抗体和IgG抗体的T线位置是否出现条带为试验无效，需重新检测。

结果	结果解释
		IgM阳性，IgG阳性	提示可能为新冠病毒近期感染
IgM阳性，IgG阴性	提示可能为新冠病毒近期感染
		IgM阴性，IgG阳性	提示新冠病毒既往感染
IgM阴性，IgG阴性	提示未感染或感染早期未产生足够可以检测到的抗体

实施例2生产工艺条件的确定及优化

IgM、IgG线和C线上抗体的包被浓度的确定都直接影响检测反应，并最终影响试纸条条带的显色效果。本实施例通过对上述因素进行系统梯度考察，考虑到实际试验涉及到实验组合较多，本实施例仅列举部分代表性实验组，通过针对阴性(PBS)及模拟阳性对照样本(IgM+IgG，Holmes，1mg/mL，每次取10μL上样)的检测(每个实验组检测设立三个重复)来确定最佳的生产工艺。具体如下表1所示：

表1

其中实验组4的检测结果如图3所示，通过结果对比分析可知，实验组4的实验结果较为理想，即IgM、IgG线和C线上抗体的包被浓度分别为0.5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml，试纸条反应稳定、显色清晰，人工判断结果最佳。实验组1、6、7由于检测线IgG包被浓度偏低，膜上的条带IgG显色不清晰，不易于进行人工判读；实验组2、8、9由于检测线IgM包被浓度偏高，导致IgM线出现拖带现象，影响检测结果的正常判读；实验组3由于质控线C包被浓度过高，导致C线不显色，不利于结果质控。实验组5由于检测线IgG包被浓度偏高，导致IgG线出现拖带现象，影响检测结果的正常判读。

实施例3新冠病毒试剂盒检测

采用本发明新冠病毒检测试剂盒对7类(A-G)样品(A为正常人血清、B为正常血浆、C为正常人指尖末梢血、D为正常人血清+模拟阳性对照样本(IgM+IgG)、E为正常人血浆+模拟阳性对照样本(IgM+IgG)、F为正常人指尖末梢血+模拟阳性对照样本(IgM+IgG)、G为正常人血浆+模拟阳性对照样本(IgG)进行检测(200μl血清/血浆+1.17g IgG标准品混匀后)。其他配置为100μL血清/血浆/全血+100μL模拟阳性对照样本。混匀后，按样本类型取相应体积样本(10μL血清/血浆或20μL全血)上样检测，每例重复3次。检测步骤如下所示：

1、打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。

2、检测时分别取20μL待检C、F类样本或10μL A、B、D、E、G类样本滴加到本发明检测卡的圆形样品孔中，再分别加70～100μl(或2-3滴)样品稀释液(本实施例所述样本稀释液的组成：20mM酪蛋白(CS)、0.2g/ml海藻糖、PBS、10mMEDTA、0.1％(体积比)吐温-80、0.03％CMIT、0.05％MIT)，室温放置15分钟内观察结果。检测结果统计表如下表4所示。

表4

从上表检测结果可以看出，本发明所述的新冠病毒检测试剂盒，具有较高的检测准确率，其中，含有IgM+IgG的模拟阳性对照样本，M检测线(IgM)和G检测线(IgG)同为阴性的，都不大于1％，而在IgG的模拟阳性对照样本中，有三例未能检测到阳性结果，但也没有出现IgM阳性的结果。

实施例4样品稀释液的制备及优化

本实施例主要考察不同抑菌防腐剂添加的样品稀释液对检测结果的影响，从而筛选出最优组成及配比，考虑到实际试验涉及到实验组合较多，本实施例仅列举部分关于抑菌防腐剂添加组分优化的相关代表性实验组，具体如下表2所示。

本发明样品稀释液的各实验组均在无菌环境下配制，其中基本组成为：酪蛋白(CS)、海藻糖、PBS、(10mM)EDTA和(0.1％体积比)吐温-80。关于抑菌防腐剂添加的种类和剂量的筛选：5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)和硫柳汞。

表2

注：即实验组28样品稀释液为PBS缓冲液。

各组样品稀释液按上表配置后，pH调整为7.4-8.2，并用0.22μm微孔滤膜过滤，封口并标记。将上述实验组在37℃环境下分别储存1d、7d、14d、21d、28d后进行样本N1-N6(健康人血液样本)、P1-P6(健康人血液样本+总抗体模拟阳性对照样本(IgM+IgG))检测(100(I血清/血浆/全血+100Ig模拟阳性对照样本。混匀后，按样本类型取相应体积样本(10匀后血清/血浆或20或后全血)上样检测，每次检测5个重复Q1-Q5)，其中部分Q3检测结果如下表3所示：

表3

(其中，-表示阴性，+++表示强阳，++表示中阳，+表示弱阳)

实验检测中用稀释液对样本进行稀释，一方面是为了稀释待测样本的浓度并保持样本中待测成分的稳定性，另一方面是为了消除或减少非特异性吸附，条检测特异性。在免疫学检测实验中，免疫反应体系中的蛋白分子种类及含量、pH值、离子强度和温度等基质对免疫反应本身有较大影响，经稀释后的待测血清应保持反应体系无明显变化，检测结果才具有准确性和可靠性。由于血清中的各种抗体、脂质、细胞因子等成分极其复杂，一些嗜异性物质、补体等均能造成抗原抗体发生非特异反应而给结果判定带来影响。稀释液的蛋白质、pH值、离子强度和其他成分对稀释样本的检测结果至关重要。

表3中实验组1中的样本稀释液所用抑菌防腐剂为CMIT，实验组2为MIT，实验组10和13所用抑菌防腐剂分别为CMIT和MIT的不同配比，实验组26为同时添加CMIT、MIT和硫柳汞，实验组27为不加防腐剂，实验组28为PBS缓冲液。由上述实验结果分析可知，实验组13的检测卡(参见图4，部分截图)使用效果最为稳定，当样品稀释液保存液于37℃环境下保存28天后检测结果仍十分明显，且从成本节约考虑，该组合配制相比其他而言最为合理，而其他实验组随着保存时间的增加，其对试剂盒实际检测结果逐渐产生明显影响：具体而言，不加抑菌防腐剂的实验组27在保存1天后，对阳性样本的检测即开始产生影响，随着保存时间的增加，逐渐会产生假阳性(21天)和假阴性(28天)的结果，严重干扰检测结果的准确性；实验组1，2在保存7天后，对阳性样本的检测开始产生一定影响，直至保存28天后，检测结果虽未产生明显假阳性或假阴性的结果，但由于检测线显色程度减弱，会对其人工判读产生一定干扰；实验组10与实验组13相比，添加的CMIT和MIT配比不同，跟踪检测时发现，保存21天后检测条带显色程度明显减弱；添加了3种抑菌防腐剂的实验组26经检测发现，其随着保存时间的增加，也会有检测条带显色程度明显减弱及假阳性(28天)的结果产生因此样本稀释液的最佳配制组合为：20mM酪蛋白(CS)、0.2g/ml海藻糖、PBS、10mMEDTA、0.1％体积比吐温-80、0.03％CMIT、0.05％MIT。

实施例5试剂盒的灵敏度检测

本实验例将通过采用模拟阳性对照样本(Holmes，霍尔姆斯(北京)诊断技术有限公司，1mg/mL)梯度稀释液进行本发明的灵敏度检测分析，模拟阳性对照样本(IgM+IgG)的特异性抗体总量梯度I-IV由低到高设置为：1μg、2μg、4μg和6μg，分成4组，分别为I，组II，组III，组IV。

每梯度重复检测20次。将检测结果统计如下表5及图5所示(组II有一检测结果是假阴性)。同时本发明在检测全血样品的过程中，不会有溶血现象，从而有效避免样本产生的检测干扰，确保检测结果的准确判读。本发明的灵敏度良好，将模拟阳性对照样本按梯度稀释之后，最低检测限可以达到2μg。

表5

实施例6试剂盒的特异性检测

本实验例将通过采用本发明实施例1所述试剂盒检测针对SARS病毒阳性标准品(1mg/mL，SARS病毒抗体国家标准品，品种编号220011)、2019-nCoV的模拟阳性对照样本(Holmes)，以及按照体积比为1：1的SARS病毒阳性标准品和2019-nCoV的模拟阳性对照样本(IgM+IgG)来测试试剂盒的检测特异性。检测步骤如实施例1所述共设3组，每组200例样本，检测结果如下表6及实验组2、3的部分结果如图6所示：

表6

上述检测结果显示当检测样本中含有2019-nCoV的模拟阳性对照样本时，不低于98％的样本检测结果中检测线和质控线均有明显条带，结果准确；当检测样本中不含有新冠病毒的模拟阳性对照样本时，检测结果中仅质控线有明显条带的占99.5％，准确率占比非常高，具体见附图。且需要补充说明的是，在待检样本中阳性参考品的总量一致的情况下，混入SARS-CoV和2019-nCoV的样本在本发明试剂盒的检测下，发现在加有少量的其他类似的抗体的阳性标本的情况下，检测结果准确率依然较高。同时由于本发明检测试剂盒可同时检测IgM和IgG，因此可用于早期诊断(IgM)和治疗期间的监测。具有良好的应用及推广价值。

实施例7

本实施例所述为本发明实施例1所述的试剂盒与市售同类产品进行检测效果对比，选用P公司生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测胶体金免疫层析试纸条。检测步骤严格按照各试剂盒说明书操作。分别取1组模拟阳性对照样本(IgM+IgG，Holmes，1mg/mL)进行检测，并设置3个平行对照，如图7所示为其中一组检测结果，可明显看出，P公司除质检条带外，IgM和IgG检测条带均出现显色不清晰或条带中空等现象，十分干扰结果的正确判读；而本发明所述新型冠状病毒检测试剂盒反应稳定、显色清晰，人工判断结果最佳。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，其特征是，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫顺次相互搭接地粘结在底板上，所述结合垫上喷涂有胶体金标记的2019-nCoV新冠病毒表面抗原和胶体金标记的兔IgG抗体，所述硝酸纤维素膜上设有包被小鼠抗人IgM抗体的M检测线和包被小鼠抗人IgG抗体G检测线、以及包被抗兔IgG抗体的质控线，所述M检测线、G检测线、质控线之间相互间隔。

2.根据权利要求1所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条条，其特征是，所述M检测线上包被的IgM抗体的浓度为0.5±0.05mg/ml。

3.根据权利要求1所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，其特征是，所述G检测线上包被的IgG抗体的浓度为1±0.05mg/ml。

4.根据权利要求1所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，其特征是，所述质控线包被抗兔IgG抗体的浓度为1±0.1mg/ml。

5.根据权利要求1-3任一项所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，其特征是，所述胶体金标记的2019-nCoV重组蛋白的浓度为1±0.1mg/mL，以1.8±0.1μL/cm的用量喷涂在结合垫上。

6.根据权利要求1-3任一项所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，其特征是，所述胶体金标记的兔IgG抗体浓度为1±0.1mg/mL，以1.8±0.1μL/cm的用量喷涂在结合垫上。

7.一种2019-nCoV新型冠状病毒检测卡，其特征是，包括塑料外壳和组装在塑料外壳内的权利要求1-6任一项所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测的层析试纸条，所述塑料卡壳是由塑料上壳和塑料下壳扣合而成，所述塑料上壳设有加样孔和显示窗，所述加样孔对应于所述层析试纸条的样品垫，所述显示窗对应于所述层析试纸条的M检测线、G检测线及质控线。

8.一种2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒，其特征是，包括有权利要求7所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测卡和样品稀释液，所述样品稀释液的组成包括有：PBS缓冲液中具有20±1mM酪蛋白、0.2±0.02g/ml海藻糖、10±0.1mM EDTA、0.1±0.01％体积比吐温-80、0.03±0.001％CMIT、0.05±0.001％MIT。

9.根据权利要求8所述的2019-nCoV新型冠状病毒检测试剂盒，其特征是，所述样品稀释液的组成为：PBS缓冲液中具有20mM酪蛋白、0.2g/ml海藻糖、10mM EDTA、0.1％吐温-80、0.03％CMIT、0.05％MIT。

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