CN113447652A - 一种用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2抗原的试剂卡盒及其制备方法，属于新型冠状病毒检测领域包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条、稀释液及使用说明书，对新型冠状病毒可以进行快速的检测，可以实现快速、大规模的批量操作，而且还可避免医务人员采集标本过程中的暴露风险，所抗体检测更安全，为疫情防控提供技术支撑。

Description

一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒检测领域，特别是一种用于检测新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用。
背景技术
新冠肺炎是由一种具有包膜的单股正链RNA新型冠状病毒(国际病毒分类学委员会命名SARS-CoV-2，别名2019-nCoV)所引发的。电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，形态似皇冠，故名冠状病毒。新型冠状病毒是人类冠状病毒中的第七种，属于β冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。已知的冠状病毒基因组结构如图1所示，5’端为开放阅读框(open reading frame，ORF)1a和1b，约占基因组全长2/3，编码聚合酶等非结构蛋白；3’端约占基因组1/3区域，编码刺突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope， E)、囊膜蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)。其中，以S区变异最为显著。新型冠状病毒是继SARS-CoV和MERS-CoV后从野生宿主跨越种系感染人类的第三种可引起严重肺炎表现的冠状病毒。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
目前，实时荧光RT-PCR方法核酸检测是新型冠状病毒感染确诊的重要检测手段，但PCR技术检测耗时费力，对实验室操作人员要求高，很难适应公共卫生事件应急处置需要。虽说核酸检测是新型冠状病毒检测的“金标准”，但核酸检测并不是100％的准确，有些患者会出现假阴性，并且对检测设备或平台要求较高，高灵敏℃的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净℃和操作人员要求也较高。与核酸检测相比，抗体检测的血液标本更易获取且标本质量有保证、操作简单快捷、无需任何仪器设备、操作者、操作空间不受任何限制，很大程℃上降低了医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险、更易于基层实验室展开筛查工作等。如果说核酸检测病毒的核糖核酸(RNA)，是病毒存在的直接证据，那么抗体检测的就是患者血液中被刺激产生的抗体，是间接证据，对临床有提示作用。当核酸检测阴性时，将IgM和IgG抗体检测增加进去，可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺点。
另有临床数据显示部分已被感染的患者不能检出病毒核酸，与临床表现不符，这种“假阴性”无法完全避免，假阴性意味着漏检，不仅会导致临床中对疑似患者不能快速确诊，而且会使漏检者成为潜在的病毒传染源。血清学检测方法中最广泛使用的酶联免疫吸附法虽然结果准确，但操作简便性欠佳，需要多次孵育和洗涤，操作繁琐，耗时长，至少1.5h才能检测出结果。解决这种情况一个行之有效的办法，就是补充新型冠状病毒特异抗体检测。
SARS-CoV-2感染人体后，除了对靶器官产生致病过程外，病毒基因组编码的结构蛋白、非结构蛋白还刺激机体免疫系统，产生特异性免疫应答，分泌病原体特异性IgM和IgG抗体至血液循环中，而IgG常发病2周后出现，是病毒感染最可靠的指标，滴度快速上升可提示近期感染，否则为既往感染。通过检测血清中该抗体，可对临床诊断起到辅助作用。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。因此，寻找一种快速、不使用或使用简单易携带的仪器在现场进行检测诊的诊断策略已经成为一种迫切需要。
发明内容
本发明的目的是对新型冠状病毒可以进行快速的检测，可以实现快速、大规模的批量操作，而且还可避免医务人员采集标本过程中的暴露风险，所抗体检测更安全，为疫情防控提供技术支撑。
为了实现上述目的：本发明提供如下技术方案：
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒，包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条、稀释液及使用说明书。
进一步的，所述试剂卡盒本体包括下盒体，所述下盒体的上表面固定连接有定位台，所述下盒体的上表面固定连接有凸台，所述凸台的上表面固定连接有检测条，所述下盒体上表面的两侧均固定连接有定位柱，所述定位柱的内壁固定连接有定位杆，所述定位杆的上表面固定连接有上盒体，所述上盒体上表面的一侧开设有凹槽，所述上盒体上表面的中部开设有观察窗口，所述上盒体上表面的另一侧开设有透气孔，所述上盒体与下盒体的正面和背面均固定连接有防滑垫。
进一步的，所述检测条包括PVC底板，所述PVC底板上由前到后依次设置有样品垫、胶体金垫、包被垫和吸水垫，所述包被垫为硝酸纤维素膜，在包被垫上设置有两条测试线，分别是G线15和M线20和一条质控线C线的硝酸纤维素膜，G 线15固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体，M线20固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。
进一步的，一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒的制
备方法，包括以下步骤：
S1，辅料，原料，试剂的准备：按标准配方的内容领取所要配制的液体所需的物料，准确称取各组分物料置于适当容器中，加适量工艺用水溶解后混合均匀，测定液体的PH值应与所配制液体要求一致，用工艺用水定容至终体积后送入半成品库存放；
S11)所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用去离子水；
S1，胶体金溶液的制备，包括：
S21)氯化金HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于去离子水中配成1％的水溶液；
S22)煮金在去离子水加入到反应瓶中，用移液器将氯金酸溶液于所述去离子水中，搅拌，加热至沸腾，再加入1％柠檬酸三钠溶液，溶液由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10min，关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，4℃保存，获得胶体金溶液；
S22)试剂必须保证严格的灭菌或过滤，除去可能混有的杂质；
S23)配置胶体金溶液的为PH7.0-7.5，否则缺乏重复性；
S24)氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平秤盘；
S25)金颗粒容易吸附在电极使之堵塞，不能使用PH电极测定金溶液的PH值；
S3，检测条核心部件的准备，具体操作步骤如下：
S31.制作样品垫；
S32.制作载有抗体的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条，这是胶体金垫；
S33.制作合适观察窗口孔径的硝酸纤维素膜条，所述硝酸纤维素膜条喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照组线，这是测试线所在的膜条，所述捕捉分析物是抗人IgG和IgM抗体，阴性对照组线是COIVD-19的多克隆抗体；
S34.制作吸水垫，
S35.将S31-S34中准备的四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上；
S4，胶体金标记物的制备：在电磁搅拌器下降1/10体积的时候，将抗原溶液加于胶体金溶液，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0，放置至室温继续反应，封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物；
S5，NC膜处理：NC膜上预先包被上测试线和质控线，测试线能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在测试线发生聚集，根据测试线的显色状况判读结果；
S6，将胶体金标记物喷涂在玻璃纤维素上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干，得到胶体金垫；
S7，印模制备：将硝酸纤维素膜NC膜贴在PVC底板上，将印模机的C、T线调整搭配合适的距离，然后进行印模，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；
S8，组板：将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置；
S9，切条：根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条，裁切宽度均一，无压痕，无划伤；
S10，包装：将裁切好的检测条压入试剂卡盒本体内。
5、根据权利要求4的一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒中的制备方法，所述检测条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A1：金溶液的制备：
A11：取200mL去离子水于洄流圆底烧瓶中，加入1mL 1％HAuCL4溶液，混匀；
A12：洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速均匀搅拌并加热沸腾；
A13：迅速一次性加入1mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；
A14：观察溶液颜色变化，依次是由浅黄、黑色、紫色、紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10min；
A15：停止加热，冷却至室温，得到金溶液；
A2：金溶液检测：
采用分光光度计，取金溶液，将其设定为500-550nm扫描，用ddH2O调零，分光光度计在532nm±2nm(40nm)522nm±2nm(30nm)附近有最高吸收峰；
A3：金溶液pH调节：
A31：配制1％K2CO3溶液；
A32：用1％K2CO3调节金溶液pH至7.4-9.0，得到待用金溶液；
A4：抗体的金标记：
A41：抗体的前处理和保存，抗体即为步骤中的蛋白：
A411：腹水的纯化：利用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法获得抗体，具体如下：将小鼠腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液pH4.0稀释后，用1M NaOH调pH 至4.5；逐滴加入辛酸，终浓度为25μl/mL稀释腹水，室温搅拌30min，4℃静置2h；4、12000r/min，4℃，30min，收集上清；上清液用滤纸过滤1次，加入1/10体积的10×PBS，冰浴至4℃；根据每mL上述混合液加0.277g固体硫酸铵，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，多次慢慢加入，并搅拌，以免造成局部浓度过高；硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心，采取4℃搅拌30min后，继续静置至少1h，再13000r/min， 4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。
A412：将上述溶液利用亲和层析进行纯化：在收集管中加入100μl的1M Tris-HCl，pH9.0，用于收集1mL的洗脱液；移去柱子下接口的塞子，扭断即可；用 10mL结合缓冲液洗柱子；
上样：用2mL上样，用5-10mL结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质；用2-5mL洗脱液进行洗脱；纯化结束后，用20％乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
A413：蛋白浓缩：蛋白浓缩常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管，根据目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定，选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的 1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管；
A414：蛋白的测定：先进行浓度测定，利用分光光度计使用280nm，260nm 波长测OD，然后利用SDS-PAGE和Western blot检测纯度，测定条带大小，看是否有杂带析出；
A415：蛋白保存：
A4151：将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，加0.05％叠氮钠防腐；
A4152：短期保存，4℃低温冷藏，蛋白活性保持数周；
A4153：长期保存，-70℃低温冷冻，注意反复冻融时，遵守-70℃至-20℃至-4℃或0℃至常温的多级降温程序，温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀；
A416：标记前处理：
A4161：离心去杂质沉淀；
A4162：蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法盐法提纯，所以使用2mM 硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出，盐将影响标记效果；
A42：抗体的金标记
A421：量取A3中得到的待用金溶液100mL金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30min；
A422：取10％BSA，逐滴加入A421的混合溶液中，至终浓度0.5％，搅拌 15min，BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性；
A423：取5％PEG，20000，，逐滴加入A422的混合溶液中，至终浓度0.1％，搅拌15min；
A43.离心纯化
A431：取A423最终得到的混合溶液，采用高速冷冻离心机离心，速度 8000-9000rpm，4℃，1h；
A432：悬浮沉淀弃上清后加入稀释液混匀，稀释比例根据原液量换算，例 100mL原液，A421中的100mL金溶液，沉淀加入用PBS稀释的10-20mL稀释液中；
A433：金标记的抗体检测：
1)以稀释液为空白对照
2)扫描金标抗体在500～550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm，标记溶液应即标即用，不宜长期存储；
A5：胶体金垫与样品垫的预处理
A51.胶体金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体的反应；样品垫能分离过滤样品种的杂质，主要选择玻纤、无纺布和滤纸，一般需要经过前期处理才能使用，处理液一般用缓冲液、表面活性剂和 Tris等，确定处理数量，裁切一定规格，每10张一叠放置；；
A52. 30mL/A4纸张大小，因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节；加完抗体处理后用吐温Twwen-20、聚乙二醇配成处理液提前泡一段时间后， BSA和Casein作为封闭液对NC膜进行封闭；
A53.将胶体金垫和样品垫分别放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上；
A54.将A53得到的材料放入37℃干燥箱，湿度小于20％，烘干至湿度恒定在20％左右；
A55.将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境，使用前要弃除材料的四个边缘，因有边缘效应；
A6：点样
A61：胶体金喷点到胶体金垫
A611：稀释标记胶体金至5OD/μL，添加：10-20％蔗糖，1-3％BSA，0.5-1％ NaCl，0.5-1％表面活性剂；
A612：在湿度20-40％,室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10PSI，喷点参数为2-6μL/cm；
A613：将喷好的胶体金条带置于37℃干燥,湿度恒定在20％后，收起并密封贮存；
A614：使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应；
A62.抗体喷点到NC膜
A621：取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1h；
A622：用缓冲溶液将抗体稀释到合适浓度(0.1-5mg/mL)，缓冲系统可选磷酸盐，Tris，碳酸盐；pH范围：6.0-9.0(根据等电点而定)，另加1％NaCl，1％蔗糖，表面活性剂若干；
A623：使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1μL/cm，并点样；
A624：烘箱干燥，37℃2h至湿度20％以下，后密封包装待用，NC膜点样前不做任何处理；
A7：试纸条的组装、剪切、包装
A71：常温，20％湿度以下，将NC膜非点样面粘贴于PVC底板；
A72：胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm；
A73：吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm；
A74：样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm；
A75：在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条；
A76：装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。
进一步的，吸水垫的材质为吸水纸。
进一步的，所述硝酸纤维素膜包被的重组新型冠状病毒抗体浓度为N蛋白，浓度为1μg/mL。
进一步的，其特征在于：所述胶体金喷点量为0.1μL/mm。
进一步的，所述质控线包被浓度：生物素为2.5mg/mL。
进一步的，所述检测线包被浓度：抗人IgG/抗人IgM抗体为1.3mg/mL。
本发明工作原理是：
试剂卡盒检测条上固定有两条检测线(G线15和M线20)和一条质控线(C线) 的硝酸纤维素膜，G线15固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体； M线20固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。样本加入样本孔后，液体在毛细管效应下向上层析。样本中新型冠状病毒(2019-nCoV)的IgM或IgG在层析过程中先与胶体金标记的重组抗原结合，然后继续向上层析，随后在M线20位置会形成固相抗人IgM单抗-新型冠状病毒 (2019-nCoV)的IgM抗体-胶体金复合物，在G线15则形成抗人IgG单抗新型冠状病毒(2019-nCoV)的IgG-胶体金复合物，胶体金结合物继续迁移到C线上后会被质控抗体(抗鼠IgG单抗)结合。
也就是在包被有抗人IgM抗体和抗人IgG抗体的检测条带处，IgM和IgG抗体的抗原抗体复合物分别被富集，出现检测带的红色反应线，未结合特异性 COVID-19抗体的胶体金标记COVID-19抗原继续流动到对照带(C)质控抗体结合并富集，出现对照带的红色反应线，这是胶体金免疫标记抗原抗体反应，主要是胶体金颗粒富集的结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
对新型冠状病毒可以进行快速的检测，可以用于初步筛查，由于本发明具有快速、大规模的批量操作的特点，并且在在实践中检测的准确率高达90％以上，而且还可避免医务人员采集标本过程中的暴露风险，所抗体检测更安全，为疫情防控提供技术支撑。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的轴测结构示意图；
图2为本发明中下盒体的俯视结构示意图；
图3为本发明中凸台的俯视结构示意图；
图4为本发明中试剂条的轴测结构示意图；
图5为本发明中上盒体的仰视结构示意图；
图中：1、上盒体；2、凹槽；3、观察窗口；4、透气孔；5、防滑垫；6、下盒体；7、定位柱；8、定位台；9、试剂条；10、凸台；11、PVC底板；12、样品垫；13、胶体金垫；14、包被垫；15、G线15；16、质控线；17、NC膜； 18、吸水垫；19、定位杆；20、M线20。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒及其制备方法，包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条9、稀释液及使用说明书。
所述试剂卡盒本体包括下盒体6，所述下盒体6的上表面固定连接有定位台8，所述下盒体6的上表面固定连接有凸台10，所述凸台10的上表面固定连接有检测条9，所述下盒体6上表面的两侧均固定连接有定位柱7，所述定位柱7的内壁固定连接有定位杆19，所述定位杆19的上表面固定连接有上盒体1，所述上盒体1 上表面的一侧开设有凹槽2，所述上盒体1上表面的中部开设有观察窗口3，所述上盒体1上表面的另一侧开设有透气孔4，所述上盒体1与下盒体6的正面和背面均固定连接有防滑垫5。
所述检测条9包括PVC底板11，所述PVC底板11上由前到后依次设置有样品垫12、胶体金垫13、包被垫14和吸水垫18，所述包被垫14为硝酸纤维素膜，在包被垫14上设置有两条测试线，分别是G线15和M线20和一条质控线C线的硝酸纤维素膜，G线15固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体， M线20固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。
吸水垫的材质为吸水纸，所述硝酸纤维素膜包被的重组新型冠状病毒抗体浓度为N 蛋白，浓度为1μg/mL，所述胶体金喷点量为0.1μL/mm，所述质控线包被浓度：生物素浓度为2.5mg/mL，所述检测线包被浓度：抗人IgG/抗人IgM抗体为1.3 mg/mL。
一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒及其制备方法的制备方法，包括以下步骤：
S1，辅料，原料，试剂的准备：按标准配方的内容领取所要配制的液体所需的物料，准确称取各组分物料置于适当容器中，加适量工艺用水溶解后混合均匀，测定液体的PH值应与所配制液体要求一致，用工艺用水定容至终体积后送入半成品库存放；
S11所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用去离子水；
S1，胶体金溶液的制备，包括：
S21氯化金HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于去离子水中配成1％的水溶液；
S22煮金在去离子水加入到反应瓶中，用移液器将氯金酸溶液于所述去离子水中，搅拌，加热至沸腾，再加入1％柠檬酸三钠溶液，溶液由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10min，关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，4℃保存，获得胶体金溶液；
S22试剂必须保证严格的灭菌或过滤，除去可能混有的杂质；
S23配置胶体金溶液的为PH7.0-7.5，否则缺乏重复性；
S24氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平秤盘；
S25金颗粒容易吸附在电极使之堵塞，不能使用PH电极测定金溶液的PH值；
S3，检测条9核心部件的准备，具体操作步骤如下：
S31.制作样品垫；
S32.制作载有抗体的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条，这是胶体金垫；
S33.制作合适观察窗口3孔径的硝酸纤维素膜条，所述硝酸纤维素膜条喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照组线，这是测试线9所在的膜条，所述捕捉分析物是抗人IgG和IgM抗体，阴性对照组线是COIVD-19的多克隆抗体；
S34.制作吸水垫，
S35.将S31-S34中准备的四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上；
S4，胶体金标记物的制备：在电磁搅拌器下降1/10体积的时候，将抗原溶液加于胶体金溶液，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0，放置至室温继续反应，封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物；
S5，NC膜处理：NC膜上预先包被上测试线15和质控线16，测试线15能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在测试线15发生聚集，根据测试线15的显色状况判读结果；
S6，将胶体金标记物喷涂在玻璃纤维素上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干，得到胶体金垫；
S7，印模制备：将硝酸纤维素膜NC膜贴在PVC底板上，将印模机的C、T线调整搭配合适的距离，然后进行印模，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；
S8，组板：将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置；
S9，切条：根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条9，裁切宽度均一，无压痕，无划伤；
S10，包装：将裁切好的检测条压入试剂卡盒本体内。
5、根据权利要求4的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒及其制备方法中的制备方法，所述检测条9的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A1：金溶液的制备：
A11：取200mL去离子水于洄流圆底烧瓶中，加入1mL 1％HAuCL4溶液，混匀；
A12：洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；
A13：迅速一次性加入1mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；
A14：观察溶液颜色变化，依次是由浅黄、黑色、紫色、紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10min；
A15：停止加热，冷却至室温，得到金溶液；
A2：金溶液检测：
采用分光光度计，取金溶液，将其设定为500-550nm扫描，用ddH2O调零，分光光度计在532nm±2nm40 nm522 nm±2nm30 nm附近有最高吸收峰；
A3：金溶液pH调节：
A31：配制1％K2CO3溶液；
A32：用1％K2CO3调节金溶液pH至7.4-9.0，得到待用金溶液；
A4：抗体的金标记：
A41：抗体的前处理和保存，抗体即为步骤中的蛋白：
A411：腹水的纯化：利用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法获得抗体，具体如下：将小鼠腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液pH4.0稀释后，用1M NaOH调pH 至4.5；逐滴加入辛酸，终浓度为25μl/mL稀释腹水，室温搅拌30min，4℃静置2h；4、12000r/min，4℃，30min，收集上清；上清液用滤纸过滤1次，加入1/10体积的10×PBS，冰浴至4℃；根据每mL上述混合液加0.277g固体硫酸铵，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，多次慢慢加入，并搅拌，以免造成局部浓度过高；硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心，采取4℃搅拌30min后，继续静置至少1h，再 13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS 中。
A412：将上述溶液利用亲和层析进行纯化：在收集管中加入100μl的1M Tris-HCl，pH9.0，用于收集1mL的洗脱液；移去柱子下接口的塞子，扭断即可；用 10mL结合缓冲液洗柱子；
上样：用2mL上样，用5-10mL结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质；用2-5mL洗脱液进行洗脱；纯化结束后，用20％乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
A413：蛋白浓缩：蛋白浓缩常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管，根据目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定，选择合适的超滤管，主要考虑 MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管；
A414：蛋白的测定：先进行浓度测定，利用分光光度计使用280nm，260nm波长测OD，然后利用SDS-PAGE和Western blot检测纯度，测定条带大小，看是否有杂带析出；
A415：蛋白保存：
A4151：将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，加0.05％叠氮钠防腐；
A4152：短期保存，4℃低温冷藏，蛋白活性保持数周；
A4153：长期保存，-70℃低温冷冻，注意反复冻融时，遵守-70℃至-20℃至-4℃或0℃至常温的多级降温程序，温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀；
A416：标记前处理：
A4161：离心去杂质沉淀；
A4162：蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法盐法提纯，所以使用2mM硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出，盐将影响标记效果；
A42：抗体的金标记
A421：量取A3中得到的待用金溶液100mL金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30min；
A422：取10％BSA，逐滴加入A421的混合溶液中，至终浓度0.5％，搅拌15min， BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性；
A423：取5％PEG，20000，，逐滴加入A422的混合溶液中，至终浓度0.1％，搅拌15min；
A43.离心纯化
A431：取A423最终得到的混合溶液，采用高速冷冻离心机离心，速度8000-9000rpm，4℃，1h；
A432：悬浮沉淀弃上清后加入稀释液混匀，稀释比例根据原液量换算，例100mL 原液，A421中的100mL金溶液，沉淀加入用PBS稀释的10-20mL稀释液中； A433：金标记的抗体检测：
1以稀释液为空白对照
2扫描金标抗体在500～550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm，标记溶液应即标即用，不宜长期存储；
A5：胶体金垫与样品垫的预处理
A51.胶体金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体的反应；样品垫能分离过滤样品种的杂质，主要选择玻纤、无纺布和滤纸，一般需要经过前期处理才能使用，处理液一般用缓冲液、表面活性剂和Tris等，确定处理数量，裁切一定规格，每10张一叠放置；；
A52. 30mL/A4纸张大小，因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节；加完抗体处理后用吐温Twwen-20、聚乙二醇配成处理液提前泡一段时间后，BSA和 Casein作为封闭液对NC膜进行封闭；
A53.将胶体金垫和样品垫分别放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上；
A54.将A53得到的材料放入37℃干燥箱，湿度小于20％，烘干至湿度恒定在20％左右；
A55.将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境，使用前要弃除材料的四个边缘，因有边缘效应；
A6：点样
A61：胶体金喷点到胶体金垫
A611：稀释标记胶体金至5OD/μL，添加：10-20％蔗糖，1-3％BSA，0.5-1％NaCl，0.5-1％表面活性剂；
A612：在湿度20-40％,室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10PSI，喷点参数为2-6μL/cm；
A613：将喷好的胶体金条带置于37℃干燥,湿度恒定在20％后，收起并密封贮存；
A614：使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应；
A62.抗体喷点到NC膜
A621：取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1h；
A622：用缓冲溶液将抗体稀释到合适浓度0.1-5mg/mL，缓冲系统可选磷酸盐，Tris，碳酸盐；pH范围：6.0-9.0根据等电点而定，另加1％NaCl，1％蔗糖，表面活性剂若干；
A623：使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1μL/cm，并点样；
A624：烘箱干燥，37℃2h至湿度20％以下，后密封包装待用，NC膜点样前不做任何处理；
A7：试纸条的组装、剪切、包装
A71：常温，20％湿度以下，将NC膜非点样面粘贴于PVC底板；
A72：胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm；
A73：吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm；
A74：样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm；
A75：在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条；
A76：装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。
制作试剂卡盒生产工艺条件的确定：
胶体金标记重组抗体条件的优化：
根据胶体金标记技术特性，将胶体金中细微的金颗粒与重组抗体稳定结合，形成红色的胶体金重组抗体结合物。
关于胶体金的检验，胶体金作为本发明的重要载体，其质量决定着结合抗原抗体的效率。
一、胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内，取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小，符合不符合所需要的颗粒直径，金颗粒是否均匀一致，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。
二、胶体金金颗粒均匀度测定
一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。
本实验中应该注意，柠檬酸三钠溶液要迅速一次性加入，搅拌应该均匀，冷却时候应该缓慢，0.1-0.2摄氏度/分钟最佳，大于0.2摄氏度/分钟和小于0.1摄氏度/分钟均不能得到大小均匀的金颗粒，本发明的制得的胶体金标记效果好。
胶体金标记最适pH值的选择：
采用目测法，取若干个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金；用0.1M K2CO3或 5M盐酸将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；取96孔酶标板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100μL加入孔中，重复三次；每孔分别加入3μL浓度为1mg/mL的重组NCP-Ag，混合，室温下放置40min；每孔分别加入20μL 浓度为10％NaCl溶液，混匀，室温下放置2h；观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)。调整pH为X-1.0、X-0.5、X、X+0.5、X+1.0，重复以上步骤，保持红色的最低pH值即为标记的最佳pH值。结果如表1：
表1：胶体金标记重组抗体最适PH值的选择实验结果
Figure BDA0003078493710000181
Figure BDA0003078493710000191
由表1实验结果可知：当PH值为8.5时，即加入0.1M K2CO3 20μL/mL时，胶体金标记重组抗体的效果较好，稳定性好，因此选定PH值8.5(即加入0.1M K2CO3 20μL/mL)为胶体金标记重组2019-nCOV-Ag的最适PH值。
最佳标记量的选择：
最低标记量：盐沉淀法和梯度法。首先采用盐沉淀法选择重组抗体的最低标记量，然后用交叉配比法选出最佳标记量。取96孔酶标板，分别加入最佳pH的胶体金100μL，重复3次；各孔依次加入不同量的蛋白，混匀，室温下放置40min；加入20μL 10％NaCl，室温下放置2h；颜色仍保持红色的为标记的最低蛋白用量。结果如表2：表2：最低标记量选择的实验结果
Figure BDA0003078493710000192
由表2实验结果可知：最低标记量为30μg/mL。
2)最佳标记量选择：用0.1M K2C03溶液调PH到8.5，然后分别加入5μg/mL～ 30μg/mL标记用重组抗体，搅拌40min，再加入10％的牛血清白蛋白至终浓度为 1％，搅拌15min。12000rpm 4℃离心40min，小心弃去上清液，加入胶体金结合物稀释液。铺金，干燥后，与以最适包被条件包被好的抗人IgG/IgM反应膜配对，检测其特异性和灵敏度。结果如表3：
表3：最低标记量选择的实验结果
Figure BDA0003078493710000201
由表3实验结果可知：在PH值8.5条件下，标记浓度为30μg/mL以上时，试纸条的特异性和敏感性较好，灵敏度较高。因此我们确定的标记条件为：每毫升胶体金加入0.1M碳酸钾溶液10μL，标记浓度为30μg/mL为最终生产工艺条件。
3)检测线包被浓度稀释比例的选择：
按照上述确定好的标记条件进行标记，将其体积浓缩至原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/10，再以不同的稀释比例稀释浓缩液，用稀释液浸泡金标垫，1.5mL/ 条，干燥后与以不同检测线包被浓度，0.1μL/mm的包被量包被好的抗人IgG/IgM 反应膜进行配对，检测参考品。实验方案如表4。
表4：实验方案设计
Figure BDA0003078493710000211
浓缩液稀释比例为1：5，检测线包被浓度为1.0mg/mL到2.0mg/mL时，反应膜质控线和检测线显色效果较好，且灵敏度，特异性较好。在此选择A3B2配对组合。即：胶体金结合物稀释液加入至原体积(原体积以胶体金体积计算)的1/2，浸泡金标垫1.5mL/条，为胶体金标记后金结合物垫制备条件。检测线IgM/IgG包被浓度为1.3mg/mL，0.1μL/mm喷点量。
4)质控线及检测线包被浓度的选择：
将生物素配成不同浓度，同时将抗人IgG、抗人IgM配制成1.0mg/mL浓度，以 0.1μL/mm喷点量，分别包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线位置上，进行干燥后，与制备好的重组抗体金结合物垫配组，用参考品进行检测，结果如表5：
表5：质控线检测结果
Figure BDA0003078493710000212
Figure BDA0003078493710000221
由表5实验结果可知：当质控线浓度为1.0mg/mL、1.5mg/mL时，质控线显线较其浓度较弱，而当检测强阳性样本时质控线显线更弱，这主要由于检测线与质控线的竞争引起来的。当质控线浓度为3.0mg/mL以上时，质控线显线较粗且不规则。综合以上实验结果，我们选取2.5mg/mL作为质控线的包被浓度。
为此反应膜最终包被条件为：
喷点量为0.1μL/mm，
质控线包被浓度：生物素为2.5mg/mL
检测线包被浓度：抗人IgG/抗人IgM抗体为1.3mg/mL
5)反应膜和重组抗体金结合物垫干燥条件的选择：
按上述确定的反应膜和重组抗体金结合物垫生产条件，将包被好的反应膜和重组抗体金结合物垫，放入干燥箱，在干燥不同的时间后，取出重组抗体金结合物垫和反应膜，组装成试纸条，用参考品进行检测，并且进行稳定性试验。
适宜的干燥条件，不仅影响本产品的灵敏度，而且关系到本产品的稳定性。结果表明，在37℃条件下，干燥3h制备的试纸条，其敏感性，稳定性均较好，故选择37℃条件下干燥3h为反应膜及重组抗体金结合物垫生产的干燥条件。
6)生产工艺的质量控制
6.1 0.05M PBS缓冲液检验：
外观检测：应为无色、澄清、透明液体无悬浮物。
PH值测定：用PH计测定PH值应为7.3～7.5。
电导率测定：将缓冲液用纯化水两倍稀释，用电导率仪测定电导率应为 9000-13000μs/cm。
6.2胶体金结合物稀释液检验：
外观检测：胶体金结合物稀释液应为无色、澄清、透明液体无悬浮物。
PH值测定：用PH计测定PH值应为8.6～8.8。
电导率测定：用电导率仪测定电导率应为2300～3000μs/cm。
6.3胶体金检验：
外观检测：胶体金为红色或紫红色液体、清亮、无悬浮物、液面无油状漂浮物。
PH值测定：用精密PH试纸测定PH值应为5.4～6.4。
6.4重组抗体金结合物垫：
操作方法：抽取重组抗体金结合物垫，与检验合格的其他组份粘贴到一起，切成3mm试纸条。装卡后，直接将10μL的样本加在样品孔里，加稀释液100μL，室温放置，10min判读结果，不可超过20min。
结果判定：
阳性：检测窗出现两条或三条红色线，即一条质控线和一条或两条检测线。
阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。
无效：检测窗无红色质控线出现。
外观检查：重组抗体金结合物垫颜色为红色或紫红色，规格为30cm×1cm。
敏感性：5份阳性参考品P1-P5，显色结果全部为阳性。
特异性：20份阴性参考品N1-N20，显色结果全部为阴性。
最低检出限：最低检出限参考品mL1-mL3、gL1-gL3为阳性。
精密性：取参考品精密性质控对10支检测卡检测，其检测结果为阳性，且显色均匀。
产品反应膜：
操作方法：取产品反应膜，与检验合格的其他组份粘贴到一起，切成3mm试纸条，装入卡壳后。将10μL样本和100μL样本稀释液加在样品孔里，室温放置，1-15min 判读结果，不可超过15min。
结果判定：
阳性：检测窗出现两条或三条红色线，即一条质控线和一条或两条检测线。
阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。
无效：检测窗无红色质控线出现。
外观检查：产品反应膜平整、干净无污点、无裂缝，各组份齐全、粘贴牢固。
敏感性：5份阳性参考品P1-P5，显色结果全部为阳性。
特异性：20份企阴性参考品N1-N20，显色结果全部为阴性。
最低检出限：最低检出限参考品mL1-mL3、gL1-gL3为阳性。
精密性：取参考品精密性质控对10支检测卡检测,其检测结果为阳性，且显色均匀。 6.6中间品检检验：
操作方法：直接将10μL样本和100μL稀释液加在加样孔中，室温放置，1-15min 判读结果，不可超过15min。
结果判定：
阳性：检测窗出现两条或三条红色线，即一条质控线和一条或两条检测线。
阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。
无效：检测窗无红色质控线出现。
外观检查：产品外壳干净无污点、无裂缝，各组份齐全、粘贴牢固。
物理检查：随机检测10个检测卡，液体移行速℃应不低于10mm/min。
敏感性：5份阳性参考品P1-P5，显色结果全部为阳性。
特异性：20份阴性参考品N1-N20，显色结果全部为阴性。
最低检出限：最低检出限参考品mL1-mL3、gL1-gL3为阳性。
精密性：取参考品精密性质控对10支检测卡检测,其检测结果为阳性，且显色均匀。 6.7成品检验：
操作方法：直接将10μL样本和100μL稀释液加在加样孔中，室温放置，1-15min 判读结果，不可超过15min。
结果判定：
阳性：检测窗出现两条或三条红色线，即一条质控线和一条或两条检测线。
阴性：检测窗仅出现一条红色质控线。
无效：检测窗无红色质控线出现。
以上变色反应是因为在包被有抗人IgM抗体和抗人IgG抗体的检测条带处，IgM和IgG抗体的抗原抗体复合物分别被富集，出现检测带的红色反应线，未结合特异性COVID-19抗体的胶体金标记COVID-19抗原继续流动到对照带(C)质控抗体结合并富集，出现对照带的红色反应线。(这是胶体金免疫标记抗原抗体反应，主要是胶体金颗粒富集的结果)
6.8物理检查：
外观平整，材料附着牢固，包装完整无破损，标识清晰可辨。
随机检测10个检测卡，液体移行速度应不低于10mm/min。
敏感性：5份阳性参考品P1-P5，显色结果全部为阳性。
特异性：20份阴性参考品N1-N20，显色结果全部为阴性。
最低检出限：最低检出限参考品mL1-mL3、gL1-gL3为阳性。
精密性：取参考品精密性质控对10支检测卡检测，其检测结果为阳性，且显色均匀。
6.9成品的储存和效期：
成品经检验合格后，交仓库管理与储存，储存在4～30℃条件下，有效期为12个月。

Claims (9)

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒，其特征在于，包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条(9)、稀释液及使用说明书。
2.根据权利要求1所述一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒，其特征在于：所述试剂卡盒本体包括下盒体(6)，所述下盒体(6)的上表面固定连接有定位台(8)，所述下盒体(6)的上表面固定连接有凸台(10)，所述凸台(10)的上表面固定连接有检测条(9)，所述下盒体(6)上表面的两侧均固定连接有定位柱(7)，所述定位柱(7)的内壁固定连接有定位杆(19)，所述定位杆(19)的上表面固定连接有上盒体(1)，所述上盒体(1)上表面的一侧开设有凹槽(2)，所述上盒体(1)上表面的中部开设有观察窗口(3)，所述上盒体(1)上表面的另一侧开设有透气孔(4)，所述上盒体(1)与下盒体(6)的正面和背面均固定连接有防滑垫(5)。
3.根据权利要求1所述一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒，其特征在于所述检测条(9)包括PVC底板(11)，所述PVC底板(11)上由前到后依次设置有样品垫(12)、胶体金垫(13)、包被垫(14)和吸水垫(18)，所述包被垫(14)为硝酸纤维素膜，在包被垫(14)上设置有两条测试线，分别是G线(15)和M线(20)和一条质控线C线的硝酸纤维素膜，G线(15)固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体，M线(20)固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。
4.一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒的制备方法，
其特征在于，包括以下步骤：
S1，胶体金溶液的制备，包括：
S11)氯化金HauCl4水溶液的配制：将l g的氯化金一次溶解于去离子水中配成1％的水溶液；
S12)煮金取200mL去离子水加入到500mL三角瓶中，置于磁力搅拌器上，打开搅拌旋钮至适当速度，用移液器吸取2mL 1％氯金酸溶液于所述200mL去离子水中，搅拌1min，加热至沸腾，1％柠檬酸三钠溶液3.6mL，溶液在2min内由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10min，关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，定容至200mL，4℃保存，获得胶体金溶液；
S13)试剂必须保证严格的灭菌或过滤，除去可能混有的杂质；
S14)配置胶体金溶液的为PH7.0-7.5，否则缺乏重复性；
S15)氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平秤盘；
S16)金颗粒容易吸附在电极使之堵塞，不能使用PH电极测定金溶液的PH值；
S2，检测条(9)核心部件的准备，具体操作步骤如下：
S21.制作样品垫；
S22.制作载有抗体的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条，这是胶体金垫；
S23.制作合适观察窗口(3)孔径的硝酸纤维素膜条，所述硝酸纤维素膜条喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照组线，这是测试线(9)所在的膜条，所述捕捉分析物是抗人IgG和IgM抗体，阴性对照组线是COIVD-19的多克隆抗体；
S24.制作吸水垫，
S25.将S21-S24中准备的四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上；
S3，胶体金标记物的制备：在电磁搅拌器下降1/10体积的时候，将抗原加于胶体金溶液，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0，放置至室温继续反应，封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物；
S4，NC膜处理：NC膜上预先包被上测试线(15)和质控线(16)，测试线(15)能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在测试线(15)发生聚集，根据测试线(15)的显色状况判读结果；
S5，将胶体金标记物喷涂在玻璃纤维素上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干，得到胶体金垫；
S6，印模制备：将硝酸纤维素膜NC膜贴在PVC底板上，将印模机的C、T线调整搭配合适的距离，然后进行印模，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；
S7，组板：将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置；
S8，切条：根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条(9)，裁切宽度均一，无压痕，无划伤；
S9，包装：将裁切好的检测条压入试剂卡盒本体内，得到一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒。
5.根据权利要求4的一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原的试剂卡盒中的制备方法，所述检测条(9)的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：A1：金溶液的制备：
A11：取200mL去离子水于洄流圆底烧瓶中，加入1mL 1％HAuCL4溶液，混匀；
A12：洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；
A13：迅速一次性加入1mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；
A14：观察溶液颜色变化，依次是由浅黄、黑色、紫色、紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10min；
A15：停止加热，冷却至室温，得到金溶液；
A2：金溶液检测：
采用分光光度计，取金溶液，将其设定为500-550nm扫描，用ddH2O调零，分光光度计在532nm±2nm(40nm)522nm±2nm(30nm)附近有最高吸收峰；
A3：金溶液pH调节：
A31：配制1％K2CO3溶液；
A32：用1％K2CO3调节金溶液pH至7.4-9.0，得到待用金溶液；
A4：抗体的金标记：
A41：抗体的前处理和保存，抗体即为步骤中的蛋白：
A411：腹水的纯化：利用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法获得抗体，具体如下：将小鼠腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液pH4.0稀释后，用1M NaOH调pH至4.5；逐滴加入辛酸，终浓度为25μl/mL稀释腹水，室温搅拌30min，4℃静置2h；4、12000r/min，4℃，30min，收集上清；上清液用滤纸过滤1次，加入1/10体积的10×PBS，冰浴至4℃；根据每mL上述混合液加0.277g固体硫酸铵，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，多次慢慢加入，并搅拌，以免造成局部浓度过高；硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心，采取4℃搅拌30min后，继续静置至少1h，再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。
A412：将上述溶液利用亲和层析进行纯化：在收集管中加入100μl的1MTris-HCl，pH9.0，用于收集1mL的洗脱液；移去柱子下接口的塞子，扭断即可；用10mL结合缓冲液洗柱子；
上样：用2mL上样，用5-10mL结合缓冲液冲洗柱子，直到流出液中没有杂物质；用2-5mL洗脱液进行洗脱；纯化结束后，用20％乙醇保存柱子，防止微生物的生长。
A413：蛋白浓缩：蛋白浓缩常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管，根据目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定，选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管；
A414：蛋白的测定：先进行浓度测定，利用分光光度计使用280nm，260nm波长测OD，然后利用SDS-PAGE和Western blot检测纯度，测定条带大小，看是否有杂带析出；
A415：蛋白保存：
A4151：将大容量的抗体分装成大瓶和小瓶两种，以免反复冻融和避免污染，加0.05％叠氮钠防腐；
A4152：短期保存，4℃低温冷藏，蛋白活性保持数周；
A4153：长期保存，-70℃低温冷冻，注意反复冻融时，遵守-70℃至-20℃至-4℃或0℃至常温的多级降温程序，温度跨度过大容易失活，产生蛋白沉淀；
A416：标记前处理：
A4161：离心去杂质沉淀；
A4162：蛋白是使用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法盐法提纯，所以使用2mM硼酸PH9.0或者是10mM的PB缓冲溶液PH7.4进行透析，将溶液内的盐充分透析出，盐将影响标记效果；
A42：抗体的金标记
A421：量取A3中得到的待用金溶液100mL金溶液，逐滴加入1mg抗体溶液，搅拌30min；
A422：取10％BSA，逐滴加入A421的混合溶液中，至终浓度0.5％，搅拌15min，BSA作用为封闭非特异性位点和增加稳定性；
A423：取5％PEG，20000，，逐滴加入A422的混合溶液中，至终浓度0.1％，搅拌15min；
A43.离心纯化
A431：取A423最终得到的混合溶液，采用高速冷冻离心机离心，速度8000-9000rpm，4℃，1h；
A432：悬浮沉淀弃上清后加入稀释液混匀，稀释比例根据原液量换算，例100mL原液，A421中的100mL金溶液，沉淀加入用PBS稀释的10-20mL稀释液中；
A433：金标记的抗体检测：
1)以稀释液为空白对照
2)扫描金标抗体在500～550nm间吸收值，抗体标记后峰值变化3-5nm，标记溶液应即标即用，不宜长期存储；
A5：胶体金垫与样品垫的预处理
A51.胶体金垫：将胶体金标记抗体通过干燥固定在玻璃纤维素膜上，是追踪抗体的反应；样品垫能分离过滤样品种的杂质，主要选择玻纤、无纺布和滤纸，一般需要经过前期处理才能使用，处理液一般用缓冲液、表面活性剂和Tris等，确定处理数量，裁切一定规格，每10张一叠放置；；
A52.30mL/A4纸张大小，因材料厚薄和性能略有差异，处理液量需灵活调节；加完抗体处理后用吐温Twwen-20、聚乙二醇配成处理液提前泡一段时间后，BSA和Casein作为封闭液对NC膜进行封闭；
A53.将胶体金垫和样品垫分别放入缓冲液完全浸透，浸泡10min，后取出脱水3min，平置在筛网上；
A54.将A53得到的材料放入37℃干燥箱，湿度小于20％，烘干至湿度恒定在20％左右；
A55.将烘干后材料装入铝箔袋或塑料袋中密封保存，贴标签及记录批号，注意处理好的玻璃纤维不能长期暴露在湿度高的环境，使用前要弃除材料的四个边缘，因有边缘效应；
A6：点样
A61：胶体金喷点到胶体金垫
A611：稀释标记胶体金至5OD/μL，添加：10-20％蔗糖，1-3％BSA，0.5-1％NaCl，0.5-1％表面活性剂；
A612：在湿度20-40％,室温条件下，将溶液用BIODOT仪器的AIRJET喷头喷到胶体金垫上，压力设置为10PSI，喷点参数为2-6μL/cm；
A613：将喷好的胶体金条带置于37℃干燥,湿度恒定在20％后，收起并密封贮存；
A614：使用时切割整条条带即可，注意金条带两端边缘要弃除，因有边缘效应；
A62.抗体喷点到NC膜
A621：取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡1h；
A622：用缓冲溶液将抗体稀释到合适浓度(0.1-5mg/mL)，缓冲系统可选磷酸盐，Tris，碳酸盐；pH范围：6.0-9.0(根据等电点而定)，另加1％NaCl，1％蔗糖，表面活性剂若干；
A623：使用BIODOT仪器，设定喷点量为0.5-1μL/cm，并点样；
A624：烘箱干燥，37℃2h至湿度20％以下，后密封包装待用，NC膜点样前不做任何处理；
A7：试纸条的组装、剪切、包装
A71：常温，20％湿度以下，将NC膜非点样面粘贴于PVC底板；
A72：胶体金垫粘贴在NC膜的下方，覆盖NC膜1mm；
A73：吸水垫粘贴在NC膜的上方，覆盖NC膜2mm；
A74：样品垫粘贴在胶体金垫的下方，覆盖胶体金垫2mm；
A75：在BIODOT，CM剪切机中将粘贴好的检测板剪切成4mm宽的条；
A76：装壳并和干燥剂一并装入铝箔袋，密封后贴上标签。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的制备方法的制备方法，其特征在于：吸水垫的材质为吸水纸。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的制备方法的制备方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜包被的抗人IgG单抗和抗IgM单抗，浓度为2mg/mL。
8.根据权利要求7所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的试剂卡盒的制备方法，其特征在于：所述胶体金喷点量为0.1μL/mm。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的制备方法的制备方法，其特征在于：所述质控线包被浓度：抗鼠IgG单抗为2mg/mL。
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