CN112051400A - 检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法 - Google Patents

检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法，所述的试剂盒包括检测卡和样本稀释液，所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡。本发明制备的检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒可以快速的检测出新型冠状病毒中和抗体，操作简单，结果直观，安全廉价，适合现场快速检测；其次，利用本发明制备的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体含量的方法，通过与胶体金免疫分析读数仪结合，可以准确测定待测物的含量，15min内出结果。

Description

检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法。
背景技术
2020年1月12日，世界卫生组织正式将造成本次新型肺炎疫情的新型冠状病毒命名为“2019-nCoV”。2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。与此同时，国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”。
由该新型冠状病毒引起的肺炎，迅速传播至亚洲、澳洲、欧洲、美洲、非洲等全球各个国家。发病时常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
由于全球感染人数和死亡人数的剧增，疫苗研制刻不容缓，成功控制新冠肺炎感染人数主要依赖于疫苗免疫。因此，疫苗免疫效果的优劣对新冠肺炎的防控起到了决定性作用。新冠中和抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，另外，新冠抗体水平检测对于新冠疫苗免疫程序的制定也具有重要意义。因此，一个快速、准确、高灵敏度和易操作的中和抗体检测方法，无论是对新冠肺炎治疗，还是对疫苗有效性的评估，都是十分重要的。
目前，常见的相关检测技术有病毒分离及鉴定、免疫荧光抗体实验、免疫胶体金技术、正向间接血凝试验、中和试验、酶联免疫吸附试验、反转录-聚合酶链反应、荧光定量技术、基因芯片技术。中和抗体的常规检测技术为中和试验，需要使用病毒或假病毒，在高级别微生物实验室中进行，对人员、设备、操作有非常高的要求，无法满足目前的临床需求。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒及检测方法，采用本发明的试剂盒结合免疫层析法可以测定样本新冠病毒中和抗体的含量，能在15min内出结果，采用本发明的试剂盒只需要简单操作，就能快速诊断中和抗体，结果直观，适合现场快速检测。
本发明的第一目的，提供了一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，包括检测卡和样本稀释液，
所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡；
结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％TritonX-100；
所述的结合垫喷10％浓缩的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
所述的硝酸纤维素膜上依次划有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线间隔距离为3-5mm，所述的检测线T线靠近滤血垫，所述的质控线C线靠近吸水纸。
进一步的，所述的与待测物结合的抗原为新型冠状病毒的RBD或NTD中和位点蛋白。进一步的，切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下密封保存。
进一步的，胶体金的保存液为含0.05-2％BSA、1-30％蔗糖、0.1％Tween-20的pH8.5 20mM Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述的检测线T线为鼠抗人IgG，稀释至1.0-2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
进一步的，所述的质控线C线为羊抗鼠IgG，稀释至1.5～2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
进一步的，所述的检测卡还包括外壳，所述的外壳由上壳和下壳扣合而成，所述的上壳将样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸压紧在PVC板上。
进一步的，所述的上壳与样品垫对应的位置处设置有加样孔，所述的上壳与硝酸纤维素膜对应的位置处设置有观察窗。
进一步的，所述的样本稀释液为含0.05-5％NaCl、0.05-5％BSA和0.1-5％Tween-20的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
本发明试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体的原理如下：
检测线T线为鼠抗人IgG，质控线C线为羊抗鼠IgG抗体。结合垫上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原RBD或NTD。检测过程中，取15-20μL样本溶液加入样品垫，同时滴加2-3滴样本稀释液，样本和标记的抗原RBD或NTD结合，一起在试纸条上移动。当遇到检测线T线上的鼠抗人IgG时，若样本中有待测物，检测线T线会呈红色，若样本无待测物，检测线T线无色。当遇到质控线C线上的羊抗鼠IgG抗体，鼠IgG会结合上去，质控线C线呈红色。
本发明的第二目的，提供了一种利用所述的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体含量的方法，取10-15μL待测血清样本加人到检测卡的加样孔中，再加入2-3滴样本稀释液中室温反应5-15min，开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中，运行仪器读取结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒可以快速的检测出新型冠状病毒中和抗体，操作简单，结果直观，安全廉价，适合现场快速检测；
(2)本发明还提供了利用本发明制备的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体含量的方法，通过与胶体金免疫分析读数仪结合，可以准确测定待测物的含量，实现高灵敏度，检测范围宽，简便快捷，15min内快速检测人血清、血浆、全血样本中的新型冠状病毒中和抗体的含量，可通过滤血垫处理全血样本，利用胶体金免疫层析技术，使用微量样本，滴加样本缓冲液，插入胶体金免疫分析读数仪，即可快速出示结果，具有灵敏度高，检测范围宽，快速简便等特点。本发明的方法能够满足单人份，快速检测新型冠状病毒中和抗体含量的要求，其样本用量少，检测时间短、操作简便，检测结果准确可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的侧面图；
图2是本发明的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的正面图。
附图标记
1-吸水纸、2-硝酸纤维素膜、3-结合垫、4-滤血垫、5-样品垫、6-PVC底板。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
如图1和2所示为本发明的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的侧面图和正面图。
实施例1
一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒如图1和2所示，包括检测卡和样本稀释液，所述的检测卡包括PVC底板6、样品垫5、滤血垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1，所述的样品垫5、滤血垫4、结合垫3、硝酸纤维素膜2和吸水纸1依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板6上，互相交错搭接的尺寸为2mm，PVC底板6的尺寸为80-300mm，形成试纸板，切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下密封保存，得到所述的检测卡；
其中，样品垫5，尺寸为20*300mm；滤血垫4，尺寸为30*300mm；吸水纸1，尺寸为28*300mm；
结合垫3为玻璃纤维材质，喷涂抗原标记的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原新型冠状病毒的RBD中和位点蛋白，胶体金的保存液为含0.5％BSA、15％蔗糖、0.1％Tween-20的pH 8.5 20mM Tris-HCl缓冲液；
试纸板的具体制备方法如下：
(1)结合垫3浸泡在10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％TritonX-100，室温下0.5h，60℃烘干1小时，将标记的胶体金均匀喷在结合垫3上，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
(2)T线划线液配制：用缓冲液将鼠抗人IgG稀释至1.0～2.0mg/mL，所述划膜缓冲液为0.01mol/L PBS(含10g/L蔗糖)，pH7.0～7.4；(3)C线划线液配制：用缓冲液将羊抗鼠IgG稀释至1.5～2.0mg/mL，所述划膜稀释液为0.01mol/L PBS(含10g/L蔗糖)，pH7.0～7.4；
(4)采用喷金划膜仪，将C线抗体、T线抗体分别包被在固定于底板上的硝酸纤维素膜2上，划液量：1μL/cm；划膜速度：50mm/s；
(5)将划好的试纸板置于鼓风干燥箱中，37℃烘干4h，加入干燥剂封存备用。
所述的检测卡还包括外壳，切割的试纸条组装在由塑料制成的上壳和塑料制成的下壳扣合而成的塑料外壳中，塑料上壳上设置有加样孔和观察窗，加样孔对应于样品垫5，观察窗对应于检测线T线和质控线C线。
所述的样本稀释液为含0.9％NaCl、0.5％BSA和1％Tween-20的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
实施例2
本实施例的试剂盒与实施例1相同，不同之处在于，结合垫3上胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原新型冠状病毒的NTD中和位点蛋白。
实施例3
本实施例的一种利用实施例1制备的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体含量的方法，包括如下步骤：
(1)将待检测样本和试剂盒恢复至室温；
(2)取10-15μL待测血清样本加入到检测卡的加样孔(S)中，再加入2～3滴样本稀释液中(如实施例1中所述，已分装成5mL/管)，室温反应5～15min；
(3)开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中；
(4)运行仪器读取检测结果。
试验例1：阳性质控品、阴性质控品的验证
(1)实施例1，试纸条阴性质控品：PBS+0.5％BSA；
试纸条阳性质控品：人源化RBD-1。
(2)实施例2，试纸条阴性质控品：PBS+0.5％BSA，
试纸条阳性质控品：人源化ECD-1。
阳性质控品以阴性质控品为基质进行梯度稀释(如表1)，浓度由高至低依次为：P1/P2/P3。
表1人源化RBD-1、ECD-1抗体稀释方案
P1 P2 P3
人源化RBD-1抗体 1：10 1：20 1：40
人源化ECD-1抗体 1：10 1：30 1：50
在加样孔里加10μL样本，再加入90μL样本稀释液，15min时读取结果。每个稀释梯度重复2次平行检测。
阳性强度由高到低依次表示为+++、++、+、±、±(弱)；阴性表示为－。
实施例1试剂盒验证结果(如表2)所示：
表2实施例1试剂盒判读结果
测试样本 P1-1 P1-2 P2-1 P2-2 P3-1 P3-2 N1-1 N1-2 N1-3
判定 +++ +++ ++ ++ + + － － －
实施例2试剂盒验证结果(如表3)所示：
表3实施例2试剂盒判读结果
测试样本 P1-1 P1-2 P2-1 P2-2 P3-1 P3-2 N1-1 N1-2 N1-3
判定 +++ +++ ++ ++ + + ﹣ ﹣ ﹣
由此可知，实施例1试剂盒阳性质控品RBD-1稀释比例为1:10、1:20、1:40，阴性质控品为PBS+0.5％BSA；
实施例2试剂盒阳性质控品ECD-1稀释比例为1:10、1:30、1:50，阴性质控品为PBS+0.5％BSA。
试验例2不同类型样本的检测
分别将实施例1和2制备的试剂盒进行如下实验：
(1)阴性样本：选择正常人阴性的静脉血全血、静脉血血浆、静脉血血清以及指尖血作为阴性样本；
(2)阳性样本：使用四种阴性样本分别10倍稀释阳性质控，作为阳性样本测试。
按照试剂盒说明书操作：加入阳性样本15μL或阴性样本15μL，滴加两滴样本稀释液，10-15min判读结果。
经过测试，阴性样本测试质控线正常，且阴性全血、阴性指尖血、阴性血清和阴性血浆无明显差异；阳性样本测试中均有C线、T线，显色均一，且使用阴性全血、阴性指尖血、阴性血清和阴性血浆稀释的阳性质控无明显差异，全血和指尖血测试背景干净，不影响实验结果。
试验例3样本加样体积的确定
分别对实施例1和2制备的试剂盒进行如下实验：
设置样本加样体积：5μL、10μL和15μL，测定阳性质控品、阴性质控品确定其加样体积。
样本加样体积测试研究中各性能指标应符合以下要求：
(1)液体移行速度应不低于5mm/min；
(2)对3份阳性质控品(P1-P3)进行检测，每份阳性参考品测试三次，检测结果应均为阳性；
(3)对4份阴性质控品(N1-N4)进行检测，每份阴性参考品测试两个次，检测结果应均为阴性。
经过实验验证，实施例1和2制备的试剂盒的评价汇总均如表4所示。
表4样本加样体积的评价汇总表
Figure BDA0002664263990000081
经过样本加样体积研究测试，10μL和15μL样本的加样体积均能满足测试要求，为节省样本使用量，10μL的样本加样体积就可以满足测试。
试验例4样本稀释液加样体积的确定
分别将实施例1和2制备的试剂盒进行如下实验：
设置样本稀释液加样体积：50μL、75μL、100μL、125μL和150μL，测定阳性质控品、阴性质控品确定其样本稀释液的加样体积。
样本稀释液的加样体积测试研究中各性能指标应符合以下要求：
(1)液体移行速度应不低于5mm/min。
(2)样本爬行状态：试纸条测试过程中，胶体金标记物均匀扩散，且样本爬行正常，NC膜无积水情况。
(3)对3份阳性参考品(P1-P3)进行检测，每份阳性参考品测试三次，检测结果应均为阳性。
(4)对4份阴性参考品(N1-N4)进行检测，每份阴性参考品测试两次，检测结果应均为阴性。
经实验验证，实施例1和2制备的试剂盒评价结果均如表5所示。
表5、样本稀释液的加样体积评价汇总
Figure BDA0002664263990000091
五组测试的试剂条在进行阴性和阳性参考品测定评价中，实验结果表明该试剂盒样本稀释液的加样量在75μL-125μL(滴瓶滴加2-3滴即可)范围内满足测试要求。
试验例5判读时间确定
分别对实施例1和2制备的试剂盒进行如下实验：
在室温条件下对该试剂盒进行判读时间范围考评，设置时间范围：1min、3min、5min、10min、15min、20min和30min，以确定其最佳结果的判读时间范围。判读时间范围研究中各性能指标应符合以下要求：
(1)样本移行速度：应不低于5mm/min；
(2)释放程度：胶体金释放完全且均一；
(3)背景情况：试纸条测试完成后，NC膜背景为白色，无残留。
(4)阳性质控品测定：对3份阳性参考品(P1-P3)进行检测，每份阳性参考品测试三次，检测结果应均为阳性。
(5)阴性质控品测定：对4份阴性参考品(N1-N4)进行检测，每份阴性参考品测试两次，检测结果应均为阴性。
经过本次判读时间范围测试，实施例1和2制备的试剂盒评价汇总均如表6所示。
表6判读时间范围评价汇总表
Figure BDA0002664263990000101
判读时间范围测试实验结果表明本发明制备的试剂盒在1、3min时，胶体金释放不完全，测试结果不准确；20min时，观察等候时间较长；30min NC膜面较干，不便判读；加样10min时，C、T线清晰，颜色明显，其结果最为准确和稳定；5～15min内条带均清晰，颜色明显。参考以上结果，因此确定本发明的试剂盒的判读时间范围为5～15min。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，包括检测卡和样本稀释液，其特征在于，
所述的检测卡包括PVC底板、样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次互相交错搭接后粘贴在所述的PVC底板上，形成试纸板，切割，得到所述的检测卡；
结合垫处理液为10mM Tris缓冲液(pH8.0)，含1％BSA、0.9％NaCl、0.5％Triton X-100；
所述的结合垫喷10％浓缩的胶体金，胶体金上标记有鼠IgG、与待测物结合的抗原，置于鼓风干燥箱中，37℃烘干过夜；
所述的硝酸纤维素膜上依次划有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线间隔距离为3-5mm，所述的检测线T线靠近滤血垫，所述的质控线C线靠近吸水纸。
2.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的与待测物结合的抗原为新型冠状病毒的RBD或NTD中和位点蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，切割成3-4mm宽的试纸条，加干燥剂于常温下密封保存。
4.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，胶体金的保存液为含0.05-2％BSA、1-30％蔗糖、0.1％Tween-20的pH 8.5 20mMTris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的检测线T线为鼠抗人IgG，稀释至1.0-2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
6.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的质控线C线为羊抗鼠IgG，稀释至1.5～2.0mg/mL进行划线，划液量为0.1-5μL/cm，划膜速度为5-100mm/s。
7.根据权利要求1所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的检测卡还包括外壳，所述的外壳由上壳和下壳扣合而成，所述的上壳将样品垫、滤血垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸压紧在PVC板上。
8.根据权利要求7所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的上壳与样品垫对应的位置处设置有加样孔，所述的上壳与硝酸纤维素膜对应的位置处设置有观察窗。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种检测新型冠状病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述的样本稀释液为含0.05-5％NaCl、0.05-5％BSA和0.1-5％Tween-20的pH 7.0的磷酸盐缓冲液。
10.一种利用权利要求1-9任意一项所述的试剂盒检测新型冠状病毒中和抗体含量的方法，其特征在于，取10-15μL待测血清样本加人到检测卡的加样孔中，再加入2-3滴样本稀释液中室温反应5-15min，开启胶体金免疫分析读数仪，初始化自检完毕后，将检测卡插入仪器对应的插口中，运行仪器读取结果。
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