CN112904001B - 新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用，该联检试剂盒包括检测试条，检测试条包括顺次搭连的样品垫、结合垫、检测垫以及吸收垫，检测垫设有相互平行的检测线和质控线，检测线包括相互分离设置的第一检测线、第二检测线和第三检测线，第一检测线上包被有新冠病毒抗体，第二检测线上包被有甲型流感病毒抗体，第三检测线上包被有乙型流感病毒抗体。本发明提供的联检试剂盒，一次采样处理后可同时检测新冠病毒、甲型流感及乙型流感三个项目，检测时间短且操作简单，避免单个项目检测出现漏诊或误诊情况；减少医务人员多次样本采集过程中与患者的反复接触，降低疫情传播的风险。

Description

新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，特别涉及一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019Novel Coronavirus，2019-nCoV)为RNA病毒，属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。2019新型冠状病毒感染后主要临床表现为发热、干咳、乏力。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。重症患者多在发病一周后出现呼吸困难或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。
流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为16个H亚型(H1-H16)和9个N亚型(N1-N9)。甲型流感病毒抗原性易转变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故可能造成更高的发病率和死亡率。流感病毒主要经空气飞沫传播，常引起鼻塞、流涕、发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。
人体感染流感病毒和新型冠状病毒(2019Novel Coronavirus，2019-nCoV)后引起的症状较为相似，单从发热等症状难以对流感病毒和新型冠状病毒进行区分，同时合并感染在呼吸道疾病中比较常见，这早在最初的新冠疫情发生时就已经检测到。
目前市场上现有的检测产品(试剂盒)多只能进行新冠或流感的单项检测，且各自的样本提取液无法互相替代，临床需要二者同时检测时通常要重复采样，并用各自试剂配套的样本提取液重复处理样本，操作较繁琐，且有暴露风险，增加了患者的负担与医务人员感染的风险。
授权公告号为CN 111579792B的中国发明专利公开了一种流感病毒和2019新型冠状病毒抗体联合检测装置及其制备方法，可以同时检测流感与新冠病毒IgM抗体，然而正常情况下，病毒感染机体到产生IgM抗体需要一定的时间，因此检测IgM抗体存在一定的“窗口期”，对于部分新近感染还未产生抗体的患者易发生漏检情况，此外抗体检测需要抽血，对采样人员有专业要求，且耗时耗力，增加了暴露风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒及其制备方法，其可以克服现有技术的缺陷，一次采样处理后可同时检测三个项目，检测时间短且操作简单，避免单个项目检测出现漏诊或误诊情况。且病毒抗原在感染早期发现，是病毒存在的直接证据，检测抗原能够更好的满足疫情防控工作的需求，为做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗”发挥重要作用。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其包括检测试条，所述检测试条包括顺次搭连的样品垫、结合垫、检测垫以及吸收垫，所述检测垫设有相互平行的检测线和质控线，所述检测线包括相互分离设置的第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线上包被有新冠病毒抗体，所述第二检测线上包被有甲型流感病毒抗体，所述第三检测线上包被有乙型流感病毒抗体。
进一步地，所述检测试条包括第一检测试条和第二检测试条，所述第一检测线设置在第一检测试条上，所述第二检测线和第三检测线相互平行的间隔设置在所述第二检测试条上。
进一步地，所述第一检测试条的结合垫上涂覆有胶体金颗粒标记的新冠病毒抗体，所述第二检测试条的结合垫上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型流感病毒抗体和胶体金颗粒标记的乙型流感病毒抗体。
进一步地，所述胶体金颗粒的粒径为50nm-60nm。
进一步地，所述第一检测线、第二检测线及第三检测线相互平行的间隔设置在同一检测试条上。
进一步地，所述试剂盒还包括样品提取液，所述样品提取液包含终浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、质量终浓度为0.5％的Tritonx-100、质量终浓度为0.1％的Proclin300及质量终浓度为1％的NaCl。
本发明还提供了上述新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
检测线包被：先制备新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒包被液，然后分别在检测试条检测垫的第一检测线、第二检测线及第三检测线上分别包被所述新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒抗体包被液；
新冠病毒抗体胶体金标记；
甲、乙型流感病毒抗体胶体金标记。
进一步地，所述新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒包被液的浓度分别为1.5mg/mL，1.0mg/mL及1.5mg/mL。
进一步地，上述制备方法还包括以下步骤：
质控线包被：在质控线上包被羊抗鼠抗体。
本发明还提供了上述新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒的应用，其应用于鼻咽拭子样本的检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：
1、本发明提供的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，一次采样处理后可同时检测新冠病毒、甲型流感及乙型流感三个项目，检测时间短且操作简单，避免单个项目检测出现漏诊或误诊情况；减少医务人员多次样本采集过程中与患者的反复接触，降低疫情传播的风险；且病毒抗原在感染早期即可发现，是病毒存在的直接证据，检测能够更好的满足疫情防控工作的需求，为做到“早发现、早报告、早诊断、早隔离、早治疗”发挥重要作用；
2、本发明提供的样本提取液可以同时处理新冠样本和甲乙型流感样本，处理后的样本采用新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测，整个过程30min内便可得到三个项目的检测结果，快速高效，有助于医务人员及时获得结果并依据三个项目检测结果综合判断、及时处置，避免恐慌、减少疫情传播；
3、本发明提供的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒对新冠病毒培养物的最低检测限是1.3×102TCID50/mL，对新冠病毒重组抗原的最低检测限是1ng/mL，对甲型流感病毒抗原的最低检测限是1.2×103TCID50/mL；对乙型流感病毒抗原的最低检测限是1.0×104TCID50/mL；灵敏度高，特异性好；
4、本发明提供的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒可用于检测鼻咽子样本，取样简单快速，无需抽血，提高了采样效率，节省了时间，降低了暴露风险；
5、本发明提供的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒无需任何仪器设备，无需专业人员操作，检测成本低，实用性强。
附图说明
图1：实施例1的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒中联检卡的结构示意图；
图2：实施例1的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒中联检卡的第一检测试条的结构示意图；
图3：实施例1的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒中联检卡的第二检测试条的结构示意图。
图中：
1、外壳，11、加样口，12、观察窗口；
22、样品垫，23、结合垫，24、检测垫，241、检测线，2411、第一检测线，2412、第二检测线，2413、第三检测线，242、质控线，25、吸收垫。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种检测快速高效、灵敏度高、特异性好的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，以及该试剂盒的制备方法与应用。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。
实施例1：
参照图1-图3所示，本实施例提供了一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，该检测试剂盒内具有联检卡(如图1所示)，所述联检卡包括外壳1和检测试条，所述检测试条设置在外壳1内，具体的设置方式可以是，外壳1包括可上下扣合的上壳和下壳，所述下壳内设有凹槽，所述检测试条嵌设在所述凹槽内。外壳1(上壳)具有加样口11和观察窗口12，加样口11用于添加/滴加待测样品，观察窗口12用于观察检测结果。
请继续参阅图2和图3所示，所述检测试条包括底板、样品垫22、结合垫23、检测垫24以及吸收垫25，沿着层析方向，样品垫22、结合垫23、检测垫24及吸收垫25顺次搭接，且样品垫22、结合垫23、检测垫24及吸收垫25均粘接在所述底板上。具体的，所述底板的材质可以是PVC，结合垫23的材质可以为玻璃纤维，检测垫24可以为硝酸纤维素膜，吸收垫25可以为吸水纸。检测垫24设有相互平行的检测线241和质控线242，检测线241包括相互分离设置的第一检测线2411、第二检测线2412和第三检测线2413，第一检测线2411上包被有新冠病毒抗体，第二检测线2412上包被有甲型流感病毒抗体，第三检测线2413上包被有乙型流感病毒抗体。该新冠病毒抗体、甲型流感病毒抗体及乙型流感病毒抗体均为鼠源性抗体，质控线242上包被有羊抗鼠抗体。
本实施例中，所述检测试条的数量为两个，分别为第一检测试条(如图2所示)和第二检测试条(如图3所示)，第一检测线2411设置在所述第一检测试条的检测垫24上，第二检测线2412和第三检测线2413相互平行的间隔设置在所述第二检测试条的检测垫24上。在其他实施例中，检测试条也可以为1个或者3个，当检测试条为1个时，第一检测线2411、第二检测线2412和第三检测线2413以及质控线242相互平行、间隔的设置在该条检测试条的检测垫上；当检测试条为3个时，第一检测线2411、第二检测线2412和第三检测线2413分别布设在3条检测试条上，每条检测试条上设有一条检测线241和一条质控线242。
本实施例中，所述第一检测试条的结合垫23上涂覆有胶体金颗粒标记的新冠病毒抗体，所述第二检测试条的结合垫23上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型流感病毒抗体和胶体金颗粒标记的乙型流感病毒抗体。所述胶体金颗粒的粒径为50nm-60nm。
所述第一检测试条的制备方法包括如下步骤：
采用胶体金标记技术，选择50nm-60nm大小的胶体金颗粒，加入K2CO3调节胶体金溶液的pH为8-9，随后加入约10μg的新冠病毒抗体(鼠源性单克隆抗体)，利用正负电荷的引力及疏水作用力使得新冠病毒抗体与胶体金颗粒结合在一起，待反应15-30min后加入20％的PEG2000及牛血清白蛋白BSA进行封闭，反应终止后用离心机离心获得的沉淀物即为胶体金标记的新冠病毒抗体。
将上述标记物加入含缓冲体系(终浓度为20mM的PBS)、封闭蛋白(质量终浓度为1％的BSA)、表面活性剂(质量终浓度为0.1％的TW20)的基础液中，用纯化水定容到一定体积(1mL)后涂布至结合垫23的玻璃纤维上，冷冻抽干后制备得胶体金标记的新冠结合垫。
用包被缓冲液将新冠病毒抗体配制成浓度为1.5mg/mL的包被液，并同时取同样体积的1.5mg/mL的羊抗鼠包被液，将两种包被液(两种包被液分别取30μL)用划膜机分别包被于检测垫硝酸纤维素膜的第一检测线2411和质控线242处制备得到新冠包被膜(检测垫)，制备得到的包被膜在37℃恒温箱晾干后干燥保存。
将上述制备得到的新冠结合垫、新冠包被膜(检测垫)及其样品垫、吸水纸依次衔接组装成新冠抗原检测板，检测板切条后得到第一检测(新冠抗原检测)试条。
所述第二检测试条的制备方法包括如下步骤：
采用胶体金标记技术，选择50nm-60nm大小的胶体金颗粒，加入K2CO3调节胶体金溶液的pH为8-9，随后加入约10μg的甲型流感病毒抗体(鼠源性单克隆抗体)，利用正负电荷的引力及疏水作用力使得甲型流感病毒抗体与胶体金颗粒结合在一起，待反应10-15min后加入20％的PEG2000及BSA进行封闭，反应终止后用离心机离心获得的沉淀物即为胶体金标记的甲型流感病毒抗体。
采用胶体金标记技术，选择50nm-60nm大小的胶体金颗粒，加入K2CO3调节胶体金溶液的pH为8-9，随后加入约10μg的乙型流感病毒抗体(鼠源性单克隆抗体)，利用正负电荷的引力及疏水作用力使得乙型流感病毒抗体与胶体金颗粒结合在一起，待反应10-15min后加入20％的PEG2000及BSA进行封闭，反应终止后用离心机离心获得的沉淀物即为胶体金标记的乙型流感病毒抗体。
将上述甲型流感病毒抗体胶体金标记物和乙型流感病毒标记物按照质量比为甲型流感病毒抗体胶体金标记物:乙型流感病毒标记物为2:1加入含缓冲体系(终浓度为20mM的PBS)、封闭蛋白(质量终浓度为1％的BSA)、表面活性剂(质量终浓度为0.1％的TW20)的基础液中，用纯化水定容到一定体积后(1mL)涂布至结合垫的玻璃纤维上，冷冻抽干后制备得胶体金标记的甲乙型流感病毒抗体结合垫。
用包被缓冲液将甲型流感病毒抗体配制成浓度为1.0mg/mL的包被液、乙型流感病毒抗体配制成浓度为1.5mg/mL的包被液，并同时取同样体积的1.5mg/mL的羊抗鼠包被液，将三种包被液(三种包被液分别取30μL)用划膜机分别包被于检测垫硝酸纤维素膜的第二检测线2412、第三检测线2413和质控线242，制备得到甲乙型流感病毒感包被膜(检测垫)，制备得到的甲乙型流感病毒感包被膜(检测垫)在37℃恒温箱晾干后干燥保存。
将上述制备得到的甲乙型流感病毒抗体结合垫、甲乙型流感病毒感包被膜(检测垫)及其样品垫、吸水纸依次衔接组装成甲乙型流感抗原检测板，检测板切条后得到甲乙型流感抗原检测试条。
将上述新型冠状病毒抗原检测试条及甲乙型流感病毒抗原检测试条分别放置在新冠、甲乙流感抗原联检卡下壳的两个凹槽内，盖扣上上壳，样品垫22与加样口11的位置相对应，检测垫24与观察窗口12的位置相对应，压卡后制得新冠病毒抗原、甲乙型流感病毒抗原联合检测联检卡。
实施例2:
本实施例提供了一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，该检测试剂盒内具有实施例1所述的联检卡，还包括样品提取液，所述样品提取液中包含50mM(mM即mmol/L)(终浓度)的PB(磷酸缓冲液Phosphate Buffer)、质量浓度0.5％(质量终浓度)Tritonx-100、0.1％(质量终浓度)Proclin300及1％(质量终浓度)NaCl，所述终浓度指的是各成分在最终形成的样品提取液中的浓度。
该样本提取液可以同时处理新冠样本和甲乙型流感样本，处理后的样本采用新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测，整个过程30min内便可得到三个项目的检测结果，快速高效，有助于医务人员及时获得结果并依据三个项目检测结果综合判断、及时处置，避免恐慌、减少疫情传播。
本实施例提供的试剂盒利用胶体金免疫层析技术，双抗体夹心法，最终产品形式为由两个检测条组成的二联卡，每个检测条物理结构相同，包括样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸。新型冠状病毒2019-nCoV抗原检测试条中，在玻璃纤维上预包被胶体金标记的2019-nCoV抗体(Au-nCoV-Ab)，在硝酸纤维素膜上包被2019-nCoV抗体。检测阳性标本时，样本中新型冠状病毒抗原与Au-nCoV-Ab结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线(T线)时与预包被的2019-nCoV抗体形成“Au-nCoV-Ab-nCoV病毒抗原-nCoV-Ab-固相材料”夹心物而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。
甲乙型流感病毒抗原检测试条中，在玻璃纤维上分别预包被胶体金标记的甲流抗体(Au-FluA-Ab)、乙流抗体(Au-FluB-Ab)，在硝酸纤维素膜上分别包被甲流抗体、乙流抗体。检测阳性标本时，样本中流感病毒抗原与Au-FluA-Ab或Au-FluB-Ab结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线(A线或B线)时与预包被的流感抗体形成“Au-FluA/FluB-Ab-FluA/FluB病毒抗原-FluA/FluB-Ab-固相材料”夹心物而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色。
本实施例提供的试剂盒的使用方法如下：
1、样本采集
(1)将拭子插入鼻腔，伸入鼻咽后部分泌物较多处；
(2)在鼻咽后部表面旋转拭子数次收集样本；
(3)从鼻腔抽出拭子。
2、样本处理
(1)将10滴(约0.3毫升)的样本提取液加到滴管中；
(2)将采样后的拭子伸入到滴管中，旋转3-5次，并让拭子在提取缓冲液中浸泡1分钟；
(3)用手指挤压滴管使得拭子上的液体尽可能多地留在滴管内，取出的拭子按生物危险品处理；
(4)将管盖安装并旋紧到滴管上，用于后续检测。
3、加样测试
(1)将于4℃-30℃保存的联检试剂盒取出后恢复至室温；
(2)沿切口撕开包装联检卡的铝箔袋，将联检卡取出，水平放置并作好标记；
(3)经过上述步骤2处理后的样本分别于联检卡的每个加样口滴加2-3滴(50-75μL)；
(4)加样后15到20分钟判读结果。
4、结果分析与判定
新冠抗原检测结果：阳性：质控线(参照图1中2019-nCoV的C区对应的试条位置)和检测线(参照图1中2019-nCoV的T区对应的试条位置)都出现紫红色条带，检测结果为阳性且有效。无论检测线的色带有多弱，结果都应视为阳性。阳性结果不排除与其他病原体合并感染。阴性：仅在质控线出现紫红色条带，检测线未出现紫红色条带，检测结果为阴性且有效。无效：质控线未出现紫红色条带，表示操作不当或者试剂失效，应重新测试。
甲乙型流感检测结果：甲型流感阳性：仅在质控线(参照图1中Flu A+B的C区对应的试条位置)和第二检测线(参照图1中Flu A+B的A区对应的试条位置)出现紫红色条带，检测结果为甲型流感阳性且有效。无论第二检测线的色带有多弱，结果都应视为阳性。阳性结果不排除与其他病原体合并感染。乙型流感阳性：仅在质控线(参照图1中Flu A+B的C区对应的试条位置)和第三检测线(参照图1中Flu A+B的B区对应的试条位置)出现紫红色条带，检测结果为乙型流感阳性且有效。无论第三检测线的色带有多弱，结果都应视为阳性。阳性结果不排除与其他病原体合并感染。甲型流感、乙型流感均为阳性：质控线、第二检测线和第三检测线都出现紫红色条带，检测结果为甲型和乙型流感阳性且有效。无论第一检测线和/或第二检测线的色带有多弱，结果都应视为阳性。阳性结果不排除与其他病原体合并感染。阴性：仅在质控线出现紫红色条带，第一检测线和第二检测线均未出现紫红色条带，检测结果为阴性且有效。阴性结果不排除流感病毒感染，应通过其他方法确认，如细胞培养。无效：如果在15-20分钟内质控线未出现紫红色条带，则检测结果无效。需要重新测试。
对比例1:
对比例1与实施例2的区别之处在于：对比例1的样品提取液由50mM PB和0.1％Proclin300组成。
对比例2:
对比例2与实施例2的区别之处在于：对比例2的样品提取液由50mM PB、0.5％Tritonx-100及0.1％Proclin300组成。
实验:
1、将实施例2、对比例1和对比例2中不同成分的样本提取液处理相同的样品，分别检测新冠病毒抗原、甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原三个项目灵敏度参考品，同时检测相应的样本提取液作为对照，计时15-20min后记录检测结果，结果见表1。
表1不同样本提取液处理样品检测灵敏度结果
Figure BDA0002910681500000131
由上述检测结果可知，用对比例1的样本提取液检测甲型流感灵敏度参考品，结果未检出，使用对比例2的样本提取液后，甲乙型流感病毒检测试纸条的甲型流感检测线出现假阳性的结果，而使用实施例2的样本提取液后，无论是三个项目的灵敏度还是检测样本提取液后的特异性均较其它组有明显优势。
2、用实施例2的试剂盒进行测试分析，结果如下：
一、新冠病毒抗原
1)灵敏度测试
通过使用病毒培养物及重组抗原测试得本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测新冠病毒抗原灵敏度高，具体方法如下：
采集健康人群鼻咽拭子样本，用样品提取液处理，混合均匀后作为基质，用于稀释2019-nCoV(也称SARS-CoV-2)病毒培养物和2019-nCoV重组抗原；
选取2019-nCoV病毒培养物及重组抗原，所述实验用2019-nCoV病毒培养物来自ZeptoMetrix Corporation，产品编号(批号)为NR-52884(Italy-INMI1)，NR-52882(HongKong/VM2000106/2020)，NR-52881(USA-WA1/2020)，所述2019-nCoV重组抗原为上海近岸科技有限公司生产，编号为R20050718；将所述2019-nCoV病毒培养物及重组抗原用上述基质进行梯度稀释。使用2019-nCoV抗原检测试剂盒(胶体金法)检测，每个浓度配3份，每份重复检测3次，加样后15-20分钟观察结果，计算阳性检出率，以100％可检出的最低浓度水平作为预设检测限，在此浓度附近制备若干浓度梯度样品，每个浓度至少重复检测20次，将具有95％阳性检出率的样本中的病毒培养物浓度水平作为最低检测限，结果见表2
表2新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒灵敏度测试结果
测试样品 最低检测限
新冠病毒培养物 1.3 x10<sup>2</sup> TCID<sub>50</sub>/mL
新冠病毒重组抗原 1ng/mL
2)交叉
将本实施例2中的新型冠状病毒检测试剂盒测试27种微生物样品，检测微生物名称及浓度见表3，该27种微生物样品的检测结果均为阴性，未见交叉反应，表明本试剂盒检测新冠病毒抗原特异性好。
表3新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒特异性测试微生物及浓度情况
Figure BDA0002910681500000141
Figure BDA0002910681500000151
3)干扰
①微生物干扰
将表3中的27种微生物(浓度如表3所示)分别取5μL添加到新冠病毒阴性、弱阳性及阳性样本中，用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒测试，检测结果与对照一致，表明以下微生物对本试剂盒中新冠病毒检测试条检测无干扰。
②外源性干扰
将表4中常见的呼吸道药物添加到新冠病毒阴性、弱阳性及阳性样本中，用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒测试，检测结果与对照一致，表明以下外源性药物对本试纸检测无干扰。
表4新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒外源性干扰测试微生物及浓度情况
干扰物质 浓度 干扰物质 浓度
全血 1％v/v 顺势疗法(阿尔卡洛利) 10％v/v
粘蛋白 2％w/v CVS滴鼻剂(苯肾上腺素) 15％v/v
妥布霉素 0.0004％w/v 阿夫林(羟甲唑啉)鼻腔喷剂 15％v/v
利口乐(薄荷醇) 0.15％w/v CVS鼻喷雾剂 15％v/v
氯酶(苯唑卡因) 0.15％w/v 丙酸氟替卡松气雾剂 5％v/v
莫匹罗星 0.25％w/v
达菲(磷酸奥斯他韦) 0.5％w/v
4)准确性
用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒测试414例阴性样本、57例阳性样本，统计本试剂盒检测结果见表5。结果表明：与RT-PCR检测结果相比，本试剂盒检测敏感度为96.49％，95％置信区间为91.71％-99.99％，特异度为99.03％，95％置信区间为98.09％-99.98％，准确度为98.73％，95％置信区间为97.71％-99.74％。
表5新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒准确性测试
Figure BDA0002910681500000161
二、甲型流感病毒
1)灵敏度测试
通过使用甲型流感病毒株测试得本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测甲型流感病毒抗原灵敏度高，具体结果见表6。
表6新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒甲型流感灵敏度测试结果
测试样品 最低检测限
甲型H3N2病毒株 1.2 x10<sup>3</sup> TCID<sub>50</sub>/mL
2)包容性
用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测不同型不同株的甲型流感病毒情况如表7统计。
表7新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒甲型流感包容性测试结果
Figure BDA0002910681500000162
Figure BDA0002910681500000171
Figure BDA0002910681500000181
3)准确度
用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒测试120例阴性样本、50例阳性样本，统计本试剂盒甲型流感检测结果见表8。结果表明：与病毒培养相比，新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒中甲乙型流感病毒抗原检测试条对甲型流感病毒的检测敏感度为84.00％，95％置信区间为73.84％-94.16％，特异度为98.04％，95％置信区间为94.71％-100.29％，准确度为93.53％，95％置信区间为89.83％-97.23％。
表8新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测甲型流感准确性测试
Figure BDA0002910681500000182
三、乙型流感病毒
1)灵敏度测试
通过使用乙型流感病毒株测试得本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测乙型流感病毒抗原灵敏度高，具体结果见表9。
表9新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒甲型流感灵敏度测试结果
待测物 最低检测限
乙型流感病毒株(B/Yamagata和B/Victoria) 1.0x10<sup>4</sup>TCID<sub>50</sub>/mL
2)准确度
用本实施例2中的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒测试120例阴性样本、36例阳性样本，统计本试剂盒中甲乙型流感病毒抗原检测试条对乙型流感检测结果见表10。结果表明：与病毒培养相比，新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒中乙型流感病毒抗原检测试条的检测敏感度为86.11％，95％置信区间为74.81％-97.41％，特异度为99.17％，95％置信区间为97.54％-100.79％，准确度为96.15％，95％置信区间为93.14％-99.17％。
表10新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒检测乙型流感准确性测试
Figure BDA0002910681500000191
3)交叉
将本实施例2中的新型冠状病毒检测试剂盒对表11中的细菌、病毒及支原体、衣原体进行评估交叉反应性，均未见交叉。
表11新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒特异性测试微生物情况
Figure BDA0002910681500000192
Figure BDA0002910681500000201
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。

Claims (8)

1.一种新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其特征在于：包括检测试条，所述检测试条包括顺次搭连的样品垫、结合垫、检测垫以及吸收垫，所述检测垫设有相互平行的检测线和质控线，所述检测线包括相互分离设置的第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线上包被有新冠病毒抗体，所述第二检测线上包被有甲型流感病毒抗体，所述第三检测线上包被有乙型流感病毒抗体；还包括样品提取液，所述样品提取液由终浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、质量终浓度为0.5%的Tritonx-100、质量终浓度为0.1%的Proclin300及质量终浓度为1%的NaCl组成。
2.根据权利要求1所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其特征在于：所述检测试条包括第一检测试条和第二检测试条，所述第一检测线设置在第一检测试条上，所述第二检测线和第三检测线相互平行的间隔设置在所述第二检测试条上。
3.根据权利要求2所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其特征在于：所述第一检测试条的结合垫上涂覆有胶体金颗粒标记的新冠病毒抗体，所述第二检测试条的结合垫上涂覆有胶体金颗粒标记的甲型流感病毒抗体和胶体金颗粒标记的乙型流感病毒抗体。
4.根据权利要求3所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其特征在于：所述胶体金颗粒的粒径为50nm-60nm。
5.根据权利要求1所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒，其特征在于：所述第一检测线、第二检测线及第三检测线相互平行的间隔设置在同一检测试条上。
6.如权利要求1-5任一项所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
检测线包被：先制备新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒包被液，然后分别在检测试条检测垫的第一检测线、第二检测线及第三检测线上分别包被所述新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒抗体包被液；
新冠病毒抗体胶体金标记；
甲、乙型流感病毒抗体胶体金标记。
7.根据权利要求6所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒的制备方法，其特征在于：所述新冠病毒抗体包被液、甲型流感病毒抗体包被液以及乙型流感病毒包被液的浓度分别为1.5mg/mL，1.0mg/mL及1.5mg/mL。
8.根据权利要求6所述的新冠及甲乙型流感病毒抗原联检试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：
质控线包被：在质控线上包被羊抗鼠抗体。
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