CN110501493A - 一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒。该检测试剂盒包括：抗人IgM抗体‑磁性微粒偶联物，人副流感病毒3型抗原，辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体，样本稀释液和化学发光底物；酶标抗体为缺失Fc端的抗体。本发明采用的是捕获法，灵敏度和特异性高，而且本发明捕获法用天然的人副流感病毒3型作为桥连，用人副流感病毒3型的单克隆抗体作为示踪物，避免了采用抗原作为示踪物时因抗原的纯度不够或位点的不全面导致的特异性和灵敏度受到影响的问题。副流感病毒3型的单克隆抗体被切除了抗体的Fc端，可以消除样本中存在的嗜异性抗体导致的假阳性。

Description

一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒。
背景技术
人副流感病毒(Human parainfluenzavirus，HPIV)属于副黏病毒科家族的成员，为单股负链RNA病毒。HPIV已确定有4种血清型，即1、2、3和4型。HPIV1和HPIV3属于呼吸道病毒属，HPIV2和HPIV4属于腮腺炎病毒属。人副流感病毒3型每年都发生，在春季和夏季为流行期，但在温带地区可以常年流行。通过大的液滴气溶胶和接触污染的表面传播，感染后潜伏期2-6天。人副流感病毒3型是引起婴幼儿呼吸道感染的重要病毒病原。临床症状主要为喉炎、毛细支气管炎、肺炎，感染后不能产生终身免疫，再次感染很常见。
人副流感病毒3型感染的检测方法有：核酸检测、抗原检测、血清学特异性抗体检测、病毒分离培养，其中血清特异性IgM抗体阳性对病原学诊断具有重要参考意义。
病毒分离培养是诊断人副流感病毒3型感染的金标准，但是由于技术要求高，出结果的时间长，很少在临床应用。核酸检测的技术同样要求高，还需要特定的设备和场地，收费价格也较高。抗原检测的灵敏度偏低，检测结果受样本质量的影响较大，同时由于核酸和抗原检测采集的是分泌物样本，样本采集难度也较大，限制了其在临床的广泛应用。血清特异性IgM抗体检测具有操作简单，样本容易采集，干扰因素少，收费合理等优点，目前在临床上被广泛应用。
目前已上市的人副流感病毒3型IgM抗体检测方法有间接免疫荧光法、酶联免疫法、胶体金层析法。间接免疫荧光法是将抗原固定在载玻片上，以荧光素FITC作为标记物，通过荧光显微镜观察结果，结果判读基本需要肉眼观察，容易存在误差。酶联免疫法是将抗原或抗体固定在聚苯乙烯微孔板上，以辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物，通过显色吸光度值判断结果，实验的反应时间长，自动化程度低。胶体金层析法是将抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上，以胶体金为标记物，通过液体毛细作用在检测线显色，结果判读基本需要肉眼观察，虽然快速但准确性低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒。该检测试剂盒可实现单人份、随机、快速、自动化检测，灵敏度和特异性都优于采用间接法原理的试剂盒，同时可消除样本中存在的嗜异性抗体导致的假阳性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒，该检测试剂盒包括：抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物，人副流感病毒3型抗原，辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体，样本稀释液和化学发光底物；其中人副流感病毒3型抗原的抗体为缺失Fc端的抗体。
作为优选，抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物中的抗人IgM抗体为鼠抗人IgM单克隆抗体、鼠抗人IgM多克隆抗体、羊抗人IgM单克隆抗体、羊抗人IgM多克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体或兔抗人IgM多克隆抗体中的一种。
作为优选，抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物中的磁性微粒的直径为0.2～4μm。
作为优选，抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物为抗人IgM抗体与磁性微粒通过共价交联的方式偶联。
作为优选，抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物的工作浓度为10～250μg/mL。
作为优选，人副流感病毒3型抗原为细胞培养的人副流感病毒3型抗原，细胞为PMK细胞、Vero细胞、HeLa细胞、Hep-2细胞或MDCK细胞。
作为优选，人副流感病毒3型抗原为C243株或临床分离株。
作为优选，人副流感病毒3型抗原的工作浓度为1～10μg/mL。
作为优选，辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体的工作浓度为0.1～0.5μg/mL。
作为优选，化学发光底物包括底物A和底物B，底物A为异鲁米诺衍生物，底物B为过氧化氢。
作为优选，样本稀释液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液。
作为优选，配制1000mL样本稀释液，其配方为：
十二水磷酸氢二钠5～6g、二水磷酸二氢钠0.5～1.0g、氯化钠5～10g、BSA 8～12g、吐温-20 0.8～1.2mL，用水定容至1000mL，加入0.01％～0.03％防腐剂。
在本发明提供的具体实施例中，配制1000mL样本稀释液，其配方为：
十二水磷酸氢二钠5.80g、二水磷酸二氢钠0.59g、氯化钠9.00g、BSA 10g、吐温-201mL，用水定容至1000mL，加入0.02％防腐剂。
作为优选，试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，阴性对照为基质液，阳性对照为含有人副流感病毒3型IgM抗体的基质液。
作为优选，配制1000mL基质液，其配方为：
十二水磷酸氢二钠5～6g、二水磷酸二氢钠0.5～1.0g、氯化钠5～10g、BSA 8～12g，用水定容至1000mL，加入0.01％～0.03％防腐剂。
在本发明提供的具体实施例中，配制1000mL基质液，其配方为：
十二水磷酸氢二钠5.80g、二水磷酸二氢钠0.59g、氯化钠9.00g、BSA 10g，用水定容至1000mL，加入0.02％防腐剂。
作为优选，阳性对照中人副流感病毒3型IgM抗体的体积百分浓度为0.1％～1％。
本发明提供了一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒。该检测试剂盒包括：抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物，人副流感病毒3型抗原，辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体，样本稀释液和化学发光底物；辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体为缺失Fc端的抗体。本发明具有的技术效果为：
1、本发明采用磁性微粒作为抗体的固相载体，利用化学发光免疫分析技术，在全自动化学发光分析仪上实现单人份、随机、快速、自动化检测。由于本发明采用的是捕获法，灵敏度和特异性都优于采用间接法原理的试剂盒，而且本发明捕获法用天然的人副流感病毒3型作为桥连，用人副流感病毒3型的单克隆抗体作为示踪物，其原理不同于采用抗原作为示踪物的捕获法试剂盒，避免了采用抗原作为示踪物时因抗原的纯度不够或位点的不全面导致的特异性和灵敏度受到影响的问题。
2、本发明中副流感病毒3型的单克隆抗体被切除了抗体的Fc端，可以消除样本中存在的嗜异性抗体导致的假阳性。
具体实施方式
本发明公开了一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1制备人副流感病毒3型IgM抗体检测试剂盒
1、制备抗人IgM抗体偶联磁性微粒
1.1磁性微粒洗涤
取200μL表面含羧基的磁微粒放在玻璃瓶中，用磁铁将磁微粒吸附在玻璃瓶底部，除去上清；加入2mL 0.02M PBS(pH 8.0)，重复以上操作3次。
1.2磁性微粒活化
将EDC和NHS分别溶解在0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中，浓度呈10～70mg/mL，然后各取1mL加入到磁微粒中；室温轻轻震荡反应30～60分钟；用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清；再加入2mL 0.1M MES(pH 5.0)缓冲液，重悬磁微粒；重复以上操作2次。
1.3偶联抗人IgM抗体
取鼠抗人IgM单克隆抗体0.2mg～1mg加入到活化后的磁微粒中；再加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液，至终体积1mL；室温轻轻震荡反应30～60分钟；用磁铁将磁微粒吸附在底部，除去上清，用2mL 0.02M PBS(pH 8.0)洗涤3次；加入20mL含1％BSA和0.02％叠氮钠的PBS缓冲液(pH 8.0)，2～8℃保存。
2、制备人副流感病毒3型抗原溶液
2.1细胞培养
将Vero细胞接种于含2％胎牛血清的MEM培养基中，置于35～37℃CO2培养箱中培养，至对数生长期。
2.2病毒接种及培养
将人副流感病毒3型C243株接种于培养细胞上，置于35～37℃CO2培养箱中培养，48h后观察细胞病变。
2.3病毒收集及灭活
低速离心弃上清，收取感染的细胞，加入少量的MEM培养液，超声裂解细胞；用伽马射线灭活病毒，置-20℃保存。
2.4抗原溶液制备
将制备的病毒抗原按照1:10～1:100的比例稀释在含1％BSA和防腐剂的缓冲液中，2～8℃保存。
3、制备抗人副流感病毒3型单克隆抗体酶结合物
辣根过氧化物酶(HRP)用常规改良过碘酸钠法活化，加入抗人副流感病毒3型抗原的单克隆抗体(该单克隆抗体为切除Fc端的抗副流感病毒3型单克隆抗体)，2～8℃反应过夜，加硼氢化钠还原酶结合物，透析去除未反应的试剂，加50％体积甘油，置-20℃保存。使用时按照1:1000～1:8000的比例稀释在含20％小牛血清和0.1％P300防腐剂的缓冲液中，2～8℃保存。
4、制备样本稀释液
配制1000mL样本稀释液：十二水磷酸氢二钠5.80g、二水磷酸二氢钠0.59g、氯化钠9.00g、BSA 10g、吐温-201mL，用去离子水定容至1000mL，加入0.02％叠氮钠防腐剂。
5、制备阴性对照和阳性对照
阴性对照为基质液，配制1000mL：十二水磷酸氢二钠5.80g、二水磷酸二氢钠0.59g、氯化钠9.00g、BSA 10g，用去离子水定容至1000mL，加入0.02％叠氮钠防腐剂。
阳性对照是在基质液中加入1/100～1/1000的人副流感病毒3型IgM抗体阳性物质制备而成。
6、化学发光底物液
底物A液采用异鲁米诺衍生物，底物B液采用过氧化氢。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
采用实施例1制备的试剂盒，与郑州安图生物工程股份有限公司生产的全自动化学发光仪AutoLumo A2000或AutoLumo A2000 Plus配合使用，用以检测人副流感病毒3型IgM抗体，具体步骤为：
1、在反应容器(以下简称“孔”)中依次加入阳性对照3孔(用于定Cutoff值)，阴性对照2孔，100μL/孔；其余孔中每孔分别加入10μL样本和100μL样品稀释液；
2、每孔分别加入磁微粒混悬液20μL；混匀后，37℃温育15分钟；然后用清洗液洗涤5次；
3、每孔分别再加入酶结合物50μL、抗原溶液50μL；混匀后37℃温育17分钟；清洗液洗涤5次；
4、最后每孔再加入底物A液和底物B液各50μL；混匀后1～5分钟检测发光强度。
结果计算：Cutoff值＝阳性对照孔平均发光值×0.4；
阳性判断值：S/CO＝待测样本发光值/Cutoff值；
S/CO≥1.00时，结果判为阳性；S/CO＜1.00时，结果判为阴性。
实施例3本发明试剂盒的性能评价
1、重复性
重复性是指对同一份样品重复测定，每次测定结果和均值的接近程度，以变异系数CV表示。
选择不同浓度的3份样本，每天检测4个重复，连续检测5天，变异系数CV<8％，结果见表1：
表1
从表1显示的结果可以看出：样本1的变异系数为2.91％，样本2的变异系数为5.07％，样本3的变异系数为6.54％，均小于行业要求的10％，证明其重复性良好。
2、特异性
八种病原体：肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、腺病毒、肠道病毒71型、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒；每种病原体各10份IgM抗体阳性样本，用本发明试剂盒检测，无交叉反应性，结果见表2：
表2
检测类风湿因子RF阳性和抗核抗体(ANA)阳性样本各12份，无干扰，结果见表3：
表3
从表2、表3结果可以看出：八种呼吸道病原体IgM抗体不与本试剂盒产生交叉反应，类风湿因子RF和自身抗体ANA不对本试剂盒产生干扰。
样本中的嗜异性抗体可以与磁微粒上包被的抗人IgM抗体反应，同时也可以与抗副流感病毒3型单克隆抗体反应，导致假阳性。嗜异性抗体的干扰可以通过在本发明试剂盒的实验过程中不加入抗原液仍检测为阳性进行验证。
使用没有切除Fc端的抗副流感病毒3型单克隆抗体和切除Fc端的抗副流感病毒3型单克隆抗体，在不加入抗原液的条件下，检测了公司的HAMA盘样本201份，献血员样本100份，体检样本50份，儿童样本123份，共计474份。使用不切除Fc端的抗副流感病毒3型单克隆抗体，共检测出46份嗜异性抗体的干扰导致的假阳性，而切除Fc端后，46份嗜异性抗体的干扰导致的假阳性全部消除。
表4
HAMA盘样本 献血员样本 体检样本 儿童样本 合计
201 100 50 123 474
不切除Fc 41 2 0 3 46
切除Fc 0 0 0 0 0
3、灵敏度
选择急性呼吸道感染住院的儿童患者，入院当天分别采集咽拭子和血清样本，对咽拭子核酸检测为人副流感病毒3型阳性的患者，出院前(5～14天)再次采集血清样本以观察抗体的变化，符合条件的患者共20例。用本发明制备的试剂盒和商品化间接法酶联免疫法试剂盒检测。商品化间接法酶联免疫法试剂盒组成包括：副流感病毒3型抗原包被的聚苯乙烯微孔板，样本稀释液，辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，底物液，终止液，结果在450nm波长读数，S/CO值>1.0为阳性。结果见表5：
表5
从表3结果可以看出：20例人副流感病毒3型核酸检测为阳性的患者双份血样本，本发明的试剂盒均检出了IgM抗体阳性或抗体血清转化，而商品化间接法酶联免疫试剂盒检测出了14例，本发明试剂盒比商品化试剂盒多检出6例，而且本发明试剂盒检测样本的S/CO值显著高于商品化试剂盒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括：抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物，人副流感病毒3型抗原，辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体，样本稀释液和化学发光底物；辣根过氧化物酶标记的人副流感病毒3型抗原的抗体为缺失Fc端的抗体。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物中的抗人IgM抗体为鼠抗人IgM单克隆抗体、鼠抗人IgM多克隆抗体、羊抗人IgM单克隆抗体、羊抗人IgM多克隆抗体、兔抗人IgM单克隆抗体或兔抗人IgM多克隆抗体中的一种。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物中的磁性微粒的直径为0.2～4μm。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物为抗人IgM抗体与磁性微粒通过共价交联的方式偶联。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgM抗体-磁性微粒偶联物的工作浓度为10～250μg/mL。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人副流感病毒3型抗原为细胞培养的人副流感病毒3型抗原，所述细胞为PMK细胞、Vero细胞、HeLa细胞、Hep-2细胞或MDCK细胞。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人副流感病毒3型抗原为C243株或临床分离株。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括底物A和底物B，所述底物A为异鲁米诺衍生物，所述底物B为过氧化氢。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白的PBS缓冲液。
10.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为基质液，所述阳性对照为含有人副流感病毒3型IgM抗体的基质液。
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