CN113533721A - 甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫层析诊断领域，具体而言，提供了一种甲型/乙型流感病毒胶体金法检测试纸条及其制备方法。检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫，该检测试纸条利用双抗体夹心免疫层析原理对待测样本进行检测，可以实现甲型流感病毒和乙型流感病毒的同时检测，同时，包被用的金标稀释液包括：10‑100mM Tris‑HCl，3‑10％(w/v)蔗糖，1‑5％(w/v)海藻糖，0.5‑3％(w/v)BSA，0.05‑0.5％(w/v)Triton X‑100和0.1‑2.0％(w/v)S17。该金标稀释液使得结合垫的稳定性更好，提高试纸条的灵敏度和抗干扰性能，批间差得到显著改善。

Description

甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫层析诊断领域，具体而言，涉及一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条及其制备方法。
背景技术
流感是病毒性呼吸系统疾病，在秋季和冬季最为普遍。当感染者打喷嚏或咳嗽，产生的飞沫传播到另一个人的鼻腔或口腔时，可造成病毒传播。流感病毒的类型有4种类型。甲型流感最为常见，其次是乙型流感。两者都具有高度传染性，症状相似。
目前甲型和乙型流感病毒诊断的主要方法有：病毒分离培养、荧光PCR法、血清学诊断等。病毒分离培养法是目前实验室诊断的金标准，但由于细胞培养时间周期较长，严重限制了其在临床中的应用；荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好、稳定及易于自动化操作的优点，但其也有着操作复杂、需要昂贵的仪器设备等缺点；血清学诊断方面有补体结合实验、血凝抑制试验等，但存在着灵敏度低、特异性差的问题。胶体金免疫层析技术具有便捷，成本低，检测结果直观和不需要检测仪器的优势，然而现有技术中甲型和乙型流感病毒抗原胶体金免疫层析诊断依然存在灵敏度低、特异性差，批间差大的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条。
本发明的第二目的在于提供一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒。
本发明的第三目的在于提供甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条，所述检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫；
所述第一结合垫包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体；
所述第二结合垫包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体；
所述第一结合垫和第二结合垫的抗体互补相同；
所述包被用的金标稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3-10％(w/v)蔗糖，1-5％(w/v)海藻糖，0.5-3％(w/v)BSA，0.05-0.5％(w/v)Triton X-100和0.1-2.0％(w/v)S17。
进一步地，胶体金的粒径为23-27nm；
优选地，胶体金标记的甲型流感病毒抗体和胶体金标记的乙型流感病毒抗体的浓度均独立地为6-10OD。
进一步地，所述样品垫的处理液包括10-100mM Tris-HCl，0.1-2％(w/v)酪蛋白钠，0.1-2％(w/v)PVP40，0.05-2％(w/v)吐温20和0.1-2％(w/v)氯化钠。
进一步地，所述检测垫上平行设置有检测线1、检测线2和质控线；
检测线1包被有1-1.8mg/ml的甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体；
检测线2包被有1-1.8mg/ml的乙型流感病毒抗体或甲型流感病毒抗体；
检测线1和检测线2包被的抗体不同；
质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；
优选地，甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液均独立地包括10-20mM PBS，1-5％(w/v)海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。
进一步地，样品垫与第一结合垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，第一结合垫与第二结合垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，第二结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。
进一步地，样品垫、第一结合垫或第二结合垫均独立地为玻璃纤维；
优选地，检测垫为硝酸纤维素膜。
进一步地，所述检测试纸条还包括用于包装所述检测试纸条的卡盒。
一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒，包括待测样品稀释液和上述检测试纸条；
所述待测样品稀释液包括含0.05-0.3％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液。
上述检测试纸条的制备方法，样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条。
进一步地，第一结合垫或第二结合垫的制备包括：采用胶体金溶液标记甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体，再包被于玻璃纤维，经干燥后得到所述第一结合垫或第二结合垫，胶体金溶液的制备方法为柠檬酸三钠还原法，胶体金溶液的制备采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器；
优选地，标记条件包括：在pH(6.6～7.8)条件下，胶体金溶液与甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体按照比例1ml：(0.006-0.008)mg反应；
优选地，胶体金溶液的分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1；
优选地，干燥为-100kPa真空冷冻干燥过夜。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条，检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫，其中，第一结合垫和第二结合垫分别包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体，该检测试纸条利用双抗体夹心免疫层析原理对待测样本进行检测，可以实现甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的同时检测且不会相互干扰，同时，包被结合垫用的金标稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3-10％(w/v)蔗糖，1-5％(w/v)海藻糖，0.5-3％(w/v)BSA，0.05-0.5％(w/v)Triton X-100和0.1-2.0％(w/v)S17。该金标稀释液可使结合垫的稳定性更好，试纸条的灵敏度和特异性、批间差均得到显著改善。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的检测试纸条结构示意图；
图2为本发明提供的带有卡盒包装的检测试纸条。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条，检测试纸条(如图1所示)包括底板和依次设置于底板上的样品垫1、第一结合垫2、第二结合垫3、检测垫9和吸水垫7，其中，第一结合垫2和第二结合垫3分别包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体，该检测试纸条利用双抗体夹心免疫层析原理对待测样本进行检测，可以实现甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的同时检测且不会相互干扰，同时，包被用的金标稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3-10％(w/v)蔗糖，1-5％(w/v)海藻糖，0.5-3％(w/v)BSA，0.05-0.5％(w/v)Triton X-100和0.1-2.0％(w/v)S17。该金标稀释液使得结合垫的稳定性更好，提高试纸条的灵敏度和抗干扰性能，批间差得到显著改善。
该检测试纸条一次测试可同时检测甲型和乙型两种流感病毒抗原，并进行区分，两种病毒的检测互不干扰。相对两种病毒分开检测，本发明的试剂盒缩短了检测周期，操作更加简便，同时因只需加样一次，减少了样本使用量。
需要说明的是，第一结合垫包被胶体金标记的甲型流感病毒抗体，第二结合垫包被胶体金标记的乙型流感病毒抗体；第一结合垫包被胶体金标记的乙型流感病毒抗体，第二结合垫包被胶体金标记的甲型流感病毒抗体。Tris-HCl浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM；蔗糖浓度可以但不限于为3％(w/v)、5％(w/v)、7％(w/v)、9％(w/v)或10％(w/v)；海藻糖浓度可以但不限于为1％(w/v)、3％(w/v)或5％(w/v)；BSA浓度可以但不限于为0.5％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)或3％(w/v)；Triton X-100浓度可以但不限于为0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)或0.5％(w/v)；S17浓度可以但不限于为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)、0.8％(w/v)、1.6％(w/v)或2％(w/v)。
在优选的实施方式中，金标稀释液：50mM Tris-HCl，5％(w/v)蔗糖，5％(w/v)海藻糖，1％(w/v)BSA，0.3％(w/v)Triton X-100和0.3％(w/v)S17。
为了进一步提高检测试纸条的灵敏度，延长有效期，胶体金的粒径优选为23-27nm，该粒径范围内胶体金标记复合物的稳定、均一性更好，检测试纸条的灵敏度更好。胶体金的粒径可以但不限于为23nm、24nm、25nm、26nm或27nm，优选为25nm。同时，胶体金标记的甲型流感病毒抗体和胶体金标记的乙型流感病毒抗体的浓度均独立地为6-10OD，浓度可以但不限于为6OD、8OD或10OD，优选为8OD。
为了进一步提高检测试纸条的特异性，改善抗干扰能力，样品垫的处理液包括10-100mM Tris-HCl，0.1-2％(w/v)酪蛋白钠，0.1-2％(w/v)PVP40，0.05-2％(w/v)吐温20和0.1-2％(w/v)氯化钠。发明人通过大量的研究和优化，发现酪蛋白钠可以显著提高甲型/乙型流感病毒抗原的检测特异性，避免交叉反应。Tris-HCl浓度可以但不限于为10mM、30mM、50mM、70mM、90mM或100mM；酪蛋白钠浓度可以但不限于为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)、0.8％(w/v)、1.6％(w/v)或2％(w/v)；PVP40浓度可以但不限于为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)、0.8％(w/v)、1.6％(w/v)或2％(w/v)；吐温20浓度可以但不限于为0.05％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)、0.8％(w/v)、1.6％(w/v)或2％(w/v)；氯化钠浓度可以但不限于为0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.4％(w/v)、0.8％(w/v)、1.6％(w/v)或2％(w/v)。
在优选的实施方式中，样品垫处理液：50mM Tris-HCl，0.3％(w/v)酪蛋白钠，0.2％(w/v)PVP40，0.1％(w/v)吐温20和0.5％(w/v)氯化钠。
在一些实施方式中，检测垫上平行设置有检测线1、检测线2和质控线；检测线1包被有1-1.8mg/ml的甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体；检测线2包被有1-1.8mg/ml的乙型流感病毒抗体或甲型流感病毒抗体；质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。检测线1包被有1-1.8mg/ml的甲型流感病毒抗体，检测线2包被有1-1.8mg/ml的乙型流感病毒抗体；检测线1包被有1-1.8mg/ml的乙型流感病毒抗体，检测线2包被有1-1.8mg/ml的甲型流感病毒抗体。需要说明的是，本发明提供的检测试纸条采用的是双抗体夹心方法，检测垫上的甲型流感病毒抗体与结合垫上的甲型流感病毒抗体结合甲型流感病毒抗原的位点并不相同，检测垫上的乙型流感病毒抗体与结合垫上的乙型流感病毒抗体结合乙型流感病毒抗原的位点也并不相同。
在一些实施方式中，甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液均独立地包括10-20mM PBS，1-5％(w/v)海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。
在优选的实施方式中，甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液：10mM PBS，2％(w/v)海藻糖和0.5mM EDTA二钠。
在一些实施方式中，样品垫与第一结合垫交错重叠1-1.5mm；第一结合垫与第二结合垫交错重叠1-1.5mm；第二结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm；检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。样品垫、第一结合垫或第二结合垫均独立地为玻璃纤维；检测垫为硝酸纤维素膜。此外，该检测试纸条还有用于包装检测试纸条的卡盒13，如图2所示，包括加样孔10和观察窗11，检测试纸条12的样品垫1位于加样孔10的下方，检测垫9位于观察窗11的下方。
本发明提供一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒，包括待测样品稀释液和检测试纸条，其中，待测样品稀释液包括0.05-0.3％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液，优选为0.2％(w/v)。
待测样本包括人口咽拭子或人鼻咽拭子。
本发明还提供上述检测试纸条的制备方法，样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条。
为了进一步减少产品的批间差，发明人对第一结合垫和第二结合垫的制备工艺进行了优化，一方面胶体金的制备工艺采用柠檬酸三钠还原法，制备过程通过采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器，使得胶体金溶液温度保持抑制，烧制的金颗粒大小一致性好；另一方面，优化标记条件，在pH6.6～7.8条件下，胶体金溶液与甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体按照比例1ml：(0.006-0.008)mg反应，该胶体金的溶液分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1。此外，干燥采用真空干燥的方式，有效保护蛋白活性，提高检测灵敏度。
在制备过程中，烧制的胶体金颗粒大小一致性、有无杂质等因素对产品特异性有较大影响，大小不一，有杂质的金颗粒容易产生假阳性结果。现有技术通常采用锥形瓶、磁力加热搅拌器和磁力转子进行胶体金的烧制，此过程中由于磁力加热搅拌器只能加热锥形瓶底部，使得整个溶液温度存在底部高，顶部低的差异，烧制的金颗粒大小存在区别，且磁力转子在旋转过程中与锥形瓶存在摩擦，会产生杂质，影响金溶液质量。本发明采用球形瓶与数显夹套式磁力搅拌器使得金烧制过程中溶液温度保持一致，烧制的金颗粒大小均一性好，且悬臂式磁力搅拌桨不与球形瓶直接接触，不存在摩擦，烧制的金溶液质量好。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒
缓冲体系：
金标稀释液：50mM Tris-HCl，5％(w/v)蔗糖，5％(w/v)海藻糖，1％(w/v)BSA，0.3％(w/v)Triton X-100和0.3％(w/v)S17。
甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液：10mMPBS，2％(w/v)海藻糖和0.5mM EDTA二钠。
样品垫处理液：50mM Tris-HCl，0.3％(w/v)酪蛋白钠，0.2％(w/v)PVP40，0.1％(w/v)吐温20和0.5％(w/v)氯化钠。
待测样本稀释液：0.2％(w/v)BSA的磷酸盐缓冲液。
步骤1.25nm左右胶体金溶液的烧制
(1)于球形瓶中加入1000ml用超纯水配制的0.01％的氯金酸溶液，使用数显夹套式磁力搅拌器、悬臂式磁力搅拌器带搅拌桨250r/min搅拌加热至沸腾；
(2)保持沸腾1-5min；
(3)快速加入20％柠檬酸三钠0.6ml；
(4)继续沸腾15min，停止加热，静置冷却；
(5)使用超纯水定容至1000ml；
(6)利用分光光度计测量，最高吸收峰在525±3nm，OD值在1.0±0.1。
步骤2.金标记甲型流感病毒单抗(标记)的制备
(1)取20ml制备好的25nm左右的胶体金溶液于玻璃小烧杯中，加入0.1M碳酸钾溶液120μL，使用磁力搅拌器250r/min搅拌5分钟；
(2)逐滴缓慢加入利用纯化水稀释好的甲型流感病毒单抗(标记)140μg，搅拌30min；
(3)加入10％牛血清白蛋白(BSA)400uL，使其终浓度为0.2％，继续搅拌15min；
(4)4℃，7500r/min，离心35min，弃上清，用0.2％BSA溶液等体积重悬，再次4℃，7500r/min离心35min，弃上清，用0.2％BSA收集沉淀至200μL，使用紫外分光光度计测量其OD值。
步骤3.金标甲型流感病毒单抗结合物垫的制备
(1)利用金标稀释液重悬沉淀，使其OD值为8OD；
(2)将稀释好的金标记甲型流感病毒单抗均匀的铺在玻璃纤维垫上，-100kPa真空冷冻干燥过夜；
(3)将整张干燥的金标甲型流感病毒单抗结合物垫切割为宽5mm的金标甲型流感病毒单抗结合物垫，于铝箔袋干燥密封保存备用。
步骤4.金标记乙型流感病毒单抗(标记)的制备
(1)取20ml制备好的25nm左右的胶体金溶液于玻璃小烧杯中，加入0.1M碳酸钾溶液120μL，使用磁力搅拌器250r/min搅拌5分钟。
(2)逐滴缓慢加入利用纯化水稀释好的乙型流感病毒单抗(标记)140μg，搅拌30min；
(3)加入10％牛血清白蛋白(BSA)400μL，使其终浓度为0.2％，继续搅拌15min；
(4)4℃，7500r/min，离心35min，弃上清，用0.2％BSA溶液等体积重悬，再次4℃，7500r/min离心35min，弃上清，用0.2％BSA收集沉淀至200μL，使用紫外分光光度计测量其OD值。
步骤5.金标乙型流感病毒单抗结合物垫的制备
(1)利用金标稀释液重悬沉淀，使其OD值为8OD；
(2)将稀释好的金标记乙型流感病毒单抗均匀的铺在玻璃纤维垫上，-100kPa真空冷冻干燥过夜；
(3)将整张干燥的金标乙型流感病毒单抗结合物垫切割为宽5mm的金标乙流单抗结合物垫，于铝箔袋干燥密封保存备用。
步骤6.包被硝酸纤维素膜
将甲型流感病毒单抗(包被)、乙型流感病毒单抗(包被)、羊抗鼠IgG多克隆抗体分别用划膜缓冲液稀释，使用划膜仪以1.0μl/cm的喷量，分别划于硝酸纤维素膜上，T1(甲型流感)检测线和T2(乙型流感)检测线相距5mm，T1(甲型流感)检测线和质控线相距5mm；其中甲型流感病毒单抗和乙型流感病毒单抗的包被浓度均为1.8mg/ml，羊抗鼠IgG多克隆抗体的包被浓度为1.0mg/ml；37℃烘箱干燥16h，密封于铝箔袋干燥保存备用。
步骤7.样品垫的处理
(1)利用样品垫处理液以40ml/张的量处理整张玻璃纤维(玻纤规格为30cm×25cm)；
(2)在室温、湿度＜20％的条件下过夜干燥，将整张玻纤切割为宽19mm，密封于铝箔袋中干燥备用。
步骤8.试纸条的组装、切割、包装
按样品垫、金标乙型流感病毒单抗结合物垫、金标甲型流感病毒单抗结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸；将组装好的试纸切割为宽4mm/条的试纸条，装入塑料CT盒压紧，加干燥剂密封于铝箔袋干燥备用。
步骤9.待测样本稀释液的配制、分装
待测样本稀释液为0.5％的BSA溶液。
将待测样本稀释液按照7.5mL/瓶分装到10mL滴瓶中。
步骤10.试剂盒的组装
将待测样本稀释液、已装入检测卡的铝箔袋和其他配套部件(滴头、样本提取管、说明书、底托)一起按包装规格组成成品试剂盒。
试验例1
胶体金标记甲型流感病毒抗体的pH优化
将甲型流感病毒单抗(标记)稀释到1mg/mL，于6支小玻璃管内各加1ml制备好的胶体金溶液，每管分别再加入0.1mol/L的K2CO3 3、4、5、6、7、8μL，混合均匀后，各加入上步中已稀释的甲型流感病毒单抗(标记)单抗30μl(蛋白质过量)。混合均匀，静置5min后各加入10％NaCl 200μL，混合均匀，静置5min后观察颜色变化。结果见表1。
表1
序号 1 2 3 4 5 6
胶体金(mL) 1 1 1 1 1 1
0.1mol/L K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(μL) 3 4 5 6 7 8
PH 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 7.8
甲流单抗(μL) 30 30 30 30 30 30
10％NaCl(μL) 200 200 200 200 200 200
颜色 蓝 紫 红 红 红 红
结论：前2号样品在加入NaCl后颜色变为紫色或蓝色，这说明胶体金发生了团聚，这时的胶体金是不稳定的。3号样品之后的胶体金是稳定的。一般情况下应调至略偏碱性，所以此处选择4号样品即1mL胶体金加6μlK2CO3。
胶体金标记甲型流感病毒抗体的用量优化
取8支小玻璃管，各加入胶体金1mL，再各加0.1mol/L的K2CO3 6μl，混合均匀后，分别加入1mg/mL甲型流感病毒(标记)单抗1、2、3、4、5、6、7、8μl，混合均匀，静置5min后各加入10％NaCl200μl，混合均匀，静置5min后观察颜色变化。结果见表2。
表2
序号 1 2 3 4 5 6 7 8
胶体金 1 1 1 1 1 1 1 1
甲流单抗 1 2 3 4 5 6 7 8
10％NaCl 200 200 200 200 200 200 200 200
颜色 蓝 蓝 蓝 紫 紫 红 红 红
结论：前5号样品在加入NaCl后颜色变为蓝色或紫色，这说明胶体金发生了团聚，这时的胶体金是不稳定的。6号样品之后的胶体金是稳定的。一般情况下蛋白量应适当过量，所以此处选择7号样品即1mL胶体金加7μl甲型流感病毒单抗(标记)。
试验例2
胶体金标记乙型流感病毒抗体的pH优化
将乙型流感病毒单抗(标记)稀释到1mg/mL，于6支小玻璃管内各加1ml制备好的胶体金溶液，每管分别再加入0.1mol/L的K2CO3 3、4、5、6、7、8μL，混合均匀后，各加入上步中已稀释的乙型流感病毒单抗(标记)单抗30μl(蛋白质过量)。混合均匀，静置5min后各加入10％NaCl 200μL，混合均匀，静置5min后观察颜色变化。结果见表3。
表3
序号 1 2 3 4 5 6
胶体金(mL) 1 1 1 1 1 1
0.1mol/L K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(μL) 3 4 5 6 7 8
PH 5.8 6.2 6.6 7.0 7.4 7.8
乙流单抗(μL) 30 30 30 30 30 30
10％NaCl(μL) 200 200 200 200 200 200
颜色 蓝 紫 红 红 红 红
结论：前2号样品在加入NaCl后颜色变为紫色或蓝色，这说明胶体金发生了团聚，这时的胶体金是不稳定的。3号样品之后的胶体金是稳定的。一般情况下应调至略偏碱性，所以此处选择4号样品即1mL胶体金加6μlK2CO3。
胶体金标记乙型流感病毒抗体的用量优化
取8支小玻璃管，各加入胶体金1mL，再各加0.1mol/L的K2CO3 6ul，混合均匀后，分别加入1mg/mL乙型流感病毒(标记)单抗1、2、3、4、5、6、7、8μl，混合均匀，静置5min后各加入10％NaCl200μl，混合均匀，静置5min后观察颜色变化。结果见表4。
表4
序号 1 2 3 4 5 6 7 8
胶体金 1 1 1 1 1 1 1 1
乙流单抗 1 2 3 4 5 6 7 8
10％NaCl 200 200 200 200 200 200 200 200
颜色 蓝 蓝 蓝 紫 紫 红 红 红
结论：前5号样品在加入NaCl后颜色变为蓝色或紫色，这说明胶体金发生了团聚，这时的胶体金是不稳定的。6号样品之后的胶体金是稳定的。一般情况下蛋白量应适当过量，所以此处选择7号样品即1mL胶体金加7μl乙型流感病毒单抗(标记)。
实施例2
与实施例1的区别在于，步骤1中使用了锥形瓶烧制25nm粒径的胶体金。
实施例3
与实施例1的区别在于，步骤1中烧制的胶体金、步骤2中金标记甲型流感病毒单抗和步骤4中金标记乙型流感病毒单抗中使用的胶体金粒径22nm。
实施例4
与实施例1的区别在于，步骤1中烧制的胶体金、步骤2中金标记甲型流感病毒单抗和步骤4中金标记乙型流感病毒单抗中使用的胶体金粒径28nm。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤3中和步骤5中金标稀释液中不含Triton X-100。
对比例2
与实施例1的区别在于，步骤3中和步骤5中金标稀释液中不含S17。
对比例3
与实施例1的区别在于，步骤3中和步骤5中金标稀释液中不含Triton X-100和S17。
实施例5
与实施例1的区别在于，步骤3中处理好的金标甲型流感病毒单抗结合物垫和步骤5中处理好的金标乙型流感病毒单抗结合物垫，置于37℃电热鼓风干燥设备中烘制过夜(12H)。
实施例6
与实施例1的区别在于，步骤3中和步骤5中使用的OD值为16。
实施例7
与实施例1的区别在于，步骤6中甲型流感病毒单抗和乙型流感病毒单抗的包被浓度均为1.0mg/ml。
实施例8
与实施例1的区别在于，金标稀释液为：10mM Tris-HCl，3％(w/v)蔗糖，1％(w/v)海藻糖，0.5％(w/v)BSA，0.05％(w/v)Triton X-100和0.1％(w/v)S17。
实施例9
与实施例1的区别在于，金标稀释液为：100mM Tris-HCl，10％(w/v)蔗糖，5％(w/v)海藻糖，3％(w/v)BSA，0.5％(w/v)Triton X-100和2.0％(w/v)S17。
实施例10
与实施例1的区别在于，样品垫的处理液为：10mM Tris-HCl，0.1％(w/v)酪蛋白钠，0.1％(w/v)PVP40，0.05％(w/v)吐温20和0.1％(w/v)氯化钠。
实施例11
与实施例1的区别在于，样品垫的处理液为：100mMTris-HCl，2％(w/v)酪蛋白钠，2％(w/v)PVP40，2％(w/v)吐温20和2％(w/v)氯化钠。
检测方法
样本采集：使用棉或聚酯纤维材质的无菌拭子采集样本。
鼻咽拭子采集：拭子贴鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，待拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，轻轻旋转一周(如遇反射性咳嗽，应停留片刻)，然后缓缓取出拭子。
口咽拭子采集：被采集人员先用生理盐水漱口，将拭子放入无菌生理盐水中湿润(禁止将拭子放入样本释放液中)，被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧咽扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧咽扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，取出拭子。
样本处理及保存：样本采集后应尽快采用本试剂盒提供的样本释放液进行处理。若不能及时处理，采集的样本应置于干燥密封的塑料管内保存，在2℃-8℃条件下可保存8小时；-20℃及以下温度可长期保存。
样本检测：在样本提取管内垂直加入400μL(约10滴)样本释放液，将采集后的拭子插入样本提取管中溶液内，紧靠试管内壁旋转约10次，并用手指反复挤压，使样本尽可能溶解在溶液中。沿样本提取管内壁挤压拭子的顶部，使液体尽可能留在管内，取出并弃去拭子，盖上滴头。
撕开铝箔袋取出检测卡，平放并记录相应的样本信息，向加样孔中滴加100μL(约2-3滴)处理后的样本释放液。在层析作用下，加入的液体将沿着试纸向硝酸纤维素膜方向移动，15-20分钟后观察记录结果，20分钟后显示的结果无意义。
结果判读：若在检测线T1和质控线C处均出现肉眼可见的深色线，则表明样本中含有甲型流感病毒抗原；若在检测线T2和质控线C处均出现肉眼可见的深色线，则表明样本中含有乙型流感病毒抗原；若在检测线T1、T2和质控线C处均出现肉眼可见的深色线，则表明样本中同时含有甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原；若质控线C处未出现肉眼可见的深色线，则说明检测卡失效或操作有误，结果无效。
测试结束后，将使用过的检测卡、样本提取管、滴头按生物医疗废弃物进行处理。
试验例3最低检出限评价
利用实施例1中制备的试剂盒对甲型流感病毒和乙型流感病毒不同亚型进行定性检测。结果见表5，本发明的试剂盒对甲型和乙型流感病毒的多种亚型均有良好的反应性。
Figure BDA0003163924410000171
试验例4交叉和干扰反应性评价
利用实施例1中制备的试剂盒检测不同类型的病原微生物及常见干扰物，结果见表6，本发明的试剂盒对多种常见干扰物和不同病原微生物进行检测，结果均未发现交叉反应现象。
表6
Figure BDA0003163924410000172
Figure BDA0003163924410000181
试验例5
对实施例1-11和对比例1-3进行甲/乙型流感病毒抗原检测试剂国家参考品性能测试以及病毒培养物的测试，实验结果如下表7-11：
表7
Figure BDA0003163924410000182
表8
Figure BDA0003163924410000183
Figure BDA0003163924410000191
表9
Figure BDA0003163924410000192
表10
Figure BDA0003163924410000193
Figure BDA0003163924410000201
表11
Figure BDA0003163924410000202
注：“-”表示结果为阴性，“+”表示结果为阳性。
实施例1、实施例7、实施例8-11均能制备出检测灵敏度高、检测准确度高、效期更久的甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒。和实施例1相比，实施例2中使用锥形瓶烧制胶体金导致金颗粒大小难以控制，从而影响试剂盒的重复性；实施例3中使用了粒径小于25nm的胶体金，导致试剂盒的检测灵敏度有一定的下降；实施例4中使用了粒径大于25nm的胶体金，提升了试剂盒的检测灵敏度，但也带来了假阳性的风险；对比例1中使用了不含Triton X-100的金标稀释液，降低了试剂盒的检测灵敏度，同时存在假阳性的风险；对比例2中使用了不含S17的金标稀释液，降低了试剂盒的检测灵敏度，同时存在假阳性的风险；对比例3中使用了不含Triton X-100和S17的金标稀释液，降低了试剂盒的检测灵敏度，同时存在假阳性的风险；在实施例5中处理好的金标甲型流感病毒单抗结合物垫和处理好的金标乙型流感病毒单抗结合物垫，置于37℃电热鼓风干燥设备中烘制过夜(12H)，保持了试剂盒的检测灵敏度和特异性，但试剂盒的重复性较差；实施例6中使用的胶体金OD值为16，提升了试剂盒的检测灵敏度，但同样存在假阳性的风险；实施例7中甲型流感病毒单抗和乙型流感病毒单抗的包被浓度均为1.0mg/ml，提升了试剂盒的检测灵敏度，而且不存在假阳性的风险，重复性也符合要求。
试验例6
采用实施例1制备的试剂盒和对照试剂盒(批号W05900123，厂家：广州万孚生物技术有限公司)对1039例临床样本进行了临床一致性的研究，结果如下表12：
表12
Figure BDA0003163924410000211
结果显示实施例1提供的试剂盒与对照试剂的阳性一致率为99.5％，阴性一致率为98.8％，整体一致率为99％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条包括底板和依次设置于底板上的样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫；
所述第一结合垫包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体；
所述第二结合垫包被有胶体金标记的甲型流感病毒抗体或胶体金标记的乙型流感病毒抗体；
所述第一结合垫和第二结合垫的抗体互补相同；
所述包被用的金标稀释液包括：10-100mM Tris-HCl，3-10％(w/v)蔗糖，1-5％(w/v)海藻糖，0.5-3％(w/v)BSA，0.05-0.5％(w/v)Triton X-100和0.1-2.0％(w/v)S17。
2.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，胶体金的粒径为23-27nm；
优选地，胶体金标记的甲型流感病毒抗体和胶体金标记的乙型流感病毒抗体的浓度均独立地为6-10OD。
3.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述样品垫的处理液包括10-100mMTris-HCl，0.1-2％(w/v)酪蛋白钠，0.1-2％(w/v)PVP40，0.05-2％(w/v)吐温20和0.1-2％(w/v)氯化钠。
4.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述检测垫上平行设置有检测线1、检测线2和质控线；
检测线1包被有1-1.8mg/ml的甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体；
检测线2包被有1-1.8mg/ml的乙型流感病毒抗体或甲型流感病毒抗体；
检测线1和检测线2包被的抗体不同；
质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；
优选地，甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液均独立地包括10-20mM PBS，1-5％(w/v)海藻糖和0.2-1.0mM EDTA二钠。
5.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，样品垫与第一结合垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，第一结合垫与第二结合垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，第二结合垫与检测垫交错重叠1-1.5mm；
优选地，检测垫和吸水垫交错重叠2-3mm。
6.根据权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，样品垫、第一结合垫或第二结合垫均独立地为玻璃纤维；
优选地，检测垫为硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测试纸条，其特征在于，所述检测试纸条还包括用于包装所述检测试纸条的卡盒。
8.一种甲型/乙型流感病毒抗原胶体金法检测试剂盒，其特征在于，包括待测样品稀释液和权利要求1-7任一项所述的检测试纸条；
所述待测样品稀释液包括0.05-0.3％BSA(w/v)的磷酸盐缓冲液。
9.权利要求1-7任一项所述的检测试纸条的制备方法，其特征在于，样品垫、第一结合垫、第二结合垫、检测垫和吸水垫依次粘贴于底板上，得到检测试纸条。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，第一结合垫或第二结合垫的制备包括：采用胶体金溶液标记甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体，再包被于玻璃纤维，经干燥后得到所述第一结合垫或第二结合垫，胶体金溶液的制备方法为柠檬酸三钠还原法，胶体金溶液的制备采用球形瓶、悬臂式磁力搅拌桨和数显夹套式磁力搅拌器；
优选地，标记条件包括：在pH6.6～7.8条件下，胶体金溶液与甲型流感病毒抗体或乙型流感病毒抗体按照比例1ml：(0.006-0.008)mg反应；
优选地，胶体金溶液的分光光度计检测最高峰在523±3nm，OD值在1.0±0.1；
优选地，干燥为-100kPa真空冷冻干燥过夜。
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