CN102636647A - 一种氯胺酮胶体金唾液检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氯胺酮胶体金唾液检测试纸条，包括反应膜和金标垫，所述反应膜是在硝酸纤维膜(NC膜)上分别包被与载体蛋白连接的氯胺酮和质控二抗IgG，形成反应线和质控线；所述金标垫包被有胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体，应用膜层析竞争抑制法，检测唾液标本中氯胺酮。应用本发明试纸条，可有效监测唾液中氯胺酮，检测特异性强，重复性好，灵敏度高，最低检出量达到50ng/ml，该试纸条操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

Description

一种氯胺酮胶体金唾液检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种氯胺酮胶体金唾液检测试纸条。

背景技术

氯胺酮(Ketamine，KET)是苯环己哌啶(N-1-phenycyclohexy-piperidine，PCP)的衍生物，医学上作为外科手术麻醉剂，黑市上俗称“K粉”、“K仔”。近年来在娱乐场所滥用日趋严重。是我国目前的主要的新型毒品之一。目前，我国列入管制的麻醉药品有120多种，精神药品有130多种。研究表明，在服用氯胺酮后都会出现“去人格化”、“去真实感”、人体形象改变、梦境、幻觉以及恶心呕吐，大剂量服用，会出现意识模糊、身体呈木僵状，呼吸抑制，甚至出现四肢抽搐以及呼吸停止等现象；长期使用氯胺酮可造成记忆缺失、认知功能损害和精神病。人体服用的氯胺酮有70％-90％在肝内代谢并经尿液排出，其在体内的代谢较快，清除半衰期约为2.5小时，一般在吸食后2-4小时内即可被检出。

目前对氯胺酮快速检测的方法和仪器较多，主要依靠气相色谱、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳等进行检测，但存在仪器昂贵、检测时间长，需要专业技术人员操作的缺点。胶体金免疫层析技术是目前较为成熟的技术方法，其原理是将氯胺酮-BSA结合物包被在硝酸纤维薄膜上，在玻璃纤维上包被胶体金标记的特异性抗体。在检测时，如样本中没有氯胺酮或其代谢产物存在，胶体金标记的特异性抗体与膜区抗原结合形成两条红线(一条反应线T，一条质控线C)，表明检测结果为阴性；如样本中存在氯胺酮或其代谢产物，而且浓度高于检测水平(1000ng/ml)时，毒品分子就与胶体金标记的抗体竞争结合，从而阻止胶体金标记的抗体与膜区抗原结合，使其对应的红色反应线消失，仅出现一条红色的质控线，表明检测结果为阳性。

尽管以胶体金免疫层析技术为原理生产的的氯胺酮检测试纸条(胶体金法)已经得到了较为广泛的临床应用，但其检测标本为尿液，目前国内外尚未有研制和生产以人体唾液作为检测样本的氯胺酮唾液检测试纸条。现有的尿液试纸条在其使用过程中存在如下不足之处(1)样本采集不卫生，为很多样本采集者和检测者难以接受；(2)隐私权问题，即性隐蔽取尿，女性尿检时需要女性人员监督；(3)新兵、公务员、特殊从业人员(飞行员、驾驶员、高空作业者等)体检，受试者易在标本采集中掺假制造假阴性；(4)而取尿时需有专用场所，而且必须一对一进行监督取尿，很不方便，不适用于驾驶员路旁筛查和娱乐场所突击抽查；(5)在实际使用过程中，易发生与美沙酮、美沙芬等药物交叉问题，从而导致错检和误检。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测人类唾液中氯胺酮的试纸条。

本发明的另一目的是提供一种氯胺酮胶体金检测试纸条的制备方法。

本发明的再一目的是提供一种氯胺酮胶体金检测试纸条的应用。

一种氯胺酮唾液检测试纸条，包括反应膜(3)和金标垫(2)，所述反应膜为硝酸纤维膜，其具有分别包被与载体蛋白连接的氯胺酮的反应线和二抗IgG的质控线；所述金标垫是包被有胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体的玻璃纤维膜。

所述载体蛋白为小牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)和/或血蓝蛋白(KLH)。

所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

所述玻璃纤维膜中胶体标记的氯胺酮的单克隆抗体的pH值为8.0～8.5，胶体金和氯胺酮单克隆抗体的配比为2～12μg/ml胶体金。

优选地，所述玻璃纤维膜中胶体金标记的氯胺酮的单克隆抗体的pH值为8.2，胶体金和氯胺酮单克隆抗体的配比为8μg/ml胶体金。

所述金标垫是将胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体加入脱脂奶粉，离心后取沉淀，沉淀用复溶液复溶后喷涂于玻璃纤维膜上制得。

所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/lTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％-3％海藻糖或1％-5％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

所述脱脂奶粉加入量为按质量比0.5‰～1‰加入10％的脱脂奶粉。

所述复溶液是按照原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％进行复溶的。

所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml。

优选地，所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体的包被浓度为0.4mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.4mg/ml。

所述包被浓度是由划膜液稀释获得的，划膜液是由终浓度为0.01-0.2mol/lTris，1％-3％海藻糖或1％-3％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.05％-0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8。

本发明氯胺酮唾液检测试纸条，还包括反应支持物(5)、上样垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维膜(3)和吸水垫(4)。

所述上样垫含有上样垫处理液，处理液配方为：0.01～0.2mol/LTris，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～2％柠檬酸钠，0.1％～2％柠檬酸，0.05％～0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％明胶，0.1％～2％α淀粉酶，0.1％～1％氯化钠或0.1％～1％氯化钾或0.1％～1％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，上述浓度均为配制处理液后的终浓度，HCl调节pH值为8.0～9.0。

所述上样垫为本发明试纸条的加样区，反应膜为反应区。

本领域技术人员可以根据需要，将本发明提供的试纸条的加样区制作为实际检测中可接受的装置，以利于唾液的收集。

本发明提供一种制备上述氯胺酮唾液检测试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备氯胺酮的单克隆抗体；

(2)硝酸纤维膜的制备：用划膜液将与载体蛋白偶联的氯胺酮稀释为终浓度为0.2～1.0mg/ml的包被抗原、将抗鼠IgG抗体稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成反应线和质控线，且于37℃中干燥4小时，备用；所述划膜液由终浓度为0.01-0.2mol/lTris，1％-3％海藻糖或1％-3％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.05％-0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8。

(3)金标垫的制备：氯胺酮的单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以2～12μg/ml胶体金加入氯胺酮的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰，加入10％的脱脂奶粉，摇匀、静置，离心，取沉淀，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于玻璃纤维膜上，37℃，烘干4h，得到金标垫；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％-3％海藻糖或1％-5％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5S9TETRONIC 1307，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

(4)在反应支持物上依次相互搭接粘贴上样垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫。

具体地，所述步骤(2)中载体蛋白为BSA、OVA和/或KLH。

所述步骤(4)中把上样垫处理液涂于玻璃纤维上，37℃，烘干4h，室温密封保存。

依次将上样垫、胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体玻璃纤维膜、包被有氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)和抗鼠IgG多克隆抗体的反应膜、吸水垫在反应支持物上进行组装；用切条机按纵向剪切，裁成宽度为4mm的条状。待检验合格后铝箔袋封存。

所述反应支持物优选PVC板；所述上样垫优选(玻璃纤维)；所述吸水垫优选吸水滤纸。

本发明提供了所述氯胺酮胶体金检测试纸条在检测氯胺酮中的应用。

本发明采用氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的氯胺酮的单克隆抗体，检测标本中的氯胺酮。

本发明通过优化胶体金标抗体复溶液、划膜液配方，优化标记过程和包被过程的工艺参数，使唾液检测试纸条能够满足产品设计的性能指标要求；通过优化上样垫处理液配方，解决了唾液样本粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素。在本发明提供的复溶液配方中，与传统配方相比增加了β-环糊精、海藻糖和水解干络素等成分；在划膜液配方中增加了海藻糖成分；整个试纸条反应系统中选用Tris-HCl缓冲系统替代了传统方法使用的磷酸缓冲液系统；在标记过程中，选用脱脂奶粉替代BSA作为稳定剂，能对氯胺酮单克隆抗体和氯金酸溶液的结合过程起到更好的保护。通过溶液的配方改进提高了本发明试纸条的灵敏度，与现有的氯胺酮尿液试纸条的最低检出量为1000ng/ml相比，而本发明的试纸条的最低检出量为50ng/ml，灵敏度显著高于现有技术的检测试纸条。

本发明提供的检测试纸条检测，以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中氯胺酮，特异性强，重复性好，灵敏度高，最低检出量达到50ng/ml，该试纸条操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

附图说明

图1为本发明氯胺酮胶体金检测试纸条的示意图，其中图1A为本发明氯胺酮胶体金检测试纸条的正面示意图；图1B为本发明氯胺酮胶体金检测试纸条的侧面示意图；其中，1：上样垫；2：金标垫，为含有胶体金标记氯胺酮单克隆抗体的玻璃纤维膜；3：反应膜(T：包被氯胺酮单克隆抗体的检测条带；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；4：吸水垫；5：反应支持物。

图2为本发明试纸条检测结果示意图；其中，6为加样区，7为反应区，图2A、2B、2C的反应区和加样区同图2D；T为反应线，C为质控线；从左至右依次为：图2A，阳性，C一条线；图2B，阴性，C和T共两条线；图2C，无效，T一条线；图2D，无效，C和T均没有显示条线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别说明，实施例中所用的试剂为市售。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20℃时容量的比例。

本发明用到的试剂，其来源如下：

化学试剂(氯金酸、碳酸钾、Tris、海藻糖、蔗糖、EDTA、曲拉通X-100、土温20、S9表面活性剂、柠檬酸钠、柠檬酸、PEG20000、水解干络素、氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、叠氮钠、HCl、β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、α淀粉酶等)均外购于国药集团北京化学试剂公司，试剂级别为分析纯；

脱脂奶粉外购于普通超市，品牌为完达山、光明；

牛血清白蛋白(BSA)、络蛋白外购于Sigma公司、罗氏公司；

氯胺酮的单克隆抗体外购于Medix、Aresta公司；

氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)外购于Medix公司、Aresta、杭州隆基公司、广州博肯公司；

抗鼠IgG外购于杭州隆基公司、广州博肯公司；

实施例1氯胺酮胶体金检测试纸条的制备(参见图1)

1、胶体金的制备：

准确量取100mL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾。将2mL 1％氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌。当溶液再次沸腾时，准确量取2mL1.0％柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸。仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热10min即可。待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至100mL，放置在4℃条件下避光保存备用。

2、氯胺酮单克隆抗体金标垫的制备

2.1所需原料氯胺酮单克隆抗体；上述步骤1制得的胶体金溶液；

1.0％K₂CO₃；10％脱脂奶粉；复溶液；玻璃纤维。

复溶液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.01mol/L Tris，2％BSA，2％海藻糖，2％曲拉通X-100，0.2％β-环糊精，0.5％柠檬酸钠，0.5％PEG20000，0.2％水解干络素，0.1％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

具体配置方法为(以100ml为例)：取100ml纯化水，依次加入0.001mol的Tris、2g BSA、2g海藻糖、0.2g β-环糊精、0.5g柠檬酸钠、0.5gPEG20000、0.2g解干络素，0.1g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100，均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为7.4，4℃条件下避光保存备用。

2.2胶体金-氯胺酮抗体标记过程氯胺酮抗体标记的过程(用2mL胶体金标记为例)：取2mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K₂CO₃调pH值至8.2后，移液器准确吸取5mg/mL氯胺酮单克隆抗体0.8μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。然后取10μL的10％脱脂奶粉(终浓度质量比0.5‰)逐滴加入溶液中，摇匀后静置30min。然后放入离心机，在12000rpm温度为4℃的条件下离心30min。完毕后，吸取上清液，弃掉，沉淀用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的60％复溶，混匀。

2.3胶体金标记物固相化把1.25ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.6cm×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h。铝箔袋密封，室温保存备用。

经实验确定，氯胺酮单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8.2，胶体金和抗体的配比为8μg/ml胶体金。标记胶体金经复溶液处理后，按每平方厘米70μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上。

3、包被硝酸纤维素膜制备反应膜

将氯胺酮-BSA(用于包被反应线T)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(用于包被质控线C)用划膜液分别稀释至0.4mg/mL，然后分别加入到自动划膜仪的T杯和C杯中；调试自动划膜仪，喷液量设定为1.0μL/cm，导轨速度8.0cm/sec，喷嘴1与2间隔6mm。调试完成后，划膜包被，形成反应线(T线)和质控线(C线)，37℃，烘干4小时。待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用。

划膜液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.1mol/lTris，2％海藻糖、0.4％EDTA，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。

4、上样垫的制作

上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制：0.03mol/lTris，2％曲拉通X-100，0.5％柠檬酸钠，0.2％柠檬酸，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.15％β-环糊精，0.1％明胶，0.15％α淀粉酶，0.2％氯化钠，0.05％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为8.0。

具体配置方法为(以100ml为例)：取100ml纯化水，边加热边加入0.1g明胶后搅拌溶解，溶解后恢复体积和室温，依次加入0.003mol的Tris、0.5g柠檬酸钠、0.2g柠檬酸、0.1g的聚乙烯吡咯烷酮、0.15g β-环糊精、0.15gα淀粉酶、0.2g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100，均匀搅拌30min，后加入0.05g叠氮钠均匀搅拌10min，用HCl调节pH值为8.0，2-8℃条件下避光保存备用。

取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h，得到上样垫。铝箔袋密封，室温保存备用。

5、氯胺酮胶体金检测试纸条组成

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；

上样垫1为2cm×0.4cm的玻璃纤维；

0.4cm×0.4cm的金标垫2含有胶体金标记的氯胺酮单抗玻璃纤维膜；

1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被氯胺酮-BSA，羊抗鼠IgG，二者间隔6mm；

吸水垫4为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；按照由1-4的顺序依次组织。上样垫1为加样区，反应膜3为反应区。即形成了氯胺酮检测试纸条(胶体金法)。

实施例2氯胺酮胶体金检测试纸条的制备

1、胶体金的制备：

准确量取100mL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾。将2mL 1％氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌。当溶液再次沸腾时，准确量取2mL1.0％柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸。仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热10min即可。待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至100mL，放置在4℃条件下避光保存备用。

2、氯胺酮单克隆抗体金标垫的制备

2.1所需原料

氯胺酮单克隆抗体；上述步骤1制得的胶体金溶液；1.0％K₂CO₃；10％脱脂奶粉；复溶液；玻璃纤维。

复溶液按照以下终浓度组分进行配制：0.2mol/L Tris，4％BSA，3％蔗糖，0.2％曲拉通X-100，2％β-环糊精，1％柠檬酸钠，1％PEG20000，1.2％水解干络素，2％氢氧化钠，0.1％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为8.0。

2.2胶体金-氯胺酮抗体标记过程

氯胺酮抗体标记的过程(用2mL胶体金标记为例)：取2mL制备好的胶体金溶液，用1.0％K₂CO₃调pH值至8.4后，移液器准确吸取5mg/mL氯胺酮单克隆抗体0.8μL，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。然后取10μL的10％脱脂奶粉(终浓度质量比0.5‰)逐滴加入溶液中，摇匀后静置30min。然后放入离心机，在12000rpm温度为4℃的条件下离心30min。完毕后，吸取上清液，弃掉，沉淀用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的80％复溶，混匀。

2.3胶体金标记物固相化

把1.25ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0.6cm×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h。铝箔袋密封，室温保存备用。

标记胶体金经复溶液处理后，按每平方厘米70μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上。

3、包被硝酸纤维素膜制备反应膜

将氯胺酮-BSA(用于包被反应线T)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(用于包被质控线C)用划膜液分别稀释至0.4mg/mL，然后分别加入到自动划膜仪的T杯和C杯中；调试自动划膜仪，喷液量设定为1.0μL/cm，导轨速度8.0cm/sec，喷嘴1与2间隔6mm。调试完成后，划膜包被，形成反应线(T线)和质控线(C线)，37℃，烘干4小时。待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用。

划膜液配方为按以下组分终浓度进行配制：0.2mol/lTris，2％蔗糖、0.2％EDTA，0.1％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.8。

4、上样垫的制作

上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制：0.1mol/lTris，0.5％曲拉通X-100，1.5％柠檬酸钠，2％柠檬酸，0.15％聚乙烯吡咯烷酮，0.15％β-环糊精，0.8％明胶，1％α淀粉酶，0.6％氯化钠，0.1％叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为9.0。2-8℃条件下避光保存备用。

取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25×30cm的玻璃纤维上，37℃，烘干4h，得到上样垫。铝箔袋密封，室温保存备用。

5、氯胺酮胶体金检测试纸条组成

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；上样垫1为2cm×0.4cm的玻璃纤维；0.4cm×0.4cm的金标垫2含有胶体金标记的氯胺酮单抗玻璃纤维膜；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被氯胺酮-BSA，羊抗鼠IgG，二者间隔6mm；吸水垫4为2.7cm×0.4cm的吸水滤纸；按照由1-4的顺序依次组织。上样垫1为加样区，硝酸纤维素膜3为反应区。即形成了氯胺酮检测试纸条(胶体金法)。

实施例3检测方法(参见图2)

将待检标本唾液直接吐入或滴加到实施例1和实施例2制得的试纸条加样区处或唾液收集装置中，样品液通过毛细作用沿膜前移，3-5分钟内判读结果，超出10分钟，结果无效。

结果：如果样本中含有氯胺酮(阳性)，则在质控线C处出现一条红色条带，反应线T处没有条带。

如果样本中没有含氯胺酮(阴性)，则在质控线C处和反应线T处各有一条条带，共两条带。

无论标本中是否含有氯胺酮，检测结果在“C”处都形成一条条带。此线是质控线，如果胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

实施例4试纸条性能评估试验

用于性能评估的氯胺酮唾液检测试纸条的批号分别为Lot1、Lot2、Lot3，包装规格为：40人份/盒。氯胺酮标准品(批号为171228-200605)，购于中国药品生物制品检定所。

1、最低检出量评估

1.1实验材料和方法将购于中国药品生物制品检定所的氯胺酮标准品用正常人唾液配制成如下浓度的样品：100、75、50、25、10ng/mL。选择三批本发明实施例1制得的氯胺酮唾液检测试纸条各15人份。取出检测试剂卡，将其置于干净平坦的台面上，用塑料滴管垂直滴加3滴无气泡的上述检测样本(约100μL)于加样区内，5分钟内观察结果，并记录。为确保结果的准确性，5分钟后不再进行结果判读。每个检测样本重复3次。

1.2实验结果本发明的最低检出量评估资料的试验结果见表1。结果显示，当样本中氯胺酮标准品的含量为100ng/mL、75ng/mL时氯胺酮检测试剂的检测结果为阳性，其中氯胺酮标准品含量为50ng/mL时，检测结果为弱阳性(±)，正确率为100％；当样本中氯胺酮标准品的含量为25ng/mL以及10ng/mL以下时氯胺酮检测试剂的检测结果为阴性(-)，正确率为100％。以上结果表明本发明试纸条的检测最低检出量不低于50ng/mL。

表1最低检出量评估试验结果

注：阳性结果(+)：目测反应显色区质控线显色清晰，反应线不显色；弱阳性(±)：目测反应显色区质控线显色清晰，反应线隐约显色；阴性结果(-)：目测反应显色区质控线显色清晰，反应线显色清晰。

1.3结论经过三批产品的实验证明，本本发明提供的氯胺酮唾液检测试纸条(胶体金法)的检测最低检出量不高于50ng/mL，符合产品设计要求。

2、特异性评估

2.1阴性参考品符合率实验

2.1.1实验材料和方法阴性参考品系列购自于中国药品生物制品检定所，包括浓度为100μg/mL的美沙酮、甲基安非他明、可卡因、地西泮、麻黄碱、伪麻黄碱、苯巴比妥、曲马多、吗啡、加替沙星、雷尼替丁、咖啡因、普鲁卡因和浓度为10μg/mL的Δ⁹-四氢大麻酚酸样品和阴性唾液。取此阴性参考品系列各1mL，放入洁净器皿恢复至室温备用；选择三批(氯胺酮检测试剂各75人份。取出检测试剂卡，将其置于干净平坦的台面上，用塑料滴管垂直滴加3滴无气泡的上述检测样本(约100μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并做记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复5次。

2.1.2实验结果试验结果见表2。结果显示，用浓度为100μg/mL的、甲基安非他明、可卡因、地西泮、麻黄碱、伪麻黄碱、苯巴比妥、曲马多、吗啡、加替沙星、雷尼替丁、咖啡因、普鲁卡因，浓度为10μg/mL的Δ⁹-四氢大麻酚酸样品和阴性唾液检测本产品，产品显色区质控线均显色清晰明确，反应线显色，检测结果全部为阴性，正确率为100％。

表2阴性参考品符合率试验结果

2.1.3结论经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条对阴性系列对照品样本的检测结果全部合格，符合产品设计要求。

2.2阳性参考品符合率实验

2.2.1实验材料和方法阳性参考品系列为不同浓度的氯胺酮标准品。将购自于中国药品生物制品检定所的氯胺酮标准品用正常人唾液配制成如下浓度的样品：100ng/mL、75ng/mL、50ng/mL。选三批检测试剂各15人份，将其置于干净平坦的台面上，用塑料滴管垂直滴加3滴无气泡的上述检测样本(约100μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复5次。

2.2.2实验结果试验结果见表3。结果显示，用浓度为100ng/mL、75ng/mL、50ng/mL的氯胺酮标准品作为阳性参考品检测本产品，产品显色区质控线均显色清晰明确，反应线不显色，检测结果全部为阳性，正确率为100％。

表3阳性参考品符合率试验结果

2.2.3结论经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条阳性样本检测结果全部合格，符合产品设计要求。

2.3小结通过三批产品的阴性参考品符合率和阳性参考品符合率试验，结果表明本发明研制的氯胺酮检测试纸条(胶体金法)在特异性方面充分满足了产品质量要求。

3、重复性试验

3.1批内不精密度

3.1.1实验材料和方法将购自于中国药品生物制品检定所的氯胺酮标准品用正常人唾液配制成如下浓度的样品：100ng/mL、75ng/mL、50ng/mL、25ng/mL。选择三批(批号分别为Lot1、Lot2、Lot3)的氯胺酮检测试剂各40人份。取出检测试剂卡，将其置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加3滴无气泡的上述检测样本(约100μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复10次。

3.1.2实验结果氯胺酮唾液检测试纸条(胶体金法)的批内不精密度评估资料的试验结果见表4，结果显示：在Lot2中氯胺酮浓度为50ng/mL中共有1例阳性标本检测结果在显色深浅上有差异，其批内不精密度为2.50％。

表4批内不精密度试验结果

3.1.3实验结论经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条的批内不精密度低于5％，符合产品设计要求。

3.2批间不精密度

3.2.1实验材料和方法将购自于中国药品生物制品检定所的氯胺酮标准品用正常人唾液配制成如下浓度的样品：75ng/mL、50ng/mL、25ng/mL。选择三批(批号分别为Lot1、Lot2、Lot3)的氯胺酮唾液检测试纸条各30人份。取出检测试剂卡，将其置于干净平坦的台面上，用塑料吸管垂直滴加3滴无气泡的上述检测样本(约100μL)于加样区内，3-5分钟观察结果，并记录。为确保结果的准确性，请勿在5分钟后判读结果。每个检测样本重复10次。

3.2.2实验结果氯胺酮唾液检测试纸条(胶体金法)的批间不精密度评估资料的试验结果见表5，结果显示：在50ng/mL中共有2例阳性检测结果在显色深浅上有差异，其批间不精密度为2.22％。

表5批间不精密度检测结果

3.2.3实验结论经过三批产品的实验证明，本发明研制的三个批号的试纸条的批内不精密度低于5％，符合产品设计要求。

实施例5临床应用实验

采用多中心随机同步盲法测试临床试验设计，以杭州艾康生物公司生产的氯胺酮尿液检测试纸条为对照，与本发明试纸条进行对比试验研究。LC-MS检测每一份标本，并以此方法判定结果。

1、材料

氯胺酮唾液检测试纸条(胶体金法)批号：20100101，检测阈值：50ng/ml对照试剂名称：氯胺酮尿液检测试纸条(胶体金法)批号：201006003，生产厂家：艾康生物技术(杭州)有限公司，检测域值：1000ng/ml。采用前往某戒毒场所接受强制戒毒的受试者的唾液作为检测样本。工作人员对同一受试者收集2份唾液标本，A份：收集唾液，唾液样本量不少于0.5ml，B份：备份保存在-20℃。对A份唾液进行LC-MS检测。

2、检测方法

2.1被评价试剂的操作方法按照产品说明书的要求进行。

观察试剂卡上色带出现。质控区C线均应出现色带，反应区T线出现表明结果为阴性；T线未出现则表示对应的检测物质浓度高于试剂检测的临界值。质控区的线条(C线)出现表明试纸条系统正常工作，检测区和质控区均无线条出现，表示试纸条失效，应重做。若对检测区的色带很浅，难以判断，应重新检测，结果依旧不明确的，可判断为临界结果(+/-)。

2.2LC-MS检测按照LC-MS检测常规进行。

3、数据统计分析本次试验采用以LC-MS检测结果为标准，计算符合率结果。对照分析应用卡方检验分析，列表及公式如下：

表6

计算公式为：

${\mathrm{\χ}}^2=\frac{{\left(\right|b-c|-1)}^2}{b+c},$ v＝1

根据计算值判定本发明试纸条和LC-MS结果之间是否存在显著性差异。本试验本发明试纸条的临床灵敏度、特异性和总符合率，计算方法如下：阳性符合率＝A/(A+B)×100％；阴性符合率＝D/(C+D)×100％；总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％。

A：诊断阳性；B假阳性；C：假阴性；D：本试剂诊断阴性

4、结果

4.1本发明试纸条与尿液试纸条对150例样本的检验结果统计

表7本发明试纸条与尿液试纸条对150例样本的检测结果

结果分析：

以LC-MS的结果为标准进行比较：

灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝45/(45+0)×100％＝100％

特异度＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝103/(103+2)×100％＝98.1％

符合率＝(真阳性+真阴性)/总样本数＝(45+103)/150×100％＝98.67％

4.2本发明试纸条与尿液试纸条检验结果卡方检验分析：

表8本发明试纸条与尿液试纸条对150例样本检测结果卡方检验分析结果

由此数据得出，经过卡方检验分析，本发明试纸条与尿液试纸条临床测定结果没有显著性差异，临床测值符合较好。

4.3本发明试纸条与对LC-MS对150例样本的检验结果统计

表9本发明试纸条与对LC-MS对150例样本的检验结果

结果分析：

以对照试剂的结果为标准进行比较：

灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)＝44/(44+3)×100％＝93.62％

特异度＝真阴性/(真阴性+假阳性)＝103/(103+0)×100％＝100％

符合率＝(真阳性+真阴性)/总样本数＝(44+103)/150×100％＝98％

4.4本发明试纸条与LC-MS结果检验结果卡方检验分析：

表10本发明试纸条与LC-MS检测结果卡方检验分析结果

由此数据得出，经过卡方检验分析，本发明试剂与LC-MS检测临床测定结果没有显著性差异，临床测值符合较好。

本次临床试验通过对150份唾液样本进行对照检测，本发明研制的试纸条与传统尿液试纸条结果不符的标本有2例，其检测灵敏度为100％、特异性98.1％和符合率为98.67％；本发明研制的试纸条与LC-MS检测结果中出现差异的有3例，其检测灵敏度为93.62％，特异性为100％，符合率为98％。结果说明，本发明研制生产的氯胺酮唾液检测试纸条与传统的尿液检测试纸条、LC-MS检测的临床检测灵敏度、特异性、符合率基本一致。可以运用于临床筛查和现场检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种氯胺酮唾液检测试纸条，包括反应膜(3)和金标垫(2)，所述反应膜为硝酸纤维膜，其具有分别包被与载体蛋白连接的氯胺酮的反应线和二抗IgG的质控线；所述金标垫是包被有胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体的玻璃纤维膜。

2.根据权利要求1所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为BSA、OVA和/或KLH，所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。

3.根据权利要求1所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述玻璃纤维膜中胶体金标记的氯胺酮的单克隆抗体的pH值为8.0～8.5，胶体金和氯胺酮单克隆抗体的配比为2～12μg/ml胶体金。

4.根据权利要求1所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述金标垫是将胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体加入脱脂奶粉，离心后取沉淀，沉淀用复溶液复溶后喷涂于玻璃纤维膜上制得。

5.根据权利要求4所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％-3％海藻糖或1％-5％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

6.根据权利要求1所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.2～1.0mg/ml。

7.根据权利要求6所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述包被浓度是由划膜液稀释获得的，划膜液是终浓度为0.01-0.2mol/1Tris，1％-3％海藻糖或1％-3％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.05％-0.1％叠氮钠；HCl调节pH值为7.2～7.8。

8.根据权利要求1-7任意一项所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物(5)、上样垫(1)、吸水垫(4)；所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(1)、金标垫(2)、反应膜(3)和吸水垫(4)。

9.根据权利要求8所述氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于，所述上样垫含有上样垫处理液，处理液配方为：0.01～0.2mol/LTris，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～2％柠檬酸钠，0.1％～2％柠檬酸，0.05％～0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％明胶，0.1％～2％α淀粉酶，0.1％～1％氯化钠或者0.1％～1％氯化钾或0.1％～1％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠，所述浓度均为配置后的终浓度；HCl调节pH值为8.0～9.0。

10.一种制备权利要求1-9任一所述氯胺酮唾液检测试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备氯胺酮的单克隆抗体；

2)硝酸纤维膜的制备：用划膜液将与载体蛋白偶联的氯胺酮稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml、将抗鼠IgG抗体稀释为浓度为0.2～1.0mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成反应线和质控线，且于37℃中干燥4小时，备用；所述划膜液由终浓度为0.01-0.2mol/lTris，1％-3％海藻糖或1％-3％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.05％-0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.2～7.8。

3)金标垫的制备：氯胺酮的单克隆抗体标记胶体金的pH值为8.0～8.5，以2～12μg/ml胶体金加入氯胺酮的单克隆抗体，摇匀后静置，按质量比0.5‰～1‰，加入10％的脱脂奶粉，摇匀、静置，离心，取沉淀，用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％复溶，将复溶后的胶体金标记物喷涂于玻璃纤维膜上，37℃，烘干4h，得到金标垫；所述复溶液是由终浓度为0.01～0.2mol/LTris，1％～5％BSA或0.01％～0.2％络蛋白，1％-3％海藻糖或1％-5％蔗糖或0.1％-1％EDTA，0.1％～2％曲拉通X-100或0.1％～0.5％土温-20或0.01％～0.5％S9表面活性剂，0.1％～1％柠檬酸钠，0.1％～2％β-环糊精，0.1％～1％PEG20000，0.1％～2％水解干络素，0.1％～2％氯化钠或0.1％～2％氯化钾或0.1％～2％氢氧化钠，0.05％～0.1％叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0～8.0。

4)在反应支持物上依次相互搭接粘贴上样垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水垫。

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