CN107727849B - 一种检测人体疲劳状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人体疲劳状态的方法，属于一种用胶体金试纸检测唾液中疲劳标志物的方法，包括先用疲劳状态检测试纸检测高浓度的唾液待测液，如果疲劳状态检测试纸显示为重度疲劳，再在疲劳状态检测试纸上用低浓度的唾液待测液检测重度疲劳级别；本发明采用非侵入式的方式对人体疲劳状态进行检测，对被测者无创、无痛，无需依赖其他仪器设备、专业操作人员或特定场所，具有操作简单、方便快捷、检测成本低、结果准确直观的优点。
Description
技术领域
本发明涉及人体疲劳状态的检测，尤其是用胶体金试纸检测唾液中疲劳标志物，属于一种用试纸判定人体疲劳状态的方法。
背景技术
疲劳又称疲乏，是主观上一种疲乏无力的不适感觉，客观上会失去其完成原来所从事的正常活动或工作的能力，按照形成的原因和发生机制可分为紧张性疲劳、运动性疲劳、情绪性疲劳、癌性疲劳及特定器官的疲劳。精神和躯体疲劳会导致操作人员由适任状态衰退成亚适任和不适任状态，类似醉酒后失去正常活动或工作的能力，对人的警觉、机敏、动作的协调、信息处理和决策都会产生负面影响，大量证据显示疲劳所致判断、决策和操作水平降低，导致了大量的职业伤害，比如交通事故及医源性伤害。疲劳伤害是各国面临的重大公共卫生问题之一。全球每年因疲劳导致的伤害占职业性伤害的21.7％，所致死亡占交通死亡的57％；我国每年因疲劳意外死亡约60万人；但因没有方便快捷的检测方法，立法执行困难。
核连蛋白2，英文名称Nucleobindin-2(NUCB2)，是一种疲劳标志物，在疲劳程度较高的人体血液和唾液中含量较高。研究结果表明，核连蛋白2在人体血液和唾液中的含量均与脑电波显示的人体疲劳程度呈显著的正相关性，可以作为检测人体疲劳程度的指标。检测血液中的核连蛋白2需要对被检人进行抽血，并对血样中的核连蛋白2进行分离和提取。该检测方式存在的不足之处在于会对被测者会造成侵入性伤口，甚至有交叉感染的风险，短期内不能频繁多次检测。而且检测人员需要具有专业技能、对检测场所和设备的要求也较高，不能在被检测者的工作现场检查，存在操作步骤繁琐、检测成本高、过程耗时长等问题。目前尚未见到关于通过检测唾液中核连蛋白2含量，判定人体疲劳状态(程度)的简便、快捷的方法或装置。
免疫层析胶体金技术是一种新型的诊断技术，具有快速简便、准确、结果直观等优点。免疫层析胶体金技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当抗原-抗体-胶体金颗粒复合物富集时，会形成肉眼可见的红色沉淀线。
胶体金检测试纸的金标垫上包被有一种抗体标记的胶体金颗粒(免疫胶体金)，并在反应膜上的检测线区域包被抗体，当样品中含有相应的特异性抗原时，便能够与胶体金标记的抗体相结合形成复合物，然后在反应膜上进行层析的过程中在检测线区域被抗体捕获，形成红色条带，表明检测结果为阳性。
胶体金检测试纸常见于血液和尿液样品的检测，很少用于人体唾液样品的检测。目前尚未见到用试纸检测人体疲劳状态的方法和技术，也没有关于核连蛋白2胶体金试纸或检测装置的报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种检测人体疲劳状态的方法，采用非侵入式的方式对人体疲劳状态进行检测，对被测者无创、无痛，无需依赖其他仪器设备、专业操作人员或特定场所，具有操作简单、方便快捷、检测成本低、结果准确直观的优点。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种检测人体疲劳状态的方法，先用疲劳状态检测试纸检测高浓度的唾液待测液，如果疲劳状态检测试纸显示为重度疲劳，再在疲劳状态检测试纸上用低浓度的唾液待测液检测重度疲劳级别。
本发明的上述技术方案的进一步改进在于具体包括如下步骤：
A.将收集到的人体唾液与磷酸缓冲液混合,配制成高浓度的唾液待测液和低浓度的唾液待测液；
B.将高浓度的唾液待测液加至疲劳状态检测试纸上，静置5～15分钟；
C.当疲劳状态检测试纸上只显示质控线时，为轻度疲劳；当同时显示检测线和质控线时，为重度疲劳；当质控线未显示时，为无效结果；
D.当步骤C同时显示检测线和质控线时，将低浓度的唾液待测液加至疲劳状态检测试纸上，如果只显示质控线，则为重度疲劳Ⅰ级，如果同时显示检测线和质控线，则为重度疲劳Ⅱ级，当质控线未显示时，为无效结果。
本发明的上述技术方案的进一步改进在于：使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为0.5～3mL。
本发明技术方案的进一步改进在于：高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的1.5～3倍，所述磷酸缓冲液中含10～20mmol/L的磷酸氢二钠、1～5mmol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.2mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为7.0～8.0。
本发明技术方案的进一步改进在于：疲劳状态检测试纸包括底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸样垫，金标垫上含有核连蛋白2单克隆抗体标记的免疫胶体金，反应垫上有检测线和质控线，检测线上含有核连蛋白2单克隆抗体，质控线上含有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
本发明技术方案的进一步改进在于核连蛋白2单克隆抗体标记的免疫胶体金溶液的制备方法为：在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为10～25μg/ml，静置15～30分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.3～0.5倍。
本发明技术方案的进一步改进在于胶体金溶液的制备方法包括如下步骤：
a.将浓度为8～10mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾10～15分钟后，迅速加入5～6mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:45～50，再次沸腾后，超声处理5～8分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，4℃条件下避光保存。
本发明技术方案的进一步改进在于：复溶液中含有0.1～0.3mol/L的Tris、10～25g/L的BSA、4～8g/L的海藻糖、5～10g/L的蔗糖、2～5g/L的Tween-20、5～10g/L的聚乙二醇20000、氯化钠3～8g/L的氯化钠和0.2～0.5g/L的叠氮钠，pH值为7.0～8.0。
本发明技术方案的进一步改进在于：检测线是将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至2～3mg/mL后喷涂干燥得到，质控线是将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至1.5～2.0mg/mL后喷涂干燥得到；
所述划膜液中含有10～15g/L的蔗糖、0.2～0.3mol/L的Tris、2～2.5g/L的BSA、1.5～2.0g/L的聚乙二醇20000、0.2～0.5g/L的叠氮钠,划膜液的pH值为7.0～8.0。
本发明技术方案的进一步改进在于：样品垫是由预处理液浸泡后干燥得到，所述预处理液含有1～5g/L的曲拉通X-100、3.5～5.0g/L的海藻酸钠、2.5～4.5g/L的氯化钾、5～8g/L的抗坏血酸、1.5～2.0g/L的α淀粉酶、1.0～1.5g/L的β环糊精、0.3～1.0g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～0.3mol/L的Tris，预处理液的pH值为8.0～8.5。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明采用非侵入式的方式对人体疲劳状态进行检测，对被测者无创、无痛，无需依赖其他仪器设备、专业操作人员或特定场所，具有操作简单、方便快捷、检测成本低、结果准确直观的优点。
本发明检测样本为唾液，样本易得；唾液收集量为0.5～3mL即可进行检测，与用血液作为检测样本相比具有收集过程方便快捷，收集量小，对被测者无创、无痛并且短期内能反复检测的优点。唾液中的核连蛋白2含量与人体疲劳程度呈正相关，本发明对唾液中的核连蛋白2的最低检出量为5ng/ml，具有检出量低，检测方法灵敏准确的优点。唾液收集时先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后收集唾液，这大幅度减少了唾液中其他杂质对检测结果的干扰，此收集方法优于刷牙等其它收集方式。
本发明利用磷酸缓冲液预处理唾液样本，维持了唾液样本的稳定性，有利于后续的检测。人体唾液中的有机物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等，无机物有钠、钾、钙、氯和硫氰离子等，pH值为6～7，粘度比水大18～35倍。唾液与磷酸缓冲液体积比为2:1～7时，磷酸缓冲液不仅能起到缓冲作用，而且磷酸缓冲液环境更接近于体内环境，减小了对唾液中活性物质的损害，使唾液中各物质维持在正常有活力的状态，使后续检测结果更精确可靠。
本发明制备的胶体金颗粒粒径为20～40nm，颗粒大小均一，分散单一，使得核连蛋白2单克隆抗体在胶体金溶液中能分布均匀，并且提高了制备得到的金标垫与唾液待测液中的核连蛋白2的特异性结合，避免了唾液中其他物质与金标垫的非特异性结合而导致的假阳性结果，进而提高了检测结果的可靠性。
本发明提供的复溶液、划膜液与样品垫预处理液配方，使疲劳检测试纸能够满足产品设计的性能指标要求，保证结果的准确性。复溶液的配方能防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，对核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的结合过程起到了很好的保护作用，维持了胶体金溶液的稳定性；划膜液作为核连蛋白2单克隆抗体与羊抗鼠IgG多克隆抗体的稀释液，用于检测线与质控线的制备过程，划膜液中的BSA与聚乙二醇20000作为稳定剂保证了两种抗体的生物活性，使抗体能够迅速的捕捉到层析过程中的胶体金复合物，保证了检测试纸的灵敏度，进而提高了结果的准确性；样品垫由预处理液浸泡后干燥得到，预处理液的配方解决了唾液样本粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素的问题；此外，复溶液与划膜液中含有一定量的叠氮钠，叠氮钠有一定的防腐作用，可防止细菌增生，对抗体活性的维持起到促进作用，延长了试纸条的有效期。
本发明疲劳状态检测试纸试纸不仅能区分人体疲劳轻重程度，还能判断重度疲劳等级。当唾液中的核连蛋白2含量大于零小于300ng/ml时，一般定义为轻度疲劳；当唾液中的核连蛋白2含量大于300ng/ml时，为重度疲劳。检测高浓度唾液待测液时，疲劳状态检测试纸上若只显示质控线时，为轻度疲劳；同时显示检测线和质控线时，为重度疲劳；当质控线未显示时，为无效结果。检测结果为重度疲劳时，再检测低浓度的唾液待测液，如果只显示质控线，则为重度疲劳Ⅰ级，如果同时显示检测线和质控线，则为重度疲劳Ⅱ级，当质控线未显示时，为无效结果。
本发明疲劳状态检测试纸各部分分布合理，保证了结果的直观性与准确性。疲劳状态检测试纸从左到右依次为底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸样垫。将唾液待测液滴加到样品垫上，唾液中的核连蛋白2会通过毛细作用从样品垫到达金标垫，在金标垫上与核连蛋白2单克隆抗体结合，形成胶体金颗粒复合物，在移动到反应垫4上后进行层析，会在检测线与质控线处形成肉眼可见的红色沉淀线。
本发明检测过程只需将待测唾液样本滴加到试纸上，5～15min后根据显色结果即可判断疲劳状态，检测人员无需具有专业技能，对检测场所和设备要求也较低，可以在被检测者的工作现场进行检测，具有操作步骤简便、检测成本低、过程耗时短等优点。
附图说明
图1是本发明疲劳状态检测试纸结构示意图；
其中，1-底板，2-样品垫，3-金标垫，4-反应垫，5-吸样垫，6-检测线，7-质控线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，如图1所示:
A.按(7.5～8.5cm)×(0.3～0.5cm)裁剪PVC板，得到底板1；按(2.5～3.5cm)×(0.3～0.5cm)裁剪玻璃纤维膜，得到样品垫2；
B.金标垫3的制备步骤如下：
a.将浓度为8～10mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾10～15分钟后，迅速加入5～6mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:45～50，再次沸腾后，超声处理5～8分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，得到胶体金溶液，4℃条件下避光保存；
c.按如下配方配制复溶液：0.1～0.3mol/L的Tris、10～25g/L的BSA、4～8g/L的海藻糖、5～10g/L的蔗糖、2～5g/L的Tween-20、5～10g/L的聚乙二醇20000、3～8g/L的氯化钠和0.2～0.5g/L的叠氮钠，pH值为7.0～8.0；
d.在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为10～25μg/ml，静置15～30分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.3～0.5倍；
e.将步骤d中复溶后的液体喷涂于聚酯膜上，38～40℃下烘干10～20h，按(2.7～3.6cm)×(0.3～0.5cm)进行裁剪，得到金标垫3，4℃条件下避光保存备用。
C.反应垫4的制备步骤如下：
a.按如下配方配制划膜液：10～15g/L的蔗糖、0.2～0.3mol/L的Tris、2～2.5g/L的BSA、1.5～2.0g/L的聚乙二醇20000、0.2～0.5g/L的叠氮钠,pH值为7.0～8.0；
b.将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至2～3mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至1.5～2.0mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.0～1.5μL/cm，喷嘴1与2间隔6～8mm；调试完成后，在硝酸纤维膜上划膜包被，形成检测线6和质控线7,38～40℃，烘干10～20h；检验合格后，室温存放备用；
c.按(2.0～2.5cm)×(0.3～0.5cm)裁剪硝酸纤维膜得到反应垫4。
D.吸样垫5的制备步骤如下：
a.按如下配方配制预处理液：1～5g/L的曲拉通X-100、3.5～5.0g/L的海藻酸钠、2.5～4.5g/L的氯化钾、5～8g/L的抗坏血酸、1.5～2.0g/L的α淀粉酶、1.0～1.5g/L的β环糊精、0.3～1.0g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～0.3mol/L的Tris，pH值为8.0～8.5,3～6℃避光保持备用；
b.将预处理液喷涂于吸水试纸上，38～40℃，烘干4.5～6h，按(3.5～4.0cm)×(0.3～0.5cm)裁剪吸水试纸，得到吸样垫5；
E.在干燥室内，温度为20～25℃，湿度小于30％，将样品垫2(玻璃纤维膜)、金标垫3(聚酯膜)、反应垫4(硝酸纤维膜)以及吸样垫5(吸水试纸)粘贴在底板1上，其中反应垫4位于底板1的中部，反应垫1靠近质控线的一端与吸样垫的1/6～1/10搭接，反应垫靠近检测线的一端与金标垫的1/4～1/3搭接，吸样垫的1/4～1/3与金标垫的另一端搭接，最后切成宽度为2.5～3.0mm的试纸条，即制得疲劳状态检测试纸，也可将试纸条装入一个卡套中制成检测卡。
本发明在使用时，使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为0.5～3mL。
配制高浓度与低浓度的唾液待测液，高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的1.5～3倍，其中磷酸缓冲液中含10～20mmol/L的磷酸氢二钠、1～5mmol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.2mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为7.0～8.0。
取1～2mL高浓度唾液待测液，滴加到试纸条的样品垫2上，5～15min观察结果。当疲劳状态检测试纸上只显示质控线7时，为轻度疲劳；当同时显示检测线6和质控线7时，为重度疲劳；当质控线7未显示时，为无效结果；如果为轻度疲劳，则无需配置低浓度唾液待测液；结果为重度疲劳时，再将低浓度的唾液待测液加至疲劳状态检测试纸上，如果只显示质控线，则为重度疲劳Ⅰ级，如果同时显示检测线和质控线，则为重度疲劳Ⅱ级，当质控线未显示时，为无效结果。
实施例1
A.按7.5cm×0.3cm裁剪PVC板，得到底板1；按2.5cm×0.3cm裁剪玻璃纤维膜，得到样品垫2；
B.金标垫3的制备步骤如下：
a.将浓度为8mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾15分钟后，迅速加入5mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:45，再次沸腾后，超声处理8分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，得到胶体金溶液，4℃条件下避光保存；
c.按如下配方配制复溶液：0.1mol/L的Tris、10g/L的BSA、4g/L的海藻糖、5g/L的蔗糖、2g/L的Tween-20、5g/L的聚乙二醇20000、3g/L的氯化钠和0.2g/L的叠氮钠，pH值为7.0；
d.在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为10μg/ml，静置30分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.3倍；
e.将步骤d中复溶后的液体喷涂于聚酯膜上，40℃下烘干20h，按2.7cm×0.3cm进行裁剪，得到金标垫3，4℃条件下避光保存备用。
C.反应垫4的制备步骤如下：
a.按如下配方配制划膜液：10g/L的蔗糖、0.2mol/L的Tris、2g/L的BSA、1.5g/L的聚乙二醇20000、0.2g/L的叠氮钠,pH值为7.0；
b.将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至2mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至1.5mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.0μL/cm，喷嘴1与2间隔6mm；调试完成后，在硝酸纤维膜上划膜包被，形成检测线6和质控线7,40℃，烘干20h；检验合格后，室温存放备用；
c.按2.0cm×0.3cm裁剪硝酸纤维膜得到反应垫4。
D.吸样垫5的制备步骤如下：
a.按如下配方配制预处理液：1g/L的曲拉通X-100、3.5g/L的海藻酸钠、2.5g/L的氯化钾、5/L的抗坏血酸、1.5g/L的α淀粉酶、1.0g/L的β环糊精、0.3g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.2mol/L的Tris，pH值为8.0,6℃避光保持备用；
b.将预处理液喷涂于吸水试纸上，40℃，烘干6h，按3.5cm×0.3cm裁剪吸水试纸，得到吸样垫5；
E.在干燥室内，温度为25℃，湿度小于30％，将样品垫2(玻璃纤维膜)、金标垫3(聚酯膜)、反应垫4(硝酸纤维膜)以及吸样垫5(吸水试纸)粘贴在底板1上，其中反应垫4位于底板1的中部，反应垫1靠近质控线的一端与吸样垫的1/10搭接，反应垫靠近检测线的一端与金标垫的1/4搭接，吸样垫的1/4与金标垫的另一端搭接，最后切成宽度为2.5mm的试纸条，即制得疲劳状态检测试纸，也可将试纸条装入一个卡套中制成检测卡。
选择三名受试人，使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为3mL。
配制高浓度与低浓度的唾液待测液，高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的1.5倍，其中磷酸缓冲液中含10mmol/L的磷酸氢二钠、1mmol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为7.0。
取1mL高浓度唾液待测液，滴加到试纸条的样品垫2上，15min后观察结果，结果如下表所示，其中“高”为高浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果，“低”为低浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果：
表1
| 受试人 | 高 | 低 | 疲劳级别 |
| 1号 | 质控线 | / | 轻度疲劳 |
| 2号 | 质控线、检测线 | 质控线 | 重度疲劳Ⅰ级 |
| 3号 | 质控线 | / | 轻度疲劳 |
实施例2
A.按8.5cm×0.5cm裁剪PVC板，得到底板1；按3.5cm×0.5cm裁剪玻璃纤维膜，得到样品垫2；
B.金标垫3的制备步骤如下：
a.将浓度为10mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾10分钟后，迅速加入6mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:50，再次沸腾后，超声处理5分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，得到胶体金溶液，4℃条件下避光保存；
c.按如下配方配制复溶液：0.3mol/L的Tris、25g/L的BSA、8g/L的海藻糖、10g/L的蔗糖、5g/L的Tween-20、10g/L的聚乙二醇20000、8g/L的氯化钠和0.5g/L的叠氮钠，pH值为8.0；
d.在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为25μg/ml，静置15分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.5倍；
e.将步骤d中复溶后的液体喷涂于聚酯膜上，38℃下烘干10h，按3.6cm×0.5cm进行裁剪，得到金标垫3，4℃条件下避光保存备用。
C.反应垫4的制备步骤如下：
a.按如下配方配制划膜液：15g/L的蔗糖、0.3mol/L的Tris、2.5g/L的BSA、2.0g/L的聚乙二醇20000、0.5g/L的叠氮钠,pH值为8.0；
b.将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至3mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至2.0mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.5μL/cm，喷嘴1与2间隔8mm；调试完成后，在硝酸纤维膜上划膜包被，形成检测线6和质控线7,38℃，烘干10h；检验合格后，室温存放备用；
c.按2.5cm×0.5cm裁剪硝酸纤维膜得到反应垫4。
D.吸样垫5的制备步骤如下：
a.按如下配方配制预处理液：5g/L的曲拉通X-100、5.0g/L的海藻酸钠、4.5g/L的氯化钾、8g/L的抗坏血酸、2.0g/L的α淀粉酶、1.5g/L的β环糊精、1.0g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.3mol/L的Tris，pH值为8.5,3℃避光保持备用；
b.将预处理液喷涂于吸水试纸上，38℃，烘干4.5h，按4.0cm×0.5cm裁剪吸水试纸，得到吸样垫5；
E.在干燥室内，温度为20℃，湿度小于30％，将样品垫2(玻璃纤维膜)、金标垫3(聚酯膜)、反应垫4(硝酸纤维膜)以及吸样垫5(吸水试纸)粘贴在底板1上，其中反应垫4位于底板1的中部，反应垫1靠近质控线的一端与吸样垫的1/6搭接，反应垫靠近检测线的一端与金标垫的1/3搭接，吸样垫的1/3与金标垫的另一端搭接，最后切成宽度为3.0mm的试纸条，即制得疲劳状态检测试纸，也可将试纸条装入一个卡套中制成检测卡。
选择三名受试人，使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为2.5mL。
配制高浓度与低浓度的唾液待测液，高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的3倍，其中磷酸缓冲液中含20mmol/L的磷酸氢二钠、5mmol/L的磷酸二氢钾和0.2mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为8.0。
取2mL高浓度唾液待测液，滴加到试纸条的样品垫2上，5min后观察结果，结果如下表所示，其中“高”为高浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果，“低”为低浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果：
表2
| 受试人 | 高 | 低 | 疲劳级别 |
| 4号 | 质控线、检测线 | 质控线、检测线 | 重度疲劳Ⅱ级 |
| 5号 | 质控线 | / | 轻度疲劳 |
| 6号 | 质控线、检测线 | 质控线 | 重度疲劳Ⅰ级 |
实施例3
A.按8.0cm×0.4cm裁剪PVC板，得到底板1；按3.0cm×0.4cm裁剪玻璃纤维膜，得到样品垫2；
B.金标垫3的制备步骤如下：
a.将浓度为9mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾13分钟后，迅速加入5.5mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:48，再次沸腾后，超声处理7分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，得到胶体金溶液，4℃条件下避光保存；
c.按如下配方配制复溶液：0.2mol/L的Tris、18g/L的BSA、6g/L的海藻糖、7g/L的蔗糖、3.5g/L的Tween-20、7g/L的聚乙二醇20000、6g/L的氯化钠和0.4g/L的叠氮钠，pH值为7.5；
d.在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为18μg/ml，静置23分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.4倍；
e.将步骤d中复溶后的液体喷涂于聚酯膜上，39℃下烘干15h，按3.2cm×0.4cm进行裁剪，得到金标垫3，4℃条件下避光保存备用。
C.反应垫4的制备步骤如下：
a.按如下配方配制划膜液：13g/L的蔗糖、0.25mol/L的Tris、2.3g/L的BSA、1.8g/L的聚乙二醇20000、0.35g/L的叠氮钠,pH值为7.5；
b.将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至2.5mg/mL，将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至1.8mg/mL，然后分别加入到划膜喷金仪的T杯和C杯中；调试划膜喷金仪，喷液量设定为1.3μL/cm，喷嘴1与2间隔7mm；调试完成后，在硝酸纤维膜上划膜包被，形成检测线6和质控线7,39℃，烘干15h；检验合格后，室温存放备用；
c.按2.3cm×0.4cm裁剪硝酸纤维膜得到反应垫4。
D.吸样垫5的制备步骤如下：
a.按如下配方配制预处理液：3g/L的曲拉通X-100、4g/L的海藻酸钠、3.5g/L的氯化钾、6g/L的抗坏血酸、1.8g/L的α淀粉酶、1.3g/L的β环糊精、0.7g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.25mol/L的Tris，pH值为8.2,4℃避光保持备用；
b.将预处理液喷涂于吸水试纸上，39℃，烘干5h，按3.8cm×0.4cm裁剪吸水试纸，得到吸样垫5；
E.在干燥室内，温度为23℃，湿度小于30％，将样品垫2(玻璃纤维膜)、金标垫3(聚酯膜)、反应垫4(硝酸纤维膜)以及吸样垫5(吸水试纸)粘贴在底板1上，其中反应垫4位于底板1的中部，反应垫1靠近质控线的一端与吸样垫的1/8搭接，反应垫靠近检测线的一端与金标垫的1/4搭接，吸样垫的1/3与金标垫的另一端搭接，最后切成宽度为2.8mm的试纸条，即制得疲劳状态检测试纸，也可将试纸条装入一个卡套中制成检测卡。
选择3名受试人，使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为1.5mL。
配制高浓度与低浓度的唾液待测液，高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的2倍，其中磷酸缓冲液中含15mmol/L的磷酸氢二钠、3mmol/L的磷酸二氢钾和0.15mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为7.5。
取1mL高浓度唾液待测液，滴加到试纸条的样品垫2上，13min观察结果，结果如下表所示，其中“高”为高浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果，“低”为低浓度唾液待测液检测疲劳试纸条显示结果：
表3
| 受试人 | 高 | 低 | 疲劳级别 |
| 7号 | 质控线 | / | 轻度疲劳 |
| 8号 | 质控线 | / | 轻度疲劳 |
| 9号 | 质控线、检测线 | 质控线 | 重度疲劳Ⅰ级 |
对照试验
为验证本发明检测结果的准确性，详细说明本发明的优点，将实施例1～3中收集到的唾液进行核连蛋白2含量的测定，核连蛋白-2含量的测定按如下方法进行：
A.将唾液进行离心处理得到上清液Ⅰ，离心处理的转速为5000rpm，离心处理时间为10分钟，向上清液Ⅰ中滴入质量分数为0.2％的DTT和质量分数为15％的TCA丙酮溶液后，在冷冻温度为-20℃的冰箱内冷冻10h，得到冷冻液；
B.将冷冻液进行离心处理，离心处理的转速为12000rpm，离心处理时间为10分钟，取下后，将下层液再次放入冷冻温度为-80℃的冰箱内冷冻1.5h，得到蛋白干粉；
C.将蛋白干粉溶于水化液中并离心处理，离心处理的转速为5000rpm，离心处理时间为10秒，得上清液Ⅱ；将上清液Ⅱ与碳酸氢铵溶液混合，并转移至3K的超滤管中进行离心处理，离心处理的转速为5000rpm，离心处理时间为2min，重复两次；将离心处理后向得到的上清液中加入胰酶，控制温度为37℃，消化酶解8小时；
D.利用体外标记法进行TMT试剂标记酶解后的溶液，并将标记后的溶液采用高通量的液相-质谱联用分析，可以得到唾液样品的液相-质谱图，并计算出核连蛋白-2的含量，结果如下表所示，其中“蛋白含量”为核连蛋白2的在唾液中的含量：
表4
| 受试人 | 蛋白含量(ng/ml) | 对照疲劳级别 | 实施例疲劳级别 |
| 1号 | 5 | 轻度疲劳 | 轻度疲劳 |
| 7号 | 56 | 轻度疲劳 | 轻度疲劳 |
| 5号 | 186 | 轻度疲劳 | 轻度疲劳 |
| 3号 | 215 | 轻度疲劳 | 轻度疲劳 |
| 8号 | 264 | 轻度疲劳 | 轻度疲劳 |
| 6号 | 346 | 重度疲劳 | 重度疲劳Ⅰ级 |
| 2号 | 375 | 重度疲劳 | 重度疲劳Ⅰ级 |
| 9号 | 435 | 重度疲劳 | 重度疲劳Ⅰ级 |
| 4号 | 587 | 重度疲劳 | 重度疲劳Ⅱ级 |
由上表可以看出利用本发明检测疲劳状态结果与对照实验结果基本吻合，当唾液中的核连蛋白2含量大于零小于300ng/ml时，为轻度疲劳；当唾液中的核连蛋白2含量大于300ng/ml时，为重度疲劳，随着核连蛋白2含量的增加，重度疲劳级别由Ⅰ级升为Ⅱ级，说明本发明检测人体疲劳状态的方法结果准确可靠；本发明在核连蛋白2含量低至5ng/ml时仍有较直观的结果，说明本发明检测人体疲劳状态的方法具有检出量低、灵敏度高的优点；利用本发明检测人体疲劳状态只需收集唾液，然后滴加到疲劳状态试纸条上，5～15min即能得到结果，与检测唾液中核连蛋白2含量相比具有耗时短、检测过程简便的优点；另外，本发明对受试者无创、无痛，对检测场所无要求，检测人员也无需具备专业知识。
Claims (1)
1.一种检测人体疲劳状态的方法，其特征在于：先用疲劳状态检测试纸检测高浓度的唾液待测液，如果疲劳状态检测试纸显示为重度疲劳，再在疲劳状态检测试纸上用低浓度的唾液待测液检测重度疲劳级别；
具体包括如下步骤：
A.将收集到的人体唾液与磷酸缓冲液混合,配制成高浓度的唾液待测液和低浓度的唾液待测液；
B.将高浓度的唾液待测液加至疲劳状态检测试纸上，静置5～15分钟；
C.当疲劳状态检测试纸上只显示质控线（7）时，为轻度疲劳；当同时显示检测线（6）和质控线（7）时，为重度疲劳；当质控线（7）未显示时，为无效结果；
D.当步骤C同时显示检测线和质控线时，将低浓度的唾液待测液加至疲劳状态检测试纸上，如果只显示质控线，则为重度疲劳Ⅰ级，如果同时显示检测线和质控线，则为重度疲劳Ⅱ级，当质控线未显示时，为无效结果；
所述高浓度的唾液待测液为人体唾液与磷酸缓冲液按体积比2:1混合，高浓度的唾液待测液浓度是低浓度的唾液待测液浓度的1.5～3倍，所述磷酸缓冲液中含10～20mmol/L的磷酸氢二钠、1～5mmol/L的磷酸二氢钾和0.1～0.2mol/L的氯化钠，磷酸缓冲液的pH值为7.0～8.0；
疲劳状态检测试纸包括底板（1）、样品垫（2）、金标垫（3）、反应垫（4）和吸样垫（5），金标垫（3）上含有核连蛋白2单克隆抗体标记的免疫胶体金，反应垫上有检测线（6）和质控线（7），检测线（6）上含有核连蛋白2单克隆抗体，质控线（7）上含有羊抗鼠IgG多克隆抗体；
核连蛋白2单克隆抗体标记的免疫胶体金溶液的制备方法为：在搅拌状态下，向胶体金溶液中缓慢加入核连蛋白2单克隆抗体溶液，核连蛋白2单克隆抗体与胶体金溶液的质量体积比为10～25μg/ml，静置15～30分钟后离心，将沉淀物用复溶液复溶，复溶液的体积是胶体金溶液体积的0.3～0.5倍；
复溶液中含有0.1～0.3mol/L的Tris、10～25g/L的BSA、4～8g/L的海藻糖、5～10g/L的蔗糖、2～5g/L的Tween-20、5～10g/L的聚乙二醇20000、3～8g/L的氯化钠和0.2～0.5g/L的叠氮钠，pH值为7 .0～8.0；
检测线（6）是将核连蛋白2单克隆抗体用划膜液稀释至2～3mg/mL后喷涂干燥得到，质控线（7）是将羊抗鼠IgG多克隆抗体用划膜液稀释至1.5～2.0mg/mL后喷涂干燥得到；
所述划膜液中含有10～15g/L的蔗糖、0.2～0.3mol/L的Tris、2～2.5g/L的BSA、1.5～2.0g/L的聚乙二醇20000、0.2～0.5g/L的叠氮钠, 划膜液的pH值为7.0～8.0；
样品垫是由预处理液浸泡后干燥得到，所述预处理液含有1～5g/L的曲拉通X-100、3.5～5.0g/L的海藻酸钠、2.5～4.5g/L的氯化钾、5～8g/L的抗坏血酸、1.5～2.0g/L的α淀粉酶、1.0～1.5g/L的β环糊精、0.3～1.0g/L的聚乙烯吡咯烷酮、0.2～0.3mol/L的Tris，预处理液的pH值为8.0～8.5；
人体唾液的收集过程为：使受试人先用生理盐水漱口三次，再用清水漱口三次，然后做咀嚼运动或舌尖上翘，使唾液在下颌部聚集，通过下唇收缩，使唾液顺着下唇形成的通道流入唾液收集管中，唾液收集量为0.5～3mL；
胶体金溶液的制备方法包括如下步骤：
a.将浓度为8～10mmol/L的氯金酸溶液搅拌状态下加热，沸腾10～15分钟后，迅速加入5～6mol/L的柠檬酸三钠溶液并搅拌，柠檬酸三钠溶液与氯金酸溶液的体积比为1:45～50，再次沸腾后，超声处理5～8分钟；
b.将a步骤所得溶液再次加热至沸腾后，在搅拌状态下缓慢加入与a步骤中相同体积和浓度的氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液，至溶液颜色变成深红色后停止加热，4℃条件下避光保存。
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