CN204925132U - 用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开一种用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，包括有一试卡本体及一设置于该试卡本体内的植入单元。该试卡本体包括一内槽及与该内槽相对应接合的一基底层及一载体层，该载体层上设置有相间隔的一检体垫片、一与该检体垫片相邻接的金标结合垫片、一吸收垫片及一连接在该金标结合垫片与该吸收垫片间的分析薄膜，该分析薄膜上依序形成相间隔的一测试线区及一控制线区。该植入单元包括一分布于该金标结合垫片的抗蛇毒金标抗体、多个分别固定于该测试线区的抗蛇毒抗体，及固定于该控制线区的第二抗体。借由本实用新型的蛇毒试片装置可供医护人员快速决定可中和受中伤蛇毒的适用抗毒蛇血清，于短时间内进行有效治疗。
Description
技术领域
本实用新型关于一种蛇毒检验试片，特别是指一种能快速且有效地检测出人体血清中是否含有特定蛇毒的快速检验试片，供第一线医护人员选用适当抗蛇毒血清加以治疗。
背景技术
目前，毒蛇咬伤发生率及死亡率最高的地区，仍在于南亚、东南亚等热带地区，在该些地区毒蛇咬伤往往容易造成死亡及失能，先前的医疗观念主张遭遇毒蛇咬伤的患者，医师会尝试要求该患者去辨识是哪一只毒蛇所咬伤，或希望病患或家属将毒蛇带来医院辨识，指认正确的毒蛇种类。但毒蛇的外貌相当多变复杂，若要求病人活捉及打死毒蛇则很有可能造成旁人和患者的生命危险；再加上依照患者主观描述毒蛇的外貌仍有判断错误的风险，进而导致使用错误的治疗方法。
台湾眼镜蛇(Najaatra)属于亚洲种，是重要的毒蛇之一。根据统计，眼镜蛇咬伤事件占全台湾毒蛇咬伤事件的10%。在中部地区，被眼镜蛇的咬伤频率与赤尾鲐（Trimeresurusstejnegeri）或龟壳花（Protobothropsmucrosquamatus）的咬伤频率相当。受到眼镜蛇咬伤时，临床症状主要出现局部组织红肿、发炎反应后的组织坏死及少见的神经毒性等症状。由于眼镜蛇咬伤初期，常因明显的组织红、肿及缺少典型的神经症状，因此常被误认为是赤尾鲐、龟壳花等毒蛇咬伤，而延迟给予正确且专一的抗血清的时机，延误诊断的结果，造成病人肢体局部伤口皮肤严重的坏死、溃烂，严重者需要做外科清创及皮肤移植手术，而毒蛇咬伤的适当处置安排，仰赖于医师的临床诊断经验。再者，由于许多病患可能是被非毒蛇咬伤，然而在缺乏明确的症状出现之前，需要观察至少24小时，这样的现象不仅浪费医疗资源也耗费相当多的人力成本。而真正被毒蛇咬伤的患者，却因为早期诊断工具的缺乏，无法及时判别毒蛇种类及蛇咬伤的严重性，导致未能及时使用抗蛇毒血清而造成更严重的临床症状，甚至产生不可逆的组织损伤。
根据林奈氏生物分类法(Linnaeantaxonomy)，眼镜蛇属(Naja)分类在蝙蝠蛇科(Elapidae)下，目前约有20多个物种已确认并归类在眼镜蛇属。此属的成员主要分布于中东、东南亚、非洲、印度大陆等地。过去研究发现，眼镜蛇属的主要蛇毒成分与其他属的蛇毒组成具有相似的蛇毒蛋白(cobrotoxins)，差别在于浓度与含量的不同(Chang,etal.,2000;Joubert&Taljaard,1980;Wei,etal.,2003)；NPAV(NeuroPolyvalentSnakeAntivenom)抗蛇毒血清对于大部分眼镜蛇属的蛇毒具有不同程度的中和效果(Leongetal.,2012)，即使同属于蝙蝠蛇科的不同蛇种，其蛇毒组成成份虽有差异，却仍具有相似之处。
同样地，蛇毒的差异性极其微细且种类繁多，蛇毒检测的应用上仍存在难度需要克服，例如：样本体积必须要多、要新鲜，取样必须接近伤口，其检测灵敏度亦较低，在临床的使用上有许多的限制。
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，在于提供紧急时刻，可以协助医护人员快速且正确的选用适当抗蛇毒血清加以治疗，于短时间内进行有效治疗。
本实用新型提供一种用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，包括：
一试卡本体，包括一内槽及与该内槽相对应接合的一基底层及一载体层，该载体层上设置有相间隔的一检体垫片、一与该检体垫片相邻接的金标结合垫片、一吸收垫片及一连接在该金标结合垫片与该吸收垫片之间的分析薄膜，该分析薄膜上依序形成相间隔的一测试线区及一控制线区，该测试线区包括多个抗蛇毒血清测试线；以及多个植入单元，包括一分布于该金标结合垫片的抗蛇毒金标抗体，及多个分别固定于该测试线区的与蛇毒蛋白具有特异性结合的抗蛇毒抗体，及固定于该控制线区的与该抗蛇毒金标抗体结合的第二抗体。
其中该固定于该测试线区的抗蛇毒抗体由分别与抗同属的不同种蛇毒蛋白具有特异性结合的抗体组成。
其中该固定于该测试线区的抗蛇毒抗体进一步包括与抗不同属的蛇毒蛋白具有特异性结合的抗体。
其中该植入单元包含5-100ng/ml的抗蛇毒抗体。
其中该分布于该金标结合垫片的抗蛇毒金标抗体包含由不同抗蛇种蛇毒的抗体组成的抗体混和物。
本实用新型具有的优点在于：
本实用新型只需要将检体滴入该试卡本体的载体层的检体垫片上，利用侧流免疫层析技术(lateral-flowimmunochromatographicassaytechnique,LFA)通过流体自然的毛细作用，该检体往该金标结合垫片移动，并与该金标结合垫片内的抗蛇毒金标抗体相互作用，再继续沿该分析薄膜移动至该测试线区与该控制线区，分别与该蛇毒蛋白具有特异性结合的抗蛇毒抗体及该抗蛇毒金标抗体结合的第二抗体相互作用，产生红色指示线，就能分别借由判读该控制线区是否呈色判读该检验试片是否有效，及借由判读该测试线区呈色结果判读该检体是否含有蛇毒及其蛇种，借此，使本实用新型能快速且有效地检验出生物检体中是否含有特定的蛇毒，以实时进行治疗。
本实用新型的特点在于，该测试线区可能出现一道或多道的红色指示线，表示医护人员可依照红色指示线，选用任一种抗蛇毒血清加以治疗，亦即通过本实用新型可以协助第一线救护人员选用有效的抗蛇毒血清。
附图说明
图1是一不完整的正视示意图，说明现有的一蛇毒快速检验试片一较佳实施例的一试卡本体的一载体层的配置型式；
图2是一不完整的侧视示意图，说明该较佳实施例的试卡本体由一基底层与该载体层相对应接合的情形；
图3是一蛇毒试片装置其较佳实施例的立体示意图；
图4是一侧视的使用示意图，说明将含有非眼镜蛇科蛇毒的检体滴加到该较佳实施例的试卡本体的检体垫片上的情形；
图5一侧视的使用示意图，说明将含有眼镜蛇科蛇毒的检体滴加到该较佳实施例的试卡本体的检体垫片上的情形；
图6是该蛇毒试片装置其较佳实施例的正视示意图；
图7是一使用示意图，说明以该较佳实施例的试卡本体测试该检体后呈现二道红色指示线时的显示结果。
图中：
10检体；
100非眼镜蛇毒；
101眼镜蛇毒；
2蛇毒试片装置；
3试卡本体；
31基底层；
32载体层；
321检体垫片；
322吸收垫片；
323金标结合垫片；
324分析薄膜；
325测试线区；
3251测试线；
3252测试线；
3253测试线；
3254测试线；
326控制线区；
4植入单元；
41抗蛇毒金标抗体；
410金标抗体-眼镜蛇蛇毒蛋白结合体；
411兔抗Najaatra蛇毒抗体；
412奈米金颗粒；
42抗蛇毒抗体；
43抗蛇毒抗体；
44抗蛇毒抗体；
45抗蛇毒抗体；
46羊抗兔抗体；
43兔抗Najaatra抗体；
5卡匣；
51壳体；
511第一标记；
512第二标记；
513第三标记；
514第四标记；
515第五标记；
52加样区；
53判读窗口。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。
参阅图1、图3与图5，本实用新型用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置2的较佳实施例是用以检测一生物检体10中的眼镜蛇毒101，在该实施例中是以该蛇毒试片装置2侦测该生物检体10中的蛇毒，该蛇毒试片装置2包含一试卡本体3、一设置于该试卡本体3的植入单元4，及一围绕该试卡本体3设置的卡匣5。
参阅图1与图2，该试卡本体3包括相对应接合的一基底层(Backing)31及一载体层32，该载体层32具有相间隔设置的一检体垫片(Samplepad)321、一吸收垫片(Absorbentpad)322、一与该检体垫片321相邻接的金标结合垫片(Conjugatedreleasepad)323，及一连接在该金标结合垫片323与该吸收垫片322之间的分析薄膜324，在该分析薄膜324上并依序形成相间隔设置的一测试线区325及一控制线区326，在该测试区325上依序形成一测试线3251、一测试线3252、一测试线3253及一测试线3254。
其中，该检体垫片321、吸收垫片322及金标结合垫片323均是由玻璃纤维材质所制成。且该分析薄膜324属于硝化纤维膜(cellulosenitratemembrane，简称为NC膜)。
参阅图4与图5，该植入单元4包括多个分布在该试卡本体3的金标结合垫片323内的抗蛇毒金标抗体41、多个固定在该试卡本体3的分析薄膜324的控制线区326，用以与该等金标抗体41相结合呈色的第二抗体46、及多个分别固定在该分析薄膜324测试线区325的测试线3251、测试线3252、测试线3253及测试线3254，用以与结合有蛇毒101的金标抗体41相结合呈色的抗蛇毒抗体42、抗蛇毒抗体43、抗蛇毒抗体44及抗蛇毒抗体45。
其中，该多个抗蛇毒金标抗体41实质上为兔抗Naja蛇毒(Rabbitanti-NajaIgG)的金标抗体，且是使用多个兔抗Naja蛇毒抗体411分别与一胶体金溶液中的多个奈米金颗粒412相结合而制成。为了使呈色优化，并可推广应用至东南亚地区，通过试片上奈米金颗粒与不同比例的兔抗蛇毒抗体混合如表1。该等第二抗体46实质上为羊抗兔抗体(Goatanti-rabbitIgG)、该多个抗蛇毒抗体42实质上为兔抗Najasiamensis抗体(Rabbitanti-NajasiamensisIgG)、该等多个蛇毒抗体43实质上为兔抗Najanaja抗体(Rabbitanti-NajanajaIgG)、该多个抗蛇毒抗体44实质上为兔抗Najakaouthia抗体(Rabbitanti-NajakaouthiaIgG)及该多个抗蛇毒抗体45实质上为兔抗Najaatra抗体(Rabbitanti-NajaatraIgG)。
表1：
| 眼镜蛇属蛇毒种类 | 奈米金颗粒含量百分比(%) |
| Naja atra | 50-80 |
| Naja kaouthia | 20-50 |
参阅图3，该卡匣5具有一包覆在该试卡本体3外的壳体51、一对应该载体层32的检体垫片321贯穿形成于该壳体51的加样区52，及一对应该分析薄膜324的控制线区326与测试线区325贯穿形成于该壳体51的判读窗口53。在此以T表示该测试线区325，并以C表示该控制线区326。在该实施例中，该判读窗口53旁的壳体51外表设置对齐该测试线区325的一第一标记511、一第二标记512、一第三标记513及一第四标记514，设置对齐该控制线区326的一第五标记515，以分别通过该等标记快速地判读呈色反应是发生在该测试线区325及该控制线区326的情形。
参阅图3、图4与图5，检验时，将从疑似被眼镜蛇咬伤的患者所取得的生物检体10通过该加样区52滴加至该检体垫片321，该检体10流动通过该金标结合垫片323，并沿着该分析薄膜324往该吸收垫片322方向流动，流动过程中，检体10内若含有非眼镜蛇科蛇毒100(见图4)，则该金标结合垫片323中的金标抗体41无法辨识并结合检体10中属于非眼镜蛇蛇毒蛋白的特异性分子，流动直接经过该测试区325，经再借由固定于该控制线区326的第二抗体46与该金标抗体进行结合后呈色的机制，判别检体10中是否为含有非眼镜蛇属蛇毒，进而达到检验鉴定的功效，救护人员可采取其他非眼镜蛇科的抗蛇毒血清予以救护。
检验时，将从疑似被眼镜蛇咬伤的患者所取得的生物检体10通过该加样区52滴加至该检体垫片321，该检体10流动通过该金标结合垫片323，并沿着该分析薄膜324往该吸收垫片322方向流动，流动过程中，检体10内若含有眼镜蛇科蛇毒101(见图5)，则该金标结合垫片323中的金标抗体41可辨识并结合检体10中属于眼镜蛇蛇毒蛋白的特异性分子，流动经过该测试区325时，经再借由蛇毒具有特异性的双抗体法，固定于该测试线区325的抗体42、抗体43、抗体44及抗体45与该金标抗体进行结合后呈色的机制，若于该测试线区325出现一条或多条的红色指示线，医护人员可依照红色指示线的任一种，选用该种抗蛇毒血清即可予以治疗，而达到检验鉴定的功效。其中，当该生物检体10中的蛇毒浓度大于等于5ng/ml时，即能利用发生在该测试线区325且容易为肉眼所观察到的呈色反应判别该生物检体10内含有的蛇毒是否为眼镜蛇属。
该等金标抗体41中的兔抗眼镜蛇蛇毒(Rabbitanti-NajaatraIgG)的抗体及固定于该测试线区325的抗体42、抗体43、抗体44及抗体45是取自抗台湾眼镜蛇蛇毒的多株兔血清。注射不同比例混合的蛇毒液至健康纽西兰大白兔体内，经5次免疫后，采集兔子血清。血清中的多株抗体使用ProteinASepharose4B(ZymedLaboratories,Inc.,USA)亲合性管柱纯化，透析隔夜之后调整浓度至1mg/ml供制备结合有抗蛇毒金标抗体41的胶体金垫片323使用；固定在该控制线区326的第二抗体46则是使用抗兔子抗体的羊多株抗体(JacksonImmuno-ResearchLaboratories,Inc.,USA)。
该分析薄膜324使用的硝化纤维膜为AE98(Whatmanplc.,England)，该金标结合垫片323是grade6613(AhlstromCorp.,Finland)的玻璃纤维垫片、该检体垫片321是grade8964(AhlstromCorp.,Finland)的玻璃纤维垫片，该吸收垫片322则是grade205(Whatmanplc.,England)的玻璃纤维垫片。将该检体垫片321、金标结合垫片323、分析薄膜324及吸收垫片322依图2所示的配置排列并固定至塑料材质的基底层31上，该基底层31为GL-187(G&LPrecisionDieCuttingInc.,USA)的塑料材质所制成。
该胶体金溶液以氯化金以及柠檬酸钠制备，并以光谱波长订出其直径为30nm。所配制出的胶体金溶液再以0.1M碳酸缓冲液(pH9.6)调整pH至7.0。将兔抗眼镜蛇蛇毒的抗体加入已调整pH的胶体金溶液中并温和搅拌一小时，与溶液中的奈米金颗粒聚合形成金标抗体41。之后以1%BSA20mM的boratebufferpH8进行阻断，再以39000g离心30分钟。离心后重新回溶到含蔗糖以及BSA的PBS缓冲液中，金浓度在540nm下约为O.D.=40，将该胶体金溶液保存在4℃。
参阅图3与图5，分别将该植入单元4的抗体，以1mg/ml的抗体42、抗体43、抗体44与抗体45，及0.5mg/ml的第二抗体(羊多株抗体)46，以1μl/cm的流速喷到已经固定在该基底层31的分析薄膜324的测试线区325、控制线区326上。该金标结合垫片323需先浸泡在含有Broaxbuffer(pH8.2)，Tritonx-100，PVP-40的缓冲溶液中，干燥过夜。之后将已含有该等金标抗体41的胶体金溶液以1μl/cm的流速喷洒到经过前处理的金标结合垫片323上面。然后在温度37℃干燥4小时。组装完成后，将该试卡主体3裁切成0.4mm宽度的细条，放入塑料材质的卡匣5中，即制得该蛇毒快速检验试片装置2成品。该蛇毒快速检验试片装置2成品可储存在铝箔袋中并放入干燥剂密封保存以延长保存期限。
将该蛇毒快速检验试片装置2拆封后平放于桌面上，以滴管吸取检体10，并通过该卡匣5的加样区52滴加检体10至该试卡本体3的检体垫片321，静置20分钟后，即可以肉眼观察并判读与该判读窗口53相对齐的测试线区325与控制线区326。
该检体10内的液体会促使该金标结合垫片323中的金标抗体41，借流体毛细作用沿该分析薄膜324往前移动，若该检体10中未含有眼镜蛇蛇毒或含有非眼镜蛇蛇毒100，则该等金标抗体41会与该控制线区326中的第二抗体46结合发生特异性结合，而沉淀在该控制线区326上，形成肉眼可观察到的红色指示线。若该检体10中含有眼镜蛇蛇毒101，则该蛇毒蛋白会与部分金标抗体41进行特异性结合，形成金标抗体-眼镜蛇蛇毒蛋白结合体410，该多个结合体410(见图5)与部分未结合有蛇毒蛋白的金标抗体41，会同时因毛细作用沿该分析薄膜324往前移动，于该移动过程中，该多个未结合蛇毒蛋白的金标抗体41会与该控制线区326的第二抗体46特异性结合，并沉淀形成红色指示线，而该等结合体410则利用对蛇毒具有特异性的双抗体夹心法，可能与该测试线区325的抗体42、或抗体43、或抗体44或抗体45发生特异性结合而沉淀，并呈现出另一条或多条红色指示线。
图6为该蛇毒试片装置其较佳实施例的正视示意图，如图7所示，当测试结果出现两道红色指示线，分别对齐该第二标记512、第四标记514的二条色带时，表示救护人员只需选用抗Najaatra或抗Najanaja蛇毒血清，即可达到中和蛇毒的急救效果。
分别配制不含眼镜蛇蛇毒的检体a，与四种眼镜蛇Najaatra、NajaKaouthia、Najasiamensis及Najanaja蛇毒浓度分别为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml及500ng/ml的检体b、c、d、e、f及g，共28组检体，并以28个本新型的蛇毒快速检验试片装置2，将不同蛇毒浓度的a、b、c、d、e、f及g检体分别滴入该检验试片装置2的检体垫片321，静置20分钟，观察该判读窗口53中的呈色结果。当该检体未含眼镜蛇蛇毒时及蛇毒浓度为1ng/ml，只有在该控制线区326出现红色指示线，当蛇毒浓度最低为5ng/ml时，该控制线区326与该测试线区325均出现能够以肉眼观察到的红色指示线，并且随着蛇毒浓度增加，呈现在该测试线区325的红色指示线颜色亦随之加深，显示该蛇毒快速检验试片装置2可侦测的蛇毒浓度至少为5ng/ml，亦即本实用新型的检验试片确实能以高灵敏度侦测检体中是否含有眼镜蛇蛇毒蛋白。
综上所述，本新型蛇毒快速检验试片2可获致下述的功效及优点，已能达成本实用新型的目的：一、由于本实用新型快速检验试片2可在20分钟内得知蛇咬伤病患是否为眼镜蛇咬伤，且侦测极限达5ng/ml，在紧急时刻可以协助医护人员快速且正确的选用抗蛇毒血清予以治疗。
以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。
Claims (4)
1.一种用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，其特征在于，包括：
一试卡本体，包括一内槽及与该内槽相对应接合的一基底层及一载体层，该载体层上设置有相间隔的一检体垫片、一与该检体垫片相邻接的金标结合垫片、一吸收垫片及一连接在该金标结合垫片与该吸收垫片之间的分析薄膜，该分析薄膜上依序形成相间隔的一测试线区及一控制线区，该测试线区包括多个抗蛇毒血清测试线；以及
多个植入单元，包括一分布于该金标结合垫片的抗蛇毒金标抗体，及多个分别固定于该测试线区的与蛇毒蛋白具有特异性结合的抗蛇毒抗体，及固定于该控制线区的与该抗蛇毒金标抗体结合的第二抗体。
2.根据权利要求1所述的用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，其特征在于，其中该固定于该测试线区的抗蛇毒抗体由分别与抗同属的不同种蛇毒蛋白具有特异性结合的抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，其特征在于，其中该固定于该测试线区的抗蛇毒抗体进一步包括与抗不同属的蛇毒蛋白具有特异性结合的抗体。
4.根据权利要求1所述的用于快速检定适用抗蛇毒血清的蛇毒试片装置，其特征在于，其中该植入单元包含5-100ng/ml的抗蛇毒抗体。
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