CN102590508A - 检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条 - Google Patents

检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条 Download PDF

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高春花
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杨玥涛
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Abstract

本发明公开了检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个紧密连接于样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与金标垫紧密连接的纤维素膜、和一个紧密连接于纤维素膜的吸水垫，所述的吸水垫远离金标垫，在纤维素膜上靠近吸水垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置一条检测线，检测线含有亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原，质控线含有特异性结合胶体金标记探针的抗体。本发明还提供了含有上述免疫层析试条的试剂盒，上述免疫层析试条的制备方法。本发明的免疫层析试条具有使用简便、敏感性和特异性高，检测快速的优点，并且可以同时应用于人、畜及野生动物的临床和现场使用。

Description

检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种亲内脏利什曼原虫寄生虫病的检测工具，具体来说是检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条及其制备方法。 
背景技术
利什曼原虫(Leishmania spp.)的生活史有前鞭毛体(promastigote)和无鞭毛体(amastig ote)两个时期。前者寄生于节肢动物(白蛉)的消化道内，后者寄生于哺乳类或爬行动物的细胞内，通过白蛉传播。利什曼原虫分类复杂，内脏利什曼病或称黑热病，是由利什曼原虫(Leishmania donovani)或婴儿利什曼原虫(L.infantum)/恰氏利什曼原虫(L.chagasi)寄生于人体的淋巴-巨噬细胞系统所引起的一种寄生虫病，由媒介白蛉叮咬传播。黑热病患者体内血液中含有能特异性结合所感染的利什曼原虫抗原的抗利什曼原虫抗体，检测受试者体内血液中是否含有利什曼原虫抗体，可作用受试者是否患有黑热病的指标。 
该病在世界范围内流行甚广，包括亚、欧、非及中、南美洲的61个国家，每年新发生的病例数约有50万。在上世纪60年代以前我国也深受其害，病例曾达60万，死亡率极高。准确检测感染和诊断是监测工作急需和治疗的关键所在，因此，对黑热病诊断技术的研究始终受到重视。 
以骨髓、脾等穿刺物涂片染色镜检的方法是黑热病最古老的诊断方法，迄今仍是黑热病诊断的“金标准”。国外报道显示骨髓和淋巴结穿刺物涂片镜检敏感性分别为60％-75％和30％-50％，国内报道以骨髓、淋巴结、脾穿刺涂片镜检检出率依次为：80-90％、46-87％、96-98％。由于这种检测方法对操作人员的技术要求非常高，在疾病诊断与流行病学调查中应用受到限制。 
免疫学方法在黑热病诊断上的应用越来越受到重视，最有效的免疫学诊断方法是应用纯化虫体可溶性抗原或重组抗原检测黑热病人特异抗体，常用检测方法 有间接血凝法(Indirect haemagglutination assay；IHA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫电转移印渍法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay；EITBA)，以及金标免疫点印渍法(Gold-labelled dot blotting；GDB；俗称膜法或渗滤法)。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的要求较高而不适合现场使用。 
发明内容
本发明的目的是提供一种检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条及其制备方法，所述的这种免疫层析试条及其制备方法要解决现有技术中的方法检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病疾病的方法复杂、检出率低的技术问题。 
本发明提供了一种检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜、和一个紧密连接于所述纤维素膜的吸水垫，所述的吸水垫远离所述的金标垫，在所述纤维素膜上靠近吸水垫的一端设置质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置一条检测线，其特征在于：所述的检测线含有亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原，所述的质控线含有特异性结合胶体金标记探针的抗体。 
进一步的，所述的亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原来源于亲内脏利什曼原虫虫体的前鞭毛体或无鞭毛体。 
进一步的，所述的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白、鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体，所述质控线为抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或抗链球菌G蛋白抗体、或抗鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗抗人IgG的单抗多抗的抗体、或者抗兔抗人IgG抗体的抗体。 
进一步的，亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的蛋白浓度为1-20mg/mL，喷涂量为100μL/cm2；胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为1-5mg/15-20mL。 
进一步的，抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或抗链球菌G蛋白抗体、或鼠抗 人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体溶液的浓度为0.1-5mg/mL，喷涂量为100μL/cm2。 
进一步的，所述免疫层析试条背面设置一个背板。 
具体的，所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述支持胶体金标记探针的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜；所述样品垫可以是滤血膜样品垫，所述的滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素的混合物，适合于全血样品和血清样品；所述样品垫也可以是玻璃纤维或吸水纸样品垫，适合于血清样品；所述吸水垫由吸水材料制备，如吸水纸。 
具体的，所述纤维素膜宽度控制在20-30mm；所述吸水垫可宽度为20-40mm，厚度为0.1-0.2mm；所述金标垫的宽度为5-10mm；所述样品垫宽度为20-40mm。 
具体的，所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板，背板材料的选择是多种多样的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。 
本发明还提供了一种试剂盒，由一个盒体构成，将上述的免疫层析试条设置在所述的盒体中，所述的盒体的一个侧面上设置有一个检测孔和一个观测窗，所述的检测孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观测窗位于所述的检测线和质控线的上方。 
本发明还提供了上述的一种检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的制备方法，包括以下步骤：一个制备亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原的步骤，将来源于亲内脏利什曼原虫虫体的抗原液蛋白浓度调整到1-20mg/mL；一个制备胶体金标记探针的步骤，一个制备与胶体金标记探针特异结合的抗体的步骤，所述的与胶体金标记探针特异结合的抗体的溶液浓度为0.1-5mg/mL；一个将亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原溶液喷涂到纤维素膜上形成检测线的步骤；一个将能与胶体金标记探针特异结合的抗体溶液喷涂到所述的纤维素膜上质控线的步骤，所述的质控线和所述的检测线相邻设置；一个将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记探针溶液中制备金标垫的步骤；将一个吸水垫粘贴在所述纤维素膜的一侧，所述的吸水垫靠近质控线、远离检测线，将所述的金标垫粘贴在纤维素膜的另外一侧，所述的金标垫靠近检测线，将一个样品垫粘贴金标垫的远离所述纤维素膜的一侧。 
进一步的，所述的亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的制备方法是将亲内 脏利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体接种于培养基中培养，在原虫处于对数生长期，原虫密度为105-107/mL时，2-6℃下离心收集前鞭毛体或无鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗1-5次后，按前鞭毛体或无鞭毛体的压积量加3-5倍体积的PBS，在液氮和35-40℃水浴中，反复冻融3-7次，然后在冰浴中超声粉碎1-5次，2-6℃下离心，上清即为可溶性抗原。 
进一步的，在一个制备胶体金标记探针的步骤中，将1-5mg金黄色葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白、鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体加入100mL胶体金溶液，离心取沉淀，复溶到15-20mL，加入蔗糖使蔗糖的终浓度为2％-10％。 
在本发明的一个优选的方案中，亲内脏利什曼原虫虫体的可溶性抗原液蛋白浓度为1-20mg/mL，喷涂量为100μL/cm2；胶体金标记探针浓度(以蛋白浓度计)：1-5mg/15-20mL；抗SPA抗体溶液浓度为0.1-5mg/mL，喷涂量为100μL/cm2。 
在一个优选的方案中，上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后，先在37℃下干燥0.5-2小时，再粘贴吸水垫。 
在一个优选的方案中，为使胶体金标记探针溶液与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合，可向胶体金标记探针溶液中添加2％-10％的蔗糖；为使金标垫更易于纤维素膜粘贴，可将金标垫在37℃下干燥0.5-1小时，再与纤维素膜粘贴。 
本发明还提供了一种亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的制备方法，是将亲内脏利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体接种于培养基中培养，在原虫处于对数生长期，原虫密度为105-107/mL时，2-6℃下离心收集前鞭毛体或无鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗1-5次后，按前鞭毛体或无鞭毛体的压积量加3-5倍体积的PBS，在液氮和35-40℃水浴中，反复冻融3-7次，然后在冰浴中超声粉碎1-5次，2-6℃下离心，上清即为可溶性抗原。 
本发明的免疫层析试条适用于从亲内脏利什曼原虫感染者或黑热病患者(患畜)体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的免疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫；对于血清样品，本发明的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫，也可采用滤血膜样品垫。 
本发明可以将亲内脏利什曼原虫(前鞭毛体或无鞭毛体)可溶性抗原固定在纤维素膜等支持物上作为固相抗原，用以捕获受试者者血样中的利什曼原虫抗 体。本发明的一个优选的方案中，将我国常见的亲内脏利什曼原虫可溶性虫体可溶性抗原(来源于前鞭毛体或无鞭毛体)固定在纤维膜上形成检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗利什曼原虫抗体，在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。 
黑热病患者体内血液中含有的抗利什曼原虫抗体的优势抗体类型为IgG抗体。本发明的一个优选的方案中采用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白作为检测探针，该胶体金标记探针附着于金标垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记探针可与受试者血样中的人IgG抗体结合，从而当受试者血样中存在利什曼原虫特异性抗体时在检测线位置形成色带。 
胶体金标记探针不限于金黄色葡萄球菌A蛋白，也可采用链球菌G蛋白(SPG)，鼠抗人IgG的单抗或多抗，或者采用其他动物如兔抗人IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的(若使用抗人的抗体则仅能对人体进行诊断)，这是领域的一般技术人员都知晓的。 
本发明可以将与胶体金标记探针特异性结合的抗体固定在纤维素膜上作为质控线。在本发明一个优选的方案中，胶体金标记探针是金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，相应的，质控线采用抗SPA的抗体。无论待检样品中是否含有抗利什曼原虫抗体，本发明的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病中质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。 
质控线不限于抗SPA的抗体，只要能与选定的胶体金标记抗体特异性结合，或者使用SPA能结合的任意IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。 
本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明的免疫层析试条具有以下优点：(1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试条总的敏感性可达96.1％，特异性为97.8％；(2)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经5分钟左右的纸层析后，即可出现肉眼可见的沉淀线，从而为黑热病人的治疗争取了时间，很适合现场和基层使用；(3)本发明的免疫层析试条可以同时应用与人、畜和野生动物感染的现场检测，有助于寻找确定传染源，在疾 病预防控制工作中有重要意义；(4)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。 
附图说明
图1、检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的正面结构示意图。 
图2、检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的纵截面结构示意图。 
其中：1为样品垫、2为金标垫、3为纤维素膜、4为吸水垫、5为检测线、6为质控线、7为背板。 
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。 
具体实施方式
实施例1         免疫层析试条 
如图1和2所示，一种检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫1、紧密连接于所述样品垫1的含有胶体金标记探针的金标垫2、与所述金标垫2紧密连接的纤维素膜3、和一个紧密连接于所述纤维素膜3的吸水垫4，所述的吸水垫4远离所述的金标垫2，在所述纤维素膜3上靠近吸水垫4的一端设置质控线6，在质控线6和金标垫2之间的纤维素膜3上设置一条检测线5，所述的检测线5含有亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原，所述的质控线6含有特异性结合胶体金标记探针的抗体。 
进一步的，所述的亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原来源于亲内脏利什曼原虫虫体的前鞭毛体或无鞭毛体。 
进一步的，所述的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白，所述质控线6为抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗链球菌G蛋白抗体。 
进一步的，亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的蛋白浓度为1-20mg/mL，喷涂量为100μL/cm2；胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为1-5mg/15-20mL。 
进一步的，抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗链球菌G蛋白抗体溶液的浓度为0.1-5mg/mL，喷涂量为100μL/cm2。 
进一步的，所述免疫层析试条背面设置一个背板7。 
实施例2           检测原理与结果判断 
测定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫1上，1分钟后滴一滴(约50μL)样本稀释液，稀释液带动样品按样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动，流经金标垫2时使金标垫2上的胶体金标记探针复溶，并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移动。胶体金标记探针(本发明实施例为金黄色葡萄球菌A蛋白)可与样品中的抗体或抗体亚类结合，形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5时，若标本中有待测抗体或抗体亚类(抗利什曼原虫抗原的抗体)，即被检测线5的特异性固相抗原所捕获，在硝酸纤维素膜3上的检测线5位置显出红色检测线条；此免疫复合物流经质控线6时，即被质控线6的固相抗体(本发明实施例为抗SPA抗体)所捕获，在硝酸纤维素膜3上的质控线6位置显出红色质控线条。 
阳性标本既显示检测线5，又显示质控线6；阴性标本没有检测线5，仅显示质控线6。 
实施例3            免疫层析试条的制备 
1、针对杜氏利什曼原虫的虫体可溶性抗原的制备 
杜氏利什曼原虫前鞭毛体接种于199培养基中于22℃孵育箱中培养，在原虫处于对数生长期，原虫密度约为106/mL时，4℃下以3000g离心15分钟收集前鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗3次后，按前鞭毛体的压积量加4倍体积的PBS，在液氮和37℃水浴中，反复冻融5次，然后在冰浴中超声粉碎3次，18000g，4℃离心20min，上清即为可溶性抗原。 
2、金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)可以购买获得 
3、制备免疫胶体金探针及金标垫 
用下述方法制备金黄色葡萄球菌A蛋白免疫胶体金探针及金标垫2： 
1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl4(沪试牌购于上海国药集团化学试剂有限公司)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％的柠檬酸三钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。 
2)确定胶体金偶联探针饱和浓度 
用0.2M K2C03调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至6.0，准备5支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1)制备的经纯化的金黄色葡萄球菌A蛋白稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入20μL、25μL、30μL、35μL，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少量即为稳定1mL胶体金溶液所需蛋白的最适浓度，以此为基础增加20％蛋白量即为胶体金探针饱和溶液。结果：维持胶体金溶液颜色不变的蛋白量为25μL，即探针浓度为25μg/mL。 
3)金黄色葡萄球菌A蛋白标记的免疫胶体金探针及金标垫的制备 
取50mL胶体金溶液，用0.2M K2CO3调节pH值为6.0，按25μg/mL加入已纯化的金黄色葡萄球菌A蛋白，得到含有浓度为25μg/mL金黄色葡萄球菌A蛋白的免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌1小时，再加入终浓度为0.05％PEG20000，搅拌1小时，10000rpm离心30分钟，弃上清，用20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀，并将其保存于10mL含15％蔗糖的20mM硼酸缓冲液中，得到金黄色葡萄球菌A蛋白标记的胶体金探针溶液。取5mL金黄色葡萄球菌A蛋白标记的胶体金探针溶液均匀加在玻璃纤维膜上，37℃下干燥0.5小时，得到金标垫2。 
4、该免疫层析试条的制备方法包括以下步骤： 
1)NC膜的包被 
杜氏利什曼原虫可溶性抗原包被：用0.01M pH7.2PBS稀释制备的杜氏利什曼原虫可溶性抗原液至终浓度为2mg/mL，用于包被检测线5； 
质控抗体鸡抗金黄色葡萄球菌A蛋白IgY(购自捷宁生物公司)的包被：用0.01M pH7.2PBS稀释鸡抗金黄色葡萄球菌A蛋白IgY至终浓度为0.5mg/mL，用于包被质控线6； 
BIODOT公司XZ1000喷膜机分别将利什曼原虫可溶性抗原液、鸡抗金黄色葡萄球菌A蛋白IgY喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜3(购自MILLIPORE公司)上，喷涂量为100μL/cm2，形成一条检测线5和一条质控线6，37℃下干燥1小时。 
2)具体制备 
用一块单面涂了不干胶的PVC背板7，中间粘贴上处理好的NC膜；NC膜靠近质控线6的一端紧密粘贴吸水垫4(购于MILLIPORE公司)；NC膜靠近检测线5的一端紧密粘贴金标垫2；金标垫2另一端紧密粘贴滤血膜样品垫1(购自WHATMAN公司)。得到检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。 
5、检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试剂盒的制备 
为了方便使用，将制备的免疫层析试条装入试剂盒中，加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫1的部位设有检测孔，对应于检测线5和质控线6的部位设有观测窗。 
实施例4         检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的制备 
用购买自上海业力生物科技有限公司的链球菌G蛋白(SPG)制备胶体金标记检测探针，用购买自捷宁生物公司的鸡抗链球菌G蛋白IgY包被质控线6，其他步骤同实施例3。 
实施例5     检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的实验室考核 
1、检测方法 
于免疫层析试条的滤血膜样品垫1加入待测血清或全血，1分钟后加入样本稀释液(10mM pH7.4PBS)1滴(约50μL)，2分钟后开始观察结果，20分钟观察终止。结果判定：如果检测线5和质控线6均出现红色条带，即判为黑热病，如果仅有质控线6出现红色条带，即判为阴性。 
2、实验结果 
用本发明的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条进行实验室考核结果如表2所示。由表2可以看出本发明的免疫层析试纸的敏感性可达96.1％，特异性可达97.8％。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于黑热病的快速检测。 
表2本发明检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的实验室考核结果 
  血清来源   试验例数   阳性例数(P％)
  黑热病   129   124(96.1％)
  健康人   134   3(2.2％)
  囊虫病   10   0
  血吸虫病   5   0
  弓形虫病   5   0
  肺吸虫病   5   0
  肝吸虫病   5   0
  包虫病   20   0
  疟疾   20   1(5％)
用本发明制备的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条进行实验室考核，结果与表2所示结果没有统计学差异。 
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。 

Claims (11)

1.一种检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，包括一个样品垫、一个紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记探针的金标垫、一个与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和一个紧密连接于所述纤维素膜的吸水垫，所述的吸水垫远离所述的金标垫，在所述纤维素膜上、靠近吸水垫的一端设置有质控线，在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置一条检测线，其特征在于：所述的检测线含有亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原，所述的质控线含有特异性结合胶体金标记探针的抗体。
2.如权利要求1所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，其特征在于：所述的亲内脏利什曼原虫的虫体可溶性抗原来源于亲内脏利什曼原虫的前鞭毛体或无鞭毛体。
3.如权利要求1所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，其特征在于：所述的胶体金标记探针为金黄色葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白、或鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体，所述质控线为抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或抗链球菌G蛋白抗体、或抗鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗抗人IgG的单抗多抗的抗体、或者抗兔抗人IgG抗体的抗体。
4.如权利要求1所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，其特征在于：所述的亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的蛋白浓度为1-20mg/mL，喷涂量为100μL/cm2，胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为 1-5mg/ 15-20mL。
5.如权利要求3所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，其特征在于：抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或抗链球菌G蛋白抗体、或鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体溶液的浓度为0.1-5mg/mL，喷涂量为100μL/cm2。
6.如权利要求1所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条，其特征在于：所述免疫层析试条背面设置有一个背板。
7.一种试剂盒，包括一个盒体，其特征在于：所述的盒体中设置有权利要求1所述的免疫层析试条，所述的盒体的一个侧面上设置有一个检测孔和一个观测窗，所述的检测孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观测窗位于所述的检测线和质控线的上方。
8.一种制备权利要求1所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的方法，其特征在于：包括以下步骤：一个制备亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的步骤，将来源于亲内脏利什曼原虫虫体的抗原液蛋白浓度调整到1-20mg/mL；一个制备胶体金标记探针的步骤，一个制备与胶体金标记探针特异结合的抗体的步骤，所述的与胶体金标记探针特异结合的抗体的溶液浓度为0.1-5mg/mL；一个将亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原溶液喷涂到纤维素膜上形成检测线的步骤；一个将能与胶体金标记探针特异结合的抗体溶液喷涂到所述的纤维素膜上质控线的步骤，所述的质控线和所述的检测线相邻设置；一个将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记探针溶液中制备金标垫的步骤；将一个吸水垫粘贴在所述纤维素膜的一侧，所述的吸水垫靠近质控线、远离检测线，将所述的金标垫粘贴在纤维素膜的另外一侧，所述的金标垫靠近检测线，将一个样品垫粘贴金标垫的远离所述纤维素膜的一侧。
9.如权利要求8所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的制备方法，其特征在于：所述的亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的制备方法是将亲内脏利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体接种于培养基中培养，在原虫处于对数生长期，原虫密度为105-107/mL时，2-6℃下离心收集前鞭毛体或无鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗1-5次后，按前鞭毛体或无鞭毛体的压积量加3-5倍体积的PBS，在液氮和35-40℃水浴中，反复冻融3-7次，然后在冰浴中超声粉碎1-5次，2-6℃下离心，上清即为可溶性抗原。
10.如权利要求8所述的检测亲内脏利什曼原虫感染和诊断黑热病的免疫层析试条的制备方法，其特征在于：在一个制备胶体金标记探针的步骤中，将1-5mg金黄色葡萄球菌A蛋白、或链球菌G蛋白、或鼠抗人IgG的单抗、或鼠抗人IgG的单抗多抗、或者兔抗人IgG抗体加入100mL胶体金溶液，离心取沉淀，复溶到15-20mL，加入蔗糖使蔗糖的终浓度为2%-10%。
11.一种亲内脏利什曼原虫虫体可溶性抗原的制备方法，其特征在于：将亲内脏利什曼原虫前鞭毛体或无鞭毛体接种于培养基中培养，在原虫处于对数生长期，原虫密度为105-107/mL时，2-6℃下离心收集前鞭毛体或无鞭毛体，弃上清，沉淀同法用PBS洗1-5次后，按前鞭毛体或无鞭毛体的压积量加3-5倍体积的PBS，在液氮和35-40℃水浴中，反复冻融3-7次，然后在冰浴中超声粉碎1-5次，2-6℃下离心，上清即为可溶性抗原。
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