KR20110017610A

KR20110017610A - 레이슈마니아 탐지용 항원, 및 이를 포함하는 면역탐지키트

Info

Publication number: KR20110017610A
Application number: KR1020090075160A
Authority: KR
Inventors: 윤성욱; 김정미
Original assignee: 베트올 (주)
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2011-02-22
Also published as: KR101209264B1

Abstract

본 발명은 레이슈마니아 균주(LEISHMANIA: LSH) 에 특이적인 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 레이슈마니아종 탐지용 프로브, 및 면역크로마토그라피 탐지키트에 관한 것으로서, 1종 이상의 레이슈마니아의 감염여부를 간편하고, 정확하고, 용이하게 진단하는 방법을 제공한다.

레이슈마니아, 탐지키트, 면역 진단, 면역크로마토그라피법

Description

레이슈마니아 탐지용 항원, 및 이를 포함하는 면역탐지키트{KIT FOR DETECTION OF LEISHMANIA INFECTION}

본 발명은 레이슈마니아 (LEISHMANIA) 감염을 진단하기 펩티드 프로브, 및 상기 프로브(probe)을 포함하는 면역진단키트에 관한 것이다.

레이슈만편모충증 (Leishmaniasis)은 다양한 종의 레이슈마니아(Leishmania)에 의해 감염에 의해 발생한다. 적어도 20여종 레이슈마니아(Leishmania)는 30종 이상의 흡혈성 곤충 매개체(phlebotomine sandfly)에 의해 사람을 포함한 포유류는 전염 시킬 수 있다. (Pearson et al.., 1996) 기생성 편모충은 내장리슈만편모충증 (Visceral leishmaniasis, VL), 피부리슈만편모충증 (Cutaneous leishmaniasis, CL) 및 점막피부리슈만편모충증 (Mucocutaneous leishmaniasis, MCL) 등의 3가지가 다른 임상적 질병 형태를 보이고 있다. 이러한 레이슈만편모충증 (Leishmaniasis)은 전세계 88개국에 분포되어 있으며 피부리슈만편모충증(CL)은 년간 1 - 1.5 백만만명, 내장리슈만편모충증 (VL)은 년간 500,000만명이 신규로 발병한다. 전체적으로 1,200만명이 감염 되어 있으며 3억 5,000만이 감염 위험에 노출되어 있다.(WHO., 2002: TDR Strategic Direction : Leishmaniasis).

특히, 내장리슈만편모충증 (VL)은 흑열병(kala-azar)이라고도 명명하며 지역적 특성에 따라 주로 2개의 레이슈마니얼 종 (leishmanial species)인 L. donovani 또는 L. infantum에 의해 감염되며, L. infantum은 거의 어린아이와 후천성 면역결핌증(ADIS) 환자와 같은 면역이 억제된 사람 (immunosuppressed individuals)에 감염된다. 반면, L. donovani의 경우 거의 모든 연령대에 감염될 수 있다. 매년 전세계적으로 말라리아로 사망하는 사람수 보다 많은 50,000명 이상이 내장리슈만편모충증 (VL)으로 사망하는 것으로 보고되고 있다 (Francosis et al., 2007: NATURE REVIEWS., 5: 873-882.). 또한 미국 및 유럽국가에서는 L. infantum에 감염된 개 (dog)의 경우 흡혈성 곤충 매개체(phlebotomine sandfly)을 통해 사람에게 감염되는 경우가 발생하고 있으며, 그 위험성에 대해 경고하고 있다 (Craig E.Greene., 2006:Infectious Dieases of The Dog and Cat, third edition)., Chapter 73: 685-698).

이러한 내장리슈만편모충증 (VL)질환은 감염후 수 개월간의 잠복기를 지나서 발병하며, 처음 증상은 고열, 간종대, 설사, 폐렴, 빈혈 등을 나타낸다. 긴 잠복기를 거처 발병하는 내장리슈만편모충증 (VL) 질환은 천천히 눈에 안띄게 진행된다. 따라서 내장리슈만편모충증 (VL)의 진단은 인간을 포함하여 숙주 매개체로 알려진 개(dog)를 포함하여 신속 정확하게 조기에 이루어져야 하며, 감염 확인 즉시 치료가 필요하다.

현재 사용되고 있는 내장리슈만편모충증 (VL) 검사법에는 enzyme-linked immunoassay 원리에 의한 레이슈마니얼 종 (leishmanial species) 항원을 직접 또 는 운동성에 관련된 단백질인 (kinesin related protein) k39 항원에 대한 항체를 간접적으로 측정법이 있으며 이는 90~95% 낮은 민감도 및 특이도를 보이며, 숙련된 검사자의 경험이 필요하고, 전적으로 수입에 의존하는 고가의 장비, 검사비용, 긴 검사 시간 등의 제한점이 있어, 이미 많이 진행된 환자들만 검사를 받고 있다. 그러나 이 질환은 다른 질병과의 혼동요인이 많고 최근 그 유병률 이 높아지는 추세이므로 간편 신속 정확하면서도 저렴한 검사법이 필요시 되고 있다. 이러한 면역분석 기술 중 효소면역 측정법(ELISA)은 실험실에서 다른 검출기술 보다 간편하게 검사할 수 있기 때문에 널리 사용된다. 그러나 면역 형광검사 분석실험, 웨스턴블롯 및 방사선 면역침전법 분석실험은 명확한 결과를 제공한다. 상기 언급된 면역항체 측정기술은 중합효소 연쇄반응과 마찬가지로 리더(reader) 및 실험기구 등이 요구되어, 현장 진단법으로는 실행하기가 어렵다.

따라서, 상기 레이슈마니아 를 간단하고, 정확하게 현장에서 진단할 수 있을 뿐만 아니라 높은 특이도와 민감도를 갖는 레이슈마니아의 진단 방법 및 키트, 이에 사용되는 재조합 융합 단백질 및 키트를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다. 또한, 상기 진단키트, 이에 사용되는 재조합 융합 단백질 및 키트는 가능한한 검체의 특이성에 따른 오차를 최소하고 높은 특이도 및 민감도로 분석하여 레이슈마니아 감염여부 더욱 정확하게 진단할 수 있어야 한다.

본 발명은 레이슈마니아를 높은 특이도 및 민감도로 감염여부와 정확하게 진단하기 위해서, 본 발명은 LSH에 특이적이며 가용성인 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 LSH K39 유래 펩티드와 K26 유래 펩티드를 포함하며 LSH에 특이적이며 가용성인 융합 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 LSH K39 유래 펩티드와 K26 유래 펩티드를 포함하는 LSH에 특이적이며 가용성인 융합 펩티드를 포함하는 레이슈마니아종의 감염여부를 탐지하는 방법 및 탐지하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 사람, 개 및 고양이 등에 감염되는 레이슈마니아의 감염을 진단하기 위한 펩티드 프로브, 면역 진단키트 및 분석방법, 그리고 이에 이용되는 재조합 항원에 관한 것이다.

본 발명자들은 간단한 방법으로 레이슈마니아에 감염된 환견을 분석하여 레이슈마니아의 감염여부를 진단하고, 감염된 개의 레이슈마니아의 종류를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 확립하고자 연구노력한 결과, 레이슈마니아 감염 환견에서 유도된 항체에 결합하는 K39-K26융합 재조합 단백질, 및 이를 포함하는 면역크로마토그라피 진단키트를 개발하였다. 또한, 레이슈마니아 감염 환견에서 유도된 항체에 결합하는 K39-K26융합 재조합 단백질을 포함하는 면역 진단키트, 시료에서 표적 물질을 포획하는 방법 및 표적물질을 탐지하기 위한 표지수단을 포함하는 분석키트를 제작하였고, 전기 분석키트를 사용하여 환견의 시료에서 표적물질을 분석함으로써, 레이슈마니아의 감염여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

재조합 K39 항원(rK39) 는 레이슈마니아 종 컴플렉스(Leishmania species complex, L. donovani , L .infantum, and L. chagasi)의 230 kDa 운동성에 관련된 단백질인 (kinesin related protein)로 39개 아미노산이 반복적으로 된 면역우성(immunodominant) B 세포 에피톱 이다.(Badaro` et al., 1996; . J. Infect. Dis. 173:758-761 ,Burns et al., 1993;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:775-779, Zijlstra et al., 1998; Clin. Diagn. Lab.Immunol. 5:717-720).

재조합 K39 항원(rK39) 효소면역 측정법 (ELISA) 및 신속면역진단법(rapid immunochromatographic test)는 사람 내장리슈만편모충증 (VL)과 임상증상 (clinical)이 있는 또는 임상증상이 없는 (asymptomatic) 개의 내장리슈만편모충증 (VL) 검사를 위해 적절하게 사용할 수 있는것으로 보고되고 있다 (Badaro` et al., 1996; . J. Infect. Dis. 173:758-761,Ozensoy et al., 1998; Am. J. Trop. Med. Hyg. 59:363-369, Brandonisio et al., 2002; Eur J Microbiol Infect Dis 21:461-464, Jelinek et al., 1999; Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 18:669-670, Zijlstra et al., 2001; Trop Med Int Health. 6:108-113). 그러나 재조합 K39 항원(rK39)를 사용하여 아프리카 개체군 검사하는 것은 낮은 민감도때문에 문제가 있어 지역적 다양성을 고려한 개선이 필요한 실정이다 (Robert et al., 2007; Nature Reviews Microbiology. November:S1). 뿐만 아니라 실험실 검사법인 효소면역 측정법 (ELISA) 및 중합효소연쇄반응(PCR)과 현장 스크리링 검사법인 신속면역진단법(rapid immunochromatographic test) 간의 민감도 및 특이도의 차이가 많이 발생함에 현장검사용 신속면역진단법의 개발의 필요성이 대두되고 있는 실정이다(Richard Robert et al., 2007; J. Clin. Micro. 2002: July: 2352-2356).

최근 보고에 따른면 rK39를 대체 또는 보완하기 위해 또다른 진단용 마커의 사용의 필요성이 대두 되고 있으며, 이를 위해 k9과 k26항원의 대한 연구가 다각도로 진행되고 있다 (Flinn et.al., 1994; Mol Biochem Parasitol., 65:259-270, McKean et al., 1997; Mol Biochem Parasitol., 85:221-231). 80개의 아미노산으로 구성되어 친수성 단백질로 암호화된 k9 ORF는, k26에서 관찰된 반복이 결여어 있다. 247개의 아미노산으로 친수성 단백질로 암호화된 k26 ORF는, 총계 단백질을 64%를 함유하는 14개의 아미노산 stretch의 11번의 반복을 포함한다. 대조적으로, 총계 단백질을 45%를 함유하는 유전자 B ORF의 5.5 반복은, k26 반복에서 약간 순서 다양성을 보여준다(Flinn et al., 1994; Mol Biochem Parasitol., 65:259-270, McKean et al., 1997; Mol Biochem Parasitol., 85:221-231.). 따라서 k26의 반복성 특징에 따른 단백질의 풍부성이 새로은 진단용 마커로써의 유용성을 제시하고 있다 (Bhatia et al., 1999; Mol Biochem Parasitol,102:249-261.).

따라서, 본 발명에서는 LSH K39 유래 펩티드와 K26 유래 펩티드를 포함하며 LSH에 특이적이며 가용성인 융합 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명에서는 자연상태에 존재하는 K39 서열과 K26의 서열을 유전자재조합 기술을 인위적으로 단백질의 특성을 유지할수 있게 구성한 것이다. 싱기 K39 단백질과 K26의 단백질의 반복단위서열을 하기 표1에 나타냈다.

[표 1] K39 및 K26의 반복단위서열

SEQ ID NO	아미노산서열(N->C)	설명
31	LEQQLR E SE E RAAELASQLE A T A AAK S SAEQDRE N TRA T	LSH K39 반복단위
32	LEQQLR E SE A RAAELASQLE A T A AAK M SAEQDRE N TRA T	LSH K39 반복단위
33	LEQQLR D SE E RAAELASQLE S T T AAK M SAEQDRE S TRA T	LSH K39 반복단위
34	LEQQLR E SE E RAAELASQLE S T T AAK M SAEQDRE S TRA T	LSH K39 반복단위
35	LEQQLR D SE E RAAELASQLE A T A AAK S SAEQDRE N TRA A	LSH K39 반복단위
37	PKEDG H TQKN D G D G	LSH K26 반복단위
38	PKEDG R TQKN D D G G	LSH K26 반복단위
39	PKEDG R TQKN N G D G	LSH K26 반복단위
40	PKEDG H TQKN D G D A	LSH K26 반복단위
41	PKEDG R TQKN D G D G	LSH K26 반복단위

상기 표에서 밑줄로 굵게 표시한 아미노산은 가변서열이다.

자연상태에서의 K39 유전자에서 발현되는 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 31 내지 35의 폴리펩타이드서열의 반복적 배열로 구성되어 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 구성한다. 구체적인 천연상태 K39 아미노산서열은 N말단부터 순차적으로SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35와 SEQ ID NO: 33이 연결된 형태로 존재한다.

자연상태에서의 K26 유전자에서 발현되는 단백질의 서열은 SEQ ID NO: 37 내지 41의 폴리펩타이드서열의 반복적 배열로 구성되어 SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 구성한다. 구체적인 K26 아미노산서열은 N말단부터SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37와 SEQ ID NO: 38이 연결된 형태로 존재한다.

본 발명에 있어서, 상기 LSH K39 유래 펩티드는 SEQ ID NO: 31 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 5개 반복단위가 각각 1회 내지 3회 반복되며, 아미노산 195개 내지 360개로 이루어지며, 바람직하게는 상기 rK39 유래 펩티드(A)는 N 말단부터 순차적으로 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 및 SEQ ID NO: 35로 이루어지는 아미노산서열을 포함한다. 본 발명의 일예에서, 상기 LSH K39 유래 펩티드의 예로는 SEQ ID NO:45의 아미노산 서열중 1번째 아미노산 내지 250번째 아미노산을 포함하며, 연속적인 아미노산 250개 내지 290개로 이루이지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.

본 발명에 있어서, 상기 LSH K26 유래 펩티드는 SEQ ID NO: 37 내지 SEQ ID NO: 41로 이루어진 반복단위중에서 선택된 2종 이상의 반복단위로 이루어지며, 예를 들면, SEQ ID NO: 37 및 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 상기 N-말단부터 SEQ ID NO: 37 및 SEQ ID NO: 38으로 연결되거나 SEQ ID NO: 38 및 SEQ ID NO: 37로 연결될 수 있다. LSH K26 유래 펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO: 43의 아미노산서열을 포함한다. 상기 상기 LSH K26 유래 펩티드는 SEQ ID NO: 37 내지 41에서 펩타이드 아미노산서열중 아미노말단(N-terminal)과 카르복실말단(C-terminal)의 대표성을 분석한 결과 6번째 11번째 및 13번째 아미노산 서열의 반복성을 특성을 비교하여 SEQ ID NO: 37 내지 38의 아미노산서열을 대표 서열로 선정한다.

종래에 대장균(E. coli) 을 이용한 항원물질의 발현은 가용성 여부에 따른 항원물질의 특이적 반응 및 친화 등을 결정 짓는 중요한 요소로 작용하고 있다. 종래 단백질 발현기술에서는 대다수 불용성(insoluble) 단백질로 발현됨에 따라 봉입 체(inclusion bodies)에서 단백질을 분리하고 다시 3차원구조를 형성할수 있도록 리폴딩(refolding)하는 등의 과정으로 발현단백질을 분리하여 사용하고 있다. 이는 에를리히아종 특이적 항원에 관계된 약한 항체 반응을 형성하게 만들수 있으며, 그 원인으로 대장균(E. coli) 발현 단백질의 3차원적 배열(three-dimensional configuration)이 완전하지 않아 발생할 수 있을 것으로 예상하고 있다. 따라서 에를리히아종 특이적 융합 펩티드의 가용성(soluble) 단백질의 발현은 항체와의 반응을 원할하게 할 수 있는 중요한 요소로 작용할 수 있다. 또한 동업계에서 가용성(soluble) 단백질의 생산은 공정의 단순화, 단백질 특성의 동질화 및 재현성 등의 많은 장점을 가지고 있으며, 단백질 생산 원가 감소에도 기여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체에에서, 상기 LSH종에 특이적이며 가용성(soluble)인 융합 펩티드를 포함하는 LSH종 감염 탐지용 키트가 제공된다. 상기 키트는 사람, 개 및 고양이 검체의 LSH 균주 감염을 탐지하는 것일 수 있다.

상기 키트는 곤충매개 질환의 감염시료와 상기 융합 폴리펩티드의 항원-항체반응을 이용하여 레이슈마니아를 탐지할 수 있는 면역키트일 수 있다.

상기 키트는 추가로 상기 항체와 혼성화되는 검체를 탐지하기 위한 검출시약은 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분으로 이루어지며, 촉매, 효소, 효소기질, 형광화합물, 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상의 표지시약을 포함한다.

상기 키트는 효소면역 측정법(ELISA), 블롯팅(Blotting), 면역침전법, 면역형광검사, 또는 면역 스트립형태인 탐지키트일 수 있다.

상기 진단키트의 구체적인 일예는 LSH의 rK39및 rK26 유전자의 rK39/rK26융합 재조합단백질을 포함하는 면역 진단키트 스트립(Strip)과, D. Immitis의 감염을 진단하기 위한 면역 진단키트 스트립(Strip) 또는 E. canis 의 감염을 진단하기 위한 면역 진단키트 스트립(Strip)을 포함하는 면역 진단키트일 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 LSH 항원이 rK39부터 rK26가 융합된 재조합 형태로써 LSH 특이 항체만을 포획하며 D. Immitis항원에 특이적인 항체를 또는 E.canis 특이 항체만을 포획하는 항원을 사용하여 신속 면역크로마토그라피법에 의해 검체에서 LSH 및 E. canis 또는 D. Immitis를 감별적으로 검출할 수 있는 분석 스트립을 제공한다 (도 3 내지 6).

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 검체를 분석 스트립의 접적영역에 일정량 투입하는 단계; (2) 소정의 표지가 구비된 검출시약(금(골드) 접합체)과 상기 검체 중의 분석물과 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; (3) 상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계; 및 (4) 상기 멤브레인 상의 소정 영역에 LSH로부터 면역반응을 통해 얻어질 수 있는 항체 또는 합텐 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 고정상을 갖는 반응부의 외관 변화를 관찰하여 진드기 또는 모기매개 질환의 감염여부를 동시에 판단하는 단계를 포함하는 레이슈마니아 감염 진단방법을 제공한다

상기 본 발명의 진단방법은 샌드위치법(sandwich assay) 또는 경쟁법 (competition assay)을 포함한다. 상기 본 발명의 진단방법은 샌드위치법(sandwich assay) 또는 경쟁법 (competition assay)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 면역분석법에서는, 면역 스트립내 멤브레인에 본 발명에 따른 융합 펩티드를 고정하고, 동물의 혈청으로부터 얻은 검체를 반응시킨 후에, 검체에 포함된 항체에 대한 표지된 2차 항체를 반응한 샌드위치법으로 분석할 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 진단방법을 구현하기 위한 진단 키트로서, 진드기 또는 모기 매개질환로부터 유래된 항체(또는 항원) 또는 LSH로부터 면역반응을 통해 얻어질 수 있는 항체 또는 헵텐 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 고정상을 갖는 검사선(221) 및 정상동작여부를 판단하기 위한 대조선(222)가 멤브레인(22)상의 소정영역에 구비된 분석 스트립(2); 상기 분석 스트립(2)을 각종 오염물질로부터 보호하며, 적어도 검체를 투입하기 위한 검체투입구(41)및 분석 스트립상의 검사선(221)와 대조선(222)에서의 반응결과를 관찰하기 위한 결과 표시창(42)이 구비된 면역분석장치(1)을 포함하는 Leishmania 감염 진단용 키트를 제공한다.

도5은 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석장치의 분해 사시도이다. 도5를 참조하면, 면역분석장치(1)는 검체를 흡수하여 검출 결과를 표시하는 분석 스트립(2), 서로 결합되어 분석 스트립(2)을 내장하는 하부 케이스(3)와 상부 케이스(4)를 포함한다.

하부 케이스와 상부 케이스는 하나의 분석 스트립을 내장하여 1회에 1가지 질병에 대한 검사만을 가능하게 할 수 있다(미도시). 본 실시예에서 하부 케이스(3)와 상부 케이스(4)는 1쌍의 분석 스트립(2)을 내장하여 1회에 2가지 질병에 대한 검사를 가능하게 한다. 또한 편의상, 본 실시예의 도면에서는 1쌍의 분석 스트립(2)을 내장하는 구조를 예시하고, 전체적인 설명에서는 중복을 피하기 위하여 1개의 분석 스트립(2)에 대하여 주로 설명한다.

1쌍의 분석 스트립(2)에 대하여 간략히 설명하면, 하부 케이스(3)는 분석 스트립(2) 쌍을 지지하는 제1 스트립 지지부(3A)와 제2 스트립 지지부(3B)를 포함한다.

이에 따라, 상부 케이스(4)는 분석 스트립(2) 쌍, 즉 제1 스트립 지지부(3A)와 제2 스트립 지지부(3B) 각각에 대응하는 제1 스트립 대응부(4A)와 제2 스트립대응부(4B)를 포함한다.

제1 스트립 지지부(3A)와 제1 스트립 대응부(4A)는 하나의 분석 스트립(2)의 양면(도1에서 하면과 상면)을 지지하여 내장한다. 제2 스트립 지지부(3B)와 제2 스트립 대응부(4B)는 다른 하나의 분석 스트립(2)의 양면(도1에서 하면과 상면)을 지지하여 내장한다.

분석 스트립(2)은 검체를 흡수하는 검체 패드(21)와 검출 결과를 나타내는 멤브레인(22) 및 검체의 전개 액을 흡수하는 흡수 패드(23)를 포함한다. 멤브레인(22)은 검체에 의하여 반응하는 검사선(221)과, 검사선을 비교하여 질병 분석의 기준이 되는 대조선(222)을 구비한다.

분석 스트립(2)은 스트립 지지부(3A)와 스트립 대응부(4A) 사이에 고정될 수 있도록 단변(24)의 폭(W24)과 장변(25)의 길이(L25)를 가진다(편의상, 제1 스트립 지지부(3A)와 제1 스트립 대응부(4A)로 설명한다).

하부 케이스(3)는 내장되는 분석 스트립(2)의 일면, 예를 들면, 하면을 지지하도록 형성된다. 상부 케이스(4)는 하부 케이스(3)에 결합되어 내장되는 분석 스트립(2)의 다른 일면, 예를 들면, 상면을 덮도록 형성된다.

상부 케이스(4)는 검체 패드(21)에 대응하여 형성되는 검체 투입구(41)와, 멤브레인(22)에 대응하여 형성되는 결과 표시창(42), 및 흡수 패드(23)에 대응하여 형성되는 문자 표시구(43)를 포함한다.

상기에서 검체는 바람직하게는 체외로 분비되는 체액으로서, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 눈물, 침, 젖 등을 포함한다.

면역크로마토그라피법으로 LSH및 진드기(또는 모기) 매개질환을 진단하기 위해서는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 LSH 항체를 검출할 수 있는 rK39/rK26 재조합 융합항원 또는 진드기( 또는 모기) 매개질환의 특정항원에 대한 항체를 검출할 수 있는 특이적인 항원(또는 특정단백질의 항원을 검출할 수 있는 항체) 를 정해진 위치에 흡착시키고 금입자에 각각에 대한 항체또는 항원을 접합시켜 패드에 건조시킨다. 건조된 금(골드) 접합체 패드와 검체를 적용하는 패드를 중첩하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 패드를 포함한다(도5 및 6).

본 발명에 따르는 분석 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인(22)은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 있다.

대조시약에 포함될 수 있는 표지 시약은 위 검출시약에서의 그것을 동일하게 적용할 수 있다. 보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘, 바이오틴, FITC, 항FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항 마우스 면역 글로불린항체에서 선택되는 1종이 있다.

검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분이 구비된다. 표지된 검출시약은 이미 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려 져 있다. 이러한 표지의 예는 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등으로서, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스퍼타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인(fluorescein),피코빌리프로틴(phycobiliprotein),로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등이 있다.

검체 전개용액을 추가적으로40㎕ (1 drop) 적하하며 검체 중에 존재하는 LSH 특이 항체 또는 E. canis 항체(또는D.immitis항원)이 금입자에 부착된 각각의 항체와 반응을 하면서 니트로셀룰로오스 멤브레인(22) 위를 모세관 현상에 의해서 전개된다. 멤브레인의 검사선(221)에 LSH 항체를 검출할 수 있는 rK39/rK26 재조합 융합항원 또는 E. canis 항체(또는D. immitis항원)를 검출할 수 있는 특이적인 재조합항원 (또는 항체)를 일정한 위치에 흡착시켜 놓아 해당 감염체의 감염 항체가 또는 항원이 검체중에 존재하는 경우에는 골드입자에 접합된 항원 또는 항체에 반응한 각각의 바이러스 항원 및 항체가 멤브레인에 흡착된 항체 및 항원과 다시 반응하여 해당 위치에 골드입자 색에 의한 보라색(붉은색) 밴드를 형성한다. 대조선(222) 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드입자가 검체중의 바이러스 항원의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 (붉은색) 밴드를 나타내게 하였다 (도 5 및 6). 반응하지 않은 내용물은 흡습패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 또한 검체 중에 레이슈마니아종 특이항체가 존재하지 않으면 양쪽 스트립의 대조선 부위에만 보라색 또는 붉은색 밴드가 형성된다 (도 3 및 4).

본 발명은 레이슈마니아에 특이적인 폴리펩티드, 및 이를 포함하는 레이슈마니아 진단용 프로브, 및 면역크로마토그라피법을 제공하여, 신속하고 간단하며 높은 특이도와 민감도로 레이슈마니아 감염여부 확인 할 수 있으므로, 레이슈마니아의 조기진단, 예방 및 치료에 기여할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 원료, 분석 스트립 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 의도는 아니다.

실시예1 : 재조합 LSH 항원의 준비

A. LSH 항원 발현 벡터의 제조

(i) 합성 LSH 항원 유전자의 제조

LSH의 항원 단백질은 2005년 아프리카 분리주 염기서열, NCBI 유전자은행(NCBI GenBank data, ACCESSION : L07879)으로부터 가져왔으며, 합성 유전자의 올리고뉴클레오티드는 바이오닉스 (Bionics, Korea.)에서 합성 하였다 (표2).

[표 2] LSH 항원 제조에 사용된 올리고뉴클레오타이드

SEQ ID NO	Name	Sequence (5'->3')	Other
1	Frag 0	gcgcctgcgagcggctaaccagcCTTGAGCAGCAGCTTCGCGAA
2	Frag I Sense	CTTGAGCAGCAGCTTCGCGAATCCGAGGAGCGCGCTGCGG
3	Frag I Anti-Sense	GCAGTTGTTGTTCCAGCGTGGCCCTCGTGTTCTCGCGGTCCTG
4	Fragment 1	ATCCGAGGAGCGCGCTGCGGAGCTGGCGAGCCAGCTGGAGGCCACTGCTGCTGCGAAGTCGTCGGCGGAGCAGGACCGCGAGAACACGAG
5	Frag II Sense	ACACGAGGGCCACGCTGGAACAACAACTGCGAGAGTCAGAAGCACGCGC
6	Frag II Anti-Sense	GCAATTGCTGTTCGAGCGTGGCCCTCGTGTTCTCGCGGTCCTGCTCCG
7	Fragment 2	CGAGAGTCAGAAGCACGCGCTGCGGAGCTGGCGAGCCAGCTGGAGGCCACTGCTGCTGCGAAGATGTCAGCGGAGCAGGACCGCGAGAAC
8	Frag III Sense	ACACGAGGGCCACGCTCGAACAGCAATTGCGGGATAGTGAGGAAAGAGC
9	Frag III Anti-Sense	TCACGAAGCTGCTGCTCTAGCGTGGCCCTCGTGCTCTCGCGGTCCTGCTCC
10	Fragment 3	CGGGATAGTGAGGAAAGAGCTGCGGAGCTGGCGAGCCAGCTGGAGTCCACTACTGCTGCGAAGATGTCAGCGGAGCAGGACCGCGAGAGC
11	Frag IV Sense	GCACGAGGGCCACGCTAGAGCAGCAGCTTCGTGACTCCGAGGAGCGCGCT
12	Frag IV Anti-Sense	TCGCGAAGCTGCTGCTCTAGTGTAGCGCTAGTAGATTCCCGATCTTGTTC
13	Fragment 4	TGACTCCGAGGAGCGCGCTGCGGAGCTGGCGAGCCAGCTGGAGTCCACTACTGCTGCGAAGATGTCAGCGGAACAAGATCGGGAATCTAC
14	Frag V Sense	CTACTAGCGCTACACTAGAGCAGCAGCTTCGCGAATCCGAGGAGCGCGC
15	Frag V Anti-Sense	TCACGAAGCTGCTGCTCTAGTGTAGCGCTAGTAGATTCCCGATCTTGTTC
16	Frag VI Sense	TCTACTAGCGCTACACTAGAGCAGCAGCTTCGTGACTCCGAGGAGCGCGC
17	Frag VI Anti-Sense	ACGAAGCTGCTGCTCCAACGCGGCCCTCGTGTTCTCGCGGTCCTGCTC
18	Frag VII Sense	ACACGAGGGCCGCGTTGGAGCAGCAGCTTCGTGACTCCGAGGAGCGCGC
19	rK39_Sense	GATGAATTCGCCTGCGAGCGGCTAACCAGC	ECoRI
20	rK39 pGEX AS primer1	GGCCGCTCGAGTCGACTTATGTAGCGCTAGTAGATTCCCG	SalI
21	rK39 pGEX AS primer2	CGGGAATCTACTAGCGCTACAgcggccgcactcgagcacc	EagI
22	Frag I+II AS	CGGGATCCCGTGGCCCTCGTGTTCTCGC	BamHI
23	Frag III+IV S	CGGGATCCCTCGAACAGCAATTGCGGGA	BamHI
24	Frag III+IV AS	CCATCGATGGTGTAGCGCTAGTAGATTCCC	ClaI
25	Frag V+VI S	CCATCGATGGCTAGAGCAGCAGCTTCGCGA	ClaI
26	Frag V+VI AS	CCCAAGCTTCGCGGCCCTCGTGTTCTCGC	HindIII
27	Frag VII S	CCCAAGCTT TTGGAGCAGCAGCTTCGTGA	HindIII
28	rK26_Sense 1	CCCAAGCTTCCTAAGGAGGACGGCCGTAC	HindIII
29	rK26_Sense 2	actcgagcaccgcggccgCCTAAGGAGGACGGCCGTAC	EagI
30	rK26 pGEX4T AS primer1	GGCCGCTCGAGTCGACTTAGCCATCGCCGTCATTTTTCTG	SalI

합성 올리고뉴클레오티드는 오버랩핑 PCR법(Overlapping PCR method)을 통해 2개의 프레그먼트(fragment)를 결합하고 다시 제한효소 절단 부위를 포함하는 올리 고 뉴클레오티드 프라이머(primer)를 사용하여 결합된 프레그먼트를 증폭, 제한효소로 절단한 후 프레그먼트를 연결하여 완전한 항원 단백질 유전자로 만드는데 사용된다.

상기 유전자의 제조 방법은 상보적 말단과 오버랩되는 일련의 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것을 포함한다. 가열냉각시에, 상기 말단은 상보적 가닥의 증폭 을 위한 프라이머로 사용된다. 그 후, 상기 단편들은 여분의 외부 프라이머들에 의해 증대된다. 올리고뉴클레오티드는 발현 벡터 pGEX-4T-1 로 클로닝하기 위한 제한부위를 함유 하는 것으로 제조되었다. 발현 벡터 pGEX-4T-1를 사용할 경우 역방향 올리고뉴클레오티드는 번역 중지 코돈(TAA)와 SalI 제한 부위를 함유한다.

[표 3] 프라이머 서열

명칭	SEQ ID NO:5'->3'
명칭	유전자서열	아미노산 서열	정방향프라이머	역방향프라이머
LSH-GST rK39	46	45	19	20
LSH-GST rK39/rK26 1	48	47	19	30
LSH-GST rK39/rK26 2	50	49	19	30

외부 프라이머 rK39 Sense Primer (SEQ ID NO: 19) 및 rK39 pGEX4T AS Primer (SEQ ID NO: 20)가 사용되었을 때, pGEX4T에 도입 가능한 전체 889 bp (290 아미노산) LSH-GST rK39 유전자가 합성 되었다 (염기서열은 SEQ ID NO: 46 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 45).

외부 프라이머 rK39 Sense Primer (SEQ ID NO: 19) 및 SEQ ID NO: 44를 내부에 포함하는 rK26 pGEX4T AS Primer (SEQ ID NO: 30) 가 사용되었을 때, pGEX4T에 도입 가능한 전체 856 bp (279 아미노산) LSH-GST rK39/ rK26 1 유전자가 합성 되었다 (염기서열은 SEQ ID NO: 48 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 47).

외부 프라이머 rK39 Sense Primer (SEQ ID NO: 19) 및 SEQ ID NO: 44를 내부에 포함하는 rK26 pGEX4T AS Primer (SEQ ID NO: 30) 가 사용되었을 때, pGEX4T에 도입 가능한 전체 979 bp (320 아미노산) LSH-GST rK39/ rK26 2 유전자가 합성 되었다 (염기서열은 SEQ ID NO: 50 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 49).

오버랩핑 PCR법(Overlapping PCR)의 이러한 단계들을 하기에 상세하게 기재 하였다.

PCR 반응(50ul volume)은 하기와 같이 설정하였다.

pfu DNA 중합효소(1U) 및 1X 버퍼, 더불어 25uM씩 각각의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 20 pmol씩 각각의 올리고뉴클레오티드 Sense primer(염기서열 SEQ ID NO: 25 및 30)와 Anti-Sense Primer (염기서열 SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34). 상기 반응은 95℃에서 5분간 배양된 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 20초 및 72℃에서 60초씩을 30번 순환하여 증폭 시킨 후, 72℃에서 2분간 방치하였다. 추가적으로 오버랩핑 PCR을 위해 어닐링(Annealing)시 초당 0.2℃씩 온도가 변화하도록 설정하고 이외에는 모두 초당 5℃ 변화하도록 설정하였다. PCR-산물은 Qiagen PCR 스핀 컬럼을 사용하여 정제하였다.

(ii) PCR 산물의 클로닝

상기에 언급된 대로 pGEX-4T-1에 도입을 위해 증폭된 PCR 산물은 제한 핵산 내부가수분해효소(restriction endonucleases) ECoRI+ SalI로 분해되고 겔-분리되어진 벡터 pGEX-4T-1로 연결되었다.

상기 결합 산물은 DH5-alpa 수용세포들을 형질전환하는데 사용된다. 상기 형질전환된 세포들은 100㎍/㎖의 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 배양하였다. 미니프랩을 위한 DNA들은 콜로니 배지로부터 밤새 배양되어 얻어지며 ECoRI+ SalI로 분해하여 소정의 클론들을 선별하였다.

B. LSH 항원 플라스미드를 갖는 대장균 균주의 성장 및 발현 유도

각 대장균 클론의 종균들을 100㎍/㎖의 앰피실린이 첨가된 50㎖의 살균 LB에서 37℃의 진탕배양기(shaking orbital incubator)에 밤새 배양하였다. 50㎖의 접종물을 종균으로부터 100㎍/㎖의 앰피실린이 첨가된 0.5 리터의 무균 LB를 함유한 플래스크로 옮겨서, 이들이 중-대수증식할때까지 37℃로 배양하고, 0.5 mM IPTG(isopropylthiogalactoside)로 25℃에서 밤새 배양하여 유도하였다. 상기 유도기 후에, 세포들을 원심분리기에서 펠렛화하고 표준 절차에 따라 수거하였다. 펠렛화된 세포들은 다음 단계까지 -70℃에서 보관하였다. 가용성 및 불용성 단백질 발현을 분석하기 위해 융합 단백질의 경우 Cold buffer (50 mM Tris pH 7.5. 150 mM NaCl, 1mM EDTA)와 1mM의 PMSF를 첨가하여 재부유하고, 상기 세포들은 초음파처리 (Ultrasonication)에 의해 분쇄되었다. 세포-용해질의 원심분리(10,000rpm, 30분)를 통해 수용성 용해질과 불용성 용해질로 분리하여 각각을 12%의 SDS-PAGE에서 분석하 가용성 단백질 여부를 확인였다.

C. LSH 항원의 제조

실시예 B로부터 얻어진 결빙 세포들을 각각의 GST (Glutathione S Transferase) 융합단백질은 단백질 정제 표준절차에 따라 제조되었다. GST-rK39/rK26 키메락 융합 단백질의 아미노산 구조를 도 8에 나타냈다.

각각의 표준절차는 다음과 같다.

LSH-GST 융합 단백질의 경우 Cold buffer (50 mM Tris pH 7.5. 150 mM NaCl, 1mM EDTA)와 1mM의 PMSF를 첨가하여 재부유하고, 상기 세포들은 초음파처리 (Ultrasonication)에 의해 분쇄되었다. 세포-용해질의 원심분리(10,000rpm, 30분)를 통해 수용성 용해질을 제조하였고 0.45um의 주입필터(syringe filter, Sartorius)로 여과시켰다. 글루타치온 친화력 크로마토그래피로 항원 단백질을 정제하였고, 수용성 세포 용해질은 PBS로 평형화된 글루타디온 세파로우스 4B(Pharmacia) 컬럼에 로드되었다. 3층용적(bed volumn)의 PBS로 컬럼을 세척한 후에, LSH-GST 융합 단백질은 20mM의 환원된 글루타치온, 50mM의 Tris-HCl, pH 8.0의 버퍼용액으로 용출하였다.

상기 용출 단편은 12%의 SDS-PAGE에서 분석하였다. 정제된 융합 단백질은 정제하고 0.2um 필터를 통과시켜 냉장 보관하였다. 상기 가용성 재조합 LSH rK39/rK26 융합 단백질의 정제된 정기영동사진을 도 9에 나타냈다.

실시예 2. 재조합 LSH 융합 단백질의 선별

A. 재조합 LSH 융합 단백질의 dot - Immunoassay 를 통한 선별

상기 LSH GST rK39, LSH GST rK39/rK26-1(SEQ ID NO:47) 및 LSH GST rK39/rK26-2(SEQ ID NO:49)의 재조합 항원의 항원성 분석을 위해 정제된 항원을 이용하여 특이적으로 반응하는 항원을 도트 면역검정법(Dot Immunoassay)으로 재선별하고 진단용 항원으로 사용하였다 (도 1).

도트 면역검정법은 다음과 같은 과정에 따라 이루어졌다.

각 재조합 LSH 융합 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 96공 도트 매니폴드(96-well hybrid-dot manifold, GibcoBRL, Gaitherburg, MO)를 이용하여 흡착시켰다. 그 후 blocking solution (5 % nonfatmilk-PBS solution)으로 상온에서 1 시간 이상 blocking을 수행 비특이적 반응을 억제시켰다. 2 % BSA-PBS solution에 1/50 비율로 희석한 LSH 양성 검체를 상온에서 2 시간 동안 천천히 shaking하여 반응시켰다. 검체가 반응한 멤브레인은 TBST buffer (20 mM Tris pH 8.0, 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20)으로 10 분씩 3번 membrane을 씻어 비특이적으로 결합한 검체내 물질을 제거한 뒤, HRP (houseradish peroxidase)-conjugated anti-canine IgG secondary antibody (5% nonfatmilk-TBST로 1/2000 배율로 희석)를 상온에서 1 시간 shaking 하면서 반응 시킨 후, TBST buffer로 10분씩 5회 membrane을 씻어주었다. 최종적으로 membrane은 Chemiluminescence Luminol reagent (GE Heathcare)와 상온에서 1분간 반응시킨 후 X-ray film (FUJIFILM )에 30 초 내지 4 분간 감광시켰다 (도 1).

B. 재조합 LSH 융합 단백질의 직접 효소면역 측정법( direct ELISA )을 통한 선별

상기 LSH GST rK39, LSH GST rK39/rK26-1(SEQ ID NO:47) 및 LSH GST rK39/rK26-2(SEQ ID NO:49)의 재조합 항원의 항원성 분석을 위해 정제된 항원은 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 well 당 200 ㎕씩 첨가 하고 4 ℃에서 overnight incubation하여 코팅시킨다. 코팅된 플레이트는 washing solution (PBST, KOMA BIOTECH INC, K0331041, K0331051)을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 Blocking solution (1% BSA/PBS, KOMA BIOTECH INC, K0331032)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다. blocking된 플레이트(plate)는 다시 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 1:50으로 희석된 LSH 양성 검체를 웰당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 시료의 반응이 완료된 플레이트는 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 anti-canine IgG HRP(1:5,000, Antibody Incorporated, USA)을 well 당 200 ㎕ 씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하고 washing과정을 거친 후 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H2SO4)으로 반응을 정지한 후 ELISA reader 450nm 파장 흡광도로 측정하여 분석하였다.

실시예 3A 및 3B의 결과 본 발명의 실시예 1의 3개의 재조합 항원은 LSH 감염 양성 검체 1 내지 3 (Specimen 1 - 3)에 모두 반응하는 것을 확인 하였으나 검체의 특성에 따라 그 항원성이 차별화됨을 확인하였다(도 2). 상세하게는 재조합 LSH-GST rK39/rK26-2융합 단백질에서 모두 검체의 반응성이 가장 높았으며, 그 다음 순으로 LSH-GST rK39/rK26-1 단백질에서 높은 항원성을 나타냈다. 따라서 재조 합 LSH-GST rK39/rK26-2융합 단백질이 모두 검체에서 높은 항원성을 갖는 특징을 가지고 있다. 따라서 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열(SEQ ID NO:48 염기서열)을 포함하는 재조합 항원과 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열(SEQ ID NO:50 염기서열)를 포함하는 재조합 항원의 효능이 증명되었으며, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 49 의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 항원의 효능이 가장 우수한 것으로 증명되었다.

이와 같은 반응성을 나타내는 재조합 항원를 선별하여 본 발명에 따르는 진단키트의 제작에 사용하였다. 즉, 멤브레인 흡착용 항원은 LSH GST rK39/rK26-2 을 이용하였다.

실시예 4. LSH 진단 스트립 및 진단 키트의 제조

A. LSH 항원이 코팅된 멤브레인(membrane)의 준비

보존 용액으로부터, 상기 재조합 융합단백질을 0.5 내지 2 ㎎/㎖ 농도로 맞추어 검사선으로 사용하고, 대조선은 염소 항-마우스 이뮤노글로블린 G(Goat anti-mouse IgG)를 사용하였다. 상기 검사선의 재조합 항원 및 대조선의 대조 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 코팅하였다. 낮은 습도의 실험실 에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.

B. 항 고양이 이뮤노글로블린 G와 항 개 이뮤노글로블린 G 금 ( Gold ) 접합체 제조

산양 항 고양이 이뮤노글로블린 G 항체 (Goat anti-feline IgG, ICL, Inc., USA)와 산양 항 개 이뮤노글로블린 G 항체 (Goat anti-Dog IgG, ICL, Inc., USA)를 최종 농도가 4 내지 20㎍/㎖가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 0.1%의 Casein과 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 배의 0.1%의 Casein과 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 조정하여 제조하였다.

C. 마우스 이뮤노글로블린 G-금 접합체(( Mouse IgG - Gold Conjugate )의 준비: LSH 대조 지표

LSH 대조선에 위한 금 접합를 준비하기 위해 아리스타(Arista, USA) 사에서 구입한 마우스 IgG는 최종 농도가 4 내지 20㎍/㎖가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분 리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 배의 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 조정하여 제조하였다

D. 금 접합체 처리 패드의 준비

상기 B, C에서 제조된 금 접합체는 5% 트레할로스 (Trehalose)를 첨가하여 다음과 같이 제조하였다.

LSH 분석 스트립(strip)을 위해 0.5 x 20 cm 유리섬유에 항 고양이 이뮤노글로블린 G와 항 개 이뮤노글로블린 G 금 접합체가 최종농도 0.5 내지 2.5 OD (Optical Density)로 1:1, 2:1 및 1:2 혼합하고 마우스 IgG-금 접합체가 최종농도 0.5 OD가 되게 제조한다.

E. 흡습 패드 및 검체패드 제조

흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.

F. 디바이스 조립

상기에서 제조된 각각의 멤브레인, 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드(금 접합체 처리 패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡습패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 동시 진단용 면역분석장치(콤보 디바이스, 출원번호 10-2008-0075645)의 하판에 각각 넣고 다른 진드기(센스퍼트 이케니스(E.canis) 항체진단 스트립) 또는 모기 매개질환(센스퍼트 심장사상충(D.Immitis) 항원진단 스트립)을 진단할 수 있는 진단용 스트립을 함께 넣어 상판을 덮어 동시 진단용 키트를 제조하였다(도 3). 또는 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 단독 면역분석장치(싱글 디바이스)의 하판에 각각 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였다(도 4).

G. 제품 구성

상기에서 설명된 면역분석장치와 검체 전개액 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3)을 최종 제품으로 구성되도록 하였다(도 3 및 4).

실시예 5: 재조합 LSH융합단백질을 사용한 LSH 진단 스트립의 효능 시험

상기의 실시예 4 에 의해 제조된 동시 진단 키트를 이용하여 대한민국 건국대학교 수의과대학 전염병연구소 및 이탈리아, 스페인, 독일등 해외 동물병원으로부터 제공받은 개 LSH 양성시료와 음성시료를 대상으로 감염여부를 진단하였다.

검체로는 표준방법으로 설정한 면역형광시험법 (IFA)으로 검사된 개 LSH 양 성 검체 44 개와 음성 검체 63개를 사용하였다.

본 발명에 따르는 레이슈마니아 진단 키트와 면역형광시험법(Leishmania infantum FA Substrate Slide, VMRD, USA)의 진단법을 가지고 각각 검사하여 그 결과를 표 3에 나타냈다. 각 검사방법에 따른 검출된 시료의 수를 측정하여 레이슈마니아 진단키트의 상대 민감도(relative sensitivity) 및 상대 특이도(relative specificity)로서 표 4에 나타내었으며, 면역형광시험법 에 의한 검출 수와 대비하여 상대 민감도 및 상대 특이도를 표 4에 나타냈다. 그 결과 실시예 4의 레이슈마니아 신속 면역크로마토그라피법은 표준방법으로 설정한 면역형광시험법 대비 LSH 항체 진단 분석 스트립의 경우는 97.7%의 상대 민감도 및 98.4%의 상대 특이도를 보여주었다. 따라서, 종래 형광현미경을 사용하는 면역형광시험법은 면역크로마토그라피법 대비 10배 내지 100배의 높은 민감도를 보유하고 있다는 점을 감안할 때 본 발명에 따른 레이슈마니아 진단 키트는 우수한 결과를 보였음을 알 수 있었다.

[표 4a] 레이슈마니아 양성 및 음성 검체에 대한 본 발명에 따른 레이슈마니아 진단 키트 평가

KIT 검체명	본 발명의 진단키트	면역형광시험법
KIT 검체명	LSH	IFA LSH
C1	-	음성
C2	1+	양성
C3	-	음성
C4	-	음성
C5	3+	양성
C6	3+	양성
C7	2+	양성
C8	3+	양성
C9	1+	양성
C10	-	음성
C11	-	음성
C12	-	음성
C13	-	음성
C14	3+	양성
C15	-	음성
C16	-	음성
C17	-	음성
C18	1+	양성
C19	2+	양성
C20	2+	양성
C21	1+	양성
C22	-	음성
C23	1+	양성
C24	3+	양성
C25	-	음성
C26	-	음성
C27	-	음성
C28	-	음성
C29	2+	양성
C30	2+	양성
C31	-	음성
C32	-	음성
C33	-	음성
C34	-	음성
C35	3+	양성
C36	1+	양성
C37	-	음성
C38	-	음성
C39	-	음성
C40	3+	양성
C41	-	음성
C42	-	음성
C43	-	음성
C44	-	음성
C45	3+	양성
C46	3+	양성
C47	-	음성
C48	-	음성
C49	-	음성
C50	3+	양성
C51	1+	양성
C52	-	음성

C53	-	음성
C54	1+	양성
C55	-	음성
C56	-	음성
C57	1+	양성
C58	2+	양성
C59	2+	양성
C60	1+	양성
C61	-	음성
C62	-	음성
C63	-	음성
C64	-	음성
C65	3+	양성
C66	1+	양성
C67	-	음성
C68	2+	양성
C69	-	음성
C70	-	음성
C71	-	음성
C72	-	음성
C73	-	음성
C74	-	음성
C75	-	음성
C76	-	음성
C77	-	음성
C78	2+	양성
C79	-	음성
C80	-	음성
C81	-	음성
C82	2+	양성
C83	-	음성
C84	-	음성
C85	1+	양성
C86	-	음성
C87	-	음성
C88	-	양성
C89	1+	양성
C90	3+	양성
C91	-	음성
C92	-	음성
C93	-	음성
C94	-	음성
C95	3+	양성
C96	3+	양성
C97	1+	양성
C98	1+	음성
C99	-	음성
C100	-	음성
C101	-	음성
C102	1+	양성
C103	-	음성
C104	1+	양성
C105	1+	양성
C106	1+	양성
C107	3+	양성

상기 표에서 "-" 는 해당 항목에 레이슈마니아에 감염되지 않음을 의미하며, 1+, 2+, 3+는 해당항목에 레이슈마니아에 감염되었음을 의미함과 동시에 표적물질의 양에 따른 양성 신호의 강도 정도를 의미한다. 즉 숫자가 높을수록 더욱 강한 신호를 보이고 따라서 표적물질의 양이 많이 존재하는 것을 의미하는 것이다. 또한 검체명 C88과 C98은 기존의 알려진 면역형광검사법과 본 발명의 키트검사결과가 일치하지 않았다.

[표 5] 본 발명에 따른 LSH 분석 스트립의 특이도와 민감도

본 발명의 진단키트	IFA
본 발명의 진단키트	양성	음성	합계
양성	43	1	44
음성	1	62	63
합계	44	63	107
상대 민감도 상대 특이도		97.7% 98.4 %

도 1는 재조합 LSH 융합 단백질의 dot-Immunoassay를 통한 항원성 검사.

도 2는 재조합 LSH 융합 단백질의 직접 효소면역 측정법을 통한 항원성 검사.

도 3은 본 발명에 따르는 레이슈마니아 감염 및 진드기 또는 모기매개 질환 동시 진단키트의 검체 적용후의 반응 결과 예를 촬영한 사진.

도 4은 본 발명에 따르는 레이슈마니아 감염 단독 진단키트 검체 적용후의 반응 결과 예를 촬영한 사진.

도 5는 본 발명의 레이슈마니아 감염 및 진드기 또는 모기매개 질환 동시 진단키트의 분해 사시도.

도 6는 본 발명에 따른 진단키트를 구성하는 스트립의 구조.

도 7은 본 발명에 따르는 레이슈마니아 감염 진단 키트의 촬영한 사진.

도 8은 GST-rK39/rK26 키메라 융합 단백질의 서열을 나타내는 도면

도 9는 가용성 재조합 가용성 재조합 LSH rK39/rK26 융합 단백질의 정제된 정기영동사진.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 : 면역분석장치 2 : 분석 스트립

3 : 하부 케이스 4 : 상부 케이스

3 A, 3 B : 제1, 제2 스트립 지지부

]4A, 4B : 제1, 제2 스트립 대응부

21 : 검체 패드 22 : 멤브레인

23 : 흡수 패드 221 : 검사선

222 : 대조선 24 : 단변

25 : 장변 31 : 단변 고정부

32 : 장변 고정부 33 : 하부 차단부

41 : 검체 투입구 42 : 결과 표시창

43 : 문자 표시구

<110> VETALL CO.,LTD. <120> KIT FOR DETECTION OF LEISHMANIA INFECTION <130> DPP-2009-3669-KR <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag 0 <400> 1 gcgcctgcga gcggctaacc agccttgagc agcagcttcg cgaa 44 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag I Sense <400> 2 cttgagcagc agcttcgcga atccgaggag cgcgctgcgg 40 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag I Anti-Sense <400> 3 gcagttgttg ttccagcgtg gccctcgtgt tctcgcggtc ctg 43 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment 1 <400> 4 atccgaggag cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc 60 gtcggcggag caggaccgcg agaacacgag 90 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag II Sense <400> 5 acacgagggc cacgctggaa caacaactgc gagagtcaga agcacgcgc 49 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag II Anti-Sense <400> 6 gcaattgctg ttcgagcgtg gccctcgtgt tctcgcggtc ctgctccg 48 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment 2 <400> 7 cgagagtcag aagcacgcgc tgcggagctg gcgagccagc tggaggccac tgctgctgcg 60 aagatgtcag cggagcagga ccgcgagaac 90 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag III Sense <400> 8 acacgagggc cacgctcgaa cagcaattgc gggatagtga ggaaagagc 49 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag III Anti-Sense <400> 9 tcacgaagct gctgctctag cgtggccctc gtgctctcgc ggtcctgctc c 51 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment 3 <400> 10 cgggatagtg aggaaagagc tgcggagctg gcgagccagc tggagtccac tactgctgcg 60 aagatgtcag cggagcagga ccgcgagagc 90 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag IV Sense <400> 11 gcacgagggc cacgctagag cagcagcttc gtgactccga ggagcgcgct 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag IV Anti-Sense <400> 12 tcgcgaagct gctgctctag tgtagcgcta gtagattccc gatcttgttc 50 <210> 13 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<400> 19 gatgaattcg cctgcgagcg gctaaccagc 30 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK39 pGEX AS primer1 <400> 20 ggccgctcga gtcgacttat gtagcgctag tagattcccg 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK39 pGEX AS primer2 <400> 21 cgggaatcta ctagcgctac agcggccgca ctcgagcacc 40 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag I+II AS <400> 22 cgggatcccg tggccctcgt gttctcgc 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag III+IV S <400> 23 cgggatccct cgaacagcaa ttgcggga 28 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag III+IV AS <400> 24 ccatcgatgg tgtagcgcta gtagattccc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag V+VI S <400> 25 ccatcgatgg ctagagcagc agcttcgcga 30 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag V+VI AS <400> 26 cccaagcttc gcggccctcg tgttctcgc 29 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Frag VII S <400> 27 cccaagcttt tggagcagca gcttcgtga 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK26_Sense 1 <400> 28 cccaagcttc ctaaggagga cggccgtac 29 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK26_Sense 2 <400> 29 actcgagcac cgcggccgcc taaggaggac ggccgtac 38 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rK26 pGEX4T AS primer <400> 30 ggccgctcga gtcgacttag ccatcgccgt catttttctg 40 <210> 31 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K39 repeat unit <400> 31 Leu Glu Gln Gln Leu Arg Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu Gln Asp 20 25 30 Arg Glu Asn Thr Arg Ala Thr 35 <210> 32 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K39 repeat unit <400> 32 Leu Glu Gln Gln Leu Arg Glu Ser Glu Ala Arg Ala Ala Glu Leu Ala 1 5 10 15 Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp 20 25 30 Arg Glu 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Arg Glu Asn Thr Arg Ala Ala Leu Glu Gln Gln Leu Arg 225 230 235 240 Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr 245 250 255 Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Arg Ala 260 265 270 Thr <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K26 repeat unit <400> 37 Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K26 repeat unit <400> 38 Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Asp Gly Gly 1 5 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K26 repeat unit <400> 39 Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asn Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K26 repeat unit <400> 40 Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Ala 1 5 10 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH K26 repeat unit <400> 41 Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 42 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> native LSH K26 <400> 42 Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly Pro Lys 1 5 10 15 Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Asp Gly Gly Pro Lys Glu Asp 20 25 30 Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly Pro Lys Glu Asp Gly Arg 35 40 45 Thr Gln Lys Asn Asn Gly Asp Gly Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln 50 55 60 Lys Asn Asp Gly Asp Ala Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn 65 70 75 80 Asp Gly Asp Gly Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly 85 90 95 Asp Gly Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 100 105 110 Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly Pro Lys 115 120 125 Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly Pro Lys Glu Asp 130 135 140 Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Gly Gly Gly 145 150 <210> 43 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH rK26 (28 AA) <400> 43 Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Asp Gly Gly Pro Lys 1 5 10 15 Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 20 25 <210> 44 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH rK26 (87 bp) <400> 44 cctaaggagg acggccgtac acagaaaaac gacgacggtg gccctaagga ggacggccat 60 acacagaaaa atgacggcga tggctaa 87 <210> 45 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39 (7ea, 290 AA) <400> 45 Asp Glu Phe Ala Cys Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 1 5 10 15 Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr 20 25 30 Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Glu Ser Glu Ala Arg Ala Ala Glu Leu 50 55 60 Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 65 70 75 80 Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Thr Gly Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 85 90 95 Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Arg Ala 115 120 125 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 145 150 155 160 Asp Arg Glu Ser Thr Ser Ala Thr His Arg Trp Leu Glu Gln Gln Leu 165 170 175 Arg Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser 180 185 190 Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Ser 195 200 205 Ala Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu 210 215 220 Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu 225 230 235 240 Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Ala Lys Leu Leu Glu Gln Gln Leu 245 250 255 Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser 260 265 270 Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Ser 275 280 285 Ala Thr 290 <210> 46 <211> 889 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39 (889 bp) <400> 46 gatgaattcg cctgcgagcg gctaaccagc cttgagcagc agcttcgcga atccgaggag 60 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 120 caggaccgcg agaacacgag ggccacgctg gaacaacaac tgcgagagtc agaagcacgc 180 gctgcggagc tggcgagcca gctggaggcc actgctgctg cgaagatgtc agcggagcag 240 gaccgcgaga acacgagggc cacgggatcc ctcgaacagc aattgcggga tagtgaggaa 300 agagctgcgg agctggcgag ccagctggag tccactactg ctgcgaagat gtcagcggag 360 caggaccgcg agagcacgag ggccacgcta gagcagcagc ttcgtgactc cgaggagcgc 420 gctgcggagc tggcgagcca gctggagtcc actactgctg cgaagatgtc agcggaacaa 480 gatcgggaat ctactagcgc tacacatcga tggctagagc agcagcttcg cgaatccgag 540 gagcgcgctg cggagctggc gagccagctg gagtccacta ctgctgcgaa gatgtcagcg 600 gaacaagatc gggaatctac tagcgctaca ctagagcagc agcttcgtga ctccgaggag 660 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 720 caggaccgcg agaacacgag ggccgcgaag cttttggagc agcagcttcg tgactccgag 780 gagcgcgctg cggagctggc gagccagctg gagtccacta ctgctgcgaa gatgtcagcg 840 gaacaagatc gggaatctac tagcgctaca taagtcgact cgagcggcc 889 <210> 47 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39/rK26 1 (279 AA) <400> 47 Asp Glu Phe Ala Cys Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 1 5 10 15 Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr 20 25 30 Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Glu Ser Glu Ala Arg Ala Ala Glu Leu 50 55 60 Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 65 70 75 80 Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Thr Gly Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 85 90 95 Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Arg Ala 115 120 125 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 145 150 155 160 Asp Arg Glu Ser Thr Ser Ala Thr His Arg Trp Leu Glu Gln Gln Leu 165 170 175 Arg Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser 180 185 190 Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Ser 195 200 205 Ala Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu 210 215 220 Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu 225 230 235 240 Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Ala Lys Leu Pro Lys Glu Asp Gly 245 250 255 Arg Thr Gln Lys Asn Asp Asp Gly Gly Pro Lys Glu Asp Gly His Thr 260 265 270 Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 275 <210> 48 <211> 856 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39/rK26 1 (856 bp) <400> 48 gatgaattcg cctgcgagcg gctaaccagc cttgagcagc agcttcgcga atccgaggag 60 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 120 caggaccgcg agaacacgag ggccacgctg gaacaacaac tgcgagagtc agaagcacgc 180 gctgcggagc tggcgagcca gctggaggcc actgctgctg cgaagatgtc agcggagcag 240 gaccgcgaga acacgagggc cacgggatcc ctcgaacagc aattgcggga tagtgaggaa 300 agagctgcgg agctggcgag ccagctggag tccactactg ctgcgaagat gtcagcggag 360 caggaccgcg agagcacgag ggccacgcta gagcagcagc ttcgtgactc cgaggagcgc 420 gctgcggagc tggcgagcca gctggagtcc actactgctg cgaagatgtc agcggaacaa 480 gatcgggaat ctactagcgc tacacatcga tggctagagc agcagcttcg cgaatccgag 540 gagcgcgctg cggagctggc gagccagctg gagtccacta ctgctgcgaa gatgtcagcg 600 gaacaagatc gggaatctac tagcgctaca ctagagcagc agcttcgtga ctccgaggag 660 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 720 caggaccgcg agaacacgag ggccgcgaag cttcctaagg aggacggccg tacacagaaa 780 aacgacgacg gtggccctaa ggaggacggc catacacaga aaaatgacgg cgatggctaa 840 gtcgactcga gcggcc 856 <210> 49 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39/rK26 2 (320 AA) <400> 49 Asp Glu Phe Ala Cys Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 1 5 10 15 Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr 20 25 30 Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala 35 40 45 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Glu Ser Glu Ala Arg Ala Ala Glu Leu 50 55 60 Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 65 70 75 80 Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Thr Gly Ser Leu Glu Gln Gln Leu Arg 85 90 95 Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Arg Ala 115 120 125 Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu 130 135 140 Ala Ser Gln Leu Glu Ser Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln 145 150 155 160 Asp Arg Glu Ser Thr Ser Ala Thr His Arg Trp Leu Glu Gln Gln Leu 165 170 175 Arg Glu Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser 180 185 190 Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Ser 195 200 205 Ala Thr Leu Glu Gln Gln Leu Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu 210 215 220 Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ala Lys Ser Ser Ala Glu 225 230 235 240 Gln Asp Arg Glu Asn Thr Arg Ala Ala Lys Leu Leu Glu Gln Gln Leu 245 250 255 Arg Asp Ser Glu Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Leu Glu Ser 260 265 270 Thr Thr Ala Ala Lys Met Ser Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ser Thr Ser 275 280 285 Ala Thr Arg Pro Pro Lys Glu Asp Gly Arg Thr Gln Lys Asn Asp Asp 290 295 300 Gly Gly Pro Lys Glu Asp Gly His Thr Gln Lys Asn Asp Gly Asp Gly 305 310 315 320 <210> 50 <211> 979 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LSH-GST rK39/rK26 2 (979 bp) <400> 50 gatgaattcg cctgcgagcg gctaaccagc cttgagcagc agcttcgcga atccgaggag 60 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 120 caggaccgcg agaacacgag ggccacgctg gaacaacaac tgcgagagtc agaagcacgc 180 gctgcggagc tggcgagcca gctggaggcc actgctgctg cgaagatgtc agcggagcag 240 gaccgcgaga acacgagggc cacgggatcc ctcgaacagc aattgcggga tagtgaggaa 300 agagctgcgg agctggcgag ccagctggag tccactactg ctgcgaagat gtcagcggag 360 caggaccgcg agagcacgag ggccacgcta gagcagcagc ttcgtgactc cgaggagcgc 420 gctgcggagc tggcgagcca gctggagtcc actactgctg cgaagatgtc agcggaacaa 480 gatcgggaat ctactagcgc tacacatcga tggctagagc agcagcttcg cgaatccgag 540 gagcgcgctg cggagctggc gagccagctg gagtccacta ctgctgcgaa gatgtcagcg 600 gaacaagatc gggaatctac tagcgctaca ctagagcagc agcttcgtga ctccgaggag 660 cgcgctgcgg agctggcgag ccagctggag gccactgctg ctgcgaagtc gtcggcggag 720 caggaccgcg agaacacgag ggccgcgaag cttttggagc agcagcttcg tgactccgag 780 gagcgcgctg cggagctggc gagccagctg gagtccacta ctgctgcgaa gatgtcagcg 840 gaacaagatc gggaatctac tagcgctaca cggccgccta aggaggacgg ccgtacacag 900 aaaaacgacg acggtggccc taaggaggac ggccatacac agaaaaatga cggcgatggc 960 taagtcgact cgagcggcc 979

Claims

SEQ ID NO: 31 내지 SEQ ID NO: 35로 이루어진 5개 반복단위가 각각 1회 내지 3회 반복되며, 아미노산 195개 내지 360개로 이루어지는 레이슈마니아 균주(LEISHMANIA: LSH) K39 유래 펩티드(A); 및

SEQ ID NO: 37 내지 SEQ ID NO: 41로 이루어진 반복단위중에서 선택된 2종 이상의 반복단위로 이루어지는 레이슈마니아 균주K26 유래 펩티드(B)을 포함하는 레이슈마니아종(leishmania species)에 특이적이며 가용성인 융합 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 K39 유래 펩티드(A)는 N 말단부터 순차적으로 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 및 SEQ ID NO: 35로 이루어지는 아미노산서열을 포함하는 융합 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 K39 유래 펩티드(A)는 SEQ ID NO:45의 아미노산 서열중 1번째 아미노산 내지 250번째 아미노산을 포함하며, 연속적인 아미노산 250개 내지 290개로 이루이지는 아미노산 서열을 포함하는 융합 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 K26 유래 펩티드(B)는 SEQ ID NO: 37 및 SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 융합 펩티드.
제4항에 있어서, 상기 K26 유래 펩티드(B)는 SEQ ID NO: 43의 아미노산서열을 포함하는 융합 펩티드.
제1항에 있어서, 상기 융합펩티드는 SEQ ID NO: 47 또는 SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 융합 펩티드.
제6항에 있어서, 상기 융합펩티드는 SEQ ID NO: 48 또는 SEQ ID NO: 50의 염기서열에 의해 암호화되는 펩티드인 융합 펩티드.
제1항 내지 7항중 어느 한항에 따른 레이슈마니아종(leishmania species)에 특이적이며 가용성인 융합 펩티드를 포함하는 레이슈마니아종(leishmania species) 감염의 탐지키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 촉매, 효소, 효소기질, 형광화합물, 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄졸으로 이루어진 군에서 선택된 표지수단을 추가로 포함하는 탐지키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 검체와 상기 융합 펩티드와 항원-항체반응을 이용하여 레이슈마니아종 감염를 탐지하는 탐지키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 사람, 개 및 고양이 검체의 레이슈마니아종 감염을 탐지하는 탐지키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 효소면역 측정키트(ELISA), 블롯팅 키트(Blotting), 면역침전키트, 면역형광검사 키트, 또는 면역 스트립 키트인 탐지키트. //방법으로 할려면 면역 스트립을 방법으로 표현해야 하고, 키트면 모두 키트로 포함해야 합니다.확인부탁드립니다.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 검체를 흡수하는 검체 패드와 검출 결과를 나타내는 멤브레인 및 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드를 포함하며, 단변의 폭과 장변의 길이를 가지는 분석 스트립을 하나 이상 포함하는 면역 스트립인 탐지키트.
제 8 항에 있어서, 상기 키트는 분석 스트립을 둘 이상포함하며, 하나의 분석 스트립의 펨브레인에 상기 에를리히아 균주에 특이적이며 가용성(soluble)인 융합 펩티드를 고정하고, 다른 분석 스트립의 멤브레인은 추가의 항원을 고정하하여 2이상의 균주를 탐지하는 것인 탐지키트.
제 14 항에 있어서, 상기 면역 스트립은 검체를 흡수하는 검체 패드와 검출 결과를 나타내는 멤브레인 및 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드를 포함하며, 단변의 폭과 장변의 길이를 가지는 분석 스트립;

상기 분석 스트립의 일면을 지지하는 하부 케이스; 및

상기 하부 케이스에 결합되어 상기 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 상기 검체 패드에 대응하는 검체 투입구와 상기 멤브레인에 대응하는 결과 표시창 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함하는 상부 케이스를 포함하는 면역 스트립인 탐지키트.