WO2016055836A1

WO2016055836A1 - Processo de produção e uso da proteína rk39-kddr e kit para diagnóstico de leishmaniose

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Publication number: WO2016055836A1
Application number: PCT/IB2014/065188
Authority: WO
Inventors: Ricardo Toshio FUJIWARA; Daniella Castanheira BARTHOLOMEU; Lilian Lacerda BUENO; Lucas De Carvalho Dhom LEMOS; João Luis Reis CUNHA; Tiago António De Oliveira MENDES
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais- Fapemig
Priority date: 2014-10-09
Filing date: 2014-10-09
Publication date: 2016-04-14

Abstract

A presente tecnologia descreve um novo processo de expressão heteróloga da porção repetitiva da kinesina, com o uso de primers específicos, os quais permitiram a construção de um antígeno recombinante com 7.5 motivos repetitivos da K39 associados a um motivo repetitivo degenerado chamado de KDDR (Kinesin Degenerated Derived Repeat). Ainda, a tecnologia descreve o uso desse antígeno (K39-KDDR) no diagnóstico de leishmaniose e como vacina e um Kit diagnóstico contendo o mesmo antígeno.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO E USO DA PROTEÍNA rK39-KDDR E KIT PARA DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE

Atualmente, a leishmaniose é uma das principais doenças parasitárias reconhecida pela Organização Mundial de Saúde e que afeta anualmente aproximadamente 2 milhões de pessoas no mundo. Testes de diagnóstico confiáveis, capazes de detectar indivíduos infectados por Leishmania infantum são cruciais para o controle da transmissão da leishmaniose visceral (LV). A leishmaniose visceral requer um teste de alta especificidade para se iniciar o processo de tratamento com quimioterápicos (Chappuis F, Sundar S, et al. Nat Rev Microbiol. 2007 Nov;5(1 1 ):873-82.), uma vez que o tratamento é extremamente nocivo. Além disso, esse teste diagnóstico precisa ter alta sensibilidade, devido a grande proporção de indivíduos residentes em áreas endémicas que possuem a doença na forma assintomática. Por apresentarem baixas titulações de anticorpos, se passam muitas vezes por falsos negativos em testes sorológicos (Faria AR, Costa MM, et al. PLoS Negl Trop Dis. 201 1 Sep; 5(9):e1310). Em 1993 Burns JM Jr, Shreffler WG, et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 1993 Jan 15;90(2):775-9 (US005719263) caracterizaram um antígeno relacionado à molécula de kinesina de L. infantum que possuía uma série de repetições de 39 aminoácidos denominado rK39. Atualmente esse antígeno recombinante é um dos que apresenta excelente sensibilidade (93-100%) e especificidades (97-98%) em testes de ELISA realizados em vários países endémicos para a LV (Braz RF, Nascimento ET, et al. Am J Trop Med Hyg. 2002 Oct;67(4):344-8; Badaró R, Benson D, et al. J Infect Dis. 1996 Mar;173(3):758-61 ; Qu JQ, Zhong L, et al. Trans R Soe Trop Med Hyg. 1994 Sep-Oct;88(5):543-5; Singh S, Gilman-Sachs A, et al. J Parasitol. 1995 Dec;81 (6):1000-3; Kurkjian KM, Vaz LE, Haque R, et al. Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Dec;12(12):1410-5; Costa MM, Penido M, et al. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6(5):e1622). Entretanto, esse antígeno tem sido menos eficiente em algumas regiões, como por exemplo, no leste da África. De algum modo, pacientes residentes em áreas endémicas do Sudão apresentam baixos títulos de anticorpos contra a rK39 quando comparados com pacientes indianos (Chappuis F, Sundar S, et al. Nat Rev Microbiol. 2007 Nov;5(1 1 ):873-82). Diante disso, neste trabalho propomos uma nova técnica de expressão heteróloga da porção repetitiva da kinesina, visando, sobretudo a construção de um antígeno recombinante que possua 7.5 motivos repetitivos da K39 associados a um motivo degenerado que chamamos de KDDR (Kinesin Degenerated Derived Repeat). Com o uso de primers específicos contendo em suas extremidades sítios de restrição para facilitação da transferência de amplicons em vetores de clonagem e expressão, foi possível produzir um antígeno recombinante que se mostrou, a partir de dados preliminares de ELISA, ser ainda mais eficaz que a atual rK39, possivelmente devido à presença da KDDR. Além disso, identificamos um potencial da rK39-KDDR ser utilizada como vacina a partir de dados obtidos de análises de bioinformática, como a predição de epítopos de linfócitos B e T (linfócitos T CD4⁺ e T CD8⁺), que indicaram a presença de muitos epítopos de células B e T ao longo da proteína Kinesina e principalmente nas regiões que correspondem à rK39- KDDR.

Além dos artigos científicos acima citados, existem no estado da técnica diversos documentos de patente que descrevem o uso do antígeno K39, bem como suas repetições ou associações a outros peptídeos, no diagnóstico da leishmaniose e como vacina. Como exemplo, o documento US005719263 descreve a descoberta de um antígenos de 230 Kd (K39) em Leishmania chagasi e Leishmania donovani, e um polipeptídeo compreendendo uma pluralidade de K39 e composições vacinais contendo esse peptídeo. O documento US2010008924 descreve uma proteína de fusão contendo os antígenos K26, K39 e K9 para ser usada no diagnóstico de leishmaniose visceral. O documento KR201 10017610 descreve um peptídeo de fusão contendo peptídeos derivados de K39, de Leishmania sp., compreendendo 195-360 aminoácidos com unidades repetitivas da sequência 31 -35. No entanto, nenhum dos documentos encontrados compromete a presente invenção, uma vez que, apesar dela apresentar um antígeno que compreende sequências repetitivas de K39, a última sequência repetitiva (KDDR) desse antígeno apresentou diferenciação de aminoácidos da K39 já descrita. Sendo essa diferenciação vantajosa já que o antígeno aqui descrito apresentou melhores resultados no diagnóstico de Leishmaniose, quando comparado com a K39 já descrita. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Desenho esquemático do cromossomo 14 de L infantum. O cromossomo 14 contém o gene que codifica a proteína Kinesina (LiKin), uma proteína relacionada à movimentação do flagelo que é expressa tanto nas formas amastigotas quanto nas formas promastigotas.

Figura 2. Gel de agarose a 1% do produto da PCR do DNA genômico de L. infantum. Bandas mais fortes contendo amplicons de tamanho esperado (1080pd) são excisados para clonagem em vetor de clonagem pGEM®-T.

Figura 3. Gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) para a separação das amostras de bactérias estimuladas com IPTG e não estimuladas e teste de solubilidade. A canaleta 1 :corresponde à amostra de bactérias não induzidas; 2: amostra de bactérias com três horas de indução com IPTG a 1 mM; 3: amostra de bactérias não transformadas (E. coli); 4: fração solúvel do teste de solubilidade e 5: fração insolúvel do teste de solubilidade.

Figura 4. Gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) para a confirmação da purificação por cromatografia de afinidade da proteína K39-KDDR. As bandas fortes na altura dos 40KDa correspondem à K39-KDDR.

Figura 5. Curva de eluição após purificação por cromatografia de afinidade da proteína K39-KDDR. O pico de absorbância ocorreu entre as frações 9 e 16, indicando a presença da proteína K39-KDDR nas respectivas frações. Figura 6. Gráfico comparativo dos ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) da K39-KDDR e rK39 utilizando soros caninos comprovadamente negativos e positivos para a LVC. Os CUTOFFs foram calculados pela soma da média das absorbâncias mais dois desvios-padrão. O sinal positivo (+) indica um n^Q de 41 cães comprovadamente positivos para a LVC e o sinal negativo (-) indica um n° de 39 cães comprovadamente negativos para a LVC.

Figura 7. Predição de epítopos lineares de células B (BepiPred), MHCI, MHCII e grau de desordem (lUPred) da proteína LiKin. A régua acima representa a proteína LiKin em toda sua extensão. O primeiro retângulo abaixo da régua indica a região onde se situa a K39-KDDR na proteína LiKin. Os demais retângulos abaixo indicam a posição dos epítopos preditos ao longo da sequência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente tecnologia descreve um novo processo de expressão heteróloga da porção repetitiva da kinesina através dos primers, representados pelas sequências SEQ ID N^Q1 (GCTAGCCGTGAAAGCGCCTGC) e SEQ ID N^Q2 (CTCG AGTCAGGCCTCCAGCTG A) , os quais são capazes de anelar dentro da região repetitiva da Kinesina de L. infantum. Esses primers permitiram produzir um antígeno recombinante contendo 7,5 motivos repetitivos de K39 associados a um motivo degenerado chamado de KDDR (Kinesin Degenerated Derived Repeat) onde um único motivo de K39 compreende a sequência de aminoácidos de uma letra

LEQQLR(D/E)SE(E/A)RAAELASQLE(A/S)T(A/T)AAK(M/S)SAEQDRE(N/S)TRA (T/A). Ainda, a tecnologia descreve o uso desse antígeno (K39-KDDR) representado por SEQ ID N^Q3, no diagnóstico de leishmaniose, como vacina e na composição de um Kit diagnóstico de leishmaniose.

Para melhor compreensão da tecnologia seguem os exemplos, não limitantes:

Exemplo 1- Obtenção de DNA genômico de L. infantum Para extração de DNA genômico foi utilizado o kit GFXTM Genomic Blood DNA Purification (GE Healthcare) seguindo o protocolo do fabricante.

Foram utilizados em cada extração 10⁸ promastigotas de L. infantum cepa BH46 cultivadas em meio LIT. As formas promastigotas foram submetidas à centrifugação a 3.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5804 R) a 4°C por 10 minutos. Após essa centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado duas vezes com 10 mL de PBS com centrifugação a 3.000 rpm (Eppendorf centrifuge 5804 R) a 4°C por 10 minutos em cada lavagem. A 300 uL de cada amostra foi adicionado 20 uL de proteinase K e 400 uL do tampão de lise, seguido de vortexação por 15 segundos e incubação por 10 minutos em temperatura ambiente. DNA genômico foi separado da mistura inicial por sua afinidade a uma coluna de sílica. A coluna com o DNA ligado foi lavada 3 vezes com tampão de lavagem. O DNA extraído foi eluído da coluna de sílica com água milliQ autoclavada, quantificado no espectrofotômetro NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000.

A sequência de DNA da K39-KDDR apresenta características singulares em relação a K39. Possui 7,5 motivos repetitivos de 39 aminoácidos (Tabela 1 .

- sublinhado simples em preto), em quanto que a rK39 possui apenas 6.5 como descrito por Burns JM Jr, Shreffler WG, et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 1993 Jan 15;90(2):775-9.

Além disso, um motivo repetitivo degenerado chamado KDDR (Kinesin

Degenerated Derived Repeat), cuja sequência de aminoácidos está destacada em cinza na tabela 1 , apresenta-se associado aos motivos de K39.

Provavelmente, o fato da K39-KDDR apresentar um motivo de K39 a mais e conter o motivo KDDR pode estar relacionado à sua melhor eficiência nos testes de ELISA em relação a rK39. A K39-KDDR possui um total de 1 080 pares de bases preditos e 360 aminoácidos. Seu peso molecular total predito é de 40 KDa e seu ponto isoelétrico (PI) de 4,67.

Exemplo 2- Desenho de primers que flanqueiam a região repetitiva da LiKin para a amplificação de amplicons utilizados na expressão heteróloga Pela primeira vez, primers específicos para a região repetitiva da LiKin foram desenhados e testados por meio da amplificação por PCR. Para permitir que o primer reverso se anele especificamente dentro da porção repetitiva, sem que ocorra sucessivos anelamentos inespecíficos, devido à similaridade entre as sequências de nucleotídeos dentro dessa porção, foi necessário encontrar pelo menos um nucleotídeo degenerado entre os motivos repetitivos (Figurai.). Com o uso de ferramentas de bioinformática (Larkin MA, Blackshields G, et al. Bioinformatics. 2007 Nov 1 ;23(21):2947-8), foi encontrado um nucleotídeo T degenerado. Com isso, nosso primer reverso pode ser desenhado de modo a anelar em cima do nucleotídeo T degenerado (Figurai.). À extremidade 5^X de cada primer foram adicionados sítios de restrição para facilitar a transferência dos amplicons entre os vetores de clonagem pGEM^®-T (Promega) e de expressão pET28a-TEV.

Tabela 1- Sequência de DNA e proteica da construção K39-KDDR atgggccatc ate ate ate te aeg ag a a te tgt a tttcc agg e atatgcgtg a a age

M G H H H H - H M R E S

g e e tg e g a g c g ge taaceagce tt g a g e a g c a ge t te gc g a a te e g a gg a g c g eg c tg cg

A C E R T S R S E E R Á Á

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E Ii A S Q L E A T A A A K S S A E Q D R

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E R A T S E A R A A E

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L A S Q IL E A T A A A K M S A E Q D R E

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N T R A T IL E Q Q IL R D S E E R A A E IL

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Q I. E S T T A A K M S A E Q D R E S T

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L E S T T A A K M S A E Q D R E S T R A

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E S T T A A K M S A E Q D R E N T R A T

eta geage e tegtg a eeg aggag geg tgegg ag tg gagee agetggga

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g age ageag ttegtg aete g agg agegegeeg gg agetggeg a g te ag tgg aggee

tg aetegag OBs.: Em letra minúscula a sequência de DNA do gene da K39-KDDR (1080pb); em letra maiúscula a sequência de aminoácidos da proteína K39-KDDR (360aa), onde um único motivo de K39 compreende a sequência de aminoácidos de uma letra

LEQQLR(D/E)SE(E/A)RAAELASQLE(A/S)T(A/T)AAK(M/S)SAEQDRE(N/S)TRA(T/A); sublinhado simples estão os motivos repetitivos de 39 aminoácidos da K39 e sublinhado duplo corresponde a cauda His-tag; a sequência de letras maiúsculas destacadas em cinza corresponde ao motivo degenerado KDDR; as letras maiúsculas em negrito dentro do motivo KDDR correspondem aos aminoácidos degenerados.

As amplificações por PCR foram realizadas utilizando como template 150ng de DNA genômico de formas promastigotas de L. infantum (BH 46), com o tampão Green GoTaq®Reaction Buffer (Promega) 1 x; 200μΜ de dNTP; 10ng de cada um dos primers forward e reverse; e 1 ,25U de Tap DNA Polimerase (Phoneutria Biotecnologia e Serviços Ltda), em um volume final de 30 μΙ_ de reação.

Os amplicons (1080 pb) obtidos nas PCRs foram submetidos à separação em gel de agarose 1 % a 120v em tampão TAE 1 X (4,8g/L Tris-base pH8,0; 1 ,14ml_ ácido acético glacial; 2ml_ EDTA 0,5M), contendo brometo de etídio (0,3 μς/μί). Foi utilizado padrão de 1 kb.

Na Figura 2 as bandas mais fortes (destacadas) se encontram sutilmente acima da banda 1000pb do padrão, indicando boa especificidade dos primers quanto ao anelamento nas regiões esperadas (1093-2121 ) no gene da kinesina (ID- CAM66679.2). Outra banda mais fraca aparece na altura dos 1500pb indicando que o primer reverso anela-se ainda mais adentro da porção repetitiva da kinesina.

Após a separação em gel de agarose, as bandas de tamanho esperado foram excisadas, utilizando uma lâmina de bisturi. O bloco de agarose obtido foi submetido ao protocolo do QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen), para obtenção do DNA purificado.

Exemplo 3- Ligação dos amplicons purificados ao vetor de clonagem pGEM®-T Os amplicons purificados foram clonados no vetor pGEM@-T (Promega), através de incubação por 16 horas a 4°C com a enzima T4-ligase, seguindo as instruções do fabricante (T4 DNA Ligase - Promega). Devido à presença do gene de resistência a ampicilina no vetor, esse antibiótico foi utilizado para seleção de transformantes positivos.

Após a ligação desses amplicons ao vetor pGEM®-T, esse vetor contendo o inserto foram transformados em bactérias E. coli àa linhagem XL1 - Blue (Phoneutria). Cerca de 20ul_ dos sistemas de ligação foram incubados por 5 minutos no gelo com 50μΙ_ de bactérias Escherichia coli, das cepas XL1 -Blue (Phoneutria), ou BL-21 Star, eletrocompetentes. Após este período, as amostras foram transferidas para MicroPulserCuvettes (Bio-Rad) de 0,1 cm, e submetidas a um pulso (2,50kV) em um eletroporador MicroPulser (Bio-Rad). Após a eletroporaçao, foram adicionados 300 μΙ_ do meio de cultura 2xYT líquido, seguido por incubação durante uma hora a 37^QC em agitação a 180rpm (rotações por minuto). Após este período, as amostras foram plaqueadas em meio sólido 2xYT-ágar 1 ,5% com ampicilina (100 pg/mL) caso o vetor utilizado tenha sido o pGEM ou kanamicina (50pg/ml_) no caso do vetor pET28a-TEV. As placas foram colocadas em estufa durante 12-16 horas, para obtenção de colónias isoladas.

Os clones positivos obtidos foram inoculados em 3-4 mL de meio 2xYT, contendo o antibiótico específico para cada vetor, e cultivados durante 12-16 horas a 37°C em agitação de 180 rpm. A extração dos plasmídeos foi realizada utilizando o kit QIAprep®Spin Miniprep Kit (Qiagen).

Exemplo 4- Sequenciamento das montagens clonadas em pGEM®-T

O sequenciamento dos clones positivos foi realizado pela empresa Macrogen (Seul, Coréia do Sul) em sequenciador automático ABI Prism®3730xl DNA Analyser (AppliedBiosystems), utilizando os primers M13 forward e reverso para o vetor pGEM@-T. As sequências obtidas foram processadas pelo pacote PhredPhrapConsed (Ewing B, Green P. Genome Research 8:186-194, 1998; Gordon, David, A. D. Baxevanis. in Current Protocols in Bioinformatics. 2004, 1 1 .2.1 -1 1 .2.43) para formação de contigs, retirada de sequências de baixa qualidade e sequências do vetor. Após o processamento, as sequências foram submetidas à pesquisa de homologia usando o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Altschul SF, Gish W, J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.) contra o banco de dados "Nucleotidecollection (nr/nt)" do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e contra todos os bancos de genoma do Tritrypdb (Aslett M, Aurrecoechea C. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38 Database issue:D457-62.), para confirmação da identidade dos genes clonados.

Com a identidade confirmada como correta, prosseguiu-se com a subclonagem desses insertos nos vetores de expressão (pET28a-TEV).

Exemplo 5- Digestão dos vetores de clonagem e expressão com enzimas de restrição Os plasmídeos pGEM contendo os insertos, assim como o vetor de expressão pET28a-TEV foram submetidos a dupla digestão, durante 16 horas à 37°C, com as enzimas de restrição específicas para cada amplicon. Após a digestão, as amostras foram submetidas à eletroforese e purificação em gel de agarose, como previamente descrito. Exemplo 6- Ligação ao vetor de expressão pET28a-TEV

O vetor de expressão pET28a-TEV, produzido no centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas/SP), possui o gene de resistência à kanamicina, para seleção positiva dos transformantes.

A ligação entre os fragmentos obtidos do pGEM por digestão enzimática e o vetor pET28a-TEV, também digerido com as mesmas enzimas de restrição, foi realizada através de suas extremidades coesivas, por incubação a 4°C durante 16 horas com a enzima T4 Ligase (Promega) em tampão específico (Tris-HCI 30mM (pH 7.8 a 25°C), MgCI2 10mM, DTT 10mM e ATP 10mM). Após a incubação, o produto de ligação foi utilizado na transformação de bactérias BL-21 Star através de eletroporação.

Exemplo 7- Indução da expressão das proteínas recombinantes

Colónias isoladas de BL-21 Star contendo o plasmídeo pET28a-TEV tendo como inserto um dos genes que codificam para as proteínas hipotéticas de interesse, foram inoculadas em 3 ou 20mL de meio 2xYT líquido contendo kanamicina (50pg/ml_) e incubadas por 14-16 horas sob a agitação de 180 rpm. Após este período, os inóculos foram diluídos 1 :20 em 10 ou 400ml_ de meio 2xYT/kanamicina (50pg/ml_) e incubados a 37°C a 180 rpm até atingirem DO600 (Densidade óptica) de 0,6 a 0,8. A expressão das proteínas recombinantes foi induzida através da adição de 1 mM IPTG (Invitrogen), sendo a cultura, então, incubada por 3 horas a 37°C a 180rpm ou 16 horas a 30°C a 180rpm. Após as 3 horas de indução, a cultura foi centrifugada a 3000 rpm, por 25 minutos a 4°C em centrífuga Eppendorf 5804R, congelada em nitrogénio líquido e armazenada a -80oC. Alíquotas da cultura imediatamente antes da adição de IPTG, e após 3 horas de expressão, foram também congeladas.

Exemplo 8- Teste de solubilidade

Os sedimentos celulares mantidos a -80°C foram descongelados em gelo e resuspendidos em 5 ml_ de PBS (NaCI 137 mM; KCI 2,7 mM; Na2HPO4 10mM; KH2PO4 1 ,8 mM; pH 7,4) para cada 50 mL de cultura, na presença de Lisozima (100 pg/mL), sendo, então, homogeneizados e deixados em repouso por 15 minutos. Após o repouso, as alíquotas foram submetidas a 4-5 ciclos de congelamento em nitrogénio líquido e descongelamento em banho-maria a 37°C e passadas exaustivamente em seringas de insulina (1 ml_/cc,261/2 G, 13x0,45), para fragmentação de seu DNA genômico. As amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 14.000 rpm (Eppendorf 5804R) a 4°C, para separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel (pellet). Amostras destas duas frações foram analisadas em eletroforese gel de poliacrilamida- SDS para a avaliação de qual fração a proteína recombinante se encontra. Quando a proteína se apresentou insolúvel, foi adicionado ao tampão de re- suspensão 8 Molar de uréia para torná-la solúvel.

Analisando a Figura 3 veremos que as bactérias não estimuladas com IPTG já apresentaram uma produção basal significativa da proteína K39-KDDP. Após 3 horas de estímulo essas bactérias apresentaram um aumento notável na expressão da K39-KDDR (Figura 3. -2).

O teste de solubilidade revelou que a K39-KDDR é uma proteína solúvel

(Figura 3. -4 e 5), visto que é encontrada praticamente apenas na fração solúvel. Tal característica é uma excelente vantagem para a posterior purificação, uma vez que não será necessário o tratamento prévio com ureia, método este que aumenta drasticamente a perda de proteína a ser purificada.

Exemplo 9- Purificação de proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade

O extrato proteico da fração sobrenadante do teste de solubilidade foi aplicado em uma coluna HisTrap HP de 1 mL (GE Healthcare Life Sciences). A coluna foi primeiramente lavada com 5 volumes de coluna com tampão A (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 30mM). A eluição foi realizada através da adição do tampão B (fosfato de sódio 20mM; NaCI 500mM; imidazol 500mM). O imidazol na concentração de 500mM, compete com a cauda de histidina pela ligação ao níquel na coluna, liberando a proteína recombinante da coluna e permitindo sua obtenção na fração eluida. Todas as frações obtidas que compreendem toda a extensão do pico de absorbância observado durante a eluição foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida- SDS.

Na Figura 5 nota-se que o aumento da absorbância durante a eluição da proteína ligada à coluna His-trap começa a acentuar-se na fração 9 até atingir o seu auge na fração 1 1 e posteriormente na fração 13, mantendo-se constante até o final da eluição. A presença de bandas fortes na altura dos 40 KDa (Figura 4) após a corrida de alíquotas dessas frações em gel de poliacrilamida- SDS (SDS-PAGE) corroborou com os resultados achados na curva de eluição.

Exemplo 10- Teste de ELISA

Os ensaios de ELISA foram realizados utilizando a proteína K39-KDDR purificada e a proteína rK39. Placas de ELISA (96 wels) foram sensibilizadas por 12-16 horas a 4^QC com 50ng de antígeno diluídos em 1 00uL de tampão carbonato. Após a sensibilização, a placa foi bloqueada com 150uL de PBS- Caseina durante 2 horas à temperatura ambiente. Após o bloqueio, toda a solução dos poços foi removida. A seguir, 100uL dos soros diluídos 1 :100 em PBS-Tween20 a 0,05% foram adicionados aos poços e incubados por 12-16 horas a 4^QC. As placas foram lavadas 5 vezes com a solução de lavagem (PBS-0,05% Tween20) e 100uL o anticorpo anti-lgG canino diluído a 1 :2.500 em PBS-Tween20 a 0,05% foi adicionado em todos os poços. Após a incubação a 37^QC por 1 hora 30 minutos, as placas foram novamente lavadas 5 vezes com a solução de lavagem, e 100uL da solução reveladora, contendo ácido cítrico 0,1 M, Na2PO4 0,2 M, OPD 0,05% e H2O2 0,1 % foram adicionados. As placas foram incubadas a 37^QC ao abrigo de luz por 10 minutos com a solução reveladora, quando a reação foi interrompida pela adição de 50 uL de H2SO4. A absorbância resultante foi lida em leitor de ELISA a 492 nm.

Os dados do gráfico da Figura 6 indicam que a K39-KDDR possui uma resposta muito semelhante à resposta da rK39, entretanto a rK39 apresenta um maior número de falsos negativos (pontos abaixo do CUOFF rK39 nos soros sabidamente positivos). Os resultados preliminares das ELISAs das duas proteínas apresentados pela Tabela 1 corroboram com os dados apresentados no gráfico. A K39-KDDR possui uma maior sensibilidade que a rK39 (78% para K39-KDDR - 51 % para rK39). Enquanto que suas especificidades mantiveram- se altas e extremamente semelhantes (95% para K39-KDDR - 97% para rK39).

Tabela 2. Resultados pareados dos testes de diagnóstico por ensaio imunoenzimático (ELISA)

Exemplo 11- Análise de Bioinformática

Para a predição de epítopos lineares de células B foi utilizado o programa BepiPred 1 .0(Larsen JE, Lund O. Res. 2006 Apr 24;2:2.) e para células T CD4+ e T CD8+ foram utilizados os programas netCTL 1 .2 (Larsen MV, Lundegaard C. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31 ;8:424.) e netMHCII 2.2 (Nielsen M, Lund O. BMC Bioinformatics. 2009 Sep 18;10:296.), respectivamente. Para a determinação do grau de desordem da região da K39- KDDR foi utilizado o programa lUPred (Dosztányi Z, Csizmok V. Bioinformatics. 2005 Aug 15;21 (16):3433-4).

O alto valor de desordem (lUPred) assim como a presença de diversos epítopos lineares preditos tanto para células B quanto para células T (MHCI e MHCII) na região da K39-KDDR (Figura 7), corroboram sua utilização no diagnóstico e como possível antígeno vacinai contra a leishmaniose.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Prism 5.0 e o programa Microsoft Excel 2007.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1) PROTEÍNA RECOMBINANTE caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID N^Q3 e ser denominada rK39-KDDR.

2) PROTEÍNA RECOMBINANTE de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelos aminoácidos da SEQ ID N^Q3 nas posições 34, 73, 1 12, 151 , 190, 229, 268, 307 e 346 serem representados por um aspartato ou um ácido glutâmico; pelos aminoácidos nas posições 37, 76, 1 15, 154, 193, 232, 271 , 310 e 449 serem representados por uma alanina ou um ácido glutâmico; pelos aminoácidos nas posições 48, 87, 126, 165, 204, 243, 282 e 360 serem representados por uma serina ou uma alanina; pelos aminoácidos nas posições 50, 89, 128, 167, 206, 245, 284, 323, 362, 66, 105, 144, 183, 222, 261 e 300 serem representados por uma alanina ou uma treonina; pelos aminoácidos nas posições 54, 93, 132, 171 , 210, 249, 288 e 327 serem representados por uma serina ou uma metionina; pelos aminoácidos nas posições 62, 101 , 140, 179, 218, 257, 296 e 335 serem representados por uma asparagina ou uma serina.

3) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE caracterizado por compreender o uso dos primers representados pelas sequências SEQ ID N^Q1 e SEQ ID N^Q2.

4) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE caracterizado por apresentar as seguintes etapas:

a. Amplificação do gene que codifica a proteína de protozoários do género Leishmania utilizando os primers senso e antisenso, representados, respectivamente, pelas SEQ ID N^Q1 e SEQ ID N^Q2;

b. Inserção do amplicom obtido na etapa a em vetor de clonagem;

c. Transformação de bactérias com a inserção do plasmídeo recombinante obtido na etapa b;

d. Crescimento em meio de cultura dos clones transformantes positivos obtidos na etapa c; e. Extração dos plasmídeos contendo o gene que codifica para a proteína recombinante denominada rK39-KDDR e representada pela sequência SEQ ID N^Q3;

f. Digestão enzimática dos plasmídeos obtidos na etapa e e obtenção dos genes clonados;

g. Inserção dos genes clonados obtidos na etapa f em vetor de expressão; h. Transformação de bactérias com a inserção do plasmídeo recombinante obtido na etapa g;

i. Crescimento em meio de cultura dos clones transformantes positivos obtidos na etapa h;

j. Indução da expressão da proteína recombinante rK39-KDDR representada pela sequência SEQ ID N^Q3;

k. Purificação da proteína recombinante obtida na etapa j.

5) PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 4, etapas b e h, caracterizado pela transformação ser preferencialmente com bactérias Escheríchia coli eletrocompetentes e por eletroporação.

6) PROCESSO DE OBTENÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE rK39- KDDR, de acordo com a reivindicação 4, etapa f, caracterizado pela digestão enzimática ser realizada preferencialmente com as enzimas de restrição Nhe I e Xho I.

7) USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE caracterizado por ser no diagnóstico de leishmanioses em seres humanos e/ou cães e pela proteína (rK39-KDDR) ser representada pela sequência SEQ ID N^Q 3 .

8) USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser em composição vacinai contra leishmaniose humana e/ou canina e pela proteína recombinante (rK39-KDDR) ser representada pela sequência SEQ ID N^Q 3 .

9) KIT PARA DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSES caracterizado por compreender: a. a proteína recombinante rK39-KDDR representada pela sequência SEQ ID N^Q3;

b. anticorpos primários específicos para reconhecimento da proteína descrita no item a;

c. anticorpos secundários ou proteínas conjugados a uma enzima ou um marcador, específicos para reconhecerem o anticorpo primário descrito no item b;

d. um reagente para detectar a enzima ou o marcador mencionados no item c.