KR20010013751A

KR20010013751A - 항체측정방법 및 항체측정장치

Info

Publication number: KR20010013751A
Application number: KR1019997011766A
Authority: KR
Inventors: 다치가와데츠야; 오다데츠야; 다카하시시게오; 노다아츠나리; 아카마츠스구루; 가츠라기기요노리; 마치가와후사이치
Original assignee: 히구치 다츠오; 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2001-02-26
Also published as: CN1163753C; BR9906351A; ES2306509T3; CN1263599A; KR100766098B1; TWI250281B; EP0989406A4; US20030175699A1; ATE395598T1; WO1999053318A1; AU757629B2; AU3168799A; HK1027397A1; EP0989406A1; DE69938701D1; US7368277B2; EP0989406B1; CA2293677C; ID23440A; CA2293677A1

Abstract

본 발명은 체액 중에 존재하는, 감염원에 대항하는 항체를 정밀도 좋게 간편하면서 특이적으로 측정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 피검시료 중의 표적항체와 항원의 항원항체반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 항체면역측정법 및 항체검출시약으로서 그 항체 IgG의 Fc영역에서 결합특이성을 갖는 것을 이용한 항체 측정방법이다.

Description

항체측정방법 및 항체측정장치{METHODS FOR ASSAYING ANTIBODY AND DEVICE FOR ASSAYING ANTIBODY}

체액중에 존재하는 박테리아나 바이러스 등의 감염원(병원체)에 대항하는 특이항체의 검출은 감염의 유무를 간접적으로 진단하기 위해 유용하다. 이 때문에 종래부터 넓게 진단분야에서, 병원체 또는 그 유래 성분을 측정계의 항원으로 이용해서 그 항체를 검출하는 면역측정법 및 면역측정장치가 사용되고 있다.

그렇지만 측정계의 항원으로서 이와 같은 병원체 또는 그 유래 성분을 사용한 면역측정법의 경우, 측정계의 구축이 용이한 이점은 있지만 충분히 만족할 수 있는 감도나 특이성을 얻을 수 없어 아직 개량의 여지가 남아 있다.

또 면역측정법으로 사용되는 면역측정장치로서 스트립 형태의 한조각의 다공질기재상에서 결합엣세이(항원항체반응)를 시행하는 것을 들 수 있다. 이 종류의 측정장치는 상기 다공질기재의 모세관 특성에 의해 스트립의 한쪽 끝에 붙어있던 액체가 차례차례 일정방향으로 모세관 이동하는 성질을 이용한 것이다. 즉, 분석대상물을 포함하는 피검시료(액체)를 여러 가지의 반응성분이 특정의 위치에 순차적으로 배치되는 스트립의 한쪽 끝에 붙이면 피검시료는 그 스트립에 따라서 차례차례로 모세관 이동하고 이것에 의해 소망의 위치에서 반응성분이 접촉해서 반응한다. 또 분석대상물의 존재는 리간드와 리셉터 간의 결합반응에 포함되는 검출가능한 표식으로부터의 시그널을 검출하는 것에 의해 확인, 측정된다.

이러한 원리를 이용한 이무노엣세이는 종종 이무노캐필러리엣세이 또는 이무노크로마토그래피엣세이 등으로 불린다. 예를 들면 국제공개 제87/02774호, EP 0306772호 등에 개시되어져 있다. 또 그 개량법으로는 일본 특개소64-63865호공보, 특개평1-299464호공보 및 특개평6-167497호공보에 기재된 발명을 들 수 있다.

이런 측정장치는 특별한 측정기계 등을 필요로 하지 않고 간편하고 단시간 내에 측정을 완료 할 수 있다는 이점이 있지만 감도나 특이성의 면에서는 아직 개량의 여지가 남아 있다.

또, 하나의 테스트마다 독립한 측정이기 때문에 음성 혹은 양성 컨트롤 검체를 동시에 측정할 수 없고, 얻은 측정치가 적절한 측정에 기초하여 신뢰성이 있는지 없는지의 판단을 할 수 없다는 문제를 가지고 있다.

일반적으로 뇨나 타액 등의 체액은 혈액과 비교해서 조제가 비침습적(非侵襲的)이고 간편하면서 안전하기 때문에 임상검사에 있어 바람직한 검체이다.

그렇지만 이중에 존재하는 항체량은 혈액중의 항체량의 통상, 일천분의 일에서 일만분의 일 정도로 극히 저농도이다. 더욱 수분을 대량으로 섭취한 피험자의 뇨샘플은 극단적으로 엷은 것처럼, 샘플간의 항체량에 상당한 차이가 있다.

이 경우 상기와 같은 종래의 항체측정장치로서는 피검시료가 너무 엷어 항체를 검출할 수 없는 경우도 「음성」결과를 나타내기 때문에 결과가 진짜로 「음성」인지, 피검시료가 너무 엷어 「음성(위음성)」인지를 구별할 수 없는 문제를 포함하고 있다.

또 항체량이 적은 피검시료를 대상으로 하는 경우 고감도로 검출할 수 있는 측정계가 필요로 하지만, 그 결과 검체에 존재하는 협잡물에 기초하여 비특이반응에 의해 생긴 부생성물을 검출하기 쉽게 되어 위양성의 판정결과를 얻을 수 있는 문제도 있다.

이렇기 때문에 뇨나 타액 등의 체액을 검출하는 경우에 있어서도 충분한 검출 정밀도를 얻을 수 있는 항체측정계, 즉 높은 특이성을 갖는 것에 의해 위음성 및 위양성검출이 저감되어 신뢰성이 높은 측정계가 필요하게 된다.

본 발명의 첫 번째 목적은 체액 등의 피검시료 중에 존재하는 감염원에 대항하는 항체를 고감도이면서 높은 특이성을 갖고 검출할 수 있는 항체측정기술(항체측정방법 및 항체측정장치)을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 두 번째 목적은 뇨 등의 비교적 항체량이 적은 체액을 피검시료로 하는 경우에도, 피검시료 중의 협잡물에 기초하여 생기는 「위양성」반응을 억제해서 정밀도가 높은 항체측정방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 세 번째 목적은 이무노캐필러리 또는 이무노크로마토그래피엣세이의 개량법으로, 피검시료 중의 검출대상인 표적항체의 존재 및 량을 피검시료에 기초하여 생기는 「위음성」과 「진성음성」을 구별해서 정밀도 좋게 검출 측정할 수 있는 항체 측정 기술을 제공하는 것에 있다.

본 발명은 피검시료중의 항체를 검출 내지는 측정하는 방법, 특히 임상검체에서의 체액, 특히 뇨에 존재하는 박테리아나 바이러스 등의 감염원에 대항하는 항체를 정밀도 좋게 또한 간편하면서 특이적으로 검출 내지는 측정하는 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은 피검시료중의 항체를 검출 내지는 측정하는 장치, 특히 임상검체에서의 체액, 특히 뇨에 존재하는 감염원에 대항하는 항체를 정밀도 좋게 동시에 간편하면서 특이적으로 검출 내지는 측정하는 장치에 관한 것이다.

더욱, 본 발명은 상기 항체측정방법 및 상기 항체측정장치를 이용한 측정법에 유용한 항체측정용 시약 키트에 관한 것이다.

도1은 본 발명인 항체측정장치에 포함된 스트립 형상의 고상지지체의 구도를 나타내는 도이다. 도에서 기호1은 제1영역, 2는 트레이서영역, 3은 제2영역, 4는 제3영역, 5는 테스트 부위, 및 6은 콘트롤부위를 나타낸다.

도2는 본 발명의 항체측정장치에 의한 피검시료 중의 표적항체의 측정원리를 나타내는 도이다. 도에 있는 각 기호는 도1과 같다.

도3은 본 발명인 항체측정장치에 포함된 스트립 형상의 고상지지체(A)의 약도 및 그 고상지지체를 포위한 하우징(B)의 약도를 나타낸다. 도에서 기호1~6은 도1과 같고, 기호7은 하우징의 상부섹션, 8은 하우징의 하부섹션, 9는 시료 첨가창, 및 10은 검출창을 나타낸다.

도4는 실시예1(5)(i)에 따른 뇨중의 H. 필로리 (H. pylori) 항체의 측정결과를 나타낸 도면이다. 도중에서 ○은 ¹³C-UBT테스트에서 양성 판정된 H. 필로리 감염자의 뇨샘플 결과를, ●는 같은 테스트에서 음성 판정된 H. 필로리 비감염자의 뇨샘플 결과를 각각 나타낸다.

도5는 실시예1(5)(ii)에 따른 뇨 중 H. 필로리항체의 측정결과를 나타낸 도면이다. 도중에서 종축은 흡광도(0.D.450nm)을, 횡축은 ¹³C-UBT테스트에서 확인한 H. 필로리 감염양성군 및 동음성군을 나타낸다.

도6은 실시예1(6)에 따른 뇨중 H. 필로리 항체의 측정결과를 나타낸 도면이다. 도면에서 ○은 ¹³C-UBT테스트에서 양성판정된 H. 필로리 감염자의 뇨검체의 결과를, ●는 같은 테스트에서 음성판정된 H. 필로리 비감염자의 뇨검체의 결과를 각각 나타낸다.

도7은 실시예2(2)에 따른 뇨중 HBc 항체의 측정결과를 나타낸 도면이다. 도면에서 ●는 혈중 HBc항체 양성자의 뇨검체의 결과를, ○는 혈중 HBc항체음성자의 뇨검체의 결과를 각각 나타낸다.

도8은 뇨중 HIV항체의 측정에 있어 위양성의 결과를 주는 뇨 검체의 겔여과와 각 분획의 항체반응성을 나타낸 도이다.(실시예3(1)). 더욱 도면에서 종축은 흡광도 (O.D.)를, 횡축은 겔여과의 분획(프랙션 번호)를 나타낸다. 실선은 280nm에 있어서의 단백질의 흡광도를, 검정원선은 상기 항휴먼(IgG+IgM)항체에 의한 검출결과를, 흰삼각선은 상기 항휴먼IgG(Fc특이적)항체에 의한 검출결과를 각각 나타낸다.

도9는 실시예5에 따른 뇨중 필로리 항체의 측정결과를 나타낸는 도이다. 도면중에서 종축은 흡광도 (O.D.450~650mm)을, 횡축은 ¹³C-UBT테스트로 확인한 H. 필로리 감염양성군(+:n=56) 및 동음성군(-:n=44)을 나타낸다.

도10은 실시예6에 따른 뇨중 풍진 바이러스(루벨라)항체의 측정결과를 나타내는 도이다. 도면에서 종축은 흡광도 (O.D.450~650mm)를, 횡축은 시판 키트로 측정된 혈청레벨에 있어서의 루벨라 항체양성군(+:n=76) 및 동음성군(-:n=23)을 나타낸다.

도11은 본 발명의 항체측정장치의 제2영역에 있어서 테스트 부위 및 콘트롤 부위를 나타내는 도이다(실시예7(3)).

도12는 본 발명의 항체측정장치를 사용해서 뇨, 전혈액 및 혈장 중의 H. 필로리 항체를 측정한 결과를, 비교장치(A~E)와 비교한 도이다. 더욱 도에서 [specificity]는, ¹³C-UBT테스트로 음성이 확인된 피험자의 각 검체를 각 측정장치로 측정했을 때에, 음성으로 검출되는 비율 (음성율)을 나타내고, [Sensitivity]는 ¹³C-UBT테스트로 양성이 확인된 피험자의 각 검체를 각 측정장치로 측정했을 때에, 양성으로 검출되는 비율(양성율)을 나타낸다. 또 비교장치 A~H는 하기의 측정 장치를 나타낸다.

A: Helitest(Cortecs Diagnostics사제)

B: H.pylori-Check-1

(Bio-Medical Products사제)

C: First Check H. pylori

(Worldwide Medical Corp사제)

D: Biocard Helicobacter pylori IgG

(Anti Biotech Oy사제)

E: Insta Test H.pylori

(Cortez Diagnostics Inc.사제)

F: One Step H.pylori Test

(Teco Diagnostics사제)

G: H.pylori SPOT

(International Immuno-Diagnostics사제)

H: Quick Stripe H.pylori

(Diatech Diagnostics Inc.사제)

본 발명자들은 뇨 등의 비교적 항체 존재량이 적은 체액을 피검시료로 한 경우에도 표적 항체가 고정밀도로 측정할 수 있는 측정계를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 끝에 항원항체 반응에 있어 항원에 비특이적으로 결합하는 항체성분(이하, 비특이결합성 항체성분이라고 함)이 측정계에 존재하는 것에 의해 비특이반응이 생겨 그것이 위양성의 측정결과를 초래해 검출정도를 저하시키고 있는 것을 알아냈다.

이러한 인식에 기초하여 본 발명자들은 끝없는 연구를 거듭한 끝에, 측정대상인 표적항체와 그것에 대응하는 항원과의 항원항체반응을 대장균에서 유래한 성분의 존재하에서 시행하는 것에 의해 비특이적인 항원항체반응을 억제할 수 있어 그 결과, 위양성의 판정결과를 저감시켜 검출정밀도를 유의(有意)하게 향상시킬 수 있다는 것을 알아냈다.

또 본 발명자들은 상기 비특이결합성 항체성분이 IgG의 경쇄(L쇄) 혹은 동F(ab)영역의 항원성을 보유한 IgG 단편화물 및/또는 동변성물인 것을 알아내고 해당 항체성분이 혈청항체측정계에 있어 넓게 채용되고 있는 일반 항체검출시료(2차항체등)와 교차반응하여 그 결과, 위양성의 판정결과를 초래하고 있는 것을 확인했다.

이러한 인식에 기초하여 본 발명자들은 항체검출시료로서 검출대상인 표적 항체 IgG의 Fc영역에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 시료를 사용하는것에 의해, 항체측정계에 있어서의 비특이반응을 억제할 수 있어, 그 결과 위양성의 판정 결과를 저감시켜 검출정밀도를 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다.

또 본 발명자들은 항체측정장치(이무노캐필러리 엣세이장치, 이무노크로마토그래피 엣세이장치)의 개량을 목적으로 검토한 결과, 측정장치의 스트립 반응영역(판정영역)에, 검출대상인 표적항체를 검출하는 부위(「테스트부위」)에 더하여 피검시료 중에 포함되는 임의의 항체를 검출 측정하는 「콘트롤 부위」를 설치하는 것에 의해,「진성음성」을 「위음성」과 구별하여 정확히 검출 측정할 수 있다는 것을 알아냈다. 즉, 이러한 측정계에 의하면, 피검시료의 농도가 엷은 (즉, 피검시료 중의 총 항체량이 적은)등의 이유로 판정불가능한 부적합한 피검시료를 사용한 경우는 「콘트롤 부위」가 음성을 나타내 판정불능을 표시한다. 한편, 피검시료가 적합 농도의 항체량을 가진 경우는 「콘트롤 부위」는 양성을 나타내 피검시료의 적합성을 표시한다. 이 경우 「테스트 부위」에 있어서의 결과에 의해 피검시료 중의 표적항체의 존재의 유무, 즉 「양성」인지「진성음성」인지를 판정할 수 있다.

더욱 항체측정장치(이무노캐필러리장치, 이무노크로마토그래피엣세이장치)의 개량법을 개시한 특개평1-299464호 공보 및 특개평6-167497호 공보에는 본 발명과 같이 판정영역에 테스트 부위를 첨가해서 콘트롤 부위를 설치한 엣세이 장치가 기재되어 있지만 이러한 콘트롤부위는 스트립의 상류역(上流域)에 배치한 표지체가 모세관 이동에 의해 이동해서 테스트부위의 통과 유무를 확인 판정하는 것으로 본 발명과는 전혀 다른 것이다.

더욱 본발명자들은 상기 개선된 항체측정장치에 있어 표적항체와 그것에 대응하는 항원과의 결합반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것에 의해 항원항체반응에 있어서의 비특이 반응을 억제할 수 있고, 또 항체검출시약으로 IgG의 Fc영역에서 결합 특이성을 갖는 시약을 사용하는것에 의해 항원항체결합물에 대응하는 비특이반응을 억제할 수 있다. 그래서, 위양성검출을 유의하게 저감할 수 있는 것도 확인했다.

본 발명은 이러한 몇가지의 인식에 기초하여 완성되어진 것이다.

즉, 제1로 본 발명은 위양성검출이 저감된 높은 검출정밀도를 갖는 항체 측정방법이다.

(1-1) 이러한 항체측정방법의 하나의 양태로서 피검시료중의 표적 항체를 항원항체반응을 이용해서 검출 측정하는 방법에 있어, 상기 항체와 항원의 항원항체반응을 대장균 유래 성분의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 항체측정방법을 들 수 있다.

더욱, 이러한 항체 측정 방법에는 하기의 방법이 포함된다.

(a) 대장균 유래성분이 대장균 가용성 성분 또는 리포다당 중의 어느것이든 적어도 1종인 항체 측정방법

(b) 대장균 유래성분은, 측정계의 항원 1μg당, 0.1~100μg정도, 바람직하게는 0.5~50μg정도의 비율로 존재시키는 항체측정방법

(1-2)항체측정방법의 다른 양태로서, 피검시료 중의 표적항체를 샌드위치법에 따라 검출 측정하는 방법에 있어, 항체검출시약으로 그 항체 IgG의 Fc영역에서 결합특이성을 가지는 제2항체를 포함한 시약을 사용하는 것을 특징으로 하는 항체측정방법을 들 수 있다.

즉, 이러한 항체측정방법에는 하기의 방법이 포함된다.

(a) 제2항체가 Fc특이적 항IgG항체인 상기 항체측정방법

(b) 피검시료중의 표적항체와 이 항체에 대응하는 항원을 고정화해서 되는 고상화 항원과의 항원항체 반응공정 및 이 고상화 항원에서 포착된 측정대상 항체와 그 항체 IgG의 Fc영역에서 결합특이성을 갖는 제2항체와의 반응공정을 포함하는 항체측정방법

(c) 항원항체반응은 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 항체측정방법

제 2로, 본 발명은 항체측정장치에 관한 것이다. 이 장치에는 다음의 양태를 포함시킬수 있다.

(2-1) 적어도 (a)피검시료를 접촉시키는 제1영역 및 (b) 그 피검시료중의 항체를 반응시키는 제2영역을 피검시료가 모세관 현상에 의해 그 제1영역에서 제2영역으로 전송 되도록 설치해서 되는 고상지지체 및 제2영역에서의 반응결과를 검출하기 위한 표지수단을 함유하는 측정장치이고, 상기(b)제2영역에서, (i)검출 대상인 표적항체를 포착하는 리간드를 고정화한 테스트 부위와 (ii)피검시료중의 임의항체를 포착하는 리간드를 고정화한 콘트롤 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 항체측정장치

(2-2) 테스트 부위에 고정화된 리간드가 피검시료 중의 표적항체에 대응하는 항원인 항체측정장치

(2-3) 콘트롤 부위에 고정화된 리간드가 피검시료의 임의항체를 포착하는 항휴먼이무노글로불린항체인 항체측정장치

(2-4) 표지수단으로서 표적항체 및 임의항체의 어느 것과도 결합하는 표지화된 리간드를 갖는 항체측정장치

(2-5) 표지수단이 표적항체 및 임의항체의 어느것과도 결합하는 표지화된 리간드이고, 그 표지화 리간드는 고상지지체의 제2영역보다 상유역에서 탈리가능하게 지지되어 있어, 피검시료와 접촉하면 그 시료중의 표적항체 및 임의항체와 반응해서 각각 표적항체/표지화리간드-복합체 및 임의항체/표지화리간드-복합체를 형성하고, 모세관현상에 의해 제2영역으로 전송되어 각각 테스트부위 및 콘트롤부위에 결합하는 항체측정장치.

(2-6) 표지화 리간드가 고상지지체의 제1영역과 제2영역사이에 위치하는 영역(트레이서영역)에 지지되어 되는 항체 측정장치.

(2-7) 표적항체 및 임의항체의 어느 것과도 결합하는 표지화리간드가 표지화된 항휴먼이무노글로불린항체인 항체 측정 장치

(2-8) 상기항휴먼이무노글로불린항체가 이무노글로불린 G의 Fc 영역에서 결합특이성을 갖는 항IgG항체인 항체측정장치.

(2-9) 고상지지체가 제1영역 및 제2영역에 이어서 흡수영역을 더 갖고 이것에 의해 제1영역에서 제2영역으로 전송된 피검시료가 모세관현상에 의해 더욱더 흡수영역으로 전송되는 항체측정장치.

(2-10) 제2영역의 테스트부위에 있어서의 표적항체의 결합반응이 대장균 유래성분의 존재하에서 수행되는 항체측정장치.

제 3 으로, 본 발명은 상기 항체측정장치를 이용한 피검시료 중의 표적항체의 고상엣세이 방법에 관한 것이다. 이 방법에는 다음의 양태를 포함시킬 수 있다.

(3-1) 피검시료를 상기 항체측정장치의 제1영역에 접촉시켜 제2영역의 콘트롤부위가 발색하고 있는 조건 하에서 제2영역의 테스트부위의 발색의 유무를 검출하는 것으로 되는 표적항체의 고상엣세이 방법.

(3-3) 항체측정장치의 제2영역의 테스트부위에 있어서 표적항체의 결합반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 표적항체의 고상엣세이방법.

제4로, 본 발명은 상술한 항체측정방법에 이용할 수 있는 항체 측정시약 키트에 관한 것이다. 이러한 항체측정시약키트의 양태로서 다음의 것을 포함시킬 수 있다.

(4-1) 대장균 유래 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체측정용 시약키트.

(4-2) 더욱 고상화되어도 좋은 항원 또는 항체검출시약을 함유하는 항체측정용 시약키트.

(4-3) 항체검출시약으로서 Fc 특이적 항IgG항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체측정용 시약키트.

(4-4) 상술한 본 발명인 항체측정장치를 포함하는 항체측정용 시약키트.

(1) 항체측정방법.

우선, 제1의 발명인 항체측정방법에 관해서 설명한다.

본 발명인 항체측정방법은 항체면역측정법의 개량방법으로, 비특이반응을 억제하는 것에 의해 위양성검출을 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

(1-1) 상기 항체측정방법의 하나의 양태로서 피검시료 중에 포함되는 표적항체와 그 항체의 항원과의 항원항체반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 의하면 항원항체반응에 있어서 비특이적 반응을 유의하게 억제할 수 있어, 그 결과 위양성의 판정결과의 발생을 감소할 수 있다.

여기에 사용할 수 있는 대장균 유래성분은 대장균(Escherichia coli)에서 유래하는 성분이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 그 단백질성분, 당질성분, 지질성분 또는 그 혼합성분이면 된다. 바람직하게는 대장균의 가용성 추출물, 또는 리포다당(LPS)을 예시 할 수 있다.

상기 대장균 유래성분의 조제방법은 특히 제한되지 않고 각종의 방법에 의해 가능하다. 통상, 임의의 대장균을 그 대장균의 발육에 적당한 배양기를 이용해서 생육,증식시켜, 얻어진 균체를 집균해서, 초음파 파쇄기 등을 이용한 물리적수단에 의해 혹은 계면활성제 등을 이용해서 파쇄 혹은 가용화하는 것에 의해 가용성성분(가용성추출물)으로서 조제할 수 있다. 또, LPS 는 유기용매, 예를 들면 페놀, 클로로포름 및 에테르 등의 단용매 또는 2 ∼ 3종의 혼합용매를 사용해서 추출하는 것에 의해 제조할 수도 있고, 또 유전자 공학적 수법에 의해 인공적으로 제조할 수도 있다. 또, 이런 것들은 간편하게는 시판품을 사용할 수 있다. (예를 들면, 리포폴리사카라이드 E.coli:Difco사, 리포폴리사카라이드 E.coli:시그마사).

본 발명이 대상으로하는 피검시료로서는, 「체액」이 바람직하다고 할 수 있다. 「체액」이란, 측정대상이 되는 표적항체의 존재가 인정되는 생체(사람, 그 밖의 동물을 포함)의 체액이라면 특별히 한정되지 않고, 일반의 임상검사에 있어 검체로서의 체액을 넓게 의미한다. 구체적으로는 혈청, 혈장을 포함하는 혈액, 뇨, 척수액, 양수, 타액, 땀 등의 체액을 예시할 수 있다. 특히 본 발명은 종래부터 항체검출용 검체로서의 사용이 요망되었던 비침습적(非侵襲的) 생체시료, 예를 들면 뇨, 타액, 및 땀, 바람직하게는 뇨에 있어서 검출정밀도의 문제를 해결하는 것이므로, 체액으로서 바람직하게 이러한 생체시료를 예시할 수 있다.

또, 측정대상인 「표적항체」는 그 측정 내지 검출이 요망되는 항체라면 특별히 한정은 없고, 예를 들면 생체에 있어서 이물질인 각종의 감염원에 대한 항체 일수 있다.

이러한 감염원으로서는 특별한 한정은 없고, 사람, 그 밖의 동물에 감염하고 그 결과로서 항체생산이 인정되는 각종의 병원체를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, HIV(휴먼면역부전바이러스), A형, B형, 및 C형 등의 각종 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 마진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 단순 헤르페스바이러스, 수두, 대상 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 엔테로바이러스 등의 바이러스류; 헬리코박터 필로리 (H. 필로리: 이하, 단지 H. 필로리균 이라고도 함), 클라미디아, 결핵균, 스피로헤타, 임균, 매독균, 마이코플라즈마 등의 박테리아류(대장균은 제외); 또 톡소플라스마, 적리아메바, 진드기 등의 원충류 등을 들 수 있다. 바람직하게는, HIV, 각종 간염바이러스, 풍진 바이러스, 인플루엔자바이러스, 마진바이러스, 헤르페스바이러스 등의 바이러스류; 헬리코박터 필로리균 등의 박테리아류이고, 특히 바람직한것은 헬리코박터 필로리균 등의 박테리아류이다.

본 발명의 측정방법에 있어 이용되는 항원으로서는, 검출해야만 하는 표적항체와 항원항체반응하는 항원이면 특별한 제한은 없고, 예를 들면 기존의 혈청 항체측정계에 있어 채용되어져 있는 항원을 어느것이라도 양호하게 채용할 수 있다. 이것들은, 상술한 바와 같이 바이러스나 박테리아 등의 병원체 그 자체로도 괜찮으나, 적어도 그 병원체에 고유의 항원 결정기를 갖는 것이면 된다. 예를 들면 병원체를 가온처리나 방사선 조사 등에 의해 불활성화한 것으로, 병원체를 계면활성제 등으로 추출처리해서 얻을수 있는 항원, 또 화학합성이나 유전자 공학적수법에 의해 인공적으로 제조한 항원 등을 예시할 수 있다.

더한층, 채용하려는 항원이 본 발명의 측정법에서 양호하게 사용될 수 있는가는, 예를 들면 표적항체와의 반응성을 통상적인 방법에 따라서 시험하는것에 의해 용이하게 확인 할 수 있다.

본 발명의 측정 방법에 있어, 상기 항원은 소망에 의해, 통상적인 방법에 따라서 각종 임의의 고상에 고정화해서 이용할 수 있다. 이 고상으로서는, 그 기술분야에 있어 관습의 각종 고상을 이용할 수 있고, 예를 들면 글라스, 셀룰로오스 분말, 세판덱스, 세파로스, 폴리스티렌, 여과지, 카르복시 메틸 셀룰로오스, 이온교환수지, 덱스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 나일론, 글라스비즈, 견, 폴리아민-메틸비닐에테르-말레인산 공중합체, 아미노산 공중합체 및 에틸렌-말레인산 공중합체 등의 여러 종의 소재로 된 스틱, 비즈, 플레이트 (마이크로 플레이트를 포함) 및 시험관 등을 넓게 예시할 수 있다.

고정화방법에 관해서도 특별히 제한은 없고, 물리적 결합 및 화학적 결합중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면 공유결합법으로 디아조법, 펩피드법(산아미드 유도체법, 카르복실클로라이드수지법, 무수말레인산유도체법, 이소시아네이트유도체법, 브로모시안 활성화 다당체법, 셀룰로오스 카르보네이트 유도체법, 축합시약을 사용하는 방법 등), 알킬화법, 가교시약에 의한 담체결합법 (예를 들면, 가교시약으로 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트 등을 사용하는 것), Ugi 반응에 의한 담체결합법 등의 화학적반응; 혹은 이온교환수지와 같은 담체를 사용하는 이온결합법; 글라스비즈 등의 다공성 글라스를 담체로 사용하는 물리적 흡착법 등을 예시할 수 있다.

더욱, 측정계에서 사용되는 항원량은 특별히 제한되지 않고, 채용하는 측정계에 있어 관용의 항원량에 따라서 임의로 결정할 수 있다. 예를들면, 샌드위치법을 채용하는 경우에는 통상, 표적항체에 대해서 과잉의 항원이 사용된다. 예를 들면, 100㎕용량의 반응액 중에서 반응시키는 경우를 예를 들면 통상 0.1-100㎍/㎖정도, 바람직하게는 1-10㎍/㎖정도의 항원량을 예시할 수 있다.

상기 항원과 표적항체의 항원항체반응은 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것을 한도로, 특별히 제한되지 않지만, 통상의 면역측정법으로 채용되는 조건이 채용된다. 일반적으로는 45℃ 이하, 바람직하게는 약 4-40℃, 보다 바람직하게는 25-40℃ 정도의 온도조건 하에서 대장균 유래 성분과 함께, 항원과 표적항체를 공존시켜 약 0.5-40시간, 바람직하게는 1-20시간 정도 방치 또는 인큐베이션 하는 방법을 들 수 있다. 또, 반응에 사용되는 용매 및 그 pH도, 그 반응에 악영향을 주지 않는 것이면 특별히 제한 되지 않지만, 통상적인 방법에 따라서 또는 그것에 준해서, 예를 들면 구연산완충액, 인산완충액, 트리스 염완충액, 초산완충액 등의 pH 약5-9의 범위에서 완충 능력을 갖는 완충액을 예시할 수 있다.

그 반응계에 있어서 대장균 유래성분의 배합비율은 특별히 제한은 없지만, 반응계의 항원 1㎍정도에 통상 0.1-100㎍정도, 바람직하게는 0.5-50㎍정도를 예시할 수 있다.

본 발명의 항체측정방법은 기본적으로는 대장균유래성분의 존재하에서의 표적항체와 그 항체에 대해서 고정화되어 있어도 좋은 항원과 항원 항체 반응과정을 갖는 것이면 다른 공정은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 더욱 그 항원에 포착된 표적항체(항원항체결합물)의 검출공정. 구체적으로는 항원항체 결합물과 항체검출시약과의 반응 과정을 포함하고 있는 것이 바람직하다.

항원 항체반응으로 얻을 수 있는 항원항체 결합물을 검출ㆍ측정하는 방법 또는 그것들의 조건은 특별히 제한되는 것은 없고, 통상의 면역 측정법으로 사용되고 있는 것 또는 그것에 준한 방법 및 조건을 채용할 수 있다.

본 발명에 가장 알맞는 것은 샌드위치법에 따라 실시 할 수 있다. 예를 들면, 고상화 샌드위치법에 의하면 피검시료 중의 표적항체는, 예를 들면 다음과 같이해서 측정할 수 있다.

우선, 표적항체와 특이적으로 항원항체반응을 하는 항원을 고상화해서 되는 고상화항원에, 대장균 유래 성분 및 표적항체를 포함해 얻는 피검시료(예를 들면 뇨 등의 체액)를 첨가해서 항원항체반응을 일으킨다. 다음으로 고상화항원에 결합하지 않았던 미결합물질을, 예를 들면 세정에 의해 제거하고, 그 후 항체검출시약을 첨가해서, 고상화 항원에 결합한 표적항체(항원항체결합물)와 반응시켜 그 시약에 대응한 검출수단에 의해 항원항체결합물의 존재를 검출 또는 그 량을 측정한다.

이러한 측정수법에 있어서 각종수단의 선택이나 그것들의 개변 등은 어느것도 당업자가 잘 알고 있는 것으로, 본 발명에 있어 그러한 각 수법의 어느 것에 의해서도 할 수 있다 [「임상검사법제요」, 김원출판, 1995년등 참조).

여기서 항체 검출시약으로서는 특별히 제한되는 것은 없고, 일반적으로 당업계에서 사용되어지고 있는 각종의 시약을 넓게 사용할 수 있다. 예를들면, 측정대상인 항체(이무노글로불린)와 결합해 얻는 항휴먼이무노글로불린항체 등의 2차항체를 들 수 있다. 더욱 그 항휴먼이무노글로불린항체에는 측정대상인 각 클래스의 이무노글로불린을 면역원으로 해서 면역된 임의의 피면역동물로 부터 얻을 수 있는 항혈청 또는 그 정제물(폴리클로날항체) 혹은 모노클로날항체가 포함된다.

또, 항체검출시약으로, 후기 (1-2)에서 설명하는 것과 같이 측정대상인 항체(IgG)의 Fc영역에서 결합특이성을 갖는 항IgG항체를 사용할 수도 있다. 이러한 항 IgG항체로서는, IgG의 경쇄 혹은 IgG의 F(ab)영역과, 반응성을 나타내지 않는 Fc특이적 항IgG항체, 또는 IgG의 Fc영역에 대해서 특이적으로 반응성을 갖는 프로테인 A나 프로테인 G등을 사용할 수도 있다. 이런것들은 표적항체가 IgG인 경우에, 특히 가장 알맞게 사용할 수 있다.

이러한 항체검출시약은, 통상적인 방법에 따라 조제할 수 있고, 또, 시판품도 입수할 수 있다.

해당 항체검출시약은 그 검출 때문에 통상의 표지제에 의해서 직접적으로 수식(변형)되어 있어도 되고, 또, 첨가적인 검출수단에 의해 간접적으로 수식할 수도 있다.

이 표지제로서는, 특별히 제한받지는 않으나, 종래 공지의 것 또는 장래 사용될 수 있는 어느 것이라도 사용할 수 있지만, 구체적으로는¹²⁵I, ³H, ¹⁴C 등의 방사성동위원소류 ; 알카리포스타파제(ALP), 페록시다제(HRP) 등의 효소류 ; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라 메틸로다민 이소시아네이트(RITC) 등의 형광물질류 ; 및 1N-(2, 2, 6, 6- 테트라메틸-1-옥실-4-피페리딜)-5N-(아스파르테이트)-2,4-디니트로벤젠(TOPA) 등이 예시되고, 이것들을 표지제로 사용하는 면역측정법은, 각각 라디오이무노엣세이, 엔자임이무노엣세이, 풀루오로이무노엣세이, 및 스핀이무노엣세이 라고 일컬어지고 있다. 또, 금콜로이드 착색 라텍스 입자 등을 표지해서 되는 항체검출시약을 이용한 이무노크로마토엣세이법을 채용할 수도 있다.

더욱, 이러한 표지제에 의한 표지방법이나 간접적인 표지화에 의한 수식(변형)방법, 및 그것들의 검출방법 등은 자체공지의 방법에 따라서 시행할 수 있다. (「단 클론항체」, 이와사키다츠오 등 저, 고담사 사이언티픽, 1984 ; 「효소면역측정법」제2판, 이시가와에이지 등 저, 의학서원, 1982 등).

본 발명의 측정방법은, 상기 측정 대상인 표적항체와 그 항원의 반응에 있어 대장균 유래성분을 사용하는 것을 필수로 하는 것으로 그 한계에 있어 다른 기본적 조작 등은 특별히 제한되는 것 없고, 통상의 면역측정법에 있어서의 방법 및 관용의 방법 등을 넓게 채용할 수 있다.

그러므로, 상기의 항원항체결합물과 항체검출시약의 반응조건도 특히 제한되지 않고, 면역측정법에서 일반적으로 채용되는 조건이 사용된다. 통상, 상술한 항원항체반응의 조건과 같은 조건, 예를 들면, 통상 45℃이하, 바람직하게는 약 4-40℃, 보다 바람직하게는 25-40℃정도의 온도조건하에서, pH가 약 5-9정도 하에서 약 0.5-40시간, 바람직하게는 1-20시간 정도 방치하는 것 내지 인큐베이션 하는 방법을 들 수 있다.

피검시료 중에 있어서의 표적항체의 존재 유무, 혹은 그 함유량은 통상적인 방법에 따라서 항체검출시약의 표지에서 사용한 표지제 (혹은 그 간접적인 표지)의 종류에 대응한 표지활성의 측정에 의해, 혹은 그 측정값에 의해 환산한 항체력 값으로 평가된다.

(1-2) 본 발명의 항체측정방법의 다른 양태로서 피험시료 중에 존재하는 표적항체의 면역측정법에 있어, 항체검출시약으로 표적항체 IgG의 Fc영역에서 결합특이성을 갖는 시약을 사용하는 방법을 들 수 있다.

이 방법에 의하면, 비특이결합성 항체 성분과 항체검출시약과의 반응을 유의하게 억제할 수 있어, 그 결과 위양성의 판정결과가 발생하는 것을 감소시킬 수 있다. 즉, 이 항체측정 방법을 샌드위치 법에 따른 항체면역측정법의 개량방법으로 위치를 정할 수 있다.

본 발명에서 사용된 항체검출시약은, 측정대상인 항체(IgG)와 반응성을 갖는 것에 의해 그 검출에 사용할 수 있고, 또 표적항체 IgG의 경쇄 혹은 IgG의 F(a b) 영역과는 반응성을 나타내지 않는다. 즉, 표적 IgG의 Fc영역에서 결합특이성을 갖는 것에 의해 특징을 갖게 된다.

이 항체 검출시약으로는, 보다 구체적으로는, 표적항체 IgG의 Fc영역을 면역원으로서 조제되는 Fc특이적 항IgG항체를 예시할 수 있고, 이것은 그 면역원에서 면역된 임의의 피면역동물로부터 얻을 수 있는 항혈청 또는 그 정제물(폴리클로날 항체) 혹은 모노클로날 항체를 포함하는 것이다. 또 이 시약은 이러한 항체로부터 되는 시약으로 한정되지 않고, 예를 들면, 항체 IgG의 Fc영역에 대해서 특이적으로 반응성을 갖는 프로테인 A나 프로테인 G 등이어도 좋다.

더욱 이러한 항체 검출시약은, 통상적인 방법에 따라 조제할 수 있고, 또 시판품으로도 입수할 수 있다. (예를 들면, 시그마사, Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., 및 Cappel사 등으로부터 입수할 수 있다).

상기 항체검출시약은, 그 검출을 위해 통상의 표지제에 의해, 직접적으로 수식되어 있어도 좋지만, 또 첨가적인 검출 수단에 의해 간접적으로 수식 할 수도 있다.

더욱 더, 표지제의 종류, 표지방법 및 표지제의 검출방법에 관해서는, 상기 (1-1)에서 서술한 것과 같은 방식으로 예시할 수 있다.

본 발명의 항체측정방법은, 표적항체의 검출, 즉 항원항체 결합물의 검출에 있어, 상기 특정의 항체 검출시약의 사용을 필수로 하는 것으로, 그 한계에 있어 다른 기본적 조작 등은 특별히 제한되지 않고, 통상의 샌드위치법에 따른 면역측정법에 있어서의 조작을 넓게 채용할 수 있다.

기본적으로는, 본 발명의 항체측정방법은, 검출을 소망하는 표적 항체와 반응할 수 있는 항원을 사용해서, 그 항원을 피검시료 중에 존재하는 표적항체와 항원항체 반응시키고, 그 결과, 이 항원에 결합한 표적항체(항원항체 결합물)를 상기 항체검출시약으로 검출하는 것에 의해 실시된다.

더욱, 여기에서 피검시료 및 항원은 상기 (1-1)에서 들었던 것과 똑같이 예시할 수 있고, 또 표적 항체에 관해서도, 감염원에 대응한 항체 IgG인 한 전술의 (1-1)에서 들었던 것을 똑같이 예시 할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서는 감염원으로서 대장균을 포함할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서 항원 또는 항체검출시약은, 소망에 의해, 통상적인 방법에 따라서 각종 임의의 고상에 고정화해서 사용할 수 있다. 더욱, 사용되는 고상 및 고상화방법에 관해서는, 상기의 (1-1)에서 들었던 것을 마찬가지로 예시할 수 있다.

항원과 표적항체와의 항원항체반응에 관해서도 특별히 제한되지 않고, 통상의 면역측정법에 있어서의 조건이 채용된다. 일반적으로는 45℃이하, 바람직하게는 약4-40℃, 보다 바람직하게는 25-40℃정도의 온도 조건하에서, 항원과 측정대상 항체를 공존시켜 약 0.5-40시간, 바람직하게는 1-20시간정도, 방치 또는 인큐베이션 하는 방법을 들 수 있다.

더욱, 이러한 항원 항체 반응에 있어, 제한은 되지 않지만, 상기(1-1)에 기재한바와 같이, 대장균에 유래하는 성분을 공존시킬 수도 있다.

이어서, 얻을 수 있는 항원 항체 결합물을 세정해서, 그 항원 항체 결합물을 상술한 특정의 항체검출시약과 반응시키는 공정에 제공되도록 한다. 그 반응은 면역측정법 (샌드위법)에 있어 일반적으로 채용되는 조건과 같은 방법 또는 그것에 준해서 시행할 수 있다. 예를 들면, 용매는 해당 반응에 악영향을 주지 않는 것이라면 특별한 제한은 없고, 구체적으로는 구연산완충액, 인산완충액, 트리스염완충액, 초산완충액 등의 pH가 약 5-9정도의 완충액을 예시할 수 있다. 또, 반응시간 및 반응온도에 관해서도, 특별히 제한되지는 않지만, 상술한 항원항체반응의 조건과 같은 조건을 예시할 수 있다.

더욱, 피검시료 중에 있어서 표적 항체의 존재 유무 혹은 그 함유량은 (1-1)과 마찬가지로, 통상적인 방법에 따라서 항체검출시약의 표지에 사용한 표지제(혹은 그 간접적인 표지)의 종류에 대응한 표지활성의 측정에 의해, 혹은 그 측정치에 의해 환산한 항체력 값으로 평가된다.

(2)항체측정장치

다음에 제2의 발명의 항체측정장치에 관해서 설명한다.

본 발명의 항체측정장치는, 고상엣세이를 이용해서, 피검시료 중의 검출대상인 표적항체의 존재 및/또는 양을 정밀도 좋게 검출ㆍ측정하도록 개량된 것이다. 구체적으로는 본 발명의 항체 측정장치는, 적어도 (a)피검시료를 접촉시키는 제 1 영역 및 (b) 피검시료 중의 항체를 반응시키는 제2영역을, 피검시료가 모세관현상에 의해 그 제 1영역부터 제 2영역으로 수송되도록 설치하여 된 고상지지체, 및 제 2영역에서의 반응결과를 검출하기 위한 표지수단을 함유하는 엣세이장치로서, 상기(b)제2영역에, (i)엣세이대상인 표적항체에 대한 리간드를 고정화 한 테스트부위와 (ii)피검시료 중의 임의항체를 포착하는 리간드를 고정화한 콘트롤부위를 갖는 것을 특징으로 하는 항체측정장치이다.

본 발명의 항체측정장치의 특징은, 제2영역의 테스트부위와는 별개로 콘트롤부위를 설계한 것으로, 그 콘트롤부위는, 적합한 피검시료를 적용해 적절한 장치로 적절하게 측정된 경우는, 피검시료 중에 표적항체가 존재하는지 아닌지에 관계없이, 표지의 존재하에서 양성의 결과를 나타내는 표시를 형성하고, 만일 부적합한 피검시료를 적용한 경우, 혹은 부적절한 장치로 또는 부적절하게 측정된 경우는, 피검시료에 표적항체가 존재하는지 아닌지에 관계없이, 표지의 존재하에서 음성의 결과를 나타내는 표시를 형성하도록 구성된다.

즉, 이 장치의 제 2 영역중의 콘트롤부위는, 피검시료 중에 표적항체가 존재하는지 아닌지에 관계없이, 테스트부위의 결과(특히 음성의 결과)가, 유효한 엣세이결과인지 아닌지를 표시하는 부위에 상당한다. 그리고, 이러한 구성에 기초하여, 본 발명의 항체측정장치에 의하면, 위음성과 진성음성을 구별하여 정밀도 좋게 (높은 신뢰성으로) 피검시료 중의 항체를 정성, 정량 할 수 있게 된다.

더욱, 본 발명의 항체측정장치는, 테스트부위에 있어서 표적항체의 반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하도록 설계되어 있어도 좋고, 또는, 그 테스트부위에 있어서 반응을 검출하는 항체검출시약으로서 표적항체 IgG의 Fc 영역에 결합특이성을 갖는 시약이 사용되도록 설계되어 있어도 좋다. 이러한 구성에 기초하여, 본 발명의 항체측정장치에 의하면, 비특이적 반응이 억제되어, 그 결과 위양성 판정결과가 생기는 것을 유의하게 저감해서, 정밀도 좋게 고감도로 피검시료 중의 항체를 정성, 정량 할 수 있게 된다.

즉, 본 발명의 항체측정장치가 대상으로 하는 피검시료 및 표적항체로서는, (1)에 있어서 서술한 항체측정방법과 같은 것을 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 우선, 적어도 제 1영역과 제 2영역을 가지는 고상지지체가 제공된다.

제1영역은 피검시료가 첨가되어 피검시료와 접촉하는 영역이고, 제2영역은, 그 피검시료 중에 포함된 항체(표적항체를 포함하는 전항체)가 리간드 리셉터 또는 항원-항체의 관계로 반응,결합하여, 또 더 나아가 표지체의 존재하에서 그 반응결과가 나타나는 영역(반응영역 및 판정영역)이다. 이러한 영역은, 고상지지체의 제1영역에 첨가되어, 접촉한 피검시료가, 그 제1영역부터 제 2영역으로 모세관현상에 의해 전송되는 양태로 고상지지체상에 배치된다. 바람직하게는, 제1영역에 접촉한 피검시료의 전부 또는 적어도 일부가, 고상지지체의 실질적으로 평면인 층을 통해서 제 2영역으로 모세관이동 하도록 배치된다.

더욱, 고상지지체는, 제1영역에서 제2영역을 통해서 모세관이동 하는 피검시료(액체)를 흡수하는 영역으로서, 제2영역에 이어서 제3영역을 갖고 있어도 좋다.

고상지지체는, 바람직하게는 스트립의 형상을 갖고, 제1영역 및 제2영역은, 스트립의 동일평면상에 피검시료가 모세관작용에 의해 제1대역 (제1영역)으로부터 제2대역(제2영역)으로 이동하고, 필요하다면, 더 나아가 제2대역에서 계속해서 제3대역(제3영역)으로 유입하는 양식으로 배열된다. 더욱, 이와 같이 고상지지체의 바람직한 형상은, 스트립 형태이지만, 그 형상 및 그 형식은 본 발명의 항체측정장치의 각종의 기능을 실시할 수 있는 한, 다른 형상 어느것이라도 채용 할 수 있다.

고상지지체는, 피검시료(액체)를 흡수 할 수 있고, 동시에 시료에 의해 습윤 했을 때에, 적어도 그 시료에 포함되는 항체를 모세관 작용에 의해 고상지지체의 제1영역에서 제2영역으로, 필요하다면 다시 계속하여 제2영역부터 제3영역으로 유동시킬 수 있는 것이다. 더욱 고상지지체는, 피검시료중에 포함되는 항체(표적항체를 포함한다)와 반응해서 그것을 포착하는 리간드를 지지 고정화 할 수 있는 것이 바람직하다.

적절한 고상지지체의 예로서는, 폴리에틸렌, 글라스파이버, 셀룰로오스, 레이온, 나일론, 가교 덱스트란, 각종의 크로마토그래피 용지, 니트로 셀룰로오스, 여과지 등의 다공성 기재를 들 수 있다.

고상지지체의 제1영역, 제2영역, 제3영역 등의 각 영역은, 상기 언급한 기재 중으로부터 선택된 동일 또는 다른 기재로 구성 할 수 있고, 각 영역의 비율이나 기능에 따라서, 여러가지를 선택하여 채용된다.

고상지지체의 제1영역은, 그 표면에 적용된 피검시료를 흡수하고, 그 시료를 제2영역으로 모세관이동 시킬 수 있는 다공성 기재로부터 되는 것이 바람직하다. 제1영역에 적당한 다공성 기재로서는, 특별히 제한은 되지 않지만, 통상 폴리에틸렌(예를 들면 POREX:Porex Technologies, Fairburn, Georgia 제), 글라스파이버, 레이온, 나일론, 및 종이를 포함하는 셀룰로오스계 소재 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는 다공성 폴리에틸렌, 여과지 등의 셀룰로오스계 소재이다.

고상지지체의 제2영역은, 그 모세관작용에 의해 제1영역에서 제2영역으로 피검시료(액체)를 배척하면서(wicking), 모세관이동 시킬 수 있고, 또 피검시료 중의 항체(표적항체를 포함한다)에 대한 리간드를, 시료의 모세관이동에 의해 이탈하지 않도록 지지할 수 있는 다공성기재인 것이 바람직하다. 이와같은 다공성기재로서는, 여과지, 크로마토그래피 용지, 글라스파이버, 가교결합된 덱스트란, 나일론, 및 니트로 셀룰로오스 등을 들 수 있지만, 바람직한 것은, 리간드를 용이하게 고정할 수 있는 이유 때문에, 니트로 셀룰로오스이다.

제2영역에는, 피검시료 중의 표적항체를 특이적으로 인식하여 그것을 포착하는 리간드를 결합, 고정화해서 되는 테스트부위, 및 피검시료 중의 임의항체를 인식해서 그것을 포착하는 리간드가 결합고정화해서 되는 콘트롤부위를 설치 할 수 있다. 콘트롤부위는, 테스트부위와 일정한 간격을 두고, 바람직하게는 모세관이동의 하류위치에 배치되어, 양 부위가 같은 조건으로 피검시료의 액체선단에 의해 접촉되는 것이 바람직하다.

테스트부위의 리간드로서는, 분석대상인 표적항체와 특이하게 결합하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는, 표적항체에 특이적으로 인식되어, 특이적으로 결합(항원항체반응)하는 항원을 들 수 있다. 이러한 항원으로서는, 기존의 혈청항체측정계에 있어 채용되어져있는 항원을 넓게 채용할 수 있다. 이것들은, 바이러스나 박테리아 등의 병원체 그 자체로도 좋지만, 적어도 해당 병원체에 고유의 항원결정기를 갖는 것이라면 좋다. 예를 들면, 병원체를 가온처리나 방사선조사 등에 의해 불활성화 한 것, 병원체를 계면활성제 등으로 추출처리 해서 얻을 수 있는 항원, 또, 화학합성이나 유전자공학적 수법에 의해 인공적으로 조제한 항원 등을 예시 할 수 있다.

콘트롤 부위의 리간드로서는, 피검시료 중에 포함되는 임의의 항체와 결합하는 것이라면, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는, 특히 뇨에 포함되는 임의항체를 특이적으로 인식해서, 그 항체에 결합하는 항체(항- 이무노글로불린항체)를 들 수 있다.

이러한 리간드는, 액체시료의 모세관이동에 의해 테스트부위 및 콘트롤부위로부터 탈리 제거되지 않도록, 각각 테스트부위 및 콘트롤부위에 위치하는 다공성기재에 고정된다. 즉, 각 리간드는 제2영역이 분석대상물을 포함한 시료에 의해 젖었을 때에, 확산하지 않도록 상기 다공성기재의 각 부위에 결합해서, 그래서 그 각부위에 고정화된 상태를 유지, 고상지지체의 제3영역으로 수송되는 것이 없도록 지지되는 것이 바람직하다.

이와 같은 리간드의 고정화는, 해당 기술분야에 있어서 공지 방법에 의해, 상기의 각종 다공성기재에 물리적결합 또는 화학적결합을 시키는 것에 의해 달성할 수 있다.

예를 들면, 공유결합법으로서 디아조법, 펩티드법(산아미드유도체법, 카르복실클로라이드수지법, 카르보디이미드수지법, 무수말레인산유도체법, 이소시아네이트유도체법, 브로모시안 활성화 다당체법, 셀룰로오스카르보네이트유도체법, 축합시약을 사용하는방법 등), 알킬화법, 가교시약에 의한 담체결합법(예를 들면 가교시약으로 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트 등을 이용한 것), Ugi 반응에 의한 담체결합법 등의 화학적반응:혹은 이온결합법: 물리적 흡착법 등을 예시 할 수 있다. 또 제2영역에 이용되는 리간드(항원)의 양은, 피검시료 중에 존재한다고 생각되는 표적항체가 본질적으로 전부 테스트 부위에 결합하도록 과잉량인 것이 바람직하다.

또, 제2영역의 콘트롤부위에 이용되는 리간드(항-이무노글로불린항체)의 양은, 피검시료 중의 임의의 항체(표적항체를 포함하고 있어도 좋다) 가 본질적으로 전부 콘트롤부위에 결합하도록 과잉량인 것이 바람직하다.

더욱, 테스트부위에 있어서 표적항체와 리간드(특히 항원)와의 결합반응은, 대장균유래성분의 존재하에서 시행되어지는 것이 바람직하다. 이러한 대장균유래성분은 피검시료의 희석용액 중에 배합되어 피검시료와 함께 제1영역에 부착되는 것에 의해 반응계에 제공되어도 좋고, 또 고상지지체의 테스트부위 또는 그 상류역(상술의 제1영역, 후술하는 트레이서 영역 등)에 탈착 가능하도록 부착 고정되어있어도 좋다. 대장균유래성분으로서는, 먼저 서술한 것처럼 대장균에서 유래하는 성분이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 그 단백질성분, 당질성분, 지질성분 또는 그 혼합성분 일 수 있다. 바람직하게는 대장균의 가용성추출물, 리포다당(LPS)이 예시된다.

피검시료를 제 1영역에 적용하면, 시료는 제1영역에서 모세관이동에 의해 제2영역에 유입하고, 거기서 먼저 제2영역 내의 테스트부위에 시료중의 표적항체가 결합,고정화되고, 다음에 그 하류에 위치하는 콘트롤부위에 남아있는 임의항체(테스트부위에 결합하지 못한 표적항체를 포함)가 결합,고정화된다.

본 발명에서 사용되는 표지수단은, 피검시료 중의 표적항체 및 임의항체가 각각 상기 테스트 부위 및 콘트롤부위에 결합,고정화 되었는지 아닌지를 검출하는 수단으로 사용된다.

이러한 표지수단으로서는, 항체에 대한 리간드와 그 리간드에 결합한 검출가능한 표지로부터 구성되는 것을 들 수 있다.

항체에 대한 리간드는, 피검시료 중에 존재하는 항체를 인식하는 동시에 그것에 결합하는 분자라면 특별히 제한되지는 않으나, 본 발명에 있어서는, 측정대상인 표적항체 및 피검시료 중에 포함된 임의의 항체 중 어느것에라도 결합하고 있는 것이 바람직하고, 이러한 것으로는 상술한 콘트롤부위의 리간드와 동일인 것으로, 특히 그 콘트롤부위의 리간드로서 채용한 것과 동일한 결합성을 갖는 항이무노글로불린항체를 예시 할 수 있다.

그 항이무노글로불린항체에는, 예를 들면 휴먼이무노글로블린 등의 대상에 대응하는 이무노글로불린을 면역원으로해서 면역된 임의의 피면역동물로부터 얻어지는 항혈청 또는 그 정제물(폴리크로날항체) 혹은 모노크로날항체가 포함된다.

더욱, 콘트롤부위의 리간드로서의 항이무노글로불린항체는, 소망에 의해, 예를 들면 피검시료에 포함되는 총 항체를 보충하여 이것을 검출하도록 모든 클래스의 항체에 대응하는 것으로 할 수 있고, 혹은, 이무노글로블린G(IgG) 등의 임의의 소망클래스의 항체에 대응하는 것으로 할 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 리간드는 측정을 소망하는 표적항체의 클래스와 같은 클래스의 항체에 대응하는 항이무노글로불린항체로 할 수 있고, 이 경우에는 콘트롤부위에 있어 표적항체와 동종항체의 검출이 수행되어지는 것에 의해, 뇨에 한정하지 않고, 혈청 등의 각종 체액을 피검시료로 사용하는 경우에 있어서도, 그 엣세이가 적절히 실시되었는지를 판단한 후에 가장 적합한 지표를 부여하는 점이 바람직하다.

또, 표적항체가 IgG인 경우는, 상기 표지수단으로서의 리간드는, 보다 바람직하게는 항체 IgG의 Fc 영역에서 결합특이성을 갖는 것으로 특징되어지는 리간드인 것이 좋고, 예를 들면 항체 IgG의 경쇄 혹은 F(a b)영역과 반응성을 나타내지 않는 Fc 특이적 항 IgG 항체, 또는 항체 IgG의 Fc 영역에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 프로테인 A나 프로테인 G 등의 채용을 바람직하게 예시 할 수 있다. 이러한 항이무노글로불린 항체 내지 리간드는, 통상적인 방법에 따라서 조제할 수 있고, 또, 시판품으로도 입수 할 수 있다.

검출 가능한 표지성분은, 특이적 결합엣세이, 특히 이무노엣세이에 사용된 해당 기술분야에 있어 공지의 것 또는 장래 사용될 수 있는 이른바 검출가능한 표지라면 특별한 제한은 되지 않는다.(「단 클론항체」이와사키타츠오 등 저, 고단사 사이언티픽, 1984 ; 「효소면역측정법」제2판, 이시가와이지 등 저, 의학서원 1982등).

바람직한 표지로서는, 제2영역의 테스트부위나 콘트롤부위에 있어 바람직하게는 색의 변화를 생기게 하는 것이다. 제한은 되지 않지만, 보다 바람직하게는 색의 변화를 어떠한 계측기도 필요로 하지 않고, 가시적으로 인식 할 수 있는 것이다. 예를 들면, 각종의 발색원, 예를 들면 형광성 물질, 흡수성 색소 등을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 가시적으로 검출가능한 마커를 포함한 입자상의 표지를 들 수 있다.

적절한 입자상의 표지에는, 폴리머(예를 들면, 라텍스 또는 폴리스티렌), 낭(囊; sack), 리포좀, 금속 겔(예를 들면, 은 콜로이드 또는 금 콜로이드) 또는 폴리스티렌 염료의 입자가 포함된다. 바람직한 것은 은 콜로이드 또는 금 콜로이드 등의 금속 겔이다.

이러한 표지는, 통상적인 방법에 따라서, 리간드에 화학적 혹은 물리적으로 결합을 시키는 것에 의하여 표지화 리간드로서 조제되고, 이것들은 또 시판품으로도 입수 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 표지수단은, 고상지지체의 제2영역(테스트부위 및 콘트롤부위를 포함)에 적용되어, 그 영역에서 생긴 시료중의 항체와의 반응결과를 검출 할 수 있도록 표지하는 것이면 좋다. 이러한 목적을 충족시키는 것에 있어 그 존재 양태는 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들면, 본 발명 측정장치를 플로스루(flow through)타입의 장치로 하는 경우에는, 해당 표지수단은 고상지지체와는 별개의 것으로 해서, 항체측정용 시약키트에 포함시킬 수 있다.

바람직하게는, 표지수단은 고상지지체에 탈리 가능한 양태로지지 고정화 되어있고, 보다 바람직하게는 고상지지체의 제2영역보다 상류역에서 탈리 가능한 양태로 지지 고정화 되어 있는 것이 바람직하다. 한층 더 바람직한 양태는, 고상 지지체의 제1영역과 제2영역과의 사이에 위치하는 영역(이하, 트레이서 영역이라 함)에 지지되는 것이다. 이러한 경우, 제1영역에 적용된 피검시료는, 모세관이동에 의해 트레이서영역으로 이동하고, 거기서 표지화리간드와 접촉하여, 표적항체/표지화리간드-복합체 및 임의항체/표지화리간드-복합체를 각각 형성한다. 트레이서 영역을 통과 후, 이러한 복합체를 포함하는 피검시료는 더욱이 모세관이동에 의해 제2영역으로 이동한다. 제2영역내의 테스트부위에 배치된 리간드(항원)는, 표적항체에 특이적이고, 또 콘트롤부위에 배치된 리간드(항이무노글로블린항체)는, 임의항체에 특이적이다. 이것 때문에, 모세관이동을 해서 온 시료중의 표적항체/표지화리간드-복합체는 먼저 그 테스트부위에 포착되고, 다음에 시료중에 남아있는 임의항체/표지화리간드-복합체(표적항체/표지화리간드-복합체를 포함 함)가 콘트롤 부위에 포착된다.

이러한 고상지지체의 트레이서영역은, 표적항체 및 임의항체를 포함한 피검시료를 제1영역에서 제2영역으로 모세관이동에 의해 수송할 수 있는 동시에 상술한 표지화 리간드를 이러한 모세관이동에 따라서 탈리 가능하도록 지지고정 할 수 있는 기재로 된 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 통상, 다공성 기재로 된, 예를 들면, 폴리에틸렌, 글라스파이버, 레이온, 나일론, 또는 종이 등을 포함한 셀룰로오스계 재료 등을 예시할 수 있다. 바람직하게는, 비특이적인 흡착을 나타내기 어려운 재료이고, 예를 들면 소망에 의해 폴리비닐알콜(PVA)로 처리되어도 좋은 글라스파이버 등을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태는, 고상지지체에, 상기 트레이서 영역과 제2영역내의 테스트부위가 일정의 간격을 두고 배치되어진 것이 포함되어있다. 이러한 것처럼, 트레이서영역과 테스트부위와의 사이에 일정의 영역이 설치되어진 것에 의해, 트레이서영역에서 표지화리간드와 접촉한 피검시료는, 제2영역의 테스트부위에 도달하기 앞서, 이러한 영역에서 항체와 표지화리간드가 혼합되어, 항체와 표지화리간드의 결합반응이 촉진된다. 다시 말하면, 이러한 영역은, 시료중의 표적항체 및 임의항체가 각각 테스트부위 및 콘트롤부위에 접촉하기 전에, 그 표적항체 및 임의항체와 표지화리간드의 결합을 위해 인큐베이트영역(시간, 공간)을 제공하는 것이다.

더욱이, 본 발명인 고상지지체는, 제2영역에 이어서 제3영역을 갖고 있어도 좋다.

피검시료는 제1영역, 필요하면 트레이서영역을 통과하여 제2영역에 접속 후, 모세관이동에 의해 제2영역을 통과해서 그 제3영역으로 계속 이동한다. 즉, 이러한 제3영역은 제2영역으로부터 유입하는 액체를 받는 영역으로서 기능하고, 제2영역과 모세관이동에 의해 액체 전달되어진다.

제3영역은, 통상 적어도 제2영역에서 결합하지 않았던 액체함유물질을 받기 위해 기능하는 것이라면 좋지만, 더욱이, 액체시료의 모세관류(즉, 액체의 선단)가, 고상지지체상의 예비 결정된 완료 죤으로 진행하여 엣세이 완료를 알려주는 부위를 갖을 수도 있다.

이러한 목적으로, 고상지지체에는, 제2영역의 하류역에 에리스로신 B, 사프라닌 O, 또는 페놀 레드 등의 수용성 염료를 포함한 가시 인디케이터 죤을 만들 수도 있다. 이 경우, 피검시료의 액체선단이 제2영역을 횡단, 그리고 제3영역에 들어갈 때에 상기 인디케이터 죤을 통하여 흘러, 거기에 위치하는 염료는 피검시료(액체)의 모세관이동에 의해 하류역으로 운반되어, 거기서 피검시료가 제1영역, 트레이서영역 및 제2영역(테스트부위, 콘트롤부위)을 통과하여, 엣세이가 완료한 것을 검출, 확인할 수 있다.

제3영역은, 피검시료(액체)를 흡수할 수 있는 기재로부터 된 것이면 특별한 제한이 없으며, 예를 들면 폴리에틸렌, 레이온, 나일론, 또는 종이 등을 포함한 셀룰로오스계 재료 등을 예시할 수 있다. 바람직한 것은 종이 등을 포함한 셀룰로오스계 재료이다.

이하, 본 발명을, 항체측정장치 및 그 부품의 바람직한 양태를 첨부하는 도면을 참조하면서 설명한다. 단, 그 도면에 나타내는 장치는 본 발명의 일양태에 지나지 않으며, 본 발명은 이러한 것에 전혀 한정되지 않는다.

도1은, 본 발명의 장치에 포함된 스트립형상의 고상지지체(60x5mm)의 약도이다. 도1중, 기호1은 피검시료가 적용되어 그 피검시료가 접촉하는 제1영역(16x5mm, 두께0.92mm)이고, 기호2는 표지화리간드(예를 들면, 금 콜로이드 표지화 항휴먼 IgG 항체)가 지지되고 있는 트레이서영역(5x5mm, 두께 0.79mm)이고, 기호 3은 피검시료 중의 항체와 반응하고, 그 결과를 표시하는 제2영역(18mmx5mm, 두께0.1mm)이고, 기호 4는 제1영역부터 제2영역을 통하여 이동하여온 피검시료를 흡수하는 제3영역(22x5mm, 두께1.46mm)이다.

제1영역의 두께는 통상 0.2-2mm, 바람직하게는 0.8-1.2mm이고, 트레이서영역의 두께는 통상 0.2-1.5mm, 바람직하게는 0.5-1mm이고, 제2영역의 두께는 통상 0.03-0.2mm, 바람직하게는 0.08-0.12mm이고, 제3영역의 두께는 통상 0.5-3mm, 바람직하게는 1-2mm를 들 수 있으나, 이것들에 아무것도 제한받지는 않는다.

제2영역 (3)내에는, 표적항체에 특이적으로 결합하는 리간드가 지지고정화 되는 테스트부위(테스트라인 약1x5mm)(기호5)와 임의항체에 결합하는 리간드(항휴먼이무노글로불린항체)가 지지고정화되는 콘트롤부위(콘트롤라인, 약 1x5mm)(기호6)가 배치된다. 테스트부위(5)는 트레이서영역(2)으로부터 일정의 간격(약 6mm 정도)을 두고, 또 콘트롤부위 (6)는 테스트부위 (5)부터 일정 간격 (약 6mm 정도)을 두고 배치된다. 테스트부위는, 피검시료 중의 표적항체와 특이적인 반응을 하고, 표지의 존재하에서 그 표적항체의 존재 유무를 표시하도록 기능하고, 콘트롤부위는 사용한 피검시료가 적합성인지 아닌지를 표지의 존재하에서 표시하도록 기능한다.

스트립의 고상지지체를 구성하는, 제1영역, 트레이서영역, 제2영역 및 제3영역의 각 부재(기재)는, 시료가 이동하는 스트립의 긴쪽방향으로 각각 접합되어있으면 좋으나 그 접합 양태를 묻지는 않으며, 바람직하게는 제1영역의 긴쪽방향의 선단역(front end part)과 제2영역의 기단역(rear end part), 및 제2영역의 선단역과 제3영역의 기단역이 적층된 상태로 접합되어져있는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 도1에 지시된 것처럼, 제1영역의 긴쪽방향의 선단역이 트레이서영역의 기단역 위에 적층되고, 또 트레이서영역의 긴쪽방향의 선단역이 제2영역의 기단역 위에 적층되는 양태이고, 더욱이 제 3영역의 기단역이 제 2영역의 선단역 위에 적층되어져도 좋다. 따라서 접합 양태를 갖는 것에 의해, 제1영역에 붙여진 시료는 스트립의 긴쪽 방향으로 부드럽게 이동할 수 있다. 적층역의 긴쪽 방향 폭은 특별히 제한되지는 않으나, 0.5-10mm, 바람직하게는 1-2mm, 한층 더 바람직하게는 0.8-1.2mm 정도를 예시할 수 있다. 더욱, 적층부 각 영역의 상하위치는 이것에 한정되어지지 않고, 그 반대이어도 좋다.

상술한 고상지지체는, 사용하기 쉽도록 엣세이장치의 형태로 패키징되어있는 것이 바람직하다.

(3) 고상 엣세이 방법

다음에 도2에 기초하여, 본 발명장치에 의한 엣세이 원리를 설명한다.

더욱, 제3의 본 발명은 이 장치를 이용하는 표적항체의 고상 엣세이법으로, 구체적으로는 항체 측정장치의 제1영역에 피검시료를 접촉시키고, 제2영역의 콘트롤부위가 발색하고 있는 조건에서, 제2영역의 테스트부위의 발색유무를 검출하는 것으로부터 되는 피검시료 중의 표적항체의 고상에세이법이다.

엣세이에 있어서 표적항체를 포함한 의혹이 있는 피검시료는 먼저 고상지지체의 제1영역(1)에 적용된다.

더욱, 피검시료는 오줌 등의 체액을 그대로 사용하여도, 또 적당한 희석용액으로 희석하여 사용하여도 좋다. 희석용액으로는 특별한 제한없이, 예를 들면 pH5∼9정도, 바람직하게는 pH6.5∼8.5 정도의 범위에서 완충능력이 있는 완충제(예를 들면 구연산완충액, 인산완충액, 트리스완충액, 초산완충액, 붕산완충액 등), 계면활성제 등을 포함하는 것이 가능하다

또, 항원항체반응을 대장균에서 유래하는 성분의 존재하에 시행하는 것에 의해, 항원항체반응에 있어서의 비특이적반응이 억제되어, 그 결과 위양성검출이 저감되는 것때문에, 바람직하게는 더욱이 대장균 유래성분을 포함하는 희석용액을 사용하는 것이 바람직하다. 희석용액에 배합하는 대장균유래성분(LPS) 의 양은, 특히 제한은 없지만, 반응계, 즉 테스트영역에 있어서의 리간드(항원) 1μg당, 0.1 ∼ 10μg정도 바람직하게는 0.5 ∼ 5μg 정도의 비율이 되도록 조제되는 것이 바람직하다. 더욱 피검시료에 배합되는 대장균 유래성분 (L P S)의 양으로 통상 5μg/ml이상, 바람직하게는 5∼100μg/ml, 더욱 바람직하게는 10∼50μg/ml의 범위를 예시할 수 있다.

더욱, 100μg/ml이상 배합하는 것은 특별히 제한하지는 않으나, 그것이하의 배합으로 본 발명의 효과는 달성된다.

피검시료를 제1영역(1)에 적용하는 것에 의하여 제1영역은 습윤된다. 적용된 피검시료는, 제1영역(1)을 통하여 모세관이동에 의해 트레이서영역(2)에 들어가서, 여기서 트레이서 영역내에 이탈가능한 상태로 지지되어 있는 표지화 리간드 (금 콜로이드 표지화항휴먼 IgG항체)와 접촉하고 반응한다.

적합한 피검시료를 사용한 경우에 있어서, 시료 중에 표적항체가 포함되어 있는 경우는, 표적항체와 시료에 포함된 임의항체는 어느 것도, 트레이서 영역(2)에 있어서 상기 표지화 리간드에 결합하여, 각각 표적항체/표지화 리간드-복합체 및 임의항체/표지화 리간드-복합체를 형성한다. 피검시료가 트레이서영역 (2)를 통과 후, 형성된 각 복합체 또는 복합체를 형성하지 않은 표지화 리간드는 피검시료와 함께 트레이서 영역(2)로부터 하류역에 수송된다. 바람직한 양태에 있어서 아직 복합체를 형성하지 않은 표지화 리간드는, 트레이서영역 (2)으로부터 제2영역 (3)의 테스트부위(5)에 접촉할 때까지의 사이에, 항체를 포함한 피검시료와 함께 모세관이동을 하면서, 복합체형성에 충분한 시간(공간)이 주어진다. 다음에 제2영역의 테스트부위 (5)에 도달하면, 먼저 그 부위 (5)에 있어서 피검시료에 포함된 표적항체/표지화 리간드-복합체가 그 부위에 지지되는 리간드와 결합하고, 고정화된다. 다음에, 피검시료는 더욱 모세관이동에 의해 하류역에 이동하고, 콘트롤 부위 (6)에 있어서 임의항체/표지화리간드-복합체가 그 부위의 리간드(항휴먼 이무노글로불린항체)와 결합하고, 고정화된다. 다음에 제2영역의 테스트부위(5) 및 콘트롤 부위 (6)에 고정화된 복합체를 그 표지화 리간드의 표지성분에 기초하여 검출하는 것에 의해 엣세이결과를 양성으로 표시하는 것이 가능하다. 그것에 대응하여, 피검시료로서 표적항체를 포함하지 않는 시료를 사용한 경우는 테스트부위 (5)에 결합하는 표적항체/표지화 리간드-복합체가 형성되지 않기 때문에 그 테스트부위 (5)에서 표지는 검출되지 않는다 (음성).

그런데, 테스트부위(5)에 표시되는 음성 결과에는 시료의 농도가 엷은 (즉, 시료 중의 총 항체량이 적은) 것에 기인하는 음성(위음성)결과와 시료 중에 표적항체가 존재하지 않는 음성(진성음성)결과의 양자가 포함된다. 이러한 음성의 구분은 테스트부위 (5)의 결과만으로는 판별할 수 없으나, 위음성의 경우는, 콘트롤부위 (6)에 결합하는 임의항체/표지화리간드-복합체 자체가 형성되지 않기 때문에, 콘트롤 영역이 음성을 나타내고, 진성음성의 경우는, 임의항체/표지화리간드-복합체가 형성되기 때문에, 콘트롤영역이 양성을 나타내고, 이러한 콘트롤부위 (6)의 음성 및 양성의 상이에 의해, 테스트부위 (5)의 음성결과가 위음성인지 진성음성인지를 구별할 수 있다. 더욱이, 실활한(활성을 잃은) 표지화 리간드가 채용된 경우 등, 적절한 장치에서 적절하게 측정이 실시되지 않은 경우에는, 같은 방법으로 콘트롤부위 (6)가 음성을 나타내는 것에 의해, 이것들의 원인에 의한 위음성검출도 방지할 수 있다.

이른바 미결합항체, 표지화리간드 등을 포함하는 액체시료는 모세관이동에 의해 더욱더 제2영역 (3)으로부터 하류역에 위치하는 제3영역 (4)에 계속 이동된다. 소망에 의해, 인디케이터 죤을 설치할 수 있고, 이 경우, 액체의 선단은 인디케이터 죤으로부터 완료 죤으로 염료를 운반, 그 액체염료가 제3영역을 통과하여 엣세이가 종료한 것을 나타낸다.

수평방향으로 사용된 본 발명의 항체측정장치의 예를, 도3에 나타낸다. 제1영역(1), 트레이서영역(2), 제2영역(3)(테스트부위(5)와 콘트롤부위(6)을 포함), 제3영역(4)를 포함한 고상지지체(A)는, 적당한 재료로부터 되는 하우징 내(B)에 둔다. 이러한 하우징 재료로서는, 성형가능한 플라스틱, 예를들면 폴리스티렌 등이 바람직하지만, 다른 재료, 예를 들면 유리, 금속, 종이 등을 사용할 수도 있다. 상기 하우징은, 몇 개의 개구부를 가지는 상부섹션 (7)과 하부섹션 (8)로 되고, 고상지지체는 하우징의 하부섹션 상에 위치되어, 그 위로부터 상부섹션에 의해 덮여진다. 하우징의 상부섹션의 개구부 (9) 및 (10)는, 고상지지체의 각 영역의 배치에 따라 정렬되어, 각각 고상지지체의 제1영역 (1) 및 제2영역 (3)에 대응하고 있다.

개구부 (9)에 의해 지지체의 제1영역 (1)에 시료를 적용하는 것이 가능하게 된다(시료첨가창). 개구부 (9)는, 그 개구부의 주변에 한층 높은 측면을 가지고 있는 것이 바람직하고, 이러한 측면은 웰을 형성하여 액체시료가 지지체의 제1영역에 적하되어 침투하는 것을 촉진한다. 더욱, 피검시료를 고상지지체의 제1영역에 접촉시키는 방법은, 특별히 제한되지는 않지만, 장치의 시료첨가창 (9)로부터 고상지지체 평면에 대응하여 수직이 되도록 똑바로 적하하는 것이 바람직하다.

개구부 (10)은, 고상지지체의 제2영역의 테스트부위 및 콘트롤부위가 눈으로 볼수 있도록 배치되어, 이것에 의해 테스트부위의 표지화 리간드/표적항체-복합체의 결과 유무, 및 콘트롤부위의 표지화리간드/임의항체-복합체의 결과 유무를 시각에 의해 검출 가능하게 된다(검출창, 판정창). 더욱, 개구부 (10)은, 반드시 테스트부위와 콘트롤부위의 쌍방을 포함하도록 개구하고 있을 필요는 없고, 고상지지체의 테스트부위와 콘트롤부위가 별개의 개구부에 의해 두 개의 검출창을 형성하도록 하여도 좋다.

본 발명의 항체측정장치에 의하면, 통상 45℃이하, 바람직하게는 4∼ 40℃, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 30℃정도의 온도조건하에서, 피검시료 적용후 수분 ∼ 30분, 바람직하게는 5 ∼ 20분 방치하는 것에 의해, 피검시료 중의 표적항체의 존재 유무 및 / 또는 그 양을 정밀도 좋게 엣세이 할 수 있다.

(4) 항체측정용시약 키트

상기 (1)에서 설명한 항체측정방법, 또는 (2)에서 설명한 항체측정장치를 이용한 고상엣세이법을 실시하는 것에 있어서, 항체측정에 필요한 각종시약 및 장치를 완비한 항체측정용 시약 키트를 사용하는 것이 간편하다.

본 발명은, 이러한 항체측정방법 또는 고상엣세이법을 실시하기 위한 항체측정용 시약 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 항체측정용 시약 키트는, 피검시료 중의 항체를 항원항체 반응을 이용하여 검출 측정하기 위한 것으로, 그 일 양태로서 상술한 대장균 유래성분을 일성분으로 하여 포함한 것을 들 수 있다. 이 시약 키트는 더욱이 측정대상인 표적항체와 항원항체반응하는 고상화 되어있어도 좋은 항원, 또는 항체검출시약 등을 함유하고 있어도 좋다. 또, 이 시약 키트에는, 측정의 실시 편익을 위해, 더욱 적당한 반응액, 희석액, 세정액, 반응정지액, 표지활성측정시약 등이 포함되어 있어도 좋다.

또, 본 발명의 항체측정용 시약키트의 다른 양태로서, 항체 검출 시약으로서, 상술한 표적항체 IgG의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 것, 바람직하게는 Fc 특이적 항 IgG항체를 포함하는 것을 들 수 있다.

더욱 본 발명의 항체 측정용 시약 키트의 다른 양태로서, 상술한 항체측정장치를 함유하는 것을 들 수 있다. 이 시약키트에는, 시약으로서 더욱 상술한 것처럼 대장균 유래성분 또는 표적항체 IgG의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 것의 적어도 하나를 포함할 수 있고, 더욱 또 상술한 것처럼 반응액, 희석액, 세정액, 반응정지액, 표지활성측정시약 등의 각종시약, 또는 스포이드나 피검시료를 희석하기 위해 사용되는 앰플(튜브) 등의 부속품을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 설명을 위한 실시예를 기재하지만, 해당 실시예는 하등 본 발명의 기술적 범위를 제한하는 것은 아니다. 당 업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식(변형), 변경을 더할 수 있고, 그것들은 모두 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예1 H. 필로리항체의 측정

(1) H. 필로리 항원의 조제

H. 필로리균(임상분리주)을 브루셀라 아가 배지(벡톤사)에서 48시간 배양(10% CO₂, 5% O₂, 37℃) 하고, 냉 P B S에서 집균하였다. 냉 PBS로 5회 원심세정 후, 균체농도가 100mg/ml가 되도록 냉 PBS를 첨가하여, 교반하고, 당량의 냉 0.2% 트리톤 X-100 PBS용액을 더하였다. 5분간 교반후 원심하여 얻은 상청을 H. 필로리 항원용액으로 하고, -80℃에서 보존하였다.

(2) H. 필로리 항원 플레이트의 조제

상기 H. 필로리 항원용액(2.5㎍프로테인/㎖ )을 100㎕/웰의 비율로 96웰 플레이트에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 그 웰을 PBS로 1회 세정 후 블록킹 액 (달벡코-PBS(D-PBS), 1% BSA, 5% 소비톨, 0.05% NaN₃(pH7.4))를 300㎕/ 웰에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 블록킹 액을 제거하고, 25℃에서 하룻밤 건조시켜, 이것을 알루미늄자루에 건조제와 같이 넣어 밀봉하여, 사용시까지 4℃에서 보존하였다.

(3) 대장균유래성분의조제

대장균(pvc18/JM109주 : 타카라 주조사제)를 암피실린 함유액체 LB배지(Luria-Bertani배지, 일본제약사)에서 37℃, 18시간 배양 후, 원심에 의해 집균하고 PBS로 2회 세정하였다. 균체농도가 100㎎/㎖가 되도록 냉 PBS를 첨가하여, 초음파 파쇄기에 의해 파쇄추출 하였다(10초×3회). 이렇게하여 얻은 원심상청을 대장균 유래성분으로 하고, - 80℃에서 보존하였다 (이하, 대장균 추출물이라한다).

(4) H. 필로리 뇨중 항체의 측정

피검시료로서 뇨를 사용하여, 뇨중에 포함되어진 H. 필로리항체를 측정하였다.

즉, 상기 (2)에서 제조한 H. 필로리 항원 플레이트의 각 웰에, 20㎍프로테인/㎖의 대장균추출물을 포함한 제1완충액(200mM 트리스 완충액, 0.14M NaCl, 2%카세인, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN₃, (pH7.3))을 25㎕ 및 뇨 샘플을 100㎕첨가하여, 10초간 교반 후, 37℃에서 1시간 방치하였다. 그 플레이트를 PBST ( 0.05% Tween 20 및 0.05% NaN₃을 포함한 PBS용액)로 6회 세정 후, 효소(HRP)표지 항 휴먼IgG항체(Peroxidase conjugated Affini Pure Goat anti-Human IgG (FC) : 잭슨, 이무노ㆍ리서치사)를 제2완충액(50mM 트리스완충액, 0.14M NaCl, 0.5% BSA, 5% 염소혈청, 0.05% Tween 20, 0.1% XL-II, (pH7.3))으로 11,000배 희석한 것을 100㎕ 첨가하여 37℃에서 1시간 방치하고, 그 후 PBST로 6회, 플레이트 세정을 시행하였다.

발색액 (50mM 구연산 인산 완충액, 50% TMB용액, 0.0075%, H₂O₂) 100㎕를 첨가하여 실온에서 20분간 반응 후, 반응정지액 (50%, TMB 정지용액, 50% 1N-H₂SO₄)를 100㎕ 첨가하여 흡광도를 측정하였다.

(5) 측정결과

(i) 현재의 진단법중에서 가장 정확한 H. 필로리 감염진단법 이라고 하는 ¹³C-UBT 테스트 [J.Gastroenterol., 33:pp.6-13(1998)]로 분류한 H.필로리 감염양성자 및 동 음성자 각 5예의 뇨를 검체로서, 뇨중의 H. 필로리 항체를 상기(4)에 의하여 측정하였다.

또한, 대조실험으로서 대장균추출물을 첨가하지 않은 이외는 동일방법으로 동일 뇨검체를 측정하고, 그 결과로부터 대장균추출물의 첨가에 의한 본 발명 방법의 효과를 검사하였다.

결과를 도4에 나타낸다.

도4에 있어서, 종축은 흡광도(OD450 - 650nm)를, 횡축은 대장균 추출물의 첨가 유(+) 무(-)를 나타내고, 또 도에서, ○은 ¹³C - UBT 테스트에 의한 H. 필로리 감염양성자의 뇨샘플의 결과를, ●는 동 테스트에 의한 H. 필로리감염 음성자의 뇨샘플의 결과를 각각 나타낸다.

도4에서 밝혀진 것처럼, 대장균 추출물을 첨가한 본 발명 방법에 의한 측정에 의하면, ¹³C-UBT 테스트의 결과와 일치한 양태로, H. 필로리 감염 양성자와 음성자를 명확히 구별할 수 있어, 정밀도가 우수한 검출이 가능하였다.

(ii) H. 필로리의 근색치료를 받은 적이 없는 건강한 사람 99명 및 위질환을 갖고 있는 환자 20명(위궤양 7예 및 위염13예)의 뇨샘플을 사용하여, 상기(4)에 따라서 대장균 추출물이 존재하는 계통에서 뇨중의 H.필로리항체를 측정하였다. 결과를 도5에 나타낸다. 동 도에 있어서, 종축은 흡광도 ( O.D 450nm)를 횡축은 ¹³C - UBT 테스트에 의한 분류 (양성자, 음성자)를 나타낸다. 이 결과로부터, 대장균 추출물을 첨가한 측정계에 있어서, 음성자의 뇨샘플은 위양성을 나타내는일 없이, 명확히 음성 결과를 나타내는 것이 밝혀졌다.

(iii) 상기(ii)에 있어서 피검자의 혈청중에 포함되는 H. 필로리 항체의 양을, 시판하는 ELISA 키트를 사용하여 측정하고, 그 측정방법의 감도, 특이성 및 정밀도를 동일 피검자의 뇨샘플을 사용하여 측정한 본 발명 방법의 결과와 비교하였다. 즉, 피검자의 혈청 샘플 및 뇨샘플은, 동시에 채취하고 평소의 방법에 따라서 조제하였다.

사용한 시판의 ELISA키트는, 「 HM - CAP™ kit;Enteric Products사」(HM - CAP), 「Helico G™ kit; Shield Diagnostic 사」 (Helico G) 및 「HEL - p TEST™ kit ; AMRAD BIOTECH사」(HEL-p)이고, 각 측정은, 각 키트에 첨부된 지시서에 따라서 실시하였다. 결과를 표1에 나타낸다.

표1에 있어서, 「감도」는 H. 필로리 양성자 ( ¹³C - UBT 테스트에 대한 감염양성자 ; n=70)에 대한 각 키트에서의 양성율을, 「특이성」은 H.필로리 음성자 (¹³C - UBT 테스트에 대한 감염음성자 : n=49)에 대한 각 키트에서의 음성율을 각각 나타내는 것이고,「정밀도」는, 전피험자 (70+49=119 예)에 대한 각 키트에서 정확히 측정된 비율을 나타낸다.

본 발명 방법에 의한 H. 필로리 항체의 측정에 의하면, 항체가 미량밖에 존재하지 않는 뇨를 피검체로 사용함에도 불구하고, 기존의 혈중항체 검출 키트 보다도 감도 및 특이성에 있어서 우수하고, 현저히 우수한 정밀도를 나타내는 것이 분명해진다.

(6) H. 필로리 뇨중 항체의 측정

대장균 추출물 대신에 대장균 LPS (Difco사제)를 포함하는 제 1완충액(LPS 농도 : 5㎍/웰)을 사용한 이외에는, 상기 (4)에 따라서, 뇨검체 중에 포함된 H. 필로리 항체를 측정하고, 상기 (5)(i)에 따라서, 그 측정결과를 평가하였다. 결과를 도6에 나타낸다. 이 도면으로부터 대장균 LPS에 대해서도 대장균 추출물과 같은 모양의 결과가 얻어지는 것을 알 수 있다.

실시예2 B형 간염 바이러스(HBc)항체의 측정

(1) B형 간염 바이러스(HBc)항체의 측정

HBc항원(Chemicon International사제)을 사용하여 상기 실시예 1 (2)에 준하여 항원 플레이트를 조제하고, 뇨중 검체에 포함된 B형 간염 바이러스(코아)(HBc) 항체의 측정을 상기 실시예 1 (4)에 준하여 시행하였다.

즉, HBc 항원 플레이트의 각 웰에, 소정농도의 대장균 추출물을 포함하는 제1완충액 25㎕ 및 뇨샘플 100㎕를 첨가하여, 10초간 교반 후, 37℃에서 1시간 방치하였다. 그 플레이트를 PBST로 6회 세정 후, 효소(HRP)표식항휴먼IgG항체를 제2완충액으로 11,000배 희석한 것을 100㎕첨가하여 37℃에서 1시간 방치하고, 그 후, 플레이트 세정(PBST로 6회)을 시행하였다.

발색액 100㎕를 첨가하여 실온에서 20분간 반응 후, 반응정지액 100㎕를 첨가하여 흡광도를 측정하였다.

(2) 측정 결과

시판하는 HBc항체 리어키트 (다이나보트사제)를 사용한 측정에 의하여, 혈중 HBc항체 양성자 및 동 음성자로 분류한 각 5예에 있어서, 뇨중 HBc항체를 상기 (1)에 따라서 측정하였다.

더욱, 반응액중의 대장균 추출물의 농도를, 0, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5㎍/㎖이 되도록 설정하고, 그 첨가에 의한 효과를 검사하였다. 결과를 도7에 나타낸다.

도7에 있어서, 종축은 흡광도 (OD 450-650nm)을, 횡축은 대장균 추출물의 첨가농도를, ●은 혈중HBc항체 양성자의 뇨검체 결과를, ○은 혈중 HBc항체 음성자의 뇨검체 결과를 각각 나타낸다. 그 도에 의해 뇨를 피검시료로 한 경우에도, 대장균 추출물의 첨가량에 의존하여, 혈중 HBc항체 양성자 및 동 음성자 각각에서 검출된 HBc항체 레벨의 차가 보다 명확히 되는 것이 분명해졌다.

실시예3

공지측정법 〔Calypte™ HIV - 1 Urine EIA : Arch. Pathol. Lab. Med., 119, 139-141(1995); Clinical infectious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)〕에 의한 뇨중 HIV항체의 측정에 있어서 위양성의 결과를 준 뇨검체를 사용하여, 그 측정계에서 비특이반응을 주는 성분이 무엇인지를 밝혀내는 검사를 시행하였다.

(1)상기 해당하는 뇨검체를 1M 인산완충액(pH7.7)으로 pH7.4로 조정후, 5.0 , 0.8 및 0.2μm의 커트 필터로 순차 여과하고, 그 20㎖를 한외여과 (10kd,카트의 멤브레인)에서 2㎖까지 농축하였다. 농축한 뇨검체를 겔여과(Sephacryl S-300, Pharmacia)처리하고, 얻어진 각 분획에 있어서, HIV 항원에의 반응성을 시험하였다.

즉, HIV항원에의 반응성은, 각 분획을 HIV항원(gp160)을 고정화한 HIV항원고상화 플레이트와 반응시킨 후, 결합성분(비특이 반응성분)을 ALP표지염소항휴먼(IgG +IgM)항체 또는 HRP표지염소항휴먼IgG(Fc특이적) 항체 또는 HRP표지염소항휴먼 IgG(Fab특이적)항체(어느 것이나 Jackson ImmunoResearch Labs. 사제)을 사용하여, 검출하였다. 결과를 도8에 나타낸다.

도 8에 있어서, 종축은 흡광도(O.D)를, 횡축은 겔여과의 분획(플렉션 번호)을 나타낸다. 실선은 280nm에 있어서의 단백질의 흡광도를, 검정원선은 상기 항 휴먼(IgG + IgM)항체에 의한 검출 결과를, 흰 삼각선은 상기 항휴먼 IgG(Fc특이적) 항체에 의한 검출결과를, 검정삼각선은 상기 항휴먼 IgG (Fab 특이적) 항체에 의한 검출 결과를 각각 나타낸다.

도8에 의하여, 항휴먼IgG(Fab특이적) 항체에서의 검출에 있어서는, 항휴먼(IgG+IgM)항체에 있어서와 같은 모양의 반응양식 (비특이반응 성분과의 반응성)을 나타내고, 한편, 항휴먼 IgG(Fc특이적)항체를 사용한 경우에는 반응성을 나타내지 않는 것이 밝혀졌다. 이것에 의해, 비특이반응을 주는 성분은, Fc부분을 포함하지 않는 항휴먼 IgG (Fab특이적) 항체와의 반응성을 보전하고 유지하는 휴먼 IgG의 단편화물 또는 동 변성물인 것으로 생각되어졌다.

따라서, 이러한 비특이반응을 주는 성분과의 반응성을 갖지 않는 항휴먼 IgG(Fc특이적)항체를 항체검출시약으로 사용하면, 항체검출에 있어서 비특이반응을 막을 수 있어, 그 결과, 비특이반응에 기초한 위양성의 판정결과 발생이 감소하는 것에 의하여 특이성이 높은 고정밀도의 항체검출 방법을 제공할 수 있는 것이 명확해졌다.

실시예4 뇨중 HIV항체의 측정

HIV항원 플레이트(Calypte™ HIV- 1 Urine EIA, Calypte Biomedical Corp.)의 각웰에, 제1완충액 (Calype™ HIV - 1 Urine EIA의 샘플 완충액)을 25㎕ 및 뇨샘플을 200㎕ 첨가하여, 10초간 교반 후, 37℃에서 1시간 방치하였다. 그 플레이트를 6회 세정 후(세정액; D-PBS, 0.05% Tween 20), HRP표지 염소항휴먼 IgG(Fc특이적)항체 (Peroxidase-conjugated Affini Pure Goat anti-Human IgG, Fc Fragment Specific, jackson ImmunoResearch Labs.사제)를 제2완충액(50mM 트리스 완충액, 0.14M NaCl, 0.5% BSA, 5% Goat Serum, 0.05% Tween 20, 0.1% XL-II (pH 7.3))에서 11,000배 희석한 것을 100㎕ 첨가하여, 마찬가지로 37℃에서 1시간 방치하고 플레이트 세정(6회)을 시행하였다.

다음에 발색액(50% TMB, 50mM Citrate-Na₂HPO₄, 0.0075% H₂O₂)을 100㎕ 첨가하여, 실온에서 10분간 반응 후, 반응 정지액 (50% TMB정지액, 50% 1N- H₂SO₄)100㎕를 첨가하여 흡광도(OD=450nm)를 측정하였다.

단, 비교대조실험으로서, ALP표지 염소항 휴먼이무노글로불린 항체를 제2항체로서 사용하는 공지측정법 〔Calypte™ HIV - 1 Urine EIA : Arch. Pathol. Lab. Med., 119, 139-141(1995); Clinical infectious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)〕를 사용하여 동일 검체를 측정하였다(대조방법). 또, 그 측정 키트의 음성 콘트롤과 양성 콘트롤을 상기 본 발명의 측정 방법에 따라서 측정한 결과, 동 키트에 있어서 측정 결과와 동등의 흡광도가 얻어진 것으로부터, 동 키트의 커트오프값의 산출법에 따라, 본 발명방법에 있어서의 커트오프값을, 그 음성콘트롤의 평균 흡광도에 0.180을 더한 값으로 하였다.

혈청 HIV 항체 양성자(2예) 및 동 항체음성자(98예)로부터 얻어진 100검체(뇨)에 대해서 측정한 결과를 표2에 나타낸다.

*4예중, 2예는 혈청HIV항체 양성자임.

표2에 의해 본 발명방법 및 대조방법의 감도는 모두 100%(2/2)였지만, 특이성은 대조방법에서는 71.4% (70/98)이고, 본 발명 방법에서는 98% (96/98)였다.

이것으로부터 본 발명 방법에 의한 항체측정방법은, 대조방법과 비교하여 위양성이 약간 감소하고 특이성에 있어서 대단히 우수한 것을 알 수 있다.

실시예5 뇨중 H. 필로리 항체의 측정

(1)H. 필로리 항원 플레이트의 조제

통상의 방법 〔J.Clin. Microbiol., 29: 2587-2589(1991)〕에 따라서 조제한 필로리균(임상분리배양주)의 100㎎/㎖ 냉 달벳코(Dulbecco)-PBS용액에, 교반기로 교반하면서 냉 0.2% 트리톤-X 용액을 같은 량 첨가하여, 5분간 교반 후 원심하였다(3,000rpm, 20min). 상등액을 새로운 튜브로 옮겨 추출액으로 하였다(1-1.5㎎/㎖ protein).

이 추출액을, D-PBS로 희석하고( 2.5㎍/㎖), 96웰 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 첨가하여, 25℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 그 웰을 세정 후, 블록킹 액 (D-PBS, 0.5% casein, 5% sorbitol, 0.05% NaN₃(pH 7.4)) 300㎕를 첨가하여, 25℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다. 다음에 블록킹 액을 제거하고, 25℃에서 하룻밤 건조시켜, 이것을 알루미늄 자루에 건조제와 함께 넣고 밀봉하여, 사용시까지 4℃에서 보존하였다.

(2)측정

상기에서 얻어진 고상화항원(플레이트)을 사용하여, 실시예 4와 같은 방식으로 하여 뇨검체 중의 필로리 항체를 측정하였다.

즉, 각 웰에, 제1완충액(200mM 트리스 완충액, 0.14M NaCl, 2% casein, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN₃, 20㎕/㎖ E. Coli추출물 ( pH 7.3) 25㎕ 및 뇨샘플 100㎕를 첨가하여, 10초간 교반 후, 37℃에서 1시간 방치하였다. 그 플레이트를 6회 세정 후, 실시예 4와 같은 방식으로, HRP표지 염소항휴먼 IgG(Fc특이적)항체의 제2완충액 용액 희석물 100㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 방치하는 것에 의해 항체를 검출하였다.

얻어진 결과를 도9 및 표3에 나타낸다.

도9 중, 종축은 흡광도 (OD= 450 - 650nm)를, 횡축은 ¹³C-UBT시험 〔J.Gastroenterol., 33: pp.6-13(1998)〕에서 확인한 필로리 감염 양성군 ( + ; N=56) 및 동 음성군 ( - ; n=44)을 나타낸다.

표3에 있어서, 감도는 ¹³C-UBT시험에 따른 양성자를, 양성과 검출한 비율을, 특이성은 ¹³C-UBT시험에 따른 음성자를, 음성과 검출한 비율을, 정확성은 ¹³C-UBT 시험에 따른 양성자 및 동 음성자를 각각 양성 및 음성과 검출한 비율을 각각 나타내고, 커트 오프 값으로서, 평균 M+3SD 또는 M+5SD를 채용한 경우에 대해서 나타내었다. 또, 대조로서는, 혈청을 피검시료로 하는 필로리 항체측정키트 [HM - CAP : EPI사/협화 메덱스(주)]를 사용하여 동일 검체를 측정한 결과를 병기하였다(대조방법).

그 결과에 의해, 본 발명방법이, 대조방법보다도 특히 감도 및 정확성에 있어서, 우수한 결과를 얻는 것이 판명되었다.

실시예 6 뇨중 풍진바이러스(루벨라) 항체의 측정

(1)루벨라 항원 플레이트의 조제

항원으로서 시판의 루벨라항원 (BIO - DESIGN사)을 사용하여, 항원 농도를 1㎕/㎖ 및 블록킹 액을 (D-PBS, 1% BSA, 5% sorbitol, 0.05% NaN₃ (pH7.4))로 한 이외는 상기 실시예 5 (1)와 같은 방식으로 하여, 루벨라 항원 플레이트를 조제하였다.

(2) 측정

상기에서 얻어진 항원 플레이트를 사용하여, 상기 실시예 5 (2)와 같이하여 뇨샘플 중의 루벨라 항체를 측정하였다. 얻어진 결과를 도10 및 표4에 나타낸다.

도 10중, 종축은 흡광도 (OD=450-650nm)를, 횡축은 시판 키트 (풍진 IgG(II) - EIA 「생연」, 덴카생연(주))에 의해 측정된 혈청 루벨라 항체 양성군(N=76) 및 동 음성군(N=23)을 각각 나타낸다. 표4는, 본 발명방법과 대조방법으로서의 상기 혈청 루벨라항체측정 결과와의 일치성을 나타내는 것이다.

그 결과에 의해, 본 발명방법과 대조방법의 일치율은 100% (99/99) 이고, 본 발명에 의하면 검체로서 안전과 동시에 간편한 뇨를 채용하여도 고감도와 동시에 고특이적인 항체검출이 가능하고, 임상 검사분야에 있어서 유용한 것이 판명되었다.

실시예7 항체측정장치의 작성

(1) H.필로리 항원의 조제

실시예 1(1)과 같은 방법으로 H. 필로리 항원용액을 조제 하고, - 80℃에서 보존하였다.

(2) 표지항휴먼 IgG항체 함유 건조 글라스파이버의 조제

글라스파이버 시트(5.0 mm × 260mm, 두께0.8mm, Whatman사제)에 직경 40nm의 금 코로이드 표지항휴먼IgG(Fc특이적)항체용액을 1㎖ 첨가하여 하룻밤 건조하여 조제하였다. 이것은, 사용할 때까지 건조제와 함께 실온에서 보존하였다.

(3) 멤브레인의 조제

상기 (1)에서 조제한 H. 필로리 항원용액(3㎎/㎖) 및 항휴먼 IgG항체(0.3㎎/㎖) 각각을, 니트로셀룰로오스 막(26.5mm ×260mm, 두께 0.1mm ; 어드벤스 마이크로디바이스사제)에, 도11에 나타낸 것 같이 일정의 간격을 두고 당긴 라인상에 분무(1.5㎕/㎝)하고, 37℃에서 120분간 건조하였다. 건조 후 스킴 밀크를 포함한 보락스(Borax)완충액(pH8.2)에 30분간 침적하여 세정하였다. 37℃에서 1시간 건조하고, 건조제와 함께 실온에서 보존하였다.

(4) 어셈블리 (고상지지체)

도3(A)에 나타낸 것처럼, 상기 멤브레인 (3), 흡수여과지 패드 (4), (22×260mm, 두께 1.5mm ; Whatman사제), 상기 표지항체함유 글라스파이버(2) 및 샘플 패드 (1) (15×260mm, 두께 1.0mm ; 여과지, Whatman사제)를 접착제로서 붙여서, 5mm폭으로 커트하였다.

이것을 도3 (B)에 나타낸 것처럼 성형된 플라스틱 하우징의 하부섹션 (8)내에 두고, 다음에, 시료첨가창 (9) 및 검출창 (10)이 늘어선 두개의 개구부를 갖는 하우징의 상부섹션 (7)을 지지체의 위로부터 끼얹어 하부 섹션 (8)과 일체화시켰다.

실시예8 뇨중 H.필로리 항체의 측정

실시예7에서 조제한 장치를 사용하여, H. 필로리 감염자 뇨, 동 미감염자 뇨 및 동 감염자의 극단히 엷은 뇨 등 3종류의 뇨검체에 있어서 H. 필로리의 항체를 측정하였다.

먼저, 검체희석액(200mM 트리스 완충액, 0.14M NaCl, 2% 카세인, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN₃(pH 7.3), 대장균 LPS (Difco사제) 50㎍/㎖) 500㎕에 뇨검체 500㎕를 첨가하여 혼합하고, 그 혼합액으로부터 6방울 (약 150㎕)를 실시예 7 기재의 장치의 시료첨가창 (9)에 적하하여 지지체에 흡착시켜, 20분 정치하였다. 그 결과, 피검체로서 적합한 뇨검체를 사용한 경우는, 검출창 (10)의 콘트롤 부위에 핑크-적색의 발색대가 출현하고, 한편 피검체로서 극단히 엷은 부적합 뇨검체를 사용한 경우는, 검출창 (10)의 테스트부위 및 콘트롤부위는 어느 것도 발색하지 않고, 판정불능의 결과를 나타내었다. 적합한 뇨검체를 사용한 경우, H. 필로리균에 감염되지 않은 경우는, 검출창 (10)의 콘트롤부위만 핑크-적색의 발색대가 출현하고, H. 필로리 감염에 관하여 음성결과(진성음성)를 나타내고, H. 필로리균에 감염되어 있는 경우는 , 검출창 (10)의 테스트부위 및 콘트롤부위가 핑크-적색의 발색대가 출현하고, H. 필로리 감염에 관하여 양성 결과를 나타내었다.

실시예9 뇨중 H. 필로리 항체의 측정.

(1) 대장균 유래성분의 조제

대장균(pvc18/JM109주 : 타카라주조사제)를 암피실린 함유액체 LB배지(Luria-Bertani배지, 일본제약사)로 37℃, 18시간 배양 후, 원심에 의해 집균하고 PBS로 2회 세정하였다. 균체농도가 100㎎/㎖가 되도록 냉 PBS를 첨가하여, 초음파 파쇄기에 의해 파쇄추출하였다(10초 × 3회). 이렇게하여 얻어진 원심상청을 대장균 추출단백으로 하였다.

(2) 실시예 8의 검체 희석액에 배합한 대장균 LPS 대신에 상기 (1)에서 조제한 대장균 추출 단백을 사용한 이외는, 실시예 8과 같이하여 뇨중의 H. 필로리 항체의 측정을 시행하였다. 그 결과, 실시예 8과 같은 결과가 얻어졌다.

실시예10

¹³C-UBT 테스트[J.Gastroenterol., 33:6-13(1998)]에서 분류한 H. 필로리 감염양성자 및 동 음성자의 각21예(계42예)의, 전혈액, 혈장, 뇨를 각각 피검시료로서, 피검시료 중의 H. 필로리 항체를 상기 실시예 8에 따라서 측정하였다.

즉, 비교실험으로서, 전혈액, 혈장을 피검시료로 한 시판의 H. 필로리 항체측정장치를 사용하여, 동일 피험자의 검체를 대상으로 측정하여, 그 결과로부터 본 발명장치의 효과를 검사하였다. 결과를 도12에 나타낸다.

더욱, 도중 비교장치 A-H는 하기의 측정장치를 나타낸다.

A : Helitest (Cortecs Diagnostics사제)

B : H. pylori-Check -1

( Bio-Medical Products사제)

C : First Check H.pylori

(Worldwide Medical Corp사제)

D : Biocard Helicobacter pylori IgG

(Anti Biotech Oy사제)

E : Insta Test H.Pylori

(Cortez Diagnostics Inc. 사제)

F : One Step H.pylori Test

(Teco Diagnostics 사제)

G : H. pylori SPOT

(international Immuno-Diagnostics사제)

H : Quick Stripe H.pylori

(Diatech Diagnostics Inc.사제)

또, 도면 중 [Specifity]은 ¹³C-UBT테스트 음성샘플을 각 키트로 측정한 때에, 음성으로서 검출된 비율(음성율)을 나타내고, [Sensitivity]는 ¹³C-UBT테스트 양성샘플을 각 키트로 측정한 때에, 양성으로서 검출된 비율(양성율)을 나타낸다.

도12의 결과로부터, 본 발명의 항체측정장치 및 고상엣세이 방법은 피검시료로서 혈액(전혈액, 혈장)을 사용한 경우는 물론, 뇨를 사용한 경우에도, 높은 검출특이성 및 정밀도를 갖는 우수한 엣세이 시스템인 것을 알 수 있다.

또, 그 결과로부터, 본 발명에 의하면, 검체로서 안전하고 동시에 간편한 뇨를 채용하여도 고감도이고 고특이적인 항체검출이 가능하고, 임상검사분야에 있어서 유용하다고 말할 수 있다.

실시예11 대장균 유래성분의 뇨중 항체측정에 대한 효과

(1) 뇨중 항체측정에 대한 대장균 유래성분의 효과를 실시예 8의 측정장치를 이용하여 평가하였다. 구체적으로는 ¹³C-UBT 테스트로 분류한 H. 필로리 감염양성자 및 동 음성자의 뇨를 각각 피검시료로서, 검체희석액에 대장균 LPS를 배합하지 않은 계(희석액1) 및 표5에 나타난 각종 농도의 대장균 LPS를 배합한 계로, 뇨중의 H. 필로리항체를 측정하였다. 테스트 부위 및 콘트롤부위의 라인의 발색은, 덴시트메타(ATTO사제)에 의한 라인 강도로 평가하였다. 결과를 표5에 나타낸다.

피검시료에 대장균 LPS를 11.1㎍/㎖ 이상 배합하는 것에서, 희석액 1에서 보여진 비특이반응이 소실하고, 위양성검출(오검출)을 방지할 수 있는 것을 알았다.

본 발명은, 비교적 항체 함유량이 적은 뇨를 피검시료로 하는 경우에 있어서도, 감염원에 대항하는 표적항체를 고감도와 동시에 높은 특이성을 갖고 검출할 수 있는 항체측정기술을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 항체측정법에 의하면 피검시료 중의 협잡물에 기초하여 생기는 「위양성」반응이 유의하게 억제되어, 정밀도와 신뢰성이 높은 항체측정결과를 얻을 수 있다. 또, 본 발명은, 이무노캐필러리엣세이 또는 이무노 크로마토그래피 엣세이의 개량법으로, 이것에 의해 피검시료 중의 표적항체의 존재 및 양을 피검시료에 기초하여 생기는 「위음성」과「진성음성」을 구별하여, 정밀도 좋게 검출 측정 할 수 있다.

Claims

피검시료 중의 표적항체를 항원항체반응을 이용하여 검출측정하는 방법으로서, 상기 항체와 항원의 항원항체반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 항체측정방법.
제1항에 있어서,

대장균 유래성분이, 대장균 가용성 성분 또는 리포다당의 어느 쪽이든지 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 항체측정방법.
제1항에 있어서,

대장균 유래성분을, 측정계의 항원 1㎍당, 0.1- 100㎍정도의 비율로 존재시키는 것을 특징으로 하는 항체측정방법.
피검시료 중의 표적항체를 샌드위치법에 따라서 검출 측정하는 면역측정법으로서, 항체검출 시약으로서 그 항체 IgG의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 항체측정 방법.
제4항에 있어서,

항체검출시약이 Fc특이적 항IgG 항체인 항체측정방법.
제4항에 있어서,

피검시료 중의 표적항체와 이 항체에 대한 항원을 고정화하여 되는 고상화항원과의 항원항체 반응공정, 및 이 고상화항원에 포착된 표적항체와 그 항체 IgG의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 항체검출시약과의 반응공정을 포함한 항체측정방법.
제6항에 있어서,

항원항체반응을 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 항체측정방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,

피검시료가 뇨인 항체측정방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,

표적항체가 감염원에 대한 항체인 항체측정 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,

감염원이 휴먼면역부전 바이러스, 간염 바이러스, 풍진 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 마진 바이러스, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 헤리코박터, 필로리균, 크라미디아균, 임균 및 톡소플라즈마스로 되어진 군으로부터 선택된 어느 것인 항체 측정 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,

항원이 박테리아, 바이러스, 원충, 또는 적어도 그것들의 항원결정기를 갖는 박테리아 유래성분, 바이러스 유래성분 혹은 원충 유래성분인 항체 측정 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서,

항원이 헬리코박터, 필로리균 또는 적어도 그 항원 결정기를 갖는 헬리코박터, 필로리균 유래성분인 항체 측정 방법.
적어도 (a)피검시료를 접촉시키는 제1영역 및 (b)그 피검시료 중의 항체를 반응시키는 제2영역을 피검시료가 모세관현상에 의해 그 제1영역으로부터 제2영역에 수송되어지도록 설치하여 되는 고상지지체, 및 제2영역에서의 반응결과를 검출하기 위한 표지수단을 함유하는 측정장치이고, 상기(b)제 2영역에, (i)검출대상인 표적항체를 포착하는 리간드를 고정화한 테스트부위와 (ii)피검시료 중의 임의항체를 포착하는 리간드를 고정화한 콘트롤부위를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

테스트부위에 고정화된 리간드가, 피검시료중의 표적 항체에 대한 항원인 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

콘트롤부위에 고정화된 리간드가, 피검시료중의 임의항체를 포착하는 항휴먼 이무노글로불린항체인 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

표지수단으로서, 표적항체 및 임의항체의 어느것에라도 결합하는 표지화 된 리간드를 갖는 항체측정장치.
제13항에 있어서,

표지수단이 표적항체 및 임의항체의 어느것에라도 결합하는 표지화 된 리간드이고, 그 표지화 리간드는 고상지지체의 제2영역보다 상류역에 탈리 가능하게 지지되고, 피검시료와 접촉하면 그 시료중의 표적항체 및 임의항체와 반응하여 각각 표적항체/표지화 리간드-복합체 및 임의항체/표지화 리간드-복합체를 형성하고, 모세관현상에 의하여 제2영역에 수송되어 각각의 테스트부위 및 콘트롤부위에 결합하는 것인 항체 측정 장치.
제17항에 있어서,

표지화 리간드가, 고상지지체의 제1영역과 제2영역과의 사이에 위치하는 영역(트레서영역)에 지지되는 항체 측정 장치.
제17항에 있어서,

표적항체 및 임의항체의 어느것에라도 결합하는 표지화 리간드가, 표지화된 항휴먼이무노글로불린항체인 항체 측정 장치.
제19항에 있어서,

항휴먼이무노글로불린항체가 이무노글로불린G의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 항IgG항체인 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

고상지지체가 제1영역 및 제2영역에 계속하여 흡수영역을 더 갖고, 이것에 의해 제1영역으로부터 제2영역에 수송된 피검시료가 모세관현상에 의해 더욱 흡수영역에 수송되는 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

제2영역의 테스트 부위에 있어서, 표적항체의 결합반응이 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하여지는 항체 측정 장치.
제13항에 있어서,

피검시료가 뇨인 항체 측정 장치.
피검시료 중의 감염원에 대항하는 검출대상인 표적항체를 측정하기 위한 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체 측정 장치의 사용.
제24항에 있어서,

피검시료가 뇨인 항체 측정 장치의 사용.
피검시료를 제13항의 항체측정장치의 제1영역에 접촉시켜, 제2영역의 콘트롤부위가 발색하고 있는 조건하에서, 제2영역의 테스트부위의 발색유무를 검출하는 것으로부터 되는 피검시료 중의 표적항체의 고상엣세이 방법.
피검시료를 제20항의 항체 측정장치의 제1영역에 접촉시켜, 제2영역의 콘트롤부위가 발색하고 있는 조건하에서, 제2영역의 테스트부위의 발색유무를 검출하는 것으로부터 되는, 피검시료 중의 표적항체의 고상 엣세이 방법.
제26항 또는 제27항에 있어서,

항체측정장치의 제2영역의 테스트부위에 있어서의 표적항체의 결합반응을, 대장균 유래성분의 존재하에서 시행하는 것을 특징으로 하는 표적항체의 고상엣세이 방법.
제26항에 있어서,

피검시료가 뇨인 표적항체의 고상엣세이 방법.
피검시료 중의 항체를 항원항체반응을 이용하여 검출 측정하는 것에 이용되어지는 시약 키트로서, 대장균 유래성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체측정용 시약 키트.
항체검출시약으로서 표적항체 IgG의 Fc영역에 결합특이성을 갖는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체측정용 시약 키트.
제13항의 항체 측정 장치를 포함하는 항체측정용 시약 키트.