CN1263599A - 测定抗体的方法及抗体测定装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高度准确、简便和特异地测定体液中特异于感染源的抗体的方法。更具体地说,本发明提供了一种抗体免疫测定法,其中在存在大肠杆菌成分的情况下,引发样品中的目标抗体和测定抗原之间的抗原-抗体反应,还提供了一种抗体测定方法,它包括用对抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的试剂作为抗体测定试剂。本发明进一步提供了一种抗体测定装置,它包括一个固相支持物,该固相支持物至少具有(a)一个第一区,样品应用于其上,以及(b)一个第二区,样品中的抗体按照事先安排的顺序,即样品通过毛细管作用从第一区迁移到第二区的顺序在此反应,还含有一种标记工具用于检测第二区中的反应结果,其特征在于(b)第二区具有(i)一个试验带,捕获待测目标抗体的配体固定在此处:和(ii)一个对照带,捕获样品中任意抗体的配体固定在此处。
Description
技术领域
本发明涉及检测或定量样品中抗体的方法,更具体地说,涉及这样一种方法,通过它可以高度准确、简便和特异性良好地检测或测定出抗临床体液样品,特别是尿样中存在的感染源(例如细菌和病毒)的抗体。
另一方面,本发明涉及检测或定量样品中抗体的装置,更具体地说,涉及这样的装置,利用它可以高度准确、简便和特异性良好地检测或测定抗临床体液样品,特别是尿样中存在的感染源(例如细菌和病毒)的抗体。
本发明还涉及抗体测定试剂盒,它在上述抗体测定方法中以及利用所述抗体检测装置的分析方法中有用。背景技术
对可能存在于体液中的对多种感染源(病原体)例如细菌和病毒具有特异性的抗体的检测是一种诊断感染的有用的间接方法。因此,通过利用病原体或病原体成分作为分析抗原而设计的检测抗体的免疫测定技术和装置,迄今已经在广泛的诊断领域得以应用。
这种利用病原体或其成分作为分析抗原的免疫分析法在便捷地建立起必需的分析系统方面具有优越性,但是在灵敏度和特异性方面不令人完全满意,因此存在改进的余地。
作为用于进行免疫测定的免疫测定装置,可以提及的有一种由多孔材料构成的条带,在其上可以进行结合测定(抗原-抗体反应)。这种类型的分析装置利用了多孔基质所具有的毛细管性质的优点,也就是说,点样于多孔条带一端的体液可以向另一端迁移。因此,当含有待测物质的测试样品(液体)在承载有以既定位置连续分布的各种试剂的条带的一端点样后,样品通过毛细管作用沿条带迁移,然后与那些在所述位置上连续分布的试剂相遇,随后发生反应。可以确定待测物质的存在,并且可以通过检测来源于包含在配体-受体偶联系统中的可检测标记的信号来确定该物质的量。
应用上述原理的免疫测定技术通常被称为免疫毛细管测定法或免疫色谱测定法,该技术已在WO 87/02774、EP 0306772以及其他出版物中有描述。至于对该技术的改进,可以提及在日本未审查专利公开文件NO.63865/1989、日本未审查专利公开文件NO.299464/1989和日本未审查专利公开文件NO.167497/1994中描述的发明。
上述装置的优点在于不需要专门的检测设备以及可以容易地完成测定,但在灵敏性和特异性方面还存在改进的余地。
另外,因为该装置仅能进行单项测试,不能够平行测定阴性或阳性对照样品,所以,存在不能够判断该结果是否是由适当检测产生的可靠数据这一缺陷。
通常说来,体液中尿和唾液用作临床试验样品为最佳,因为它的收集不需要侵入性程序,并且比血样简便安全。
然而,通常这些样品中存在的抗体浓度非常低,例如是血样浓度的千分之一到万分之一。另外,从摄入大量水的受试者体内收集到的尿样非常稀薄,结果,导致样品间抗体滴度的不可避免的巨大差异。
在这种情况下,利用上述常规测定装置,当样品太稀薄而不能检测到抗体时,试验将为阴性,以至于产生这样的问题,即由于低浓度样品的出现导致“真正阴性”病例不能从“阴性(假阴性)”病例中区别出来的。
而且,当对抗体贫乏的样品进行测试时,需要高度灵敏的分析系统,但在这种情况下存在这样的问题,即由于样品中的污染物导致的非特异性反应形成的副产物易于同时被检测,从而给出假阳性结果。
因此,需要一种能够确保足够的高度检测灵敏度的抗体分析系统,特别是在尿和唾液这类体液作为样品时,也就是说,需要一种由于高度特异性而使假阴性和假阳性试验机率降低的可靠分析系统。
本发明的第一个目的在于提供一种抗体分析技术(抗体测定方法和抗体测定装置),它能够高度灵敏和高度特异地检测抗存在于试验样品例如体液中感染源的抗体。
本发明的第二个目的在于提供一种抗体分析方法,它能够通过抑制样品中污染物引起的“假阳性”反应,进行高度准确地测定,甚至当样品是目标抗体相对较贫乏的尿或其它体液时。
本发明的第三个目的在于提供一种抗体分析方法,作为免疫毛细管测定法或免疫色谱测定法的改进,通过该方法可以区分出样品自身性质导致的“假阴性反应”和“真正阴性”反应之间的清楚界限,从而精确地确定作为样品中检测目的物的目标抗体是否存在及其存在的量。附图简述
图1是显示条带状固相支持物作为本发明抗体测定装置的组成元件的示意图。图1中,标号1表示第一区,2表示示踪区,3表示第二区,4表示第三区,5表示检测带,6表示对照带。
图2是说明用本发明的抗体测定装置测定样品中目标抗体的原理图。其中使用的各标号的含义与图1的含义相同。
图3是显示本发明抗体测定装置中包括的固相支持物条带(A)和容纳所述固相支持物的外壳(B)的示意图。图3中,标号1-6与图1中的含义相同,标号7表示所述外壳的上部,8表示其下部,9表示样品输入端口,10表示检测窗。
图4表示在实施例1(5)(i)的尿样中抗-H.pylori抗体检测结果的曲线图。图4中,空心圆表示13C-UBT试验结果为阳性的H.Pylori幽门螺杆菌感染患者的尿样数据,实心圆表示得出阴性13C-UBT试验结果的患者的尿样数据。
图5表示如实施例1(5)(ii)测定的尿样中抗-H.pylori抗体数据的曲线图。图5中,纵坐标表示吸光率(O.D.450nm),横坐标表示根据13C-UBT试验建立H.pylori-阳性组和H.pylori-阴性组。
图6表示如实施例1(6)测定的尿样中抗-H.pylori抗体数据的曲线图。图6中,空心圆表示得出阳性13C-UBT试验结果的患者的尿样数据,空心圆表示得出阴性13C-UBT试验结果的患者的尿样数据。
图7表示如实施例2(2)制备的尿样中抗-HBc抗体数据的曲线图。图7中,实心圆表示得出血液抗-HBc抗体阳性试验结果的患者的尿样数据,空心圆表示得出血液抗-HBc抗体阴性试验结果的患者的尿样数据。
图8显示测定尿中抗-HIV抗体时,得出假阳性反应尿样的凝胶渗透层析图,及其各组份的抗体反应性(实施例3(1))。图8中,纵坐标表示吸光率(O.D.450nm),横坐标表示凝胶渗透层析组份(组份号)。实线表示蛋白质在280nm的吸收,黑点线表示抗-人(IgG+IgM)抗体产生的数据,空心三角线表示抗-人IgG(Fc-特异性)抗体产生的数据;实心三角线表示抗-人IgG(Fab-特异性)抗体产生的数据。
图9表示如实施例5测定的尿样中抗-H.pylori抗体数据的曲线图。图9中,纵坐标表示吸光率(O.D.450-650nm),横坐标表示根据13C-UBT试验分类建立的H.pylori-阳性组(+:n=56)和H.pylori-阴性组(-:n=44)。
图10表示如实施例6制备的尿样中抗-风疹病毒抗体数据的曲线图。图10中,纵坐标表示吸光率(O.D.450-650nm),横坐标表示根据商品化试剂盒测定的血清水平分类建立的抗-风疹抗体阳性组(+:n=76)和抗-风疹抗体阴性组(-:n=23)。
图11是显示本发明抗体测定装置第二区的试验带和对照带的图(实施例7(3))。
图12显示利用本发明的抗体测定装置得到的尿、全血和血浆中抗-H.pylori抗体的分析数据与利用对照装置(A-E)得到的相应数据的比较。图12中,“特异性”表示为,当用各分析装置测定由13C-UBT试验证明为阴性的患者样品的每一项试验项目时,阴性试验相对于试验总数的百分数(阴性率);“灵敏度”表示为,当用各测定装置测定由13C-UBT试验证明为阳性的患者样品的每一项试验项目时,阳性试验相对于试验总数的百分数(阳性率)。对照装置A-H表示下列装置:
A:Helitest(由Cortecs Diagnostics生产)
B:H.pylori-Check-1(由Bio-Medical Products生产)
C:First Check H.pylori(由Worldwide Medical Corp生产)
D:Biocard Hilicobacter pylori IgG(由Anti Biotech Oy生产)
E:Insta Test H.Pylori(由Cortez diagnostics Inc.生产)
F:One Step H.Pylori Test(由Teco Diagnostics生产)
G:H.pylori SPOT(由International Immuno-Diagnostics生产)
H:Quick Stripe H.pylori(由Diatech Diagnostics Inc.生产)发明内容
本发明的发明人进行了大量研究,建立了一种分析系统,它将能够高度精确地测定目标抗体,甚至当样品是例如尿样等的抗体贫乏型样品时,并且发现分析系统中存在着能在抗原-抗体反应中非特异地结合抗原的抗体成分(以下称为非特异性抗体结合成分),从而引起非特异性反应,因此产生假阳性结果,并由此降低了检测的准确性。
基于上述发现,本发明人进一步研究并发现,可以在存在大肠杆菌(E.coli)成分的情况下,在需要测定的目标抗体和对特定抗体具有特异性的抗原之间引发抗原-抗体反应,来抑制所述非特异性反应,由此假阳性率可以降低,从而实现检测准确性的显著改善。
本发明人进一步发现所述非特异性结合的抗体成分包括IgG片段和/或保留了IgG轻链(L)或F(ab)区抗原性的IgG片段变性产物,并发现这些抗体成分与血清抗体分析系统中使用的常规抗体分析试剂(例如二级抗体)发生交叉反应,因此导致假阳性试验。
基于上述发现,本发明的发明人进一步确定可以通过使用对待测目标抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的试剂作为抗体分析试剂,来抑制抗体分析系统中的非特异性反应,由此可以降低假阳性率,从而显著改善检测准确性。
同时,本发明人努力改进抗体测定硬件(免疫毛细管测定装置和免疫色谱测定装置),并发现可以通过在作为本发明检测装置的一部分的条带的反应区(评价区)中建立用于测定目标抗体的测定区之外,另建立用于测定样品中任意抗体的“对照带”,以排除“假阴性”反应,进而准确测定“真阴性”反应。因此,在这种分析系统中,当样品是由于抗体浓度太低(也就是说,抗体的总量太低)等原因而不能被检测到的非合适样品时,“对照带”给出显示样品不能够被检测的阴性信号。反之,当样品中存在合适的抗体浓度,“对照带”显示出样品适于对目标抗体进行预期分析的阳性信号。然后,按照该“试验带”的结果,技术人员可以明确确定样品中是否存在或缺乏目标抗体,也就是说,样品是“阳性”还是“真阴性”。
在这一研究系列中,日本未审查专利公开文件NO.299464/1989和日本未审查专利公开文件NO.167497/1994,均公开了对抗体测定硬件(免疫毛细管测定装置和免疫色谱测定装置)的改进,其中描述了除试验带外还包括对照带的装置。然而,这些装置中的对照带的设计是用来确定分布在条带上游的标记物是否由于毛细管作用在试验带内转移,因此,该对照带与本发明的对照带相去甚远。
本发明人进一步明确,当存在大肠杆菌成分时,在上述改进的抗体测定装置中引发目标抗体和相应抗原之间的偶联反应,那么该抗原-抗体反应系统中的非特异性反应将被抑制,并确定当使用对IgG的Fc区具有特异亲合力的试剂作为抗体测定试剂时,该抗原-抗体复合物的非特异性反应将被抑制,由此使假阳性试验的发生率大幅度降低。
本发明在上述几个结果的基础上得到进一步发展。
其一方面,本发明提供了测定抗体的高度精确的方法,它降低了假阳性反应的几率。
(1-1)作为它的一种方式,上述利用抗原抗体反应检测样品中目标抗体的测定方法的特征在于在存在大肠杆菌成分的情况下,在所述抗体和分析抗原之间引发所述反应。
这种测定抗体的方法包括下列具体方法。
(a)该抗体测定方法中所述大肠杆菌成分至少是选自大肠杆菌的可溶组分和脂多糖组分之一的成分。
(b)该抗体测定方法中使用大肠杆菌成分的比例为每微克分析抗原约0.1-100微克,优选约0.5-50微克的大肠杆菌成分。
(1-2)作为另一种方式,抗体测定方法包括用“三明治技术”(sandwich technique)检测样品中的目标抗体,其特征在于含有对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的二级抗体的试剂作为抗体分析试剂。
这种测定抗体的方法包括下列具体方法。
(a)该抗体分析方法中二级抗体是Fc-特异性的抗-IgG抗体。
(b)在包含抗原-抗体反应步骤的该抗体分析方法中,样品中的目标抗体与特异于所述抗体的固定化抗原偶联,如同被固定在支持物上一样,反应步骤中由所述固定化抗原捕获的目标抗体再与对抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的二级抗体反应。
(c)上述抗体分析方法中,抗原-抗体反应是在存在大肠杆菌成分的情况下进行的。
第二方面,本发明涉及一种抗体测定装置。该装置包括下列具体方面。
(2-1)抗体测定装置包括一个固相支持物,它至少具有(a)一个用于样品上样的第一区和(b)一个第二反应区,其中试验样品中的抗体按照下述预先安排的顺序反应:样品通过毛细管作用从第一区迁移到第二区的顺序,该装置还包括一种用于检测第二区中反应结果的标记工具,所述(b)第二区具有(i)试验带,用于捕获待检目标抗体的配体固定在此处;(ii)对照带,捕获样品中任意抗体的配体固定在此处。
(2-2)抗体测定装置,其中固定在试验带上的配体是样品中存在的目标抗体的抗原。
(2-3)抗体测定装置,其中固定在对照带上的配体是能够捕获样品中任意抗体的抗-人免疫球蛋白抗体。
(2-4)抗体测定装置,包括作为所述标记工具的即将与目标抗体和任意抗体结合的标记配体。
(2-5)抗体测定装置,其中标记工具是被可移动地承载在固相支持物第二区上游的被标记抗体,该被标记抗体将与目标抗体和任意抗体以下列方式结合,即与样品接触后,该标记配体与目标抗体和任意抗体反应,从而分别形成目标抗体/标记配体复合物和任意抗体/标记配体复合物,然后它们通过毛细管作用迁移到第二区,在第二区它们分别固定在试验带和对照带上。
(2-6)抗体测定装置,其中标记配体固定在固相支持物的第一区和第二区之间的中间区域(示踪区)。
(2-7)抗体测定装置,其中即将与目标抗体和任意抗体结合的标记配体是被标记的抗-人免疫球蛋白抗体。
(2-8)抗体测定装置,其中抗-人免疫球蛋白抗体是对免疫球蛋白G的Fc区具有特异亲合力的抗-IgG抗体。
(2-9)抗体测定装置,其中固相支持物进一步具有位于第一区和第二区下游的吸收区,以便从第一区迁移到第二区的样品进一步通过毛细管作用迁移到吸收区。
(2-10)抗体测定装置,其中在第二区的试验带上,在存在大肠杆菌成分的情况下,发生目标抗体的偶联反应。
第三方面,本发明涉及样品中目标抗体的固相测定方法。该方法包括下列具体方面。
(3-1)目标抗体的固相测定方法,包括将样品在抗体测定装置的第一区点样,在第二区的对照带显色的条件下,检测第二区试验带的颜色形成状况。
(3-3)目标抗体的固相测定方法,其中在抗体测定装置第二区的试验带上,在存在大肠杆菌成分的情况下,发生目标抗体的偶联反应。
第四方面,本发明涉及一种抗体测定试剂盒,用于与所述抗体测定装置有关的应用。该抗体测定试剂盒可以包括下列具体方面。
(4-1)一种抗体测定试剂盒,其特征在于它含有大肠杆菌成分。
(4-2)抗体测定试剂盒进一步含有抗原或抗体测定试剂,该试剂可以任意地被固定或不被固定。
(4-3)抗体测定试剂盒,其特征在于它含有Fc-特异性的抗-IgG抗体作为抗体测定试剂。
(4-4)抗体测定试剂盒,含有本发明的抗体测定装置。
(1)抗体测定方法
首先,详细描述作为本发明第一方面的抗体测定方法。
本发明的抗体测定方法代表对抗体免疫测定法的改进,其特征在于通过抑制非特异性反应,降低假阳性反应的发生率。
(1-1)作为上述抗体测定方法的实施方案,提及这样一种方法,即在存在大肠杆菌成分的情况下,在样品中的目标抗体和特异于所述抗体的抗原之间进行抗原-抗体反应。按照这种方法,抗原抗体反应中的非特异性反应被显著抑制,结果即降低了假阳性试验的发生率。
大肠杆菌成分没有具体限制,只要它是大肠杆菌成分,因此包括但不限于蛋白质成分、碳水化合物成分或其脂类成分、或者这些成分的混合物。作为优选实施例,提及E.coli的可溶性部分或脂多糖(LPS)部分。
对于制备这种大肠杆菌成分的方法没有具体限制,大量方法可供选择使用。一种常用方法可以包括:在适于E.coli增殖的培养基中培养任意E.coli菌株、收获生长完全的细胞、用超声仪物理破碎细胞或者用表面活性剂等溶解细胞,制备可溶性部分(抽提物)。可以用有机溶剂例如酚、氯仿或乙醚、或者两种或三种不同有机溶剂的混合物通过抽提方法制备上面提到的LPS。还可以用基因工程技术人工制备上述物质。另外,也可以方面地使用商业产品(例如,脂多糖E.coli,由Difco或Sigma提供)。
本发明可以应用的优选样品是体液样品。对于体液没有限制,只要它是来源于人或其它动物的、其中可能含有目标抗原的体液。因此,术语“体液”包括广泛的常规试验室检测中用作样品的生物体液。更具体地说,体液包括血液(包括血清和血浆在内)、尿液、脑脊液、羊水、唾液、汗液等。本发明特别解决了与非侵害性样品有关的检测准确性低的问题,所述非侵害性样品,例如尿、唾液和汗液,尤其是尿作为抗体检测样品较佳,因此,这些生物材料可以用作体液的优选例。
“目标抗体”,即测定的目标,没有具体限制,只要它是需要检测的抗体,因此包括抗外源生物体引起宿主感染的各种来源的抗体。因此包括抗各种感染源的抗体,这些感染源对于宿主来说是外源体。
所述感染源没有具体限制,但是包括多种感染人类和其它动物并在宿主体内产生抗体的不同病原体。更具体地说,所述病原体包括多种病毒例如HIV(人免疫缺陷病毒),A、B、C和其它型肝炎病毒,风疹病毒,流感病毒,麻疹病毒,巨细胞病毒,单纯疱疹病毒,水痘状-带状疱疹病毒,腺病毒,肠道病毒等;细菌例如幽门螺旋杆菌(下文简称为H.pylori),Clamydia,结核分枝杆菌,螺旋体,淋球菌,苍白密螺旋体,枝原体属等(不包括大肠杆菌);原生动物例如鼠弓形体,溶组织内阿米巴,恙虫热立克次氏体等。优选病毒为例如HIV、肝炎病毒,风疹病毒,流感病毒,麻疹病毒,疱疹病毒等,细菌由幽门螺旋杆菌等代表,细菌例如H.Pylori特别优选。
本发明的抗体测定方法中使用的抗原没有具体限制,只要它是能够与需要检测的目标抗体进行抗原-抗体反应的抗原。因此,例如,常规血清抗体测定系统中使用的任何抗原都可以成功的应用。这些抗原不但可以是如所述病毒和细菌等真正的病原体,还可以是具有各病原体固有抗原决定簇的抗原。因此,例如,抗原可以是热处理或辐照病原体后提供的灭活病原体、可以是用表面活性剂等提取病原体制备的抗原、以及利用化学合成或重组DNA技术人工制备的抗原。
顺便说一句,可以用常规方法测定候选抗原与目标抗体的反应力,容易地确定一种侯选抗原是否可以在本发明的测定方法中成功地应用。
本发明的测定方法中,所述抗原可以随意地预先固定在任意固相上应用。这里提到的固相可以是任何本领域常规使用的多种固相,因此包括但不限于条状物、珠状物、平板(包括微量滴定平板)以及各种材料制成的测试管,例如玻璃、纤维粉、葡聚糖、琼脂糖、聚苯乙烯、滤纸、羧甲基纤维素、离子交换树脂、右旋糖苷、塑料薄膜、塑料管、尼龙、玻璃珠、丝绸、聚氨甲基乙烯醚-马来酸共聚物,氨基酸共聚物,乙烯-马来酸共聚物等。
固定化的方法也没有具体限制,但可以是任何物理结合和化学结合方法。例如,化学结合法例如共价结合法、例如叠氮法、多肽法(酰胺衍生物法、羧基氯化树脂法、碳二亚胺树脂法、马来酸酐衍生物法、异氰酸盐衍生物法、溴化氰激活的多糖法、纤维素羧酸盐衍生物法、浓缩试剂法等)、烃化法、交联剂偶联法(用戊二醛、环己烯异氰酸盐等作为交联剂偶联到支持物上的方法)、Ugi反应偶联法等;应用离子交换树脂等支持物的离子结合法;以及应用玻璃珠或其它多孔玻璃支持物的物理吸附法。
该测定系统中应用的抗原的量没有具体限制,但是可以根据具体测定系统中常规应用的抗原量任意选择。例如,当使用三明治技术时,通常应用抗原比目标抗体过量。举例说明,在100μl的反应系统中进行反应,可以使用的抗原的比例通常约为0.1-100μg/ml,优选约1-10μg/ml。
除了本反应应当在存在大肠杆菌成分的情况下进行外,所述抗原和目标抗体之间的抗原-抗体反应条件没有具体限制,但可以与传统免疫测定法常规使用的条件一致。典型程序可以包括使所述抗原、抗体和大肠杆菌成分混合在一起,在通常不高于45℃,优选约4-40℃,更优选约25-40℃的温度下,保温或保留约0.5-40小时,优选约1-20小时。反应中使用的溶剂及其pH也没有具体限制,只要不干扰反应的进行。因此,在pH约5-9范围内表现缓冲作用的常规缓冲液,例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲液等通常可以按照常规方法使用。
该反应系统中大肠杆菌成分的比例没有具体限制,但该比例通常可以为,例如反应系统中每微克抗原约0.1-100μg,优选约0.5-50μg大肠杆菌成分。
本发明抗体测定法的操作程序没有具体限制,除了以下基本条件:它包括在存在大肠杆菌成分的情况下,使目标抗体与相应抗原反应的抗原-抗体反应步骤,所述抗原可以是固定化抗原。然而,优选地,该方法最好进一步包括对由所述抗原捕获的目标抗体(抗原-抗体复合物)的检测步骤,那就是说,抗原-抗体复合物与抗体测定试剂的反应步骤。
对经所述抗原-抗体反应得到的抗原-抗体复合物的检测和定量方法及其条件没有具体限制,它们可以是一般免疫测定法中常规应用的检测定量方法和条件。
本发明优选使用三明治法进行实践。在固相三明治法中,例如,典型地可以通过下列程序测定样品中的目标抗体。
首先,将大肠杆菌成分和怀疑含有目标抗体的样品(体液例如尿液)加到固相抗原上,该固相抗原是能够与目标抗体进行特异性抗原-抗体反应的固定化抗原,以便进行抗原-抗体反应。例如,通过清洗除去没有偶联到固相抗原上的未结合物质后,加入抗体测定试剂,使其与偶联到固相抗原上的目标抗体(抗原-抗体复合物)反应,然后根据具体的测定试剂采用具体测定方法检测或定量抗原-抗体复合物。
对用于这类分析的多种方法进行选择和改进对本领域技术人员来说是公知常识,任何这类方法都可以用于本发明的实践[例如,“RinshoKensa-hou Teiyo(Outline of Clinical Test)”,Kanehara Publishing Co.,1995]。
此处使用的抗体测定试剂没有具体限制,但包括本领域常规使用的大量试剂。例如,可以包括二级抗体例如能够与目标抗体(免疫球蛋白)结合的抗-人免疫球蛋白抗体。上面提到的抗-人免疫球蛋白抗体包括用目标免疫球蛋白的免疫球蛋白作为免疫原免疫动物,得到的抗血清、其纯化产物(多克隆抗体)和单克隆抗体。
另外,也可以使用对目标抗体(IgG)的Fc区具有特异亲合力的抗-IgG抗体作为抗体测定试剂。作为这样一种抗-IgG抗体,还可以使用不与IgG的轻链或IgG的F(ab)区反应的Fc-特异性的抗-IgG抗体,或者蛋白A、蛋白G等或其它只是特异地与IgG的Fc区反应的试剂。当目标抗体是IgG时,使用这类测定试剂尤其有利。
这种抗体测定试剂可以按照常规方法制备,或者从商业资源中购买。
为了便于检测,可以用常规标记试剂直接修饰抗体测定试剂,或者通过附加测定手段来间接修饰抗体测定试剂。
对标记试剂没有具体限制,可以使用迄今已知的任何试剂,或者未来期望投入使用的任何试剂。可提到的具体实例有,可以使用放射性同位素例如125I、3H、14C等;酶例如碱式磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(例如HRP)等;荧光物质例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、四甲基若丹明异硫氰酸酯(RITC)等;1N-(2,2,6,6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基)-5N-(天冬酰胺)-2,4-二硝基苯(TOPA)等。应用上述标记试剂的免疫测定法分别被称为放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、和自旋免疫测定法。应用由标记的胶状-金染色胶体颗粒制备的抗体测定试剂的免疫色谱测定法也可以使用。
可以采用实际上已知的方法,用上述标记试剂进行标记、通过间接标记修饰、以及对它们进行检测[Tatsuo Iwasaki等:单克隆抗体,Kodansha Scientific,1984;Eiji Ishikawa等:酶免疫分析,第二版,IgakuShoin,1982,among others]。
对于本发明的测定方法,关键在于在包含待测目标抗体和相应抗原的反应体系中还包含有大肠杆菌成分,只要满足这一条件,其余的基本程序没有特别限制,它们可以与传统免疫测定或者本领域常规应用的方法相同。因此,所述抗原-抗体复合物和所述抗体测定试剂之间的反应条件也没有特别限制,但它们可以与通常使用的免疫测定法相同。最一般的程序包括在如上述抗原-抗体反应的同样条件下(及,通常温度不超过45℃,优选约4-40℃,更优选约25-40℃,pH值约5-9,保温时间约0.5-40小时,优选约1-20小时),使测定系统保温或使其静置。
通过测定标记物活性,以常规方式或根据从测定值计算出来的抗体滴度评价样品中目标抗体的存在与否或者评定出目标抗体的含量,所述标记物活性依赖于标记抗体测定试剂时使用的标记试剂(或间接标记物)的种类。
(1-2)作为本发明抗体测定方法的替换方式,可以提及一种用于测定样品中目标抗体的免疫学方法,它包括用对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的试剂作为抗体测定试剂。
按照该方法,能够显著抑制非特异性结合抗体成分和抗体测定试剂之间的反应,从而能够降低假阳性实验的几率。因此,这种抗体测定法可以认为是用于免疫测定抗体的三明治法的改进。
本发明的抗体测定试剂与目标抗体(IgG)具有反应性,因此,能够用来检测抗体,其特征在于该抗体测定试剂不与目标抗体IgG的轻链或目标IgG的F(ab)区反应,那就是说,它与目标IgG的Fc区具有特异亲合力。
更具体地说,所述抗体测定试剂可以是例如Fc-特异性抗-IgG抗体,它可以用目标抗体IgG的Fc区作为免疫原制备,它包括用所述免疫原免疫任意动物获得的抗血清、其纯化产物(多克隆抗体)和单克隆抗体。这类试剂不限于上述抗体制剂,而可以是与抗体IgG的Fc区特异性反应的蛋白A、蛋白G等。
这些抗体测定试剂可以按照常规方法制备,或者从商业来源购买(例如,Sigma,Cappel或Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.)
用于检测的抗体测定试剂可以用传统标记试剂直接修饰或用附加检测手段进行间接修饰。
标记试剂的种类、标记方法、以及标记物的检测方法可以与(1-1)中提到的相同。
本发明的抗体测定方法包括应用上述抗体测定试剂作为目标抗体(即抗原-抗体复合物)检测中的关键因素,只要满足该需要,其它的基本程序可以与采用三明治技术的传统免疫测定中使用的程序相同。
本发明的抗体测定方法主要是通过使能够与样品中的目标抗体反应的抗原发生反应,然后用所述抗体测定试剂检测结合到抗原上的目标抗体(抗原-抗体复合物)来实现。
分析样品和抗原可以分别与(1-1)中提到的那些相同,至于目标抗体也可以使用(1-1)中提到的同样抗体,只要抗体是抗感染原的抗体IgG。在本发明的方法中,感染原可以包括大肠杆菌。
如果需要,本发明中的抗原或抗体测定试剂可以固定在任意固相支持物上应用。使用的固相支持物和固定化方法可以,例如,如同(1-1)中提到的一样。
抗原和目标抗体之间的抗原-抗体反应没有特别限制,可以在传统免疫测定中应用的常规条件下进行反应。典型的程序包括使含有抗原和目标抗体的反应系统在通常温度不超过45℃,优选约4-40℃,更优选约25-40℃条件下保温或静置约0.5-40小时,优选约1-20小时。
虽然不是强制规定,但可以如(1-1)中提到的那样,使大肠杆菌成分存在于抗原-抗体反应中。
然后清洗得到的抗原-抗体复合物,接着使该复合物与所述特异性抗体测定试剂反应。该反应可以在与传统免疫测定法(三明治测定技术)中通常使用的同样条件下,或者基本上以同样的方式进行。例如,溶剂没有特别限制,只要它不干扰反应,因此包括但不限于pH约5-9的缓冲液,例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和乙酸盐缓冲液,上述仅作为实例提出。反应时间和反应温度也没有特别限制,但可以是,例如,与所述抗原-抗体反应中涉及的那些相同。
可以象在(1-1)中提到那样,通过测定标记物活性,以常规方式或以用测量结果计算出来的抗体滴度的方式,评价样品中目标抗体的存在或缺乏或者目标抗体的含量,所述标记物活性依赖于标记抗体测定试剂过程中使用的标记物质(或者间接标记物)的种类。
(2)抗体测定装置
现在详细描述本发明第二方面的抗体测定装置。
本发明的抗体测定装置是一种改进的方法,通过该方法可以通过固相测定程序高度精确地确定样品中待测目标抗体的存在和/或存在量。
更具体地说,本发明的抗体测定装置是一种如下的测定装置,它包括一个固相支持物,该支持物至少具有(a)接触样品的第一区和(b)样品中的抗体进行反应的第二区,按照能够使样品通过毛细管作用从所述第一区迁移到所述第二区的次序安排第二区,它还包括一种用于检测所述第二区中的反应结果的标记工具,其特征在于所述(b)第二区具有(i)试验带,待测目标抗体的配体被固定在此处和(ii)对照带,用于捕获样品中任意抗体的配体固定在此处。
本发明的抗体测定装置的重要特征在于,在第二区提供有独立于试验带的对照带,该对照带的作用在于当用适当方式对适当样品点样并进行实验时,对照带形成一种表明标记物存在情况下阳性实验的指标,而不管样品中是否存在目标抗体,同时,当用不适当的方式对不适当样品点样并进行实验时,对照带形成一种表明标记物存在情况下阴性实验的指标,而不管样品中是否存在目标抗体。
因此,本装置第二区中的对照带是给出这样一种指示的区域,即不管样品中是否存在目标抗体,都能够指示试验带的结果是否有效。对于本发明的抗体测定装置,正因为具有上述结构,因此能够高度精确(高度可靠)地定性和定量地测定样品中的抗体,清楚地区分假阴性和真阴性结果之间的区别。
另外,本发明的抗体测定装置可以如此设计,即试验带中目标抗体的反应在存在大肠杆菌成分的情况下进行,或者如此设计,即对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的试剂用做抗体测定试剂,用来检测试验带中的反应结果。对于本发明的抗体测定装置,正因为上述结构,非特异性性反应被抑制,从而显著降低假阳性实验的发生率,因此能够在具备优良准确性和高度灵敏性的前提下,定性和定量确定样品中的目标抗体。
作为本发明抗体测定装置适用的测定样品和目标抗体,可以应用,例如,(1)中提到的那些测定样品和目标抗体。
本发明首次提供了一种至少包括第一区和第二区的固相支持物。
第一区是所施用的样品与该装置接触的区域,第二区是样品中的抗体(可以是含有目标抗体的总抗体)以配体-受体模式或者抗原-抗体模式进行反应和偶联的区域,反应结果以出现的标记体现(反应区和评价区)。固相支持物上的上述反应以如下方式安排,即点样并进入第一区的样品通过毛细管作用从所述第一区迁移到第二区。优选地上述区域这样安排,即进入第一区的样品全部或至少部分利用毛细管作用,基本上经固相支持物的表面层,迁移到第二区。
固相支持物可以任意地在第二区下游设有第三区,作为通过毛细管作用从第一区迁移到第二区并进一步到达下游的样品(液体)的吸收区。
优选固相支持物形成条带状,所述第一区和第二区以如下方式安排在条带的一个并且是同一个平面上,即所施用的样品通过毛细管作用从第一带(第一区)迁移到第二带第二区),并任意地进一步迁移到第三带(第三区)。虽然所述固相支持物的优选形式是如上面提到的条带,然而也可以使用任何其它形状或几何体,只要本发明的固相支持物的期望功能能够得以实现。
固相支持物能够吸收样品(液体),并且当固相支持物被样品浸湿时,至少能够允许样品中的抗体通过毛细管作用从固相支持物的第一区迁移到第二区,并任意地进一步迁移到第三区。而且,固相支持物最好是能够支持和固定这样一种配体的支持物,所述配体能够与样品中含有的抗体(包括目标抗体)反应,从而能够捕获所述抗体。
适当的固相支持物包括大量多孔材料,例如,聚乙烯、玻璃纤维、纤维素、螺萦(人造丝)、尼龙、交联葡聚糖、各种类型的色谱纸、硝基纤维素、和滤纸。
固相支持物的第一区、第二区和第三区,例如,可以分别由选自上述材料的同种或不同种成分构成,材料的选择依赖于各区域的作用和功能。
固相支持物的第一区优选由易于将所施用的样品吸收到其表面并使样品通过毛细管作用迁移到第二区的多孔材料构成。适用于第一区的多孔材料没有特别限制,但通常可以使用聚乙烯(例如POREX:PorexTechnologies,Fairburn,Georgia),玻璃纤维、人造丝、尼龙、以及包括纸在内的纤维素材料。优选材料是多孔聚乙烯或例如滤纸等的纤维素材料。
固相支持物的第二区优选由满足下列条件的多孔材料构成,该条件是能够允许样品(液体)经毛细管作用从第一区迁移到第二区,并且能够承载样品中存在的抗体(包括目标抗体)的配体,而使配体不能通过毛细管作用移走。具有这些性质的多孔材料包括滤纸、色谱纸、玻璃纤维、交联葡聚糖、尼龙、硝基纤维素等。优选材料是硝基纤维素,因为配体能够轻易地固定在其上。
第二区设有试验带,在试验带固定有易于特异性识别并捕获样品中的目标抗体的配体,还设有对照带,在对照带固定有易于识别并捕获样品中的任意抗体的配体。对照带安排在偏离试验带一定间隔的位置上,最好在试验带毛细管流方向的下游,最好如下安排,以便使这两个区域在同样条件下被样品液体的前沿接触。
试验带中的配体没有特别限制,只要它能够与待测目标抗体特异性偶联,但优选由目标抗体特异性识别和结合的抗原(抗原-抗体反应)。作为上面提到的抗原,可以任意使用传统血清抗体测定系统中应用的常规抗原。这些抗原可以是例如病毒和细菌等的病原体本身,但也可以是含有各病原体固有抗原决定簇的物质。因此可以应用,例如,热或辐照灭活的病原体、用表面活性剂等试剂提取病原体得到的抗原、以及化学合成或重组DNA技术人工制备的抗原。
对照带中的配体没有特别限制,只要它能够与样品中的任意抗体偶联,但优选能够特异性识别和结合尿中任意抗体的抗体(抗-免疫球蛋白抗体)。
这些配体分别固定在试验带和对照带的多孔材料上,以至于它们不能在液体样品的毛细管流作用下从各自区域移动。因此,各配体结合到多孔材料的相应位置上,从而当第二区被含目标抗体的样品浸湿后,各配体将不能够扩散,只是保持固定在各自位置而不被运输到固相支持物的第三区。
可以通过本领域技术人员的公知技术,即物理结合或化学结合,实现配体在所述多孔材料上的固定。
因此可以使用,例如,化学结合法例如共价结合法,例如叠氮法、多肽法(酰胺衍生物法、羧基氯化树脂法、碳二亚胺树脂法、马来酸酐衍生物法、异氰酸酯衍生物法、溴化氰激活的多糖法、纤维素羧酸酯衍生物法、浓缩试剂法等)、烃化法、交联剂偶联法(用戊二醛、环己烯异氰酸酯等作为交联剂偶联到支持物上的方法)、Ugi反应偶联法等;离子结合法;以及物理吸附法。当使用硝基纤维素作为第二区的多孔材料时,可以通过非共价结合常规固定所述配体。
在第二区的试验带中应用的配体(抗原)的量优选过量,以便使可能存在于样品中的目标抗体基本上全部结合到试验带上。
在第二区的对照带中应用的配体(抗-免疫球蛋白抗体)的量也优选过量,以便使样品中的任意抗体(可以含有目标抗体)全部结合到对照带上。
试验带中目标抗体和配体(具体地说是抗原)之间的偶联反应优选在存在大肠杆菌成分的情况下进行。可以通过在测定样品的稀释液中加入大肠杆菌成分,然后将混合物在第一区点样,实现大肠杆菌成分介入反应系统,或者可以将大肠杆菌成分可移动地固定到固相支持物试验带的上游(例如,所述第一区或下文将要描述的示踪区)。大肠杆菌成分没有特别限制,只要它来源于上面提到的大肠杆菌。因此,它可以是细胞的蛋白质组分,碳水化合物组分或脂类组分,或者这些组分的混合物。通过提取细胞得到的可溶性组分或者脂多糖组分(LPS)作为优选实例提到。
随着样品在第一区点样后,样品通过毛细管作用迁移到第二区,在第二区样品中的目标抗体结合并固定到试验带上,然后,样品中其余的任意抗体(包括残存的没有结合到试验带上的目标抗体)结合并固定到试验带下游的对照带。
本发明中的标记工具用于检测样品中的目标抗体和任意抗体是否已经分别偶联并固定到所述试验带和对照带上。
标记工具可以由抗体的配体和偶联到所述配体上的可检测标记构成。
抗体的配体没有特别限制,只要它是能够识别和结合样品中存在的抗体的分子,在本发明中,它优选是不仅能够与样品中存在的待测目标抗体结合也能够与任意抗体结合的分子。作为这种配体的实例,可以提及与对照带中使用的相同的配体,具体地说,即是适于用作对照带中配体的同样的抗-免疫球蛋白抗体。
上面提到的抗-免疫球蛋白抗体包括用相关免疫球蛋白例如人免疫球蛋白作为免疫原,免疫任意动物得到的抗血清、其纯化产物(多克隆抗体)和单克隆抗体。
作为对照带中的配体的抗-免疫球蛋白抗体可以任意地为抗所有各类抗体的抗体,以便它可以捕获和检测样品中的总抗体,或者可以是抗所需类型抗体例如免疫球蛋白G(IgG)的抗体。最好,该配体是这样一种抗体,它抗与目标抗体所属同一类型的抗体,这种安排是优选的,因为当在对照带检测与目标抗体同一类型的抗体时,能够获得用于判断检测是否已经适当进行的最佳指示,该分析不仅包括使用尿样,还包括使用其它体液例如血清作为样品。
如果目标抗体是IgG,所述标记工具中的配体更优选对抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的配体,作为这种配体的优选实例,包括对抗体IgG的轻链或其F(ab)区不反应的抗-IgG抗体,或者对抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的蛋白A、蛋白G等。这种抗-免疫球蛋白抗体或配体可以以常规方式制备,或者从商业来源购买。
可检测标记成分没有特别限制,只要它是已知的或将来可能用到的用于特异性结合分析(具体地说是免疫分析)可检测标记物[TatsuoIwasaki等:单克隆抗体,Kodansha Scientific,1984;Eiji Ishikawa等:酶免疫分析,第2版,Igaku Shoin,1982等]。
优选标记物是在第二区的试验带或对照带中发生颜色改变的标记物。虽然没有限制,但是特别优选不需要借助任何装置即可观察识别其颜色改变的标记物。例如,涉及如荧光物质和吸收染料等的各种色原体。还有,更优选的是含有可观察检测的标记的粉末状标记物。
适当的颗粒状标记物包括聚合物颗粒(例如乳胶颗粒或聚苯乙烯颗粒)、包封体、脂质体、金属性凝胶(例如胶体银、胶体金等)、以及聚苯乙烯染料颗粒。其中,优选金属凝胶例如胶体银和胶体金。
可以按照传统方式,将这种标记物化学偶联或物理偶联到配体上,制备标记配体,也可以使用商业产品。
可以用于本发明的标记工具可以是满足下列条件的任何标记物,即当将标记物提供给固相支持物的第二区(包括试验带和对照带)后,它可以指示样品中存在的抗体在第二区中发生的反应的结果,只要能够实现这种功能,对于它的存在方式没有特别限制。例如,当本发明的测定装置是流体通过装置的形式,抗体测定试剂盒中含有的标记工具可以独立于固相支持物。
优选标记工具可移动地固定在固相支持物上,更优选标记工具可移动地固定在固相支持物上的第二区上游。特别优选的方式是标记工具固定在固相支持物第一区和第二区间的中间区域(下文称为示踪区)。在这种应用方式中,提供给第一区的样品通过毛细管作用迁移到示踪区,在此处样品与标记配体接触形成目标抗体/标记配体复合物和任意抗体/标记配体复合物。通过示踪区之后,含上述复合物的样品通过毛细管作用继续迁移到第二区。分布在第二区的试验带中的配体(抗原)对目标抗体具有特异性,分布在对照带中的配体(抗-免疫球蛋白抗体)对任意抗体具有特异性。因此,通过毛细管作用迁移过来的目标抗体/标记配体复合物首先被捕获在试验带,之后样品中剩余的任意抗体/标记配体复合物(包括目标抗体/标记配体复合物)被捕获在对照带。
固相支持物的示踪区没有特别限制,只要它是能够将含有目标抗体和任意抗体的测试样品从第一区运输到第二区的支持物,并且该支持物能够支持所述标记配体,并使标记配体可以随毛细管流释放。通常,它是由聚乙烯、玻璃纤维、人造丝、尼龙、或者包括纸在内的纤维素材料制成的多孔构件。优选难以存在非特异性吸附的材料,例如任选地用聚乙烯醇(PVA)处理的玻璃纤维。
在本发明的优选实施方案中有这样一个实施方案,其中在固相支持物上,第二区中的所述示踪区和所述试验带之间存在一定间隔。当在示踪区和试验带之间安排这样一个间隔区后,使样品在到达第二区的试验带之前,样品中即将与示踪区中的标记配体接触的抗体在此与标记配体混合,由此更有效地保证了抗体和标记配体之间的偶联反应。因此,该区提供了一种在样品中目标抗体和任意抗体分别与试验带和对照带接触之前,目标抗体和任意抗体与标记配体偶联的保温环境(时间和空间)。
另外,本发明的固相支持物还可以在第二区下游安置第三区。
样品通过毛细管作用从第一区连续迁移到任选示踪区和第二区,并进一步迁移到第三区。因此,第三区的功能在于接受通过毛细管作用从第二区迁移来的液体。
通常第三区仅需具备接受未结合到第二区的液体成分的功能,但也可以进一步安置这样一个区域,即能够当样品毛细管流(即液体前沿)进入固相支持物的预定终点区时提供测定完成的信息。
为实现上述目的,可以在固相支持物的第二区下游安置可观察指示剂区,该区含有例如赤藓红B、碱性藏红O、酚红等水溶性染料。在这种情况下,当样品的液体前沿从第二区迁移到第三区,该前沿流过指示剂区,分布在该区的染料随样品毛细管流(液体)向下游移动,因此显示样品已经连续通过第一区、示踪区和第二区(试验带和对照带)的信息,根据这种信息判断检测刚刚完成。
第三区的材料没有特别限制,只要它能够吸收样品(液体),因此包括聚乙烯、人造丝、尼龙和包括纸在内的纤维素材料构成的多孔薄膜或片层。优选材料是纤维素材料例如纸。
下面结合显示本抗体测定装置及其组成构件的附图,详细描述本发明。然而应该理解举例说明的装置仅是本发明的实施例,而绝不是对本发明的限定。
图1是显示一种条带状固相支持物(60×5mm)作为本发明装置组件的示意图。图1中,标号1表示第一区(16×5mm,0.92mm厚),检测样品在此处点样,并与所述条带状物接触;标号2表示示踪区(5×5mm,0.79mm厚),标记配体(例如胶体金标记的人IgG抗体)固定在此处;标号3表示第二区(18×5mm,0.1mm厚),样品中的抗体在此发生反应,并显示结果;标号4表示第三区(22×5mm,1.46mm厚),从第一区和第二区迁移过来的样品在此被吸收。
第一区的厚度通常为0.2-2mm,优选0.8-1.2mm,示踪区的厚度通常为0.2-1.5mm,优选0.5-1mm。第二区的厚度通常为0.03-0.2mm,优选0.08-0.12mm,第三区的厚度通常为0.5-3mm,优选1-2mm。然而,上述范围并不严格。
在所述第二区(3)内分布有试验带(试验线,约1×5mm)(5),对目标抗体具有特异亲合力的配体固定在该位置上,第二区(3)内还分布有对照带(对照线,约1×5mm)(6),对任意抗体具有亲合力的配体(抗-人免疫球蛋白抗体)固定在此处。试验带(5)安置在距示踪区一定距离(约6mm)的位置上,对照带(6)安置在距试验带(5)一定距离(约6mm)的位置上。试验带具有特异地与样品中的目标抗体反应,以及在存在标记物的情况下指示样品中是否存在目标抗体的功能,对照带具有在存在标记物的情况下指示应用的样品合适与否的功能。
构成固相支持物条带第一区、示踪区、第二区和第三区的材料(支持物)可以简单地沿支持物条带的纵向即样品迁移的方向串联,连接方式没有特别限制。然而优选第一区纵向前端和示踪区后端之间的连接、示踪区前端和第二区后端之间的连接、以及第二区前端和第三区后端之间的连接分别是相互重叠的。更优选的是如图1所说明的那样,第一区的纵向前端部分叠加在示踪区的后端部分上。第三区的后端部分可以叠加在第二区的前端部分上。按照这样连接方式,点样于第一区的样品可以在条带的纵向上平滑迁移。纵向上条带的宽度没有特别限制,可以为例如0.5-10mm,优选1-2mm,更优选0.8-1.2mm。应该理解在条带的重叠结构中各区的顶端/底端关系不限于上述提及的关系,而可以是相反的关系。
为了方便使用,上述固相支持物优选装配成测试单元的形式。
下面参考图2解释本发明测定装置的分析原理。
(3)固相测定方法
本发明的第三方面为利用上述装置的固相测定方法,尤其是测定样品中目标抗体的固相测定方法,它包括使样品与抗体测定装置的第一区接触,在第二区的对照带指示颜色的条件下检测第二区试验带中颜色的形成状况。
该分析中,首先将怀疑含有目标抗体的样品在固相支持物的第一区(1)点样。
对于应用的样品,可以应用体液例如尿液原样或做适当稀释后使用。该稀释液没有特别限制,包括pH在约5-9范围内,优选约6.5-8.5范围内具有缓冲作用的各种缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等)、以及表面活性剂等。
由于存在大肠杆菌成分的情况下,可以抑制抗原-抗体反应中的非特异性反应,从而降低假阳性试验的发生率,因此优选使用含例如大肠杆菌成分的稀释液。加入稀释液的大肠杆菌成分(LPS)的量没有特别限制,但最好为,例如,在反应系统,即试验带中,每μg配体(抗原)提供约0.1-10μg,优选约0.5-5μg所述成分。
加入样品的大肠杆菌成分(LPS)的量可以为,例如,通常不少于5μg/ml,优选5-100μg/ml,更优选1)-50μg/ml。尽管不限制应用超过100μg/ml的量,但是大肠杆菌成分的添加量达到100μg/ml时,就能够实现本发明的效果。
当样品点样到第一区(1)后,第一区被浸湿。应用的样品通过毛细管作用从第一区(1)流动到示踪区(2),并与可逆地固定在示踪区的标记配体(胶体金标记的抗-人IgG抗体)接触并反应。
当使用适当的样品,并且样品中含有目标抗体时,样品中含有的目标抗体和任意抗体与示踪区(2)内的所述标记配体偶联,分别形成目标抗体/标记配体复合物和任意抗体/标记配体复合物。当上述复合物通过示踪区(2)后,各自的复合物或没有形成这些复合物的标记配体随样品一起运输到示踪区(2)的下游。在一个优选方式中,当尚未形成复合物的标记配体随包含抗体的样品通过毛细管作用从示踪区(2)向第二区(3)的试验带(5)移动时,给予其足够时间(空间)以形成复合物。当样品到达第二区的试验带(5),样品中的目标抗体/标记配体复合物与固定在试验带(5)上的配体偶联,并被原位固定。样品通过毛细管作用继续向下游迁移,到达对照带(6),在此处任意抗体/标记配体复合物与该带中的配体(抗-人免疫球蛋白抗体)偶联,并固定于此。然后,根据标记配体的标记成分,检测固定在试验带(5)和对照带(6)中的复合物,测定结果指示为阳性试验。相反,当不含目标抗体的样品点样后,在试验带(5)中不形成所述固定的目标抗体/标记配体复合物,从而在该试验带(5)中不能检测到标记物(阴性试验)。
在上述研究中,试验带(5)中指示的阴性试验包括因为样品浓度太低(即样品中抗体总量很小)导致的阴性(假阴性)试验和因为样品中缺乏目标抗体导致的阴性试验(真阴性)。按照试验带(5)的单独结果还不能将这些阴性试验彼此区别开来。然而,在假阴性试验中,对照带(6)中不形成所述任意抗体/标记配体复合物,因此对照带给出阴性指示,而在真阴性试验情况下,对照带(6)形成所述任意抗体/标记配体复合物,因此对照带给出阳性指示。因此,根据对照带的指示是阴性还是阳性,可以鉴别试验带(5)中的阴性结果是假阴性或是真阴性试验。另外,当在适当系统中使用了失活标记配体,或者没有进行适当的测定时,对照带(6)就会给出阴性指示,从而防止由于这类原因导致的假阴性试验结果。
含所有未结合抗体、标记配体等的液体样品连续从第二区(3)下游迁移到第三区(4)。在这种情况下,可以任意地设置指示剂区,这种情况下,当液体前沿将指示剂区的染料运载到终点区,从而指示出液体和染料穿过第三区的流动轨迹,并且指示测定的结束。
图3显示本发明抗体测定装置在水平位置应用的示例。包括第一区(1)、示踪区(2)、第二区(3)(包括试验带(5)和对照带(6))以及第三区(4)的固相支持物(A)容纳在一个由适当材料制成的外壳(B)中。尽管也可以使用例如玻璃、金属和纸等其它材料,但是保护罩材料优选可塑性塑料材料,例如聚苯乙烯。保护罩由具有若干孔隙的上部分(7)和下部分(8)构成,固相支持物设置在保护罩的下部分(8)上,然后将上部分覆盖到其上。保护罩上部分的孔隙(9)和(10)与固相支持物的连续各区平行排列,并且在位置上分别对应于固相支持物的第一区(1)和第二区(3)。
样品可以从孔隙(9)(进样口)加入支持物的第一区(1)。孔隙(9)优选设置有围绕该孔向外突出的壁,从而该壁可以帮助液体样品滴加到支持物的第一区上。使样品与固相支持物的第一区接触的方法没有特别限制,但优选使样品从所述进样口垂直滴加到固相支持物平面上。
孔隙(10)设置在能够观察评价固相支持物第二区的试验带和对照带的位置上,由此,可以观察确定试验带中固定的标记配体/目标抗体复合物和对照带中固定的标记配体/任意抗体复合物(检测窗,评价窗)。孔隙(10)不必是能够观察评价试验带和对照带的单一孔隙,可以包括分别用于试验带和对照带的两个独立窗口。
应用本发明的抗体测定装置,将测定系统静置几分钟到30分钟,优选5-20分钟,点样后通常温度不超过45℃,优选4-40℃,更优选约15-30℃,可以高度准确地确定样品中是否存在目标抗体,以及目标抗体的存在量。
(4)抗体测定试剂盒
当使用一种包含全套各种试剂和抗体测定必须装备的抗体测定试剂盒时,可以更便捷地进行(1)中描述的抗体测定方法或利用(2)中描述的抗体测定装置的固相测定法。
因此,本发明进一步提供了一种抗体测定试剂盒,以便简化所述抗体测定法和所述固相测定法的操作。
按照本发明的抗体测定试剂盒可以用于通过抗原抗体反应检测和定量样品中抗体,作为一个优选方式,本发明抗体测定试剂盒包括所述大肠杆菌成分作为试剂盒成分之一的试剂盒。这种试剂盒进一步含有任选固定的适合与待测目标抗体进行抗原-抗体反应的抗原、抗体测定试剂等。另外,为了方便检测,该试剂盒可以进一步包括适当的反应介质、稀释液、清洗缓冲液、反应终止剂和/或标记活性检测试剂。
而且,作为另一种实施方式,本发明的抗体测定试剂盒可以包括对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲和力的试剂,优选Fc-特异性抗-IgG抗体。
作为另外一种替换方式,本发明的抗体测定试剂盒可以包括所述抗体测定装置。该试剂盒可以进一步含有所述大肠杆菌成分或所述对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲和力的物质或者二者均含有。而且,该试剂盒除了包含所述反应介质、稀释液、清洗缓冲液、反应终止剂、和标记活性检测试剂外,还可以进一步含有例如移液管和安瓿(管)等用于样品稀释附件。发明的最佳实施方式
下列实施例的目的在于进一步详细地说明本发明,决不应该构成对本发明技术范围的限定。应该理解本领域技术人员在本发明上述公开内容的基础上,可以进行不偏离本发明技术范围的任意改变和修饰。实施例1 H.pylori的测定
(1)H.pylori抗原的制备
H.pylori(临床分离株)在Brucella琼脂培养基(Becton)上培养48小时(10%CO2,5%O2,37℃),收获成熟细胞放入冷PBS。细胞用冷PBS离心清洗5次,加入冷PBS制备100mg/ml的细胞浓缩液。搅拌情况下,加入等量冷的0.2%Triton X-100/PBS。混合物搅拌5分钟,离心,收集上清液即H.pylori抗原溶液,-80℃储藏。
(2)H.pylori抗原平板的制备
将上述H.pylori抗原溶液(2.5μg蛋白质/ml)加入96-孔平板,每孔100μl,4℃保温过夜。用PBS清洗各孔一次后,加入封闭液(Dulbecco-PBS[D-PBS],1%BSA,5%山梨醇,0.05%NaN3[pH7.4]),每孔300μl,然后使平板在4℃保温过夜。弃去封闭液后,平板在25℃干燥过夜,与干燥剂一起密封在铝袋中,4℃储藏备用。
(3)E.coli成分的制备
大肠杆菌(pvc18/JM109,Takara Shuzo)在含安苄青霉素的LB液体培养基(Luria-Bertani培养基,Nippon Seiyaku)中于37℃培养18小时。离心培养物收集细胞,然后用2份PBS清洗。将冷PBS加入清洗过的细胞,使浓度为100mg/ml,用超声仪(10秒×3)破碎并提取混合物。回收上清液作为大肠杆菌成分,于-80℃储藏(下文称为E.coli提取物)。
(4)尿中抗-H.pylori抗体的测定
使用尿作为样品,测定样品中的抗-H.pylori抗体。
在(2)中制备的H.pylori抗原平板的各孔中,加入含20μg蛋白质/ml E.coli提取物的第一缓冲液(200mM Tris-HCl缓冲液,0.14 MNaCl,2%酪蛋白,0.5%BSA,0.05%Tween 20,0.1%NaN3[pH7.3])25μl和尿样100μl。混合物震荡10秒,在37℃静置1小时。用6份PBST(PBS中含有0.05%Tween 20和0.1%NaN3)清洗各孔,加入100μl用第二缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液,0.14 M NaCl,0.5%BSA,5%山羊血清,0.05%Tween 20,0.1%XL-II[pH7.3])稀释11,000倍的酶(HRP)标抗-人IgG抗体(过氧化物酶偶联的同源纯山羊抗-人IgG(Fc),Jackson ImmunoResearch)稀释液。平板在37℃静置1小时,然后用6份PBST清洗。
然后,加入100μl显色液(50mM柠檬酸盐-Na2HPO4,50%TMB溶液,0.0075%H2O2),室温下反应20分钟,随后加入100μl反应终止剂(50%TMB终止溶液,50%1N-H2SO4),然后测定吸光率。
(5)结果
(i)通过13C-UBT试验(它被认为是目前应用的所有诊断幽门螺旋杆菌感染方法中最准确的方法)诊断为H.pylori阳性的5例病例和H.pylori阴性的5例病例中,以尿作为样品,用(4)中描述的程序检测尿中的抗-H.pylori抗体。
作为对照试验,用不加E.coli提取物的同样的尿样进行同样的程序,基于得到的结果,评价本发明附加E.coli提取物的效果。
数据如图4所示。
图4中,纵坐标代表吸光率(O.D.450-650nm),横坐标代表加(+)和不加(-)E.coli提取物。另外,空心圆代表经13C-UBT试验判定为幽门螺旋杆菌阳性病人的尿样结果。实心圆代表经13C-UBT试验判定为幽门螺旋杆菌阴性病人的尿样结果。
从图4可以看出,按照本发明在存在E.coli提取物的情况下进行测定,可以清楚地区别幽门螺旋杆菌阳性和阴性病例,并与13C-UBT试验保持一致,因此本发明方法的高度精确性得以认可。
(ii)利用99个没有幽门螺旋杆菌根除治疗史的健康志愿者的尿样,按照(4)中描述的程序在存在E.coli提取物的情况下测定尿样中的抗-幽门螺旋杆菌抗体。结果如图5所示。图5中,纵坐标代表吸光率(O.D.450nm),横坐标代表根据13C-UBT试验建立的组(阳性和阴性病例)。结果表明,含E.coli提取物的测定系统中,所有来自阴性病例的尿样给出确切的阴性结果,而不存在假阳性结果。
(iii)用商品化的ELISA试剂盒确定参与试验(ii)的相同受试者血清中的抗幽门螺旋杆菌抗体的量,在灵敏度、特异性和准确性方面,将得到的结果与用本发明方法测定尿样得到的结果相比较。上述各受试者的血清和尿样都是同步收集和制备用于检测的。
商品ELISA试剂盒如下:HM-CAPTM试剂盒,肠道产品(HM-CAP);Helico GTM试剂盒,Shield Diagnostic(Helico G);以及HEL-PTM试剂盒,Amrad Biotech(HEL-p)。按照各试剂盒上标明的方案进行检测。结果如表1所示。
表1
测定方法 | 样品 | 灵敏度 | 特异性 | 准确性 |
HM-CAPHelico GHEL-p本发明的方法 | 血清血清血清尿液 | 80%(56/70)99%(69/70)97%(68/70)99%(69/70) | 96%(47/49)88%(43/49)90%(44/49)100%(49/49) | 87%(103/119)94%(112/119)94%(112/119)99%(118/119) |
关于表1,“灵敏度”指用各试剂盒检测幽门螺旋杆菌-阳性受试者(根据13C-UBT试验的阳性感染:n=70)产生的阳性率,“特异性”指用各试剂盒检测幽门螺旋杆菌-阴性受试者(根据13C-UBT试验的阴性感染:n=49)产生的阴性率,“准确性”指各试剂盒的准确结果占总量(70+49=119位患者)的百分比。
显然,与传统血液抗体测定试剂盒相比,尽管使用仅含痕量抗体的尿样,用本发明的方法测定抗幽门螺旋杆菌抗体仍得到较高的检测灵敏度和特异性以及明显较高的准确性。
(6)尿中的抗幽门螺旋杆菌抗体的测定
用含E.coli LPS(Difco)(LPS浓度为5μg/孔)的第一缓冲液替换E.coli提取物,其余重复程序(4),测定尿样中抗-幽门螺旋杆菌抗体,按照(5)(i)中的同样方式评价结果。结果如图6所示。从图中可以清楚地看到,应用E.coli LPS替换所述E.coli提取物得到相似结果。实施例2 抗-乙肝病毒(HBc)抗体的测定
(1)抗-乙肝病毒(HBc)抗体的测定
按照实施例1(2)的程序,用HBc抗原(Chemicon International)制备抗原平板,按照实施例1(4)测定尿样中抗-乙肝(核心)(Hbc)抗体。
据此,将25μl含不同浓度E.coli提取物的第一缓冲液和100μl尿样加入HBc抗原平板的各孔,振荡10秒钟后,将平板在37℃静置1小时。用6份PBST清洗平板后,加入100μl用第二缓冲液稀释11000倍的酶(HRP)-标抗-人IgG抗体稀释液,将平板在37℃静置1小时,然后清洗(6倍量PBST)。
然后,加入100μl显色剂,室温下反应20分钟,加入100μl反应终止剂后,测定吸光率。
(2)结果
对于用商品化抗-HBc抗体测定试剂盒(Dinabott)确定的5例血液抗-HBc抗体阳性和5例血液抗-HBc抗体阴性病例,再用(1)中描述的程序测定尿中的抗-HBc抗体。
反应混合物中E.coli提取物的浓度分别定为0,0.78,1.56,3.13,6.25,和12.5μg/ml,评价附加上述提取物的效果。结果如图7所示。
在图7中,纵坐标代表吸光率(O.D.450-650nm),横坐标代表附加E.coli提取物的浓度。另外,实心圆表示血液抗-HBc抗体阳性患者尿抗体的数据。空心圆表示血液抗-HBc抗体阴性患者尿抗体的数据。从图中可以看出,甚至当使用尿样时,与附加E.coli提取物时测定的水平相比,血液抗-HBc抗体阳性患者组和抗-HBc抗体阴性患者组之间的抗-HBc抗体检测水平的差异更显著。实施例3
利用由已知测定方法[CalypteTM HIV-1 Urine EIA:Arch.Pathol.Lab.Med.,119,139-141(1995);临床感染性疾病,19,1100-1104(1994)]测定尿中抗-HIV抗体时为假阳性试验的尿样,进行考察试验以鉴别在上述测定系统中可能导致非特异性反应的成分。
(1)用1M磷酸盐缓冲液(pH7.7)将上述各尿样调整到pH7.4,经5.0,0.8和0.2μm-截留滤器过滤。从上述滤液中取20ml经超滤浓缩(10kDa-截留膜)至2ml。浓缩的尿液进行凝胶渗透层析(Sephacryl S-300,Pharmacia),检测各组分对HIV抗原的反应力。
通过将各组分与用固定化HIV抗原(gp160)制备的HIV抗原-固定化平板反应,并用ALP-标记的山羊抗-人(IgG+IgM)抗体、ALP-标记的山羊抗-人IgG(Fc-特异性)抗体或HRP-标记的山羊抗-人IgG(Fab-特异性)抗体(均由Jackson ImmunoResearch Labs提供)检测结合体(非特异性结合成分),从而确定HIV抗原的反应力。结果如图8所示。
在图8中,纵坐标表示吸光率(O.D.),横坐标表示凝胶渗透层析组分(组分号)。实线代表蛋白质在280nm的吸光率,实心圆代表用所述抗-人(IgG+IgM)抗体检测的结果,空心三角线代表用所述抗-人IgG(Fc-特异性)抗体检测的结果,实心三角线代表用所述抗-人IgG(Fab-特异性)抗体检测的结果。
从图8可以观察到,在用抗-人IgG(Fab-特异性)抗体检测过程中,反应模式(与非特异性结合成分的反应力)与用抗-人(IgG+IgM)抗体检测过程中的反应模式相同,而用抗-人IgG(Fc-特异性)抗体检测却没有发现任何反应。该结果意味着上述非特异性结合成分是人IgG的片段或失活产物,其保留与没有Fc区的抗-人IgG(Fab-特异性)抗体的反应力。
因此,显然,当使用不与上述非特异性结合成分反应的抗-人IgG(Fc-特异性)抗体作为测定试剂时,抗体测定系统中的非特异反应能够被抑制,因此也抑制了基于这种非特异反应的假阳性试验的发生率,这样就提供了一种高度特异和非常准确的抗体测定法。实施例4 尿中抗-HIV抗体的测定
将25μl第一缓冲液(CalypteTM HIV-I Urine EIA的样品缓冲液)和200μl尿样加入HIV抗原平板(CalypteTM HIV-I Urine EIA,CalypteBiomedical Corp.)的每一个孔中,振荡10秒钟后,将平板在37℃静置1小时。清洗平板6次(清洗缓冲液:D-PBS,0.05%Tween 20)后,加入100μl用第二缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液,0.14 M NaCl,0.5%BSA,5%山羊血清,0.05%Tween 20,0.1%XL-II[pH7.3])稀释11,000倍的HRP标山羊抗-人IgG(Fc-特异性)抗体(过氧化物酶-结合的同源纯山羊抗-人IgG,Fc片段特异性,JacksonResearch Lab.)稀释液,平板在37℃静置1小时,然后以上述同样方式清洗(6次)。
然后,加入100μl显色液(50%TMB溶液,50mM柠檬酸盐-Na2HPO4,0.0075%H2O2),室温下反应10分钟,随后加入100μl反应终止剂(50%TMB终止溶液,50%1N-H2SO4),然后测定吸光率。
作为对照试验,用已知测定法[CalypteTM HIV-I Urine EIA:Arch.Pathol.Lab.Med.,119,139-141(1995);临床感染性疾病,19,1100-1104(1994)](对照方法)分析上述样品,该对照法使用ALP-标记的山羊抗-人免疫球蛋白作为第二抗体。另外,通过本发明的上述分析方法测定上述分析试剂盒的阴性对照和阳性对照。因为对这样建立的吸收值和用上述试剂盒建立的吸收值进行了比较,所以按照上述同样试剂盒的临界点计算法,本发明方法的临界点确定为在上述阴性对照的平均吸收值上加0.180得到的值。
血清抗-HIV抗体阳性(2例)和血清抗-HIV抗体阴性(98例)共100个受试者的样品(尿液)的测定结果如表2所示。
表2
本发明方法 | ||||
阳性 | 阴性 | 总数 | ||
对照方法 | 阳性 | 4* | 26 | 30 |
阴性 | 0 | 70 | 70 | |
总数 | 4 | 96 | 100 |
*:4个受试者中,2个受试者为血清抗-HIV抗体阳性。
从表2可以看出,虽然本发明方法的灵敏度和对照方法的灵敏度均为100%(2/2),然而对照方法的特异性为71.4%(70/98),本发明方法的特异性为98%(96/98)。
上述结果表明,与对照方法相比,本发明抗体测定方法的假阳性发生率显著较低,且特异性非常高。实施例5 尿中抗-幽门螺旋杆菌抗体的测定
(1)幽门螺旋杆菌抗原平板的制备
在用振荡器不断振荡的条件下,将等体积0.2%的冷Triton-X溶液加入按照常规方法[临床微生物杂志,29:2587-2589(1991)]制备的100mg/ml幽门螺旋杆菌(临床分离体)冷Dulbecco-PBS溶液,混合物继续振荡5分钟,离心(3000rpm,20分钟)。将上清液转移到新试管中,用作提取物(1-1.5mg/ml蛋白质)。
用D-PBS稀释提取物至2.5μg/ml,将稀释液加入96-孔平板的各孔,每孔100μl,25℃保温过夜。清洗各孔后,加入300μl封闭液(D-PBS,0.5%酪蛋白,5%山梨醇,0.05%NaN3[pH7.4]),然后将平板在25℃保温过夜。弃去封闭液后,平板在25℃干燥过夜,与干燥剂一起密封在铝袋中,4℃储藏备用。
(2)测定
使用如上制备的固定化抗原(平板),如实施例4的方式测定尿样中的抗-幽门螺旋杆菌抗体。
因此,将25μl第一缓冲液(200mM Tris-HCl缓冲液,0.14 M NaCl,2%酪蛋白,0.5%BSA,0.05%Tween 20,0.1%NaN3,20μg/ml E.coli提取物[pH7.3])和100μl尿样加入各孔,振荡10秒后,将平板在37℃静置1小时,然后清洗6此。如实施例4,加入100μl用第二缓冲液稀释的所述HRP标山羊抗-人IgG(Fc-特异性)抗体稀释液,然后将平板在37℃静置1小时用于检测抗体。
得到的结果如图9和表3所示。
表3
样品 | 临界点 | 灵敏度13C-UBT(+) | 特异性13C-UBT(-) | 准确性 | |
本发明方法 | 尿液 | M+3SD(0.104) | 56/56(100%) | 42/44(95%) | 98% |
尿液 | M+5SD(0.147) | 56/56(100%) | 43/44(98%) | 99% | |
对照方法 | 血清 | M+3SD(1.27) | 53/56(95%) | 43/44(98%) | 96% |
血清 | M+5SD(1.82) | 47/56(84%) | 43/44(98%) | 90% |
图9中,纵坐标代表吸光率(O.D.450-650nm),横坐标代表根据13C-UBT试验[肠胃病学杂志,33:pp.6-13(1998)]建立的阳性幽门螺旋杆菌感染组(+;n=56)和阴性幽门螺旋杆菌感染组(-;n=44)。
在表3中,“灵敏度”指在根据13C-UBT试验确定的阳性病例中,检测为阳性病例的百分数;“特异性”指在根据13C-UBT试验确定的阴性病例中,检测为阴性病例的百分数;“准确性”指在根据13C-UBT试验确定的阳性和阴性病例中,检测为阳性和阴性病例分别所占的百分数,各数值相对于平均为M+3SD或M+5SD的临界点。作为对照试验,用血清抗-幽门螺旋杆菌抗体测定试剂盒[HM-CAP;EPI/KyowaMedics(K.K.)]测定同一受试者的尿样,结果同样显示在表中(对照法)。
上述结果表明本发明的方法在灵敏度和准确性方面尤其优于对照法。实施例6 尿中抗-风疹病毒抗体的测定
(1)风疹病毒抗原平板的制备
除使用浓度为1μg/ml的商品风疹病毒抗原[BIO-DESIGN提供]和含D-PBS,1%BSA,5%山梨醇,0.05%NaN3[pH7.4]的封闭液之外,其余重复实施例5(1)的程序,制备风疹抗原平板。
(2)测定
用上述抗原平板,按照实施例5(2)同样的方式测定尿样中的风疹抗体。结果如图10和表4所示。
表4
对照法(血清ELISA) | ||||
阳性 | 阴性 | 总数 | ||
本发明方法(尿ELISA) | 阳性 | 76 | 0 | 76 |
阴性 | 0 | 23 | 23 | |
总数 | 76 | 23 | 99 |
在图10中,纵坐标表示吸光率(O.D.450-650nm),横坐标表示按照商品试剂盒(Rubella IgG(II)-EIA,SEIKEN;由Denka Seiken提供)建立的血清抗-风疹抗体-阳性组(n=76)和-阴性组(n=23)。表4给出的数据表明用本发明方法在尿中得到的结果与用对照方法在血清中得到的结果完全一致。
根据上述数据,本发明方法与对照方法之间的一致化程度达100%(99/99),因此表明本发明甚至能够高度灵敏和高度特异地测定安全方便的尿液中的抗体,因此可以很好地应用于试验室检查。实施例7 抗体测定装置的构建
(1)幽门螺旋杆菌抗原的制备
如实施例1(1)中的同样程序制备幽门螺旋杆菌抗原溶液,储存于-80℃。
(2)含标记抗-人IgG抗体的干玻璃纤维的制备
将用40nm(直径)胶体金-标记的抗-人IgG(Fc-特异性)抗体溶液1ml加到玻璃纤维片层(5.0mm×260mm×0.8mm厚;Whatman)上,片层干燥过夜。将这种片层和干燥剂一起室温储存备用。
(3)膜的制备
将上述(1)中制备的幽门螺旋杆菌抗原溶液(3mg/ml)和抗-人IgG抗体溶液(0.3mg/ml)分别线形喷洒到硝酸纤维素膜(26.5mm×260mm×0.1mm厚;Advance MicroDevice)的如图11指示的的预定位置上,37℃干燥120分钟。干燥后,将膜浸入含脱脂奶的Borax缓冲液(pH8.2)中漂洗30分钟。漂洗后的膜在37℃干燥1小时,与干燥剂一起室温储存。
(4)组合(固相支持物)
如图3(A)的说明,将上述膜(3)、吸收性滤纸板(4)(22×260mm×1.5mm厚;Whatman)、所述含标记抗体的玻璃纤维片层(2)和样品板(1)(15×260mm×1.0mm厚;滤纸,Whatman)用粘合剂粘合起来,然后切成5mm宽。
这样制备的固相支持物置于塑料保护罩的底部(8),将具有进样口(9)和检测窗(10)的顶部(7)盖在固相支持物的上面,使顶部(7)稳定地置于底部(8)上面。实施例8 尿中抗-幽门螺旋杆菌抗体的测定
用实施例7构建的装置,测定3种尿样中的抗-幽门螺旋杆菌抗体,这三种尿样分别是幽门螺旋杆菌感染受试者的尿样、未感染幽门螺旋杆菌受试者的尿样、以及来自幽门螺旋杆菌感染受试者的抗体含量极度贫乏的尿样。
首先,将500μl尿样加入500μl样品稀释液[200mM Tris-Hcl缓冲液,0.14 M NaCl,2%酪蛋白,0.5%BSA,0.05%Tween 20,0.1%NaN3(pH7.3),E.coli LPS(Difco)50μl/ml],然后混合。将六滴(约150μl)制得的稀释液从实施例7构建的装置的进样口(9)滴入,使样品稀释液吸附到支持物上,然后静置20分钟。结果发现,当使用有效尿样时,检测窗(10)的对照区域出现粉红色或红色色带。相反,当使用抗体含量极度贫乏的无效尿样时,检测窗(10)的试验带和对照带都不出现颜色变化,表明该样品不能被评价。当样品是来自未感染幽门螺旋杆菌的受试者的有效尿样时,仅在检测窗(10)的的对照带出现粉红-红色色带,表明幽门螺旋杆菌感染的阴性试验(真阴性),而当存在幽门螺旋杆菌感染时,在检测窗(10)的试验带和对照带均出现粉红色-红色的色带,表明幽门螺旋杆菌的阳性试验。实施例9 尿中抗-幽门螺旋杆菌抗体的测定
(1)大肠杆菌成分的制备
将大肠杆菌(pvc18/JM109,Takara Shuzo)在含安苄青霉素的LB液体培养基(Luria-Bertani培养基,Nihon Seiyaku)中于37℃培养18小时,离心收集成熟细胞,然后用2份PBS清洗。然后,加入冷PBS至细胞终浓度为100mg/ml,用超声仪(10秒×3次)破碎并提取细胞。得到的上清液作为E.coli提取物蛋白。
(2)用上述(1)中制备的E.coli提取物蛋白替换E.coli LPS,加入实施例8的样品稀释液,重复实施例8的其它程序,测定尿样中抗-幽门螺旋杆菌抗体。结果得到如实施例8中描述的同样结果。实施例10
取经13C-UBT试验[肠胃病学杂志,33:6-13(1998)]确定为幽门螺旋杆菌感染-阳性的21位受试者和同样数目的幽门螺旋杆菌感染-阴性受试者(共42个病例)的全血、血浆和尿液,用实施例8中描述的程序测定样品中的抗-幽门螺旋杆菌抗体。
作为对照试验,用测定全血或血浆中幽门螺旋杆菌抗体的商品化的测定试剂盒分别测定上述同样受试者的样品,从得到的数据评价本发明装置的有效性。结果如图12所示。
在图12中,对照试剂盒A到H分别如下:
A:Helitest(由Cortecs Diagnostics生产)
B:H.pylori-Check-1(由Bio-Medical Products生产)
C:First Check H.pylori(由Worldwide Medical Corp生产)
D:Biocard Hilicobacter pylori IgG(由Anti Biotech Oy生产)
E:Insta Test H.Pylori(由Cortez diagnostics Inc.生产)
F:One Step H.Pylori Test(由Teco Diagnostics生产)
G:H.pylori SPOT(由International Immuno-Diagnostics生产)
H:Quick Stripe H.pylori(由Diatech Diagnostics Inc.生产)
在图12中,“特异性”指用各相应试剂盒测定经13C-UBT试验测定为阴性样品的阴性试验的百分数(阴性率),“灵敏度”指用各相应试剂盒测定经13C-UBT试验测定为阳性样品的阳性试验的百分数(阳性率)。
从图12的数据可以看出,本发明的抗体测定装置和固相测定方法不必说测定血液(全血,血浆)样品,甚至为应用尿样的测定提供了一种具有高度检测特异性和准确性的优秀测定系统。
从上述结果还可以清楚地看到,甚至当样品是安全方便的尿样时,本发明仍然能够高度灵敏、高度特异地检测抗体,因此在试验室检查中十分有用。实施例11 大肠杆菌成分在尿抗体测定中的效果
(1)用实施例8中构建的测定装置评价大肠杆菌成分在尿抗体测定中的效果。因此,取13C-UBT试验选定的幽门螺旋杆菌感染阳性和阴性受试者的尿样,用不含E.coli LPS(稀释液1)的样品稀释液系统和加入如表5所示的各种浓度的E.coli LPS的同样稀释液系统检测尿样中的抗-幽门螺旋杆菌抗体。通过光密度计(由ATTO制造)测量色带强度,评价试验带和对照带的色带形成状况。结果如表5所示。
表5
稀释液1 | E.coli LPS的添加水平(μg/ml) | ||||||
100 | 33.3 | 11.1 | 3.7 | 1.2 | |||
阳性尿液 | 对照带 | 50 | 51 | 43 | 36 | 41 | 45 |
试验带 | 68 | 66 | 62 | 61 | 61 | 67 | |
阴性尿液 | 对照带 | 26 | 26 | 22 | 18 | 23 | 23 |
试验带 | 12 | 0 | 0 | 0 | 13 | 12 |
发现当样品中加入11.1μg/ml或更高水平的E.coli LPS后,使用稀释液1时观察到的非特异性反应消失,因此排除了假阳性试验(检测误差)的可能。工业实用性
本发明提供了一种抗体测定方法,甚至在用抗体相对贫乏的尿样作为试样时,通过该方法都可以高度灵敏和高度特异地检测其中的特异于感染源的目标抗体。根据本发明的抗体测定方法,由于样品中的污染物造成的“假阳性”反应被显著抑制,从而获得高度准确可靠的测定结果。另外,本发明提供了对免疫毛细管分析法或免疫色谱分析法的改进,由此通过清楚地区分“假阴性”和“真阴性”之间的界限,准确地检测样品中是否存在目标抗体和目标抗体的含量。
Claims (32)
1.一种包括通过应用抗原-抗体反应检测样品中目标抗体的抗体测定方法,其特征在于在存在大肠杆菌成分的情况下,进行所述抗体和分析抗原之间的所述抗原-抗体反应。
2.按照权利要求1的抗体测定方法,其中所述大肠杆菌成分是选自大肠杆菌的可溶性组分和脂多糖组分中的至少一种。
3.按照权利要求1的抗体测定方法,其中所述大肠杆菌成分的应用的比例约为0.1-100μg/μg分析抗原。
4.测定抗体的方法,包括用三明治技术检测样品中的目标抗体,其特征在于使用对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的物质作为抗体测定试剂。
5.按照权利要求4的抗体测定方法,其中抗体测定试剂是Fc-特异性的抗-IgG抗体。
6.按照权利要求4的抗体测定方法,包括:样品中的目标抗体与固定在支持物上的所述抗体的固定化抗原偶联的抗原-抗体反应步骤,和由所述固定化抗原捕获的目标抗体与对抗体IgG的Fc区具有特异亲合力的抗体测定试剂反应的反应步骤。
7.按照权利要求6的抗体测定方法,其中抗原-抗体反应是在存在大肠杆菌成分的情况下进行的。
8.按照权利要求1或4的抗体测定方法,其中所述样品是尿样。
9.按照权利要求1或4的抗体测定方法,其中目标抗体是抗感染源的抗体。
10.按照权利要求1或4的抗体测定方法,其中感染源选自下列成分:人免疫缺陷病毒、肝炎病毒、风疹病毒、流感病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、Clamydia spp.、淋球菌、幽门螺旋杆菌和鼠弓形体。
11.按照权利要求1或4的抗体测定方法,其中抗原选自下列成分:细菌、病毒、原生动物和至少含有所述细菌、病毒或原生动物的抗原决定簇的细菌、病毒或原生动物组分。
12.按照权利要求1或4的抗体测定方法,其中抗原是微生物一幽门螺旋杆菌或至少含有所述微生物抗原决定簇的幽门螺旋杆菌组分。
13.一种抗体测定装置,包括固相支持物,该固相支持物至少具有(a)第一区,样品点样于其上,以及(b)第二区,试验样品中的抗体按照一定的顺序,即样品通过毛细管作用从第一区迁移到第二区的顺序在此反应;和用于检测第二区中的反应结果的标记工具,所述(b)第二区具有(i)一个试验带,其中用于捕获待测目标抗体的配体固定在此处;和(ii)一个对照带,其中用于捕获样品中任意抗体的配体固定在此处。
14.按照权利要求13的抗体测定装置,其中固定在试验带中的配体是针对样品中存在的目标抗体的抗原。
15.按照权利要求13的抗体测定装置,其中固定在对照带中的配体是能够捕获样品中任意抗体的抗-人免疫球蛋白抗体。
16.按照权利要求13的抗体测定装置,包括作为所述标记工具的将与目标抗体和任意抗体结合的标记配体。
17.按照权利要求13的抗体测定装置,其中标记工具是将与目标抗体和任意抗体结合的被标记配体,所述配体以如下方式可移动地承载在固相支持物第二区的上游,即在与样品接触后,该标记配体与目标抗体和任意抗体反应,分别形成目标抗体/标记配体复合物和任意抗体/标记配体复合物,然后这些复合物通过毛细管作用迁移到第二区,在此它们分别被固定在试验带和对照带上。
18.按照权利要求17的抗体测定装置,其中标记配体被承载在固相支持物第一区和第二区之间的区域上(示踪区)。
19.按照权利要求17的抗体测定装置,其中与目标抗体和任意抗体结合的标记配体是被标记的抗-人免疫球蛋白抗体。
20.按照权利要求19的抗体测定装置,其中抗-人免疫球蛋白抗体是对免疫球蛋白G的Fc区具有特异亲和力的抗IgG抗体。
21.按照权利要求13的抗体测定装置,其中固相支持物进一步在第一区和第二区的下游设有吸收区,以便从第一区迁移到第二区的样品进一步通过毛细管作用迁移到吸收区。
22.按照权利要求13的抗体测定装置,其中在第二区试验带上的目标抗体的偶联反应在存在大肠杆菌成分的情况下进行。
23.按照权利要求13的抗体测定装置,其中所述样品是尿样。
24.权利要求13到22中任一项的抗体测定装置用于测定在样品中存在的针对于感染源的目标抗体的应用。
25.按照权利要求24的应用,其中所述样品是尿样。
26.一种测定样品中目标抗体的固相检测方法,包括将样品施加到权利要求13的抗体测定装置的第一区,并在第二区的对照带显色的条件下,检测第二区试验带的颜色形成状况。
27.一种测定样品中的目标抗体的固相检测方法,包括将样品施加到权利要求20的抗体测定装置的第一区,并在第二区的对照带显色的条件下,检测第二区试验带的颜色形成状况。
28.按照权利要求26或27的测定目标抗体的固相检测方法,其中在抗体测定装置第二区试验带上进行的目标抗体的偶联反应是在存在大肠杆菌成分的情况下进行的。
29.按照权利要求26的测定目标抗体的固相检测方法,其中所述样品是尿样。
30.一种通过抗原-抗体反应来测定样品中抗体的抗体测定试剂盒,其特征在于所述抗体测定试剂盒含有大肠杆菌成分。
31.一种抗体测定试剂盒,其特征在于其中含有对目标抗体IgG的Fc区具有特异亲和力的物质作为抗体测定试剂。
32.一种含有权利要求13的抗体测定装置的抗体测定试剂盒。
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