TWI650557B - 紙製直流式檢測平台及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

一種用於免疫分析之紙製直流式檢測平台，係包括：檢測部；具一經酶標記蛋白之可移動之結合部；以及吸收部。本發明復提供其使用方法。透過結合摺疊及滑動之設計，本發明能減少檢體液用量及避免訊號干擾之問題，並提供一操作簡單、低成本、可長期儲存且具靈敏度之可攜式快篩平台，以符合用於定點照護的快速、簡化、穩定檢測之要求。

Description

紙製直流式檢測平台及其使用方法
本發明係關於一種檢測裝置及其使用方法，尤係關於一種直流式之檢測裝置及其使用方法。
為使能在醫療資源缺乏的發展中國家迅速控制疫情，全球醫界正積極投入“精準醫療”的開發，其中項目包括定點照護(point-of-care，POC)系統，而該系統應用於檢測用途，需符合世界衛生組織(WHO)之平價、靈敏性、專一性、穩定性、簡易操作、快速、不需大型設備且便於攜帶等標準要求。
微流體技術係透過元件微小化結合分析系統，其所需樣品及試劑用量較少，且具簡化操作及縮短分析時間等優勢，近年來已被廣泛應用於定點照護系統，其中，紙製之微流體平台結合酵素免疫分析法(immunoassay)，使檢測液以毛細現象流動至特定區段令其流體與平台表面產生抗體與抗原之專一性鍵結而固定，有利於定性或定量分析，極具經濟價值。
一般的紙製檢測平台主要為側流式，惟樣品流動路徑 長，且流經控制組與測試組之路徑相同，因此容易造成樣品無效體積多及控制組與測試組之訊號相互干擾之問題，加上呈色標記多使用金奈米粒子，訊號較弱影響辨識結果，致使無法定量檢測。
少數紙製檢測平台為直流式設計，雖能區別控制區與測試區解決流體干擾的問題，然而，該直流式檢測平台係以孔徑大小不一的組件膜控制其流體方向，是以，無法達到快速檢測及檢體液體積節約的要求。
有鑑於此，有必要提出一種快速檢測、減少檢體液體積、簡單操作及高穩定性的檢測平台，以解決習知技術所存在的問題。
為解決上述問題，本發明提供一種紙製直流式檢測平台，包括：檢測部，係具有測試區及控制區，用以接受具目標蛋白之檢體液；包括經酶標記蛋白之結合部，係可移動地設於該檢測部之上方，以令該結合部抽離或覆蓋於該檢測部之上方；以及吸收部，係具有多層結構並設於該檢測部下方，且該吸收部具有分別對應該測試區及該控制區之第一吸收區及第二吸收區。
本發明復提供上述之紙製直流式檢測平台之使用方法，係包括：使具目標蛋白之檢體液接觸該紙製直流式檢測平台之檢測部之測試區及控制區；將該結合部覆蓋於該檢測部上方，以清洗緩衝溶液沖滌該結合區，使該經酶標記蛋白與該檢測部之目標蛋白專一性結合，形成結合物； 加入受質，令該結合物呈現一顏色；以及由所呈現顏色之變化獲得檢測結果。
藉由結合摺疊及滑動之設計，使本發明之紙製直流式檢測平台能減少檢體液用量及避免控制區及測試區之流體干擾之問題，提升量測準確性，並透過穩定劑的添加延長儲存，足以符合世界衛生組織(WHO)對於定點照護之標準要求。
1‧‧‧紙製直流式檢測平台
10‧‧‧檢測部
11‧‧‧結合部
12‧‧‧吸收部
13‧‧‧窗部
14‧‧‧連接部
15‧‧‧拉引部
16‧‧‧頂部
51‧‧‧吸附蛋白
52‧‧‧牛血清蛋白
61、71‧‧‧目標蛋白
60、70‧‧‧檢體液
62、72‧‧‧清洗緩衝溶液
63、73‧‧‧受質
101‧‧‧測試區
101a‧‧‧具複數個羥基之測試區表面
101b‧‧‧具複數個羧基之測試區表面
101c‧‧‧具活性酯基之測試區表面
101d‧‧‧具胺基之吸附蛋白之測試區表面
102‧‧‧控制區
111‧‧‧經酶標記蛋白
121‧‧‧第一吸收區
120‧‧‧疏水性屏障
122‧‧‧第二吸收區
131、132、161、162‧‧‧孔隙
透過例示性之參考附圖說明本發明的實施方式：第1圖係本發明一具體實施例之紙製直流式檢測平台之摺疊結構示意圖；第2圖係本發明一具體實施例之紙製直流式檢測平台之展開結構示意圖；第3A及3B圖係本發明一具體實施例之紙製直流式檢測平台之實施態樣俯視圖；第4圖係依據本發明紙製直流式檢測平台之第一具體實施態樣之表面改質反應流程圖；第5圖係依據本發明紙製直流式檢測平台之第二具體實施態樣之表面改質反應流程圖；第6圖係依據本發明紙製直流式檢測平台檢測目標蛋白之第一具體實施態樣之使用方法流程圖；第7圖係依據本發明紙製直流式檢測平台檢測目標蛋白之第二具體實施態樣之使用方法流程圖；第8圖係依據本發明一具體實施例之紙製直流式檢測 平台設計之硬蠟印刷圖；第9A至9C圖係以X射線光電子光譜法(XPS)分析本發明一具體實施態樣之紙製直流式檢測平台之表面結構之能譜圖；第10圖係本發明一具體實施態樣之紙製直流式檢測平台檢測人類免疫球蛋白G抗原濃度和顏色變化之散佈圖；第11圖係本發明一具體實施態樣之紙製直流式檢測平台檢測於室溫環境下穩定劑之濃度對檢測活性訊號強度之變化圖，其中，每個時間點由左至右分別為比較實驗例1、實驗例2、實驗例3、實驗例4、實驗例5、實驗例6，且比較實驗例1於第5天時已近乎完全降解，未顯示信號強度；第12圖係本發明一具體實施態樣之紙製直流式檢測平台檢測於4℃環境下穩定劑之濃度對檢測活性訊號強度之變化圖，其中，每個時間點由左至右分別為比較實驗例2、實驗例7、實驗例8、實驗例9、實驗例10、實驗例11，且第75和90天因信號強度過低，未顯示比較實驗例2的信號強度；以及第13圖係本發明一具體實施態樣之紙製直流式檢測平台檢測於40℃環境下穩定劑之濃度對檢測活性訊號強度之變化圖，其中，每個時間點由左至右分別為比較實驗例3、實驗例12、實驗例13、實驗例14、實驗例15、實驗例16，且第2天因信號強度過低，未顯示比較實驗例3 的信號強度，第5天因信號強度的原因，僅顯示實驗例16的信號強度。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。此外，本文所有範圍和值都係包含及可合併的。落在本文中所述的範圍內之任何數值或點，例如任何整數都可以作為最小值或最大值以導出下位範圍等。
於本發明中，「目標蛋白」係指可受檢測平台所檢測之蛋白質。
於本發明中，「吸附蛋白」係指可與目標蛋白之結合物進行專一性結合之蛋白質。
於本發明中，「活性劑」係指帶有可與該目標蛋白反應之官能基之反應試劑。
於本發明中，「偶合反應」係指使兩獨立化學實體(例如羧甲基纖維素及該活性劑)結合成一化合物之反應過程。
於本發明中，「偶合劑」(coupling agent)係指該偶合反應之催化劑，例如羧甲基纖維素與該偶合劑反應後會形成不穩定之中間體；於偶合反應始末，其偶合劑之濃度不變。
依據本發明，係提供一種紙製直流式檢測平台，包括： 檢測部，係具有測試區及控制區，用以接受具目標蛋白之檢體液；包括經酶標記蛋白之結合部，係可移動地設於該檢測部之上方，以令該結合部抽離或覆蓋於該檢測部之上方；以及吸收部，係具有多層結構並設於該檢測部下方，且該吸收部具有分別對應該測試區及該控制區之第一吸收區及第二吸收區。
於一具體實施態樣中，吸收部係以蠟(Wax)形成疏水性屏障區隔該分別對應測試區及控制區之第一吸收區及第二吸收區之流體，以避免該測試區及該控制區之流體相互干擾。
形成所述之紙製直流式檢測平台之材質可為纖維素(cellulose)纖維或硝化纖維素(nitrocellulose)纖維，二者皆具多孔性，因此，其表面化學、光學性質及孔隙度對檢測平台之檢測能力亦至關重要。其中，該纖維素纖維係具有低毒性、親水性、低成本、生物可降解佳、生物相容性及孔狀結構且不溶於水及多數有機溶劑等優點，具體而言，該紙製直流式檢測平台係使用濾紙或層析紙為主要材料。又，該硝化纖維素係部分纖維素經硝化反應而成，該硝化反應可強化纖維素的多孔性，由於其表面經硝化後轉為疏水性，可使蛋白質直接與硝化纖維之硝基形成氫鍵，令蛋白質固定於該硝化纖維之表面上，不易脫附。
所述之經酶標記蛋白係指利用酵素標記該蛋白，使其具有呈色的功能，方便使用者判斷檢測結果。該經酶標記蛋白之酵素係可選自山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶 (calf intestine alkaline phosphatase)及半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)。此外，於結合部之經酶標記蛋白以靜電吸附方式暫留，因此，可藉由其他試劑脫附結合部表面並移動。
於一具體實施態樣中，該經酶標記蛋白為具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體。
於另一具體實施態樣中，該具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體於結合部之建議含量範圍為0.01至0.3微克。
於又一具體實施態樣中，該具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體於結合部之含量為0.2微克。
所述之檢測部復包括表面活性劑，以調節紙製直流式檢測平台材料之親疏水性質，達控制流體流速之效果。
於一具體實施態樣中，所述之紙製直流式檢測平台復包括與該結合部和檢測部連接之連接部；以及與該結合部連接且具有對應該測試區及控制區的二孔隙之窗部，俾於自該檢測部之上方抽離該結合部時，使該窗部覆蓋於該檢測部之上方。
請參閱第1圖及第2圖，係分別說明本發明紙製直流式檢測平台之摺疊結構及展開結構，紙製直流式檢測平台1包括：檢測部10，係具有在同一面上間隔地設置的測試區101及控制區102；包括經酶標記蛋白之結合部11，係可移動地設於該檢測部10之上方，以令該結合部11抽離或覆蓋於該檢測部10之上方；吸收部12，係具有多層結 構並設於該檢測部10下方，且該吸收部12具有分別對應該測試區101及該控制區102之第一吸收區121及第二吸收區122；與結合部11連接之窗部13，係含有對應測試區101及控制區102的二孔隙131、132，俾於自該檢測部10之上方抽離該結合部11時，使該窗部13覆蓋於該檢測部10之上方；連接部14，係連接結合部11與檢測部10；拉引部15，視需要地形成在該窗部13之一側邊，用以握持，以供在該檢測部10上方抽換成該結合部11及該窗部13；以及頂部16，係連接該檢測部10，且含有對應測試區101及控制區102的二孔隙161、162，方便使用者滴加檢體液及試劑，並透過上述孔隙直接觀察其檢測結果。於製作前述吸收部12之一實施例中，係摺疊紙張，以形成一連續多摺之多層結構。此外，以蠟形成疏水性屏障120區隔該分別對應測試區101及控制區102之第一吸收區121及第二吸收區122，以吸收自測試區101及該控制區102流下之流體。前述檢測部10、結合部11、吸收部12、窗部13、連接部14及頂部16皆由紙製得，且在此實施例中，皆為具有四個側邊之矩形，以利於該吸收部12、連接部14及頂部16分別形成於該檢測部10的不同側邊。然而，在不同實施例中，並無限制各部形成的形狀和位置。
請參閱第3A及3B圖，係說明本發明紙製直流式檢測平台之實施態樣，第3A圖係圖示該窗部13覆蓋於該檢測部10之上方之實施態樣，且如第3A圖所示，此時頂部16係為於該窗部13上方。又，第3B圖係圖示該結合部11 覆蓋於該檢測部10之上方之實施態樣。
為使本發明之紙製直流式檢測平台可達可攜式定點照護之應用，其檢測平台表面蛋白經長期擺放易受潮而發生氧化、易構化及水解之現象，是以，如何長期保存該檢測平台係為重要議題。本發明所提供之紙製直流式檢測平台，該結合部或檢測部復包括穩定劑，其中，該穩定劑係可選自醣類、多元醇(polyols)、胺基酸或鹽類，以減緩蛋白質於保存期間內的變性。
於一具體實施態樣中，該穩定劑占該結合部之總組成之重量比例為大於0至30%。
於另一具體實施態樣中，所述之穩定劑為醣類，藉由該醣類做為惰性基質抑制結合部及檢測部其中的所有蛋白質分子的移動，減緩該蛋白質的降解，並提高該蛋白質變性的自由能。然而，該醣類之添加比例不宜過高，以避免檢測平台的呈色反應。
於一具體實施態樣中，該醣類係包括蔗糖、海藻糖或幾丁聚醣。
於另一具體實施態樣中，該穩定劑為蔗糖及海藻糖，且蔗糖的濃度為大於0至15%。
於一最佳實施態樣中，該穩定劑為蔗糖及海藻糖，其中，該蔗糖及海藻糖之重量比例為1：1，且該蔗糖的濃度為10%。
藉由穩定劑的添加，本發明之紙製直流式檢測平台可長期儲存仍不影響檢測效果，於一具體實施態樣中，該紙 製直流式檢測平台於室溫下之儲存期可達90天。
於一具體實施態樣中，該紙製直流式檢測平台於室溫下之儲存期可達30天，仍不影響檢測效果。
於另一具體實施態樣，該紙製直流式檢測平台於冷藏環境下(溫度約4℃)之儲存期為75天，仍不影響檢測效果。
於又一具體實施態樣，該紙製直流式檢測平台於40℃環境中之儲存期為2天，仍不影響檢測效果。
本發明所提供之紙製直流式檢測平台，該檢測部之測試區復包括一表面改質層。
於一具體實施態樣中，該表面改質層具式(I)結構之活性酯基：
請參閱第4圖，係說明本發明紙製直流式檢測平台之一具體實施態樣之表面改質反應流程圖，該檢測部之測試區為纖維素纖維之材質，具複數個羥基之測試區表面101a經羧甲基纖維素(Carboxymethyl Cellulose,CMC)改質後，形成具複數個羧基之測試區表面101b，接著，使用具(II)結構之化合物之偶合劑：
先與羧基形成不穩定之中間體，此中間體再經活性劑 N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)之氮原子進行親核攻擊使偶合劑離去，形成具式(I)結構之具活性酯基之測試區表面101c。
於另一具體實施態樣中，該表面改質層係包括聚乙二醇(PEG)。藉由塗佈聚乙二醇於檢測部之測試區表面，可達到抗沾黏的效果，避免非專一性貼附現象，進而降低背景值，提升檢測訊號質，增加靈敏度。
本發明所提供之紙製直流式檢測平台的一具體實施態樣中，該檢測部之測試區復包括一具胺基之吸附蛋白，用以專一性辨識該目標蛋白，屬三明治免疫分析法之應用。其中，該吸附蛋白之建議添加濃度為10至100微克/毫升，係由於過多的吸附蛋白容易因空間角度造成遮蔽效應，使部分接位遭相鄰之吸附蛋白遮住致使無法與目標蛋白有效結合；然而，吸附蛋白若含量過低，亦無法有效提升檢測平台之專一性。
請參閱第5圖，係說明所述之紙製直流式檢測平台之反應流程，該吸附蛋白51之胺基係與具活性酯基之測試區表面101c之活性酯基形成化學鍵結；接著，使用牛血清蛋白52覆蓋部分未鍵結之活性位，即形成具胺基之吸附蛋白之測試區表面101d，避免平台表面之活性位與目標蛋白直接鍵結反應，影響檢測結果，其中，該牛血清蛋白的濃度建議為1至5%。
於一具體實施態樣中，該吸附蛋白為人類免疫球蛋白G抗體，其中，該人類免疫球蛋白G抗體之建議含量範圍為5至200奈克。於另一具體實施態樣中，該人類免疫球 蛋白G抗體之含量為66奈克。
本發明復提供上述之紙製直流式檢測平台之使用方法，係包括：使具目標蛋白之檢體液接觸紙製直流式檢測平台之檢測部之測試區及控制區；將該結合部覆蓋於該檢測部上方後，以清洗緩衝溶液沖滌結合部，使經酶標記蛋白與該檢測部之目標蛋白專一性結合，形成結合物；加入受質，令該結合物呈現一顏色；以及由所呈現顏色之變化獲得檢測結果。
所述之目標蛋白包括抗體或抗原，於一具體實施態樣中，該目標蛋白具胺基與具活性酯基之紙製直流式檢測平台表面進行反應，即可在短時間內形成不可逆的化學鍵結，使目標蛋白不易再脫附。
所述之清洗緩衝溶液係包括牛血清蛋白及含有聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯之磷酸鹽緩衝溶液(Tween 20)，用以沖滌結合部及檢測部，使結合部之酶標記蛋白脫附，同時也去除檢測部中殘留的非專一性鍵結之物質，降低背景值對檢測結果的干擾，該清洗緩衝溶液的建議使用量為10至500微升，該清洗緩衝溶液的使用量不宜過多，以避免影響檢測結果降低訊號鑑別度。於一具體實施態樣中，該清洗緩衝溶液的建議使用量為100微升。
於一具體實施態樣中，經酶標記蛋白可為具山葵過氧化酶(HRP)之抗體，可與山葵過氧化酶進行酵素反應之受質係可選自碘化鉀(KI)、3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、3,3'-二氨基聯苯胺(DAB)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑 啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)及磷苯二胺二鹽酸鹽(OPD)所組成群組之其中一種，其中，3,3',5,5'-四甲基聯苯胺之毒性小，故可以3,3',5,5'-四甲基聯苯胺為受質進行呈色，其所表現的顏色為藍色，若檢體液中含有目標蛋白者，其藍色顯現可由肉眼觀測，若目標蛋白濃度極高，則受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺所呈現的藍色即呈深藍，由影像分析軟體可進一步分析其顏色深淺，並經標準化後，由該受質呈現的藍色深度可對應該目標蛋白的實際濃度，進一步達到定量的效果。
基於經酶標記蛋白與受質反應係為動態過程，由於一般呈色反應需透過反應終止試劑結束反應，本發明為求降低試劑用量，係利用時間控制決定檢測結果，於一具體實施態樣中，本發明之紙製直流式檢測平台在加入該受質5分鐘後，該結合物呈現該顏色。
為求使檢體液中的目標蛋白可快速擴散至有效結合位形成化學鍵結，溫度控制亦為一主要因素，適度的提升溫度可加速目標蛋白的移動及提高碰撞機率加速專一性鍵結反應。於一具體實施態樣中，該檢體液之溫度為25至40℃。然而，該檢體液之溫度亦不宜過高，避免造成目標蛋白變性及影響專一性鍵結能力。
請參閱第6圖，係說明本發明紙製直流式檢測平台檢測目標蛋白之第一具體實施態樣之使用方法流程，係包括：使紙製直流式檢測平台1調整為窗部13覆蓋於該檢測部10上方之狀態，透過該頂部16之孔隙161、162及窗部13 之孔隙131、132導入含目標蛋白61之檢體液60至下方該檢測部10之測試區101及控制區102，該目標蛋白61與檢測平台表面進行結合；以拉引部15抽換使該結合部11至覆蓋於該檢測部10上方後，以清洗緩衝溶液62沖滌結合部11，使經酶標記蛋白111與該檢測部之目標蛋白61專一性結合，形成結合物；以拉引部15抽換使該窗部13回復覆蓋於該檢測部10上方後，加入受質63，令該結合物呈現一顏色；以及由所呈現顏色變化獲得檢測結果。
於一具體實施態樣中，該目標蛋白為人類免疫球蛋白G抗原，該經酶標記蛋白可為具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體，以及該受質為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)。
應用本發明之紙製直流式檢測平台於人類免疫球蛋白G抗原之檢測，不僅偵測誤差小且提升檢測判斷之穩定性，亦可偵測更低濃度之人類免疫球蛋白G抗原濃度達0.1奈克/毫升(ng/ml)，檢體液樣品所需用量僅3微升，且濃縮整體檢測的操作時間至7.1分鐘，具快速、低樣品量和低成本等優點。
於另一具體實施態樣，本發明之紙製直流式檢測平台之測試區包括一具胺基之吸附蛋白。請參閱第7圖，係說明本發明紙製直流式檢測平台檢測目標蛋白之第二具體實施態樣之使用方法流程，係包括：使紙製直流式檢測平台1調整為窗部13覆蓋於該檢測部10上方之狀態，其中，該檢測平台之測試區表面為具胺基之吸附蛋白之測試區表 面101d，透過該頂部16之孔隙161、162及窗部13之孔隙131、132導入含目標蛋白71之檢體液70於下方該檢測部10之測試區101及控制區102，該目標蛋白71與具胺基之吸附蛋白之測試區表面101d之吸附蛋白51進行結合；以拉引部15抽換使該結合部11覆蓋於該檢測部10上方後，以清洗緩衝溶液72沖滌結合部11，使經酶標記蛋白111與該檢測部之目標蛋白71專一性結合，形成結合物；以拉引部15抽換使該窗部13回復覆蓋於該檢測部10上方後，加入受質73，令該結合物呈現一顏色；以及由所呈現顏色變化獲得檢測結果。
藉由結合摺疊及拉動之設計，使本發明之紙製直流式檢測平台能減少檢體液用量及避免控制區及測試區之流體干擾之問題，提升量測準確性，並透過穩定劑的添加延長儲存，足以符合世界衛生組織(WHO)對於定點照護之標準要求。
下述透過實施例對本發明做進一步詳細說明。
紙製直流式檢測平台之製備實施例1：
取纖維素試紙作為基材，將設計好的圖形(如第8圖所示)以印刷機(Wax Printer)將固態狀硬蠟印刷至該試紙上，利用加熱板120℃加熱1分鐘使蠟塊熔融滲入纖維中形成疏水性屏障，經再固化後，於試紙表面形成包括具方型親水區域之吸收部12、具二圓形親水區域的檢測部10、結合部11、窗部13及頂部16，該檢測部10表面之二個圓形親水區域之直徑約為5毫米，令此為測試區101及控制區102, 並於試紙之窗部13及頂部16之圓形親水區域以打孔機製造孔隙131、132、161、162，且該孔隙131、132、161、162係對應其檢測部10之測試區101及控制區102。
首先，先以二次蒸餾水配置25毫莫耳濃度之氯化鈣溶液並加熱，再將0.005克的羧甲基纖維素置入10毫升之上述氯化鈣溶液，所述之羧甲基纖維素之單位葡萄糖殘基(anhydroglucose unit)具有0.7個羧甲基，且其重均分子量為250,000；以加熱板升溫至40℃並攪拌15分鐘，使羧甲基纖維素完全溶解，配置成濃度0.5重量%的羧甲基纖維素溶液，再放置於室溫中冷卻。
將配好的羧甲基纖維素溶液塗佈於該測試區進行表面改質反應，經反應20分鐘後，再以加熱板乾燥，其乾燥條件為40℃，形成表面改質層。
接著，再使用0.1莫耳濃度之1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)及0.4莫耳濃度的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)於10毫莫耳濃度之醋酸鈉及醋酸緩衝溶液(常溫25℃下pH值為5.2±0.1)中配置溶液，經攪拌10分鐘後，復塗佈於上述測試區進行反應，經反應30分鐘後以0.1莫耳濃度的乙醇胺清洗以淬息反應，再以加熱板乾燥，其乾燥條件為40℃，即完成具活性酯基之紙製直流式檢測平台。
透過X射線光電子光譜法(XPS)分析該檢測平台表面，如第9A至9C圖所示，經比較分析其表面改質前後之紙製直流式檢測平台表面，可見碳(C1s)及氧(O1s)元素的訊號 強度增強，且經改質後出現氮(N1s)元素的訊號峰，故確認該檢測平台之改質已成功產生活性酯基。
接著，使人類免疫球蛋白G抗體與測試區表面之活性酯基形成化學鍵結固定於上述之測試區表面，用以專一性辨識該目標蛋白，其中，該人類免疫球蛋白G抗體(Anti-HIgG Fab specific)溶液係以磷酸鹽緩衝溶液稀釋至濃度為22微克/毫升再做使用，且注入3微升於測試區表面後需乾燥其測試區表面，該乾燥溫度為40℃且乾燥時間為4分鐘。又，使用未含有聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯之磷酸鹽緩衝溶液(Tween 20)之1至5%牛血清蛋白(BSA)溶液覆蓋部分未鍵結之活性位後，即得一具66奈克之人類免疫球蛋白G抗體固定之測試區表面。
另一方面，使具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體暫留於上述之結合部表面，其中，該具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體(Anti-HIgG-HRP)溶液係以磷酸鹽緩衝溶液稀釋至濃度為66.5微克/毫升再做使用，且注入3微升於測試區表面後需乾燥其測試區表面，該乾燥溫度為40℃且乾燥時間為4分鐘，該結合部表面含有該具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體之含量為0.2微克。
此外，上述之控制區表面並未進行表面改質及抗體固定。
實驗例1：人類免疫球蛋白G抗原之檢測
首先，分別配置一個空白溶液及七個濃度介於0.01至 10奈克/毫升之人類免疫球蛋白G(HIgG)抗原溶液3微升作為檢測標準溶液，於25℃溫度下逐步注入上述製備實施例1之紙製直流式檢測平台。
接著，以含有Tween 20及5% BSA的磷酸鹽緩衝溶液作為清洗緩衝溶液，用微量吸量管將該清洗緩衝溶液導入100微升於控制區及測試區後，待其乾燥，再導入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)進行酵素反應5分鐘呈色後，以顯微鏡擷取影像，並以影像分析軟體分析顏色變化。
請參閱第10圖，係依據本實驗例之人類免疫球蛋白G抗原濃度和顏色變化之散佈圖，當G型人類免疫球蛋白抗原濃度越高，則藍色呈色越趨明顯。由實驗結果可見，本實施例的動態線性範圍(最佳檢測範圍)為0.03至1奈克/毫升(R2=0.99)，且各濃度檢測誤差小，並求得最小偵測極限(LOD)為0.1奈克/毫升。
實驗例2：儲存期評估測試
準備數個上述製備實施例1之紙製直流式檢測平台，於該結合部滴加3微升之含有10%的海藻糖溶液作為穩定劑，再置於-20℃環境下24小時後，置於凍乾瓶內並移至冷凍乾燥機，使該檢測平台表面之液滴昇華成氣態，破真空後將具穩定劑之檢測平台放入夾鏈袋中，置放於室溫環境下(溫度約25℃)儲存，於第0、1、2、5、10、15、30、45、60、75、90、105及120天後，分別取出該檢測平台，直接於結合部滴入3微升之TMB進行酵素反應5分鐘，觀察其呈色效果並評估該檢測平台之儲存期。
其中，該紙製直流式檢測平台之檢測活性訊號強度係由呈色的藍/紅比值(B/R值)代以下式而得： 其檢測平台各別的檢測活性訊號強度之變化係如第11圖所示。
實驗例3至6：儲存期評估測試
實驗例3至6之處理方法同實驗例2，惟，異動穩定劑之組成如表1所示，並評估不同穩定劑組成對該檢測平台之儲存期之影響如第11圖所示。
實驗例7至11：儲存期評估測試
實驗例7至11之處理方法同實驗例2，惟，異動放置環境溫度為4℃及穩定劑之組成如表1所示，並評估不同穩定劑組成對該檢測平台之儲存期之影響如第12圖所示。
實驗例12至16：儲存期評估測試
實驗例12至16之處理方法同實驗例2，惟，異動放置環境溫度為40℃及穩定劑之組成如表1所示，並評估不同穩定劑組成對該檢測平台之儲存期之影響如第13圖所示。
比較實驗例1至3：儲存期評估測試
比較實驗例1之處理方法同實驗例2，惟，未添加穩定劑於該結合部，以及異動其放置環境溫度如表1，並評估不同穩定劑組成對該檢測平台之儲存期之影響。
由第11圖可見，於室溫中，未添加任何穩定劑之比較實驗例1於第5天時已近乎完全降解，而實驗例3至6仍能維持80%以上的檢測活性訊號強度，隨著添加穩定劑的濃度增加，該結合部之經酶標記蛋白的降解程度亦隨之趨 緩，實驗例3之儲存期約10天，實驗例4及實驗例5之儲存期約30天，實驗例6之儲存期約5天。
由第12圖可見，於4℃環境中，未添加任何穩定劑之比較實驗例2於第75天時已近乎完全降解，而實驗例9至11仍能維持80%以上的檢測活性訊號強度，隨著添加穩定劑的濃度增加，該結合部之經酶標記蛋白的降解程度亦隨之趨緩，其中，實驗例9至11之儲存期皆為75天。
由第13圖可見，於40℃環境中，未添加任何穩定劑之比較實驗例3於第2天時已近乎完全降解，而實驗例15仍能維持80%以上的檢測活性訊號強度。
因此，使用蔗糖及海藻糖，且重量比例為1：1作為穩定劑，所製之紙製直流式檢測平台的檢測穩定性佳，儲存期較長，為最佳實施態樣。
綜上所述，本發明藉由結合摺疊及滑動之設計，使該紙製直流式檢測平台能減少檢體液用量及避免控制區及測試區之流體干擾之問題，提升量測準確性，並透過穩定劑的添加延長儲存，足以符合世界衛生組織(WHO)對於定點照護之標準要求。
上述實施例僅為例示性說明，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發明之權利保護範圍係由本發明所附之申請專利範圍所定義，只要不影響本發明之效果及實施目的，應涵蓋於此公開技術內容中。

Claims (24)

  1. 一種紙製直流式檢測平台，係包括：檢測部，係具有測試區及控制區，用以接受具目標蛋白之檢體液；包括經酶標記蛋白之結合部，係可移動地設於該檢測部之上方，以令該結合部抽離或覆蓋於該檢測部之上方；以及吸收部，係具有多層結構並設於該檢測部下方，且該吸收部具有分別對應該測試區及該控制區之第一吸收區及第二吸收區，且該吸收部係以蠟(Wax)區隔該第一吸收區及第二吸收區之流體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，形成該紙製直流式檢測平台之材質為纖維素纖維或硝化纖維素纖維。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，復包括與該結合部和檢測部連接之連接部；以及與該結合部連接且具有對應該測試區及控制區的二孔隙之窗部，俾於自該檢測部之上方抽離該結合部時，使該窗部覆蓋於該檢測部之上方。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該經酶標記蛋白為具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該具山葵過氧化酶(HRP)之人類免疫球蛋白G抗體於該結合部之含量為0.01至0.3微克。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該結合部或該檢測部復包括穩定劑。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該穩定劑為醣類。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該醣類係包括蔗糖、海藻糖或幾丁聚醣。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該結合部復包括穩定劑，且該穩定劑占該結合部之總組成之重量比例為大於0至30%。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該穩定劑為蔗糖及海藻糖，且其中，該蔗糖的濃度為大於0至15%。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該蔗糖的濃度為10%，且蔗糖及海藻糖之重量比例為1：1。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該紙製直流式檢測平台於室溫下之儲存期為90天。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該測試區復包括表面改質層。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該表面改質層具式(I)結構之活性酯基：
  15. 如申請專利範圍第13項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該表面改質層係包括聚乙二醇(PEG)。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該目標蛋白係包括抗體或抗原。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該目標蛋白為人類免疫球蛋白G抗原。
  18. 如申請專利範圍第1項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該測試區復包括具胺基之吸附蛋白，用以專一性辨識該目標蛋白。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該具胺基之吸附蛋白為人類免疫球蛋白G抗體。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之紙製直流式檢測平台，其中，該測試區中，該人類免疫球蛋白G抗體之含量為5至200奈克。
  21. 一種如申請專利範圍第1項之紙製直流式檢測平台之使用方法，包括：使具目標蛋白之檢體液接觸該紙製直流式檢測平台之檢測部之測試區及控制區；將該結合部覆蓋於該檢測部上方，以清洗緩衝溶液沖滌該結合區，使該經酶標記蛋白與該檢測部之目標蛋白專一性結合，形成結合物；加入受質，令該結合物呈現一顏色；以及由所呈現顏色之變化獲得檢測結果。
  22. 如申請專利範圍第21項之紙製直流式檢測平台之使用方法，其中，加入該受質5分鐘後，該結合物呈現該顏色。
  23. 如申請專利範圍第21項之紙製直流式檢測平台之使用方法，其中，該檢體液之溫度為25至40℃。
  24. 如申請專利範圍第21項之紙製直流式檢測平台之使用方法，其中，該目標蛋白之最小偵測極限為0.1奈克/毫升(ng/ml)。
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