CN114166918B - 一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明构建一种检测平台既能够高效完成多步前处理步骤，又能够及时对孔雀石绿MG总量进行高灵敏测定。有益效果：本发明所述的纸基传感器集样本前处理和检测为一体，可一步法实现水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的快速高灵敏度测定。该方法利用低共熔试剂可一步法实现目标物的提取及油脂的去除。同时，本发明构建的纸基传感器具有无需复杂前处理、样本需求量少(20uL)、便携(纸基传感器尺寸：3×3cm)、成本低、易批量生产等优点。
Description
技术领域
本发明属于食品污染物快速检测领域，涉及一种集成样品前处理和检测的纸基集成传感器在水产品中孔雀石绿总量的检测应用。
背景技术
孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷型绿色染料，自20世纪30年代以来在世界范围内作为杀菌和杀虫寄广泛用于水产养殖业，对于鱼、虾等多种水产的常见病如水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等有良好的治疗效果。孔雀石绿进入鱼体后迅速还原代谢为隐色孔雀石绿(LMG)。大量研究表明MG及其代谢物在人体内具有高残留、致畸、致癌及致突变等危害，其在全世界范围内相继被列为水产业禁用药物。然而，由于MG价格低廉，效果优异，目前仍有许多MG滥用的事件发生。国际相关管理组织要求检测方法能够一次性测定MG和LMG总量，并且最高检出限不得超过2ng/g。因此，水产品中孔雀石绿及其代谢产物的高灵敏度测定非常重要。
传统的MG检测方法包含高效液相色谱结合紫外及荧光检测器技术(HPLC-VIS/FL)、液相色谱联合质谱技术(LC-MS)，上述方法可实现孔雀石绿及其代谢产物总量的同时测定，具有较高的精确度，可作为金标准对其他新方法进行评估。然而，一些内在缺点如仪器体积大、昂贵，需要专业人员操作，耗时等大大降低了大量样本筛查的检测效率。为了提高检测效率、降低成本、更好地满足样本快速筛查的需求，研究工作者提出了多种性能优异的检测技术，如基于抗体的检测方法(酶联免疫吸附分析和免疫层析试纸条)，基于电化学的检测技术(修饰电极直接用于MG检测，修饰抗体和DNA/RNA等探针间接MG测定)，基于光学的检测技术(荧光传感器和表面增强拉曼技术)等，上述方法均具有较高的灵敏度、并且显著降低了检测成本和缩短了分析时间。然而，大部分检测技术需要复杂的前处理过程(pH调节、过滤、蒸发、复溶等)或者仅用于简单水质样本(养殖水和湖水等)的MG的检测。总之，繁琐的前处理步骤是限制上述方法广泛应用的主要因素。目前大部分研究主要关注于如何提高方法的灵敏度，很少研究学者考虑如何简化复杂的样品前处理步骤，并将前处理和检测集成化实现水产品中MG总量的一步法检测。
纸基检测技术由于其低成本和易于批量生产，已成为化学/生物传感器的通用平台。纸具有广泛的灵活性，可裁剪成具有复杂萨内结构的形状，这是刚性材料很难实现的功能。折纸技术可以将整个设备人为划分为不同的功能模块，从而将多步实验步骤(预处理、传感和读出)整合到一个“纸基实验室”中。研究工作者开发了多种不同的纸基检测技术用于复杂样本(全血样本)的快速分析。因此，纸基检测平台可能满足我们的需求，将孔雀石绿总量定量检测的多步实验步骤整合在同一平台。目前，据相关调研，由于水产品中孔雀石绿的前处理步骤不仅需要多种试剂参与，而且需要繁琐的仪器(振荡器、氮吹仪等)，上述缺点限制了纸基微全分析在水产品中孔雀石绿及其代谢产物的快速检测中的应用。
发明内容
本发明目的是构建一种检测平台既能够高效完成多步前处理步骤，又能够及时对MG总量进行高灵敏测定。
本发明提出了一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，包括如下步骤：
1)孔雀石绿及其代谢产物的提取及油脂的去除：利用低共溶试剂作为提取剂对鱼肉或虾肉中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿进行提取，同时与油脂分层，实现油脂的快速去除；
2)纸基集成传感器的构建：所述传感器包含3层经石蜡处理的滤纸，每层滤纸中心具有圆形亲水区，从上至下，第1层亲水滤纸替换成聚酯纤维，第二层亲水滤纸替换成氧化剂修饰的聚酯纤维，第三层亲水滤纸表面固定修饰MG抗原的碳糊丝网印刷电极材料，将上述组装的三层滤纸进行层层折叠，最终构建一步法实现蛋白去除、隐色孔雀石绿氧化，孔雀石绿总量检测的快速检测平台；
3)孔雀石绿及其代谢产物总量的检测：取第1)步去除油脂的样品溶液与乙腈混合直接滴加到步骤2)得到的传感器第1层的聚酯纤维区，实现蛋白杂质的快速去除，滤液渗透至第2层与氧化剂反应，样本溶液中隐色孔雀石绿被转化成孔雀石绿；移除第1层滤纸，将碱性磷酸酶标记的MG抗体(ALP-Ab)溶液滴加至第二层聚酯纤维处，并利用渗透作用将ALP-Ab与氧化产物-孔雀石绿转移至第3层滤纸上的碳糊丝网印刷电极(CPE)表面，最后通过免疫竞争法及循环伏安法测定实现MG的快速测量。
优选的，所述步骤1)MG的提取和油脂去除的操作步骤如下：
(1)提取液制备：甜菜碱与乙二醇按照摩尔比1:5进行配制，超声30min溶解；
(2)样本提取：1.0g鱼肉样本与1.5mL提取液混合，震荡5min，4000rpm离心10min，取中层液体备用。
优选的，所述低共溶试剂是甜菜碱与乙二醇混合液，甜菜碱与乙二醇按照摩尔比1:5进行配置，超声30min溶解。
优选的，其特征在于：所述氧化剂是二氯二氰基苯醌(DDQ)DDQ，DDQ可将LMG转化成MG，实现MG总量的一次性测定。
优选的，步骤2)所述纸基集成传感器的具体组装步骤如下：1层：将亲水区的滤纸剪除，1cm×1cm的聚酯纤维纸片利用双面胶粘贴于滤纸背面亲水区位置；2层：亲水区的滤纸剪除，氧化剂修饰的的1cm×1cm聚酯纤维纸片利用双面胶粘贴于2层滤纸背面亲水区位置；3层：将修饰MG抗原的碳糊丝网印刷电极材料粘贴于3层亲水区位置，随后，将1，2，3层按照由上到下的方式折叠组装，储存于4℃备用。
优选的，所述纸基集成传感器检测MG及其代谢产物总量的操作步骤如下：
①20μL不同浓度LMG溶液与2μL乙腈混合滴加于折叠后的1层亲水区，室温避光反应15min；
②20μL生物素biotin修饰的孔雀石绿抗体Ab与链霉亲和素-碱性磷酸酶的混合液滴加于2层亲水区，37℃孵育0.5h，Ab-biotin制备方法：Ab与biotin按摩尔比1:20混合于PBS中振荡反应30min,超滤收集，-20℃保存备用；
③将1和2层滤纸剪去，PBS缓冲液冲洗CPE 3次，滴加100μL ALP底物溶液(0.1mMAPP与2mM NADH混合液)，37℃孵育10min,最后利用循环伏安法进行信号测定。APP是对氨基苯酚磷酸，NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide)是一种化学物质，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ。
优选的，所述不同浓度LMG溶液是LMG与CN按体积比10:1混合液，得到0.1,0.5,1,5,10,20,50,100ppb系列浓度。
优选的，所述20μL生物素(biotin)修饰的孔雀石绿抗体(Ab)与链霉亲和素-碱性磷酸酶(SA-ALP)的混合液是将SA-ALP稀释250倍后与200μg/mL Ab-biotin混合。
所述聚酯纤维纸片为上海金标提供，可作为去除红细胞或大颗粒物的滤膜，也可将试剂经过干燥处理储存于纤维中。
所述DDQ为上海吉至生化科技有限公司，是一种强氧化剂，常用于隐色孔雀石绿的氧化。
所述丝网印刷电极其工作电极和对电极为碳糊，参比电极为AgCl，由青岛波碳科技有限公司提供，通过对工作电极修饰孔雀石绿抗原利用免疫竞争法对样本中孔雀石绿进行检测。
有益效果：本发明所述的集样本前处理和检测为一体的纸基传感器可一步法实现水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的快速高灵敏度测定。该方法利用低共熔试剂可一步法实现目标物的提取及油脂的去除。同时，本发明构建的纸基传感器具有无需复杂前处理、样本需求量少，仅需20uL、便携(纸基传感器尺寸：3×3cm)、成本低、易批量生产等优点，能够实现“样品进-结果出”的模式，非常适用于食品复杂基质中痕量污染物的快速检测，对食品安全突发事件的快速筛查具有重要意义。
附图说明
图1纸基传感器的组装示意图；
图2纸基传感器检测组织样本中孔雀石绿及其代谢产物的流程图
图3样本溶液中油脂和蛋白质杂质的去除，(A)：低共熔试剂与花生油分层结果；(B)低共熔试剂与油脂的分层结果
图4样本溶液中蛋白质的去除表征(A)聚酯纤维纸去除样本中蛋白质的示意图；(B)扫描电子显微镜对添加样本后的第一层和第二层聚酯纤维纸表面形貌表征图。
图5DDQ对LMG氧化效率表征(A)DDQ对LMG的氧化可视化结果；(B)紫外表征DDQ氧化LMG的产物表征结果；(C)HPLC对DDQ氧化LMG的产物表征结果；(D)电化学循环伏安法对DDQ氧化LMG的产物表征结果。
图6(A)CPE检测MG示意图；(B和C)信号放大结果对比图；(D、E和F)CPE对不同浓度MG检测谱图及标准曲线结果。
具体实施方式
试剂仪器设备来源：
孔雀石绿抗原、抗体来自于山东绿都生物科技有限公司
孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品：上海吉至生化科技有限公司
生物素，链霉亲和素-碱性磷酸酶，明胶，牛血清白蛋白，还原辅酶I(NADH)，PBS片：北京索莱宝生物技术有限公司
聚酯纤维纸：上海金标生物科技有限公司
丝网印刷电极：青岛波碳科技有限公司
电化学工作站：CHI1040C，上海辰华仪器有限公司
二氯二氰基苯醌(DDQ)，乙腈(ACN，用于蛋白杂质沉淀)：阿拉丁试剂(上海)有限公司
对氨基苯酚磷酸(APP)、甲酸二茂铁(Fc-COOH，用于CPE修饰构建免疫传感器)：上海源叶生物科技有限公司
实施例1传感器组装
图1所示传感器组装过程：传感器包含3层经石蜡处理的滤纸，每层滤纸中心具有圆形亲水区，从上至下，第1层亲水区滤纸替换成聚酯纤维，第二层亲水区滤纸替换成氧化剂修饰的聚酯纤维，第三层亲水区滤纸表面固定修饰孔雀石绿抗原的碳糊丝网印刷电极材料，将上述组装的三层滤纸进行层层折叠，最终构建一步法实现蛋白去除、隐色孔雀石绿氧化，孔雀石绿总量检测的快速检测平台。
实施例2样本提取及油脂和蛋白杂质的去除
本发明所述低共熔试剂样本提取和油脂去除的应用及聚酯纤维在蛋白杂质的滤除中的应用
所述样本提取及油脂和蛋白杂质的去除操作步骤如下：
1)提取液制备：甜菜碱与乙二醇按照摩尔比1:5进行配置，超声30min溶解；
2)样本提取：1.0g鱼肉样本(肉泥)与1.5mL提取液混合，震荡5min，4000rpm离心10min，取中层溶液备用；
3)提取液中蛋白去除：100μL提取液与10μL乙腈混合，随后将混合液滴加到聚酯纤维表面进行蛋白滤除。
4)油脂去除和蛋白滤除效果表征：对提取后的溶液进行拍照，利用扫描电子显微镜对蛋白滤除前后的聚酯纤维表面进行了表征，结果如图3和图4。
实施例3提取样本中LMG的高效转化
本发明所述纸基传感器第2层聚酯纤维区在提取液中LMG氧化中的应用
所述LMG氧化的操作步骤如下：
(1)DDQ的配制：称取一定量DDQ粉末溶于乙腈中配成10mM的储备液，用乙腈稀释储备液至200μM，备用；
(2)氧化剂纸片的制备：将聚酯纤维裁剪成1cm×1cm尺寸的纸片，滴加50μL DDQ溶液(200μM)至其表面，室温晾干备用；
(3)LMG的氧化：利用实施例1中的提取液配制1mg/mL LMG，取50μL LMG溶液滴加至氧化剂纸片表面，避光反应20min；
(4)LMG氧化产物的表征：对氧化前后的溶液、聚酯纤维纸片可视化，收集氧化溶液对其进行紫外吸收扫描、液相色谱和循环伏安法检测，结果如图5。
实施例4MG的检测灵敏度分析
本发明所述集成化纸基传感器对MG标准品检测中的应用所述纸基传感器检测LMG的操作步骤如下：
(1)丝网印刷电极的修饰：首先，100μL壳聚糖(5mg/mL，2％冰乙酸溶解)电聚合于电极表面(电聚合参数：-0.15-0.2V，扫描20圈，扫描速度：20mV/s)其次，10μLAuNPs(1％氯金酸还原制备所得原液)与10μL Fc-COOH(4mM,乙醇溶解)混合滴加至工作电极，4℃静置过夜，备用；随后，10μL孔雀石绿抗原(200μg/mL)滴加至工作电极表面，37℃孵育1h,PBS缓冲液清洗电极3次；最后，10μL 1％明胶与1％BSA混合液(PBS溶)滴加至工作电极37℃孵育0.5h,PBS缓冲液清洗电极3次，储存于4℃备用。
(2)集成化纸基电化学免疫传感器制备：1层：将亲水区的滤纸剪除，1cm×1cm的聚酯纤维纸片利用双面胶粘贴于滤纸背面亲水区位置；2层：亲水区的滤纸剪除，含有DDQ的聚酯纤维纸片(1cm×1cm)利用双面胶粘贴于2层滤纸背面亲水区位置；3层：将修饰后的CPE粘贴于3层亲水区位置，随后，将1，2，3层按照图1方式折叠组装，储存于4℃备用。
(3)纸基电化学免疫传感器检测MG：①20μL不同浓度MG(提取液溶解，0.1,0.5,1,5,10,20,50,100ppb)溶液滴加于1层亲水区，室温避光反应20min；②20μL生物素(biotin)修饰的孔雀石绿抗体(Ab)与链霉亲和素-碱性磷酸酶的混合液(SA-ALP稀释100倍后与100μg/mLAb-B混合)滴加于1层亲水区，37℃孵育0.5h，Ab-biotin制备方法：Ab与biotin按摩尔比1:20混合于PBS中振荡反应30min,超滤收集，-20℃保存备用；③将1和2层滤纸剪去，PBS缓冲液冲洗CPE 3次，滴加100μLALP底物溶液(0.1mMAPP与2mM NADH混合液)，37℃孵育10min,最后利用循环伏安法进行信号测定。结果如图6。
实施例5水产品中MG及其代谢产物的测定
本发明所述集成化纸基传感器在水产品中MG及其代谢产物总量测定的应用
所述纸基传感器真实样本检测的操作步骤如下
(1)纸基电化学免疫传感器的组装与实施例3一致；
(2)真实样本的准备：5ppb和50ppb的LMG添加于1g鱼肉和虾肉样本中，室温静置30min，随后，5mL提取液添加至肉样中，振荡5min,4000rpm离心10min,储存于4℃备用；
(3)真实样本的检测：100μL样本提取液与10μL乙腈混合，取20μL混合液滴加于纸基传感器的第1层亲水区进行反应，后续检测与实施例3一致，检测结果与传统的LC-MS及ELISA进行对比，结果如表1：
表1
由表1可以看出本发明方法与传统方法相比检测结果具有一致性，表明本发明具有较高的准确度。然而，LC/MS与ELISA均需要不同程度的前处理过程，如提取、去脂、氧化、吹干、复溶等，且需要专业人员的操作，分析时间一般在2小时以上。本发明无需前处理，且无复杂操作流程，环境友好，且总体分析时间在1小时内能够完成，不仅简化实验流程，而且显著提高检测效率。本发明在大批量样品快速筛查中具有突出优势。
Claims (9)
1.一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
1)孔雀石绿及其代谢产物的提取及油脂的去除：利用低共溶试剂作为提取剂对鱼肉或虾肉中的隐性孔雀石绿和孔雀石绿进行提取，同时与油脂分层，实现油脂的快速去除；
2)纸基集成传感器的构建：所述传感器包含3层经石蜡处理的滤纸，每层滤纸中心具有圆形亲水区，从上至下，第一层亲水区滤纸替换成聚酯纤维，第二层亲水区滤纸替换成氧化剂修饰的聚酯纤维，第三层亲水区滤纸表面固定修饰孔雀石绿抗原的碳糊丝网印刷电极材料，将上述三层滤纸进行层层折叠，最终构建一步法实现蛋白去除、隐色孔雀石绿氧化，孔雀石绿总量检测的快速检测平台；
3)孔雀石绿及其代谢产物总量的检测：取第1)步去除油脂的样品溶液与乙腈混合直接滴加到步骤2)得到的传感器第1层的聚酯纤维区，实现蛋白杂质的快速去除，滤液渗透至第2层与氧化剂反应，样本溶液中隐色孔雀石绿被转化成孔雀石绿；
移除第1层滤纸，将碱性磷酸酶标记的孔雀石绿抗体ALP-Ab溶液滴加至第二层聚酯纤维处，并利用渗透作用将ALP-Ab与转化后的孔雀石绿转移至第3层滤纸上的碳糊丝网印刷电极表面，最后通过免疫竞争法及循环伏安法测定实现MG的快速测量。
2.根据权利要求1所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述步骤1)MG的提取和油脂去除的操作步骤如下：
(1)提取液制备：甜菜碱与乙二醇按照摩尔比1:5进行配制，超声30min溶解；
(2)样本提取：1.0g鱼肉样本与1.5mL提取液混合，震荡5min，4000rpm离心10min，取中层液体备用。
3.根据权利要求1所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述低共溶试剂是甜菜碱与乙二醇混合液，甜菜碱与乙二醇按照摩尔比1:5进行配置，超声30min溶解。
4.根据权利要求1所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于：所述氧化剂是DDQ。
5.根据权利要求1所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，步骤2)所述纸基集成传感器的具体组装步骤如下：1层：将亲水区的滤纸剪除，1cm×1cm的聚酯纤维纸片利用双面胶粘贴于滤纸背面亲水区位置；2层：亲水区的滤纸剪除，氧化剂修饰的的1cm×1cm聚酯纤维纸片利用双面胶粘贴于2层滤纸背面亲水区位置；3层：将修饰MG抗原的碳糊丝网印刷电极材料粘贴于3层亲水区位置，随后，将1，2，3层按照由上到下的方式折叠组装，储存于4℃备用。
6.根据权利要求1所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述纸基集成传感器检测MG及其代谢产物总量的操作步骤如下：
①20μL不同浓度LMG溶液滴加于折叠后的1层亲水区，室温避光反应15min；
②20μL生物素B修饰的孔雀石绿抗体Ab与链霉亲和素-碱性磷酸酶的混合液滴加于2层亲水区，37℃孵育0.5h，Ab-B制备方法：Ab与B按摩尔比1:20混合于PBS中振荡反应30min,超滤收集，-20℃保存备用；
③将1和2层滤纸剪去，PBS缓冲液冲洗CPE 3次，滴加100μLALP底物溶液，37℃孵育10min,最后利用循环伏安法进行信号测定。
7.根据权利要求6所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述不同浓度LMG溶液是LMG与蛋白沉淀剂ACN按体积比10:1混合液，得到0.1,0.5,1,5,10,20,50,100ppb系列浓度。
8.根据权利要求6所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述20μL生物素修饰的孔雀石绿抗体与链霉亲和素-碱性磷酸酶的混合液是将SA-ALP稀释250倍后与200μg/mLAb-Biotin混合。
9.根据权利要求6所述一种一步法检测水产品中孔雀石绿及其代谢产物总量的方法，其特征在于，所述ALP底物溶液是0.1mMAPP与2mM NADH混合液的混合液。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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