CN103743905A - 多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡 - Google Patents

Abstract

本发明是一种多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，包括在上外壳和下外壳之间设置上层、中间层和下层滤纸芯片、双面胶带和纸基滑动架，上层、中间层、下层滤纸芯片分别是具有亲水和疏水区域交替出现的蜡图案化滤纸芯片；上外壳本体上设有进样和加液窗口，上层滤纸芯片位于上外壳和双面胶带之间；中间层滤纸芯片位于双面胶带和下层滤纸芯片之间，其上具有呈阵列化分布的固定不同反应试剂的敏感区；纸基滑动架位于下层滤纸芯片和下外壳之间；上层、中间层滤纸芯片通过双面胶带粘接；下层滤纸芯片相对上层、中间层滤纸芯片在纸基滑动架上滑动，实现不同反应试剂在多层滤纸芯片之间的顺序流动；本发明为患者提供早期诊断的临床现场应用的器件。

Description

多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体地涉及一种能用于多肿瘤标志物联合检测的纸芯片酶联免疫测试卡。

背景技术

肿瘤标志物检测是近年来发展起来的一项肿瘤诊断的新手段，对于早期诊断、尤其是发现微转移有着独特的作用，但单一标志物的检测对肿瘤的诊断价值有限，而多指标联合检测可互补优缺点，提高阳性检出率。目前对多种肿瘤标志物的定量检测，主要依赖于传统的酶联免疫吸附法(ELISA)和化学发光酶联免疫法(CLIA)，要配备专用的试剂盒和免疫测定装置，涉及烦琐的溶液处理过程，消耗大量昂贵的抗体试剂，分析时间长且操作复杂，不利于实现多指标的临床现场快速检测应用。

微流控芯片是uTAS中当前最活跃的领域和发展前沿，它可以将多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成，能简化操作、增加分析速度和降低试剂消耗，有望为肿瘤标志物的定量检测提供简便快速有效的新方法和新器件。目前已有专利CN202083692U、CN202066861U等公开了基于微流控芯片的肿瘤快速诊断器件，可以分别用于测定胃癌、胰腺癌等癌症的多种肿瘤标志物；但这些微流控芯片仍是基于玻璃或塑料等构成的微通道，同时要集成多个检测电极，制作工艺复杂且成本较高。哈佛大学Whitesides小组以滤纸为基底材料构建了成本低的纸基微流控芯片(纸芯片)，并结合ELISA实现了对IgG的定量检测；济南大学于京华小组利用丝网印刷或蜡打印方式批量制作了阵列的纸芯片，结合CLIA实现了对癌胚抗原、PSA等肿瘤标志物的定量检测。与传统的酶联免疫分析法相比，这些纸芯片在检测成本、分析时间方面有明显改善，但在使用时仍需配备相应的试剂盒，给肿瘤诊断的临床现场应用带来不便。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种为肿瘤诊断提供适合临床现场应用的器件，且制作简单、灵敏度高、成本低的多肿瘤标志物联测用纸芯片测试卡。

(二)技术方案

为达到以上目的，本发明提供一种多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，包括上外壳、上层滤纸芯片、双面胶带、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片、纸基滑动架、以及下外壳，其上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片分别是具有亲水区域、疏水区域交替出现的蜡图案化滤纸芯片；在上外壳和下外壳之间设置上层滤纸芯片、双面胶带、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片和纸基滑动架，在上外壳本体设有进样窗口和加液窗口，上层滤纸芯片位于上外壳和双面胶带之间，中间层滤纸芯片位于双面胶带和下层滤纸芯片之间；中间层滤纸芯片上包括预先固定有不同反应试剂的多个敏感区；纸基滑动架位于下层滤纸芯片和下外壳之间；上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片通过双面胶带粘接为一体；下外壳的底部则开有与纸基滑动架对应的U形窗口，下层滤纸芯片相对上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片在纸基滑动架上滑动，以便实现不同反应试剂在多层滤纸芯片之间的顺序流动；所述上层滤纸芯片含有进样孔、疏水蜡区域和上层液流通道；所述双面胶带含有引流通道和多个引流孔；所述中间层滤纸芯片含有中间层液流通道和多个敏感区；所述下层滤纸芯片由多个测试孔和不同刻度线、手柄组成；进样窗口、进样孔、引流通道以及中间层液流通道均位于测试卡的左侧，且各中心垂直线沿测试卡的垂直竖向方向重合；上层液流通道是位于上层滤纸芯片的右侧区域上的梳子形液流通道，其梳背紧贴于加液窗口下方且两者的中心重合，其梳齿与双面胶带上的多个引流孔和中间层滤纸芯片上的多个敏感区沿测试卡的垂直竖向方向重合；在下层滤纸芯片上设置有多个测试孔、不同刻度线和手柄，测试孔紧贴于中间层液流通道下方且两者的中心重合，不同刻度线为平行于测试孔、用于标识下层滤纸芯片的滑动位置的多组虚线，手柄位于下层滤纸芯片上远离测试孔的一端。

(三)有益效果

该测试卡预先固定有不同酶联免疫反应试剂，使用时无需另外配备试剂盒，直接利用纸芯片的滑动来控制待测标志物与不同反应试剂的顺序接触和反应，通过结合便携式光学仪表，即可实现对多种肿瘤标志物的快速定量检测。

1、本发明在一个物理器件即纸芯片上集成了成熟的酶联免疫分析技术，将不同试剂预先固定在中间层滤纸芯片上，利用上层滤纸芯片的液流沟道和下层滤纸芯片的滑动来实现液体在多层滤纸芯片之间的顺序流动，不仅保留了酶联免疫分析的高特异和高灵敏度，还大大改善了酶联免疫分析在现场检测中的便携性和可操作性，利于拓展酶联免疫分析在肿瘤诊断检测中的现场应用。

2、采用喷蜡打印制作滤纸芯片图形的方式，可实现纸芯片酶联免疫测试卡关键部件的批量制作，降低了制作成本，提高了测试卡制备和检测的重复性。

3、本发明的纸芯片酶联免疫测试卡检测多种肿瘤标志物的方法，试剂耗样量少(几十微升)、灵敏度高(ng级)、操作快速简单、成本低，且检测结果由仪器自动读出，受主观因素影响小，便于现场检测应用。

本发明将纸芯片和酶联免疫分析方法相集成，为癌症患者的早期诊断提供适合临床现场应用的器件。

附图说明

图1为多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡的结构示意图。

图2A为本发明纸芯片酶联免疫测试卡在使用中下层滤纸芯片滑动相对于上层滤纸芯片和中间层滤纸芯片的位置变化。

图2B为本发明纸芯片酶联免疫测试卡在使用中液体流动的示意图。

图中部件符号说明：

1-上外壳，            2-上层滤纸芯片，      3-双面胶带，

4-中间层滤纸芯片，    5-下层滤纸芯片，      6-纸基滑动架，

7-下外壳，            8-进样窗口，          9-加液窗口，

10-进样孔，           11-疏水蜡区域，       12-上层液流通道，

13-引流通道，         14-引流孔，           15-中间层液流通道，

16-敏感区，              17-测试孔，           18-刻度线，

19-手柄，                20-U形窗口。

I-测试卡未使用时，下层滤纸芯片与中间层滤纸处于原始位置；

II-下层滤纸芯片的刻度线a与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐；

III-下层滤纸芯片的刻度线b与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐；

IV-下层滤纸芯片的刻度线c与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐；

V-下层滤纸芯片的刻度线d与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明示意图以三参数纸芯片酶联免疫测试卡为例，多测试体系可以依此类推增加纸芯片测试孔和敏感区阵列的数量。如图1为本发明三种肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡的结构示意图，包括上外壳1、上层滤纸芯片2、双面胶带3、中间层滤纸芯片4、下层滤纸芯片5、纸基滑动架6、以及下外壳7，上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4、下层滤纸芯片5分别是具有亲水区域、疏水区域交替出现的蜡图案化滤纸芯片；在上外壳1和下外壳7之间设置上层滤纸芯片2、双面胶带3、中间层滤纸芯片4、下层滤纸芯片5和纸基滑动架6，在上外壳1本体设有进样窗口8和加液窗口9，上层滤纸芯片2位于上外壳1和双面胶带3之间；中间层滤纸芯片4位于双面胶带3和下层滤纸芯片5之间；中间层滤纸芯片4上包括预先固定有不同反应试剂的多个敏感区16；纸基滑动架6位于下层滤纸芯片5和下外壳7之间；上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4通过双面胶带3粘接为一体，下外壳7的底部则开有与纸基滑动架6对应的U形窗口20，下层滤纸芯片5相对上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4在纸基滑动架6上滑动，以便实现不同反应试剂在多层滤纸芯片之间的顺序流动；所述上层滤纸芯片2含有进样孔10、疏水蜡区域11和上层液流通道12；所述双面胶带3含有引流通道13和多个引流孔14；所述中间层滤纸芯片4含有中间层液流通道15和多个敏感区16；所述下层滤纸芯片5由多个测试孔17和不同刻度线18、手柄19组成；所述进样窗口8、进样孔10、引流通道13以及中间层液流通道15均位于测试卡的左侧，且各中心垂直线沿测试卡的垂直竖向方向重合；上层液流通道12是位于上层滤纸芯片2的右侧区域上的梳子形液流通道，其梳背紧贴于加液窗口9下方且两者的中心重合，其梳齿与双面胶带3上的多个引流孔14和中间层滤纸芯片4上的多个敏感区16沿测试卡的垂直竖向方向重合；在下层滤纸芯片5上设置有多个测试孔17、不同刻度线18和手柄19，测试孔17紧贴于中间层液流通道15下方且两者的中心重合，不同刻度线18为平行于测试孔、用于标识下层滤纸芯片5的滑动位置的多组虚线，手柄19位于下层滤纸芯片上远离测试孔的一端。

所述测试卡在使用时，仅需在加液窗口加入稀释液，液体将会沿着梳子形液流通道渗至滤纸芯片的各敏感区中，随着下层滤纸芯片的滑动，敏感区中的不同试剂将与下层滤纸芯片上的待测抗原顺序地接触和反应，产生可定量检测的光学信号，此时结合便携的光学仪自动检测出各测试孔的光信号值，根据光强与抗原浓度间关系，即可实现对多肿瘤标志物的快速检测。

上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4、下层滤纸芯片5，均是以纤维素滤纸为载体，利用喷蜡打印机打印上设计图案、加热熔蜡而得到的含有不同亲、疏水区域图形的滤纸芯片。所述上层液流通道12是梳子形液流通道；所述进样孔10是亲水性的进样孔。所述多个敏感区16中各敏感区16呈阵列化分布，其上预先固定有不同反应试剂。

其中，上层滤纸芯片2为该测试卡的分液层，用于定点接受待测样本溶液和稀释液并进一步将溶液引流到中间层滤纸芯片4的亲水区域；其左侧区域分布有亲水性的进样口10，进样孔10与进样窗口8、引流通道13以及中间层液流通道的中心垂直线沿测试卡的垂直竖向方向重合；右侧区域则分布有梳子形的上层液流通道12，上层液流通道12的梳背部分紧贴于加液窗口9下方且两者的中心重合，上层液流通道12的梳齿部分与双面胶带3上的多个引流孔14和中间层滤纸芯片4上的多个敏感区16沿测试卡的垂直竖向方向重合，这样滴加的待测样本溶液和稀释液会分别在滤纸的毛吸作用下自动分流填充整个上层液流通道12。

中间层滤纸芯片4为该测试卡的敏感层，其左侧区域分布有与进样孔10对应的中间层液流通道15，用于将待测样本溶液进一步分流到下层滤纸芯片5的各测试孔17中；右侧区域分布有与上层滤纸芯片2的液流通道12对应的阵列的圆形敏感区16，其上预先固定有洗涤剂、酶标二抗和反应底物等酶联免疫反应试剂，用于将稀释液进一步分流到独立的各敏感区中，使得固定的反应试剂重新变成可流动的试剂溶液。

下层滤纸芯片5是由多个测试孔17和不同刻度线18、手柄19组成测试卡的测试条，其左侧分布多个独立的测试孔17，测试孔17紧贴于中间层液流通道15下方且两者的中心重合，其上预先固定有抗体试剂，用于为待测肿瘤标志物进行不同酶联反应提供反应场所；右侧分布有四组平行的刻度线18和手柄19用于控制下层滤纸芯片5的移动位置，其中，刻度线18为平行于测试孔的多组虚线，旁边印有a、b、c、d字母用来标识刻度线，手柄19位于下层滤纸芯片上远离测试孔的一端。

上述上层滤纸芯片2与中间层滤纸芯片4的尺寸完全一致，并且两者通过与中间层滤纸芯片4相同图案的双面胶带3粘接起来，而下层滤纸芯片5的尺寸则较中间层滤纸芯片4要稍窄、稍长，这样在测试卡组装后，下层滤纸芯片5可以在纸基滑动架6上自由滑动，通过控制下层滤纸芯片5的滑动，使得分流到测试孔17中的待测样本顺序地与敏感区16的试剂接触和反应，从而实现纸芯片与酶联免疫分析的集成化。此外，所述双面胶带的引流孔14、中间层滤纸芯片的敏感区16以及下层滤纸芯片的测试孔17的行数一致，可以根据待测肿瘤标志物的数量调整为3-6行之间。

纸基滑动架6，是用表面平滑度高且疏水的纸质材料经裁剪成U形，用于为下层滤纸芯片5的滑动提供支撑。该纸基滑动架6为U形纸层，所述U形纸层是从蜡光纸、铜版纸、胶版纸、合成纸等材料中选择一种加工得到，这样不仅简化了制作工艺，还降低了制作成本。

外壳包括上外壳1和下外壳7，两者通过上下扣合方式将上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4、下层滤纸芯片5和纸基滑动架6有机地组装起来。另外，上外壳1上还开有与进样孔10对应的进样窗口8、以及与上层液流通道12对应的进液窗口9，以方便样本和稀释液的滴加；下外壳7的底部则开有与纸基滑动架6对应的U形窗口20，这样当使用测试卡时，只需在下外壳7的底部垫上吸水纸即可方便地将多余的溶液吸走。

所述待测肿瘤标志物，为国际上推荐的肿瘤标志物组合方案，是从AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、AFU(α-L-岩藻糖苷酶)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、CYFRA21-1(细胞角蛋白19片断)、CA125(糖类抗原125)、ProGRP、SCC(鳞状上皮细胞癌抗原)、CA19-9(糖类抗原19-9)、CA242(糖类抗原242)、CA724(糖类抗原724)等肿瘤标志物中选择出的一种组合。

所述中间层滤纸芯片的各敏感区16上预先固定有与待测肿瘤标志物对应的反应试剂，所述反应试剂是抗体、酶标二抗、反应底物等反应试剂。所述敏感区16的洗涤剂，为含有吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，通过物理吸附并低温干燥固定得到的，用于免疫反应中洗涤去除未反应的免疫试剂，以降低非特异性吸附。所述敏感区16的酶标二抗，是与待测肿瘤标志物对应、且经过氧化酶或碱性磷酸酶标记的抗体，通过物理吸附并低温干燥固定得到的。所述敏感区16的反应底物，是根据酶标抗体选择对应的反应底物体系，通过物理吸附并低温干燥固定得到的。

所述测试孔17的抗体试剂，是与待测肿瘤标志物对应的单抗或多抗，通过化学交联法固定得到，用于对待测肿瘤标志物进行特异识别和响应。

使用所述纸芯片酶联免疫测试卡快速检测多肿瘤标志物的方法，是通过控制所述下层滤纸芯5片的次序滑动来完成常规酶联化学发光方法中的洗涤、免疫、发光等过程，再结合便携的化学发光仪来完成待测样本的定量检测。如图2A给出了本发明纸芯片酶联免疫测试卡使用时其下层滤纸芯片相对于上层滤纸芯片2和中间层滤纸芯片4的位置变化以及图2B给出了本发明纸芯片酶联免疫测试卡使用时液体流动的示意图。具体测试过程，包括如下步骤：

(1)在测试卡外壳的U形窗口20下面垫上吸水纸后，向进样窗口8滴加一定体积的待测样本，这样待测样本会沿着上层滤纸芯片2的进样孔10自动渗至各测试孔17，与测试孔17上已固定的抗体试剂进行免疫反应(见图2-I)；

(2)2-5分钟后，向加液窗口9滴加4倍于待测样本体积的稀释液，再向外滑动下层滤纸芯片5使其刻度线a与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐，此时，中间层液流通道15右侧的第一列敏感孔16与下层滤纸芯片5上的测试孔17重合，稀释液会沿着上层滤纸芯片2的梳子形液流通道12自动分流进入到各敏感孔16，第一列敏感孔中的洗涤剂会进一步渗入到测试孔17中，在吸水纸的作用下完成洗涤过程(见图2-II)；

(3)继续滑动下层滤纸芯片5使其刻度线b与中间层滤纸芯片4的右侧边缘对齐，并静置2-5分钟，此时，中间层液流通道15右侧的第二列敏感孔16与下层滤纸芯片5上的测试孔17重合，第二列敏感孔中的酶标抗体会进一步渗入到测试孔17中，与(1)中免疫产物反应得到双抗体夹心复合物(见图2-III)；

(4)继续滑动下层滤纸芯片5，使其刻度线c、d依次与中间层滤纸芯片4边缘对齐，这样随着下层滤纸芯片5的滑动，中间层液流通道15右侧的第三、四列孔敏感孔16分别与下层滤纸芯片5上的测试孔17重合，第三、四列敏感孔中的洗涤剂和反应底物将依次渗入至测试孔17，从而自动完成洗涤、双抗体夹心复合物与反应底物之间的反应过程(见图2-IV、V)

(5)将滑出的下层滤纸芯片5插入到便携的光学仪中自动检测出各测试孔17的光信号值，根据光强与抗原浓度间关系，即可实现对多种肿瘤标志物的快速检测，整个检测时间不超过15min。

实施例1：AFP、CEA和AFU三种肿瘤标志物的检测

AFP：是胎儿时期肝脏合成的一种胚胎蛋白，是检测原发性肝癌最有价值的肿瘤标志物。一般情况下只存在于胎儿的血液中，正常成人的肝细胞是不产生AFP的，但当肝细胞恶变后又可重新获得合成AFP的能力。且AFP含量与肿瘤大小、病理类型有一定的相关性。

CEA：一种酸性糖蛋白，存在于胚胎胃肠黏膜上皮与一些恶性组织的细胞表面，是一种重要的广普肿瘤标志物。正常成人血清中CEA的含量极低，但发生肿瘤时可重新表达，其含量与肿瘤大小、有无转移有一定关系，如在肝癌中的阳性率高达62％-75％，当发生肝转移时，CEA的升高尤为明显。

AFU：是近年来新发现的一种肿瘤标志物，其主要生理功能是参与岩糖基的糖蛋白、糖脂等生物活性大分子的分解代谢。AFU对肝癌敏感性较高，可协助AFP对肝癌进行早期诊断，提高肝癌的诊断率。

根据国际推荐的肿瘤标志物组合，选择AFP、CEA和AFU三种肿瘤标志物联合进行肝癌检测。一种应用纸芯片酶联免疫测试卡进行肝癌检测的纸芯片酶联免疫测试卡制备和使用方法，包括以下步骤：

(1)制备三测试孔17的滤纸芯片：在三张Whatman1#滤纸上利用喷蜡打印机批量打印三种不同的设计图案，分别作为上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4和下层滤纸芯片5，其中，上层滤纸芯片2上含有亲水性的进样孔10和梳子形上层液流沟道12，中间层滤纸芯片4上含有对应的三个分液孔、4×3阵列的圆形敏感区16，下层滤纸芯片5上含有对应的三个测试孔17和四组平行刻度线18；之后，在电子控温仪器中加热熔蜡，得到含有不同亲、疏水区域图形的滤纸芯片。

(2)反应试剂在中间层滤纸芯片4和下层滤纸芯片5上的固定：在平行的各敏感孔16内分别加入5ul的PBST、与CEA、AFP和AFU对应的辣根酶标记二抗以及反应底物，低温干燥5min；在各测试孔17中分别加入5μL的戊二醛以及与CEA、AFP和AFU对应的一抗，低温干燥5min，随后用10μL牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点。

(3)纸芯片酶联免疫测试卡的组装：利用刻绘机制作与中间层滤纸芯片4相同图案的双面胶带3，利用双面胶带3将制作好的上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4粘结起来，并与下层滤纸芯片5(作为测试条)裁剪成单个的纸芯片；将蜡光纸裁剪成U形作为纸基滑动架6，在塑料上下外壳上用激光切割出相应的窗口(进样窗口8、加液窗口9和U形窗口20)，然后利用外壳的扣合作用将测试卡的各部件组装起来。

(4)纸芯片酶联免疫测试卡的使用：先在测试卡外壳的U形窗口20下面垫上吸水纸，再向进样窗口8滴加40μL的待测血清样本，静置2分钟后，向加液窗口9滴加160μL去离子水，同时陆续向外滑动测试条使其刻度线a、b与中间层滤纸芯片4滤纸的边缘对齐；2分钟之后，继续滑动测试条使其刻度线c、d与中间层滤纸芯片4边缘对齐，以实现常规酶联方法中的洗涤、免疫和化学发光等过程；最后，将滑出的测试条插入到便携的化学发光仪中自动检测出各测试孔的光信号值，根据光强与抗原浓度间关系，即可实现对CEA、AFP和AFU的快速检测。

实施例2：CEA、NSE、CYFRA21-1和CA125四种肿瘤标志物检测

NSE：神经元特异性烯醇化酶，是一种酸性蛋白酶，参与糖酵解，主要作用是催化2-磷酸-甘油变成烯醇式磷酸丙酮酸。癌肿组织糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液增多，导致此酶在血清内含量增高。是小细胞肺癌(SCLC)和神经母细胞瘤的肿瘤标志物，用NSE升高来监测SCLC复发要比临床确定复发早4-12周。

CYFRA21-1：细胞角蛋白19片断，主要存在于肺癌、食管癌等上皮起源的肿瘤细胞的细胞质中。当肿瘤细胞溶解或坏死时可被释放至血液中，CYFRA21-1在肺癌患者中的阳性率可高达60％～85％。是非小细胞肺癌患者最有价值的血清肿瘤标志物，与患者体内肿瘤的负荷量相关，可以反映肿瘤病变范围，对非小细胞肺癌的诊断、病情监测和疗效判断有较高的临床应用价值。

CA125：糖类抗原125，在肺癌良性及恶性渗出液中也存在，部分肺癌患者血清CA125都有不同程度的升高。

根据国际推荐的肿瘤标志物组合，选择CEA、NSE、CYFRA21-1和CA125四种肿瘤标志物联合进行肺癌检测。一种应用纸芯片酶联免疫测试卡进行肺癌检测的纸芯片酶联免疫测试卡制备和使用方法，包括以下步骤：

(1)制备四测试孔的滤纸芯片：在三张Whatman1#滤纸上利用喷蜡打印机批量打印三种不同的设计图案，分别作为上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4和下层滤纸芯片5，其中，上层滤纸芯片2上含有亲水性的进样孔10和梳子形上层液流沟道12，中间层滤纸芯片4上含有对应的三个分液孔、4×4阵列的圆形敏感区16，下层滤纸芯片5上含有对应的四个测试孔17和四组平行刻度线18；之后，在电子控温仪器中加热熔蜡，得到含有不同亲、疏水区域图形的滤纸芯片。

(2)反应试剂在中间层滤纸芯片4和下层滤纸芯片5上的固定：在平行的各敏感孔16内分别加入5ul的PBST、与CEA、NSE、CYFRA21-1和CA125对应的碱性磷酸酶标记二抗以及反应底物，低温干燥5min；在各测试孔17中分别加入5μL的戊二醛以及与CEA、NSE、CYFRA21-1和CA125对应的一抗，低温干燥5min，随后用10μL牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点。

(3)纸芯片酶联免疫测试卡的组装：利用刻绘机制作与中间层滤纸芯片4相同图案的双面胶带3，利用双面胶带3将制作好的的上层滤纸芯片2、中间层滤纸芯片4粘结起来，并与下层滤纸芯片5(作为测试条)裁剪成单个的纸芯片；将蜡光纸裁剪成U形作为纸基滑动架6，在塑料外壳上用激光切割出相应的窗口(进样窗口8、加液窗口9和U形窗口20)，然后利用外壳的扣合作用将测试卡的各部件组装起来。

(4)纸芯片酶联免疫测试卡的使用：先在测试卡外壳的U形窗口20下面垫上吸水纸，再向进样窗口8滴加50μL的待测血清样本，静置3分钟后，向加液窗口9滴加200μL去离子水，同时陆续向外滑动测试条使其刻度线a、b与中间层滤纸芯片4滤纸的边缘对齐；3分钟之后，继续滑动测试条使其刻度线c、d与中间层滤纸芯片4的边缘对齐，以实现常规酶联方法中的洗涤、免疫和化学发光等过程；最后，将滑出的测试条插入到便携的化学发光仪中自动检测出各测试孔的光信号值，根据光强与抗原浓度间关系，即可实现对CEA、NSE、CYFRA21-1和CA125的快速检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于包括上外壳、上层滤纸芯片、双面胶带、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片、纸基滑动架、以及下外壳，其上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片分别是具有亲水区域、疏水区域交替出现的蜡图案化滤纸芯片；在上外壳和下外壳之间设置上层滤纸芯片、双面胶带、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片和纸基滑动架，在上外壳本体设有进样窗口和加液窗口，上层滤纸芯片位于上外壳和双面胶带之间；中间层滤纸芯片位于双面胶带和下层滤纸芯片之间，中间层滤纸芯片上包括预先固定有不同反应试剂的多个敏感区；纸基滑动架位于下层滤纸芯片和下外壳之间；上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片通过双面胶带粘接为一体；下外壳的底部则开有与纸基滑动架对应的U形窗口，下层滤纸芯片相对上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片在纸基滑动架上滑动，以便实现不同反应试剂在多层滤纸芯片之间的顺序流动；所述上层滤纸芯片含有进样孔、疏水蜡区域和上层液流通道；所述双面胶带含有引流通道和多个引流孔；所述中间层滤纸芯片含有中间层液流通道和多个敏感区；所述下层滤纸芯片由多个测试孔和不同刻度线、手柄组成；进样窗口、进样孔、引流通道以及中间层液流通道均位于测试卡的左侧，且各中心垂直线沿测试卡的垂直竖向方向重合；上层液流通道是位于上层滤纸芯片的右侧区域上的梳子形液流通道，其梳背紧贴于加液窗口下方且两者的中心重合，其梳齿与双面胶带上的多个引流孔和中间层滤纸芯片上的多个敏感区沿测试卡的垂直竖向方向重合；在下层滤纸芯片上设置有多个测试孔、不同刻度线和手柄，测试孔紧贴于中间层液流通道下方且两者的中心重合，不同刻度线为平行于测试孔、用于标识下层滤纸芯片的滑动位置的多组虚线，手柄位于下层滤纸芯片上远离测试孔的一端。

2.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述上层滤纸芯片、中间层滤纸芯片、下层滤纸芯片分别是以纤维素滤纸为载体，利用喷蜡打印机打印上图案，加热熔蜡，得到含有不同亲水区域、疏水区域图形的蜡图案化滤纸芯片。

3.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述上层液流通道是梳子形液流通道；所述进样孔是亲水性的进样孔。

4.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述多个敏感区中的各敏感区呈阵列化分布，其上预先固定有不同反应试剂。

5.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述引流孔、敏感区以及测试孔的行数一致，根据待测肿瘤标志物的数量调整为3-6行之间。

6.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述中间层滤纸芯片的各敏感区上预先固定有与待测肿瘤标志物对应的反应试剂，所述反应试剂是抗体、酶标二抗、反应底物。

7.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述纸基滑动架是由表面平滑且疏水的纸质材料经裁剪成U形纸层，所述U形纸层是从蜡光纸、铜版纸、胶版纸、合成纸材料中选择一种加工得到。

8.根据权利要求1所述多肿瘤标志物联测用纸芯片酶联免疫测试卡，其特征在于，所述上外壳、下外壳为上下扣合的塑料外壳，在下外壳的底部开设有与纸基滑动架对应的U形窗口，供下层滤纸芯片滑动时配合吸水纸来移去多余的液体。

Images