CN115283026A - 集成式滑动芯片 - Google Patents

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徐宏
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Abstract

本发明涉及集成式滑动芯片，具体提供一种集成式芯片，其特征在于，所述芯片通过多层芯片和多个功能腔室将细胞分离培养、一种或多种细胞分泌物的检测等功能集成在一个装置上。本发明滑动芯片在单块芯片上实现了细胞分离计数、刺激孵育、一种或多种细胞分泌物检测的细胞功能分析流程。人为操作少，步骤简单，仅需通过简单滑动即可实现芯片内流体操控，检测时间短，为设备自动化提供便利。

Description

集成式滑动芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片领域，具体涉及一种集成式滑动芯片及其用途。
背景技术
免疫细胞是指所有参与或辅助生物体免疫应答过程的细胞。按免疫细胞的来源和功能为依据，可分为造血干细胞、淋巴细胞、抗原呈递细胞和其他免疫细胞。如淋巴细胞中的辅助T细胞可以识别抗原片段，释放IL-2/4/6及IFN-γ等多种细胞因子，协助完成体液免疫过程。免疫细胞功能异常会导致生物体易患各种疾病，因此免疫细胞功能分析对于疾病诊断、预后和疗效评估至关重要。
在免疫细胞发挥作用的过程中，细胞分泌物作为信息载体，对免疫细胞的功能有重要影响。如B细胞产生的抗体，T细胞分泌的细胞因子等等。以细胞因子为例，包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子和生长因子等。检测细胞分泌物种类和含量是评估细胞免疫功能重要途径。
传统的细胞分泌物检测方法包括ELISA、ELISPOT、胞内细胞因子染色(ICCS)等。ELISA方法是对全血样本进行相应刺激后提取血清，使用ELISA直接测定上清液中的分泌蛋白水平。但是全血样本中的细胞成分复杂，该方法不涉及特定细胞群体的分离和归一化，因此难以对特定免疫细胞群体进行准确的分析。ELISPOT则是将ELISA技术和细胞培养技术相结合，通过捕获抗体、检测抗体和抗原的特异性结合关系检测特定细胞群体分泌出靶标蛋白的细胞数量。但是特定细胞群体的分离和归一化操作耗时且繁琐。ICCS是在单细胞水平分析细胞功能的方法。通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，可获得在一定数量群体中能释放细胞因子的细胞百分比。但细胞的固定和通透化操作将耗费大量的时间。因此以上方法面临准确性不高、操作繁琐耗时的问题，限制了其在快速诊断、大规模疾病筛选、动态监测领域的应用。
现场快速检测(Point-of-CareTesting，POCT)指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。快速、操作简便、成本较低，无需传统的大型实验室设备和条件，不受地点和时间的限制，可降低资源占用和整体的就医成本。微流控芯片技术是实现POC检测的重要方法之一，使用微米级别的管道来处理和操作微流体系统，特点是设备微型化、功能集成化、所需样本量和检测试剂少、检测时间短、成本低、检测灵敏度高，广泛应用于生物医学领域。因此，可集成细胞分离、刺激与即时检测于一体的POCT芯片成为微流控生物分析领域亟待突破的技术。
Huang等开发了一种基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流控免疫表型分析(MIPA)装置，能够将所有分析操作集成到一个芯片上，包括细胞接种、细胞刺激、活细胞计数和细胞因子检测。该工作使用脂多糖(LPS)刺激人类急性单核细胞白血病细胞(THP-1)产生TNF-α，用LOCI(发光氧通道免疫分析)技术对分泌的细胞因子进行原位检测。总检测时间比ELISA缩短7倍，实现了快速、高效的细胞免疫表型分析(LabonAChip,2012,12(20):4093-4101)。
但是，目前类似细胞分离及其分泌因子的微流控芯片仍存在较大局限。例如，细胞分泌物检测流程繁琐，样本预处理涉及血清提取、细胞培养模块；而常用的检测过程ELISA则含有多步洗涤，步骤复杂。且二者完全分离，没有在集成同一系统上，无法满足即时快速检测(POCT)的需求。现有的POCT芯片功能单一，如血浆提取芯片、白细胞分离芯片、细胞捕获检测特定抗原芯片等，芯片在其中作为整体检测流程的一部分，需要与其他模块配合，未能实现芯片上进行包括细胞分离、计数、刺激孵育并进行多重细胞因子检测的整个流程。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种滑动芯片，将细胞分离计数、孵育、一种或多种分泌物同时检测集成在滑动芯片上，各功能腔室空间分隔，通过滑动功能相互联系，并实现流体的接触、扩散、混合与分割等多种功能，建立了一个集成式的微流控芯片装置。实现了简便、集成化、小型化的免疫细胞功能分析。
本发明第一方面提供一种集成式滑动芯片，其特征在于，所述芯片通过多层芯片和多个功能腔室将细胞分离培养、一种或多种细胞分泌物的检测等功能集成在一个装置上，大幅减少人为操作、提高检测灵敏度。所述多个功能腔室包括细胞分离培养腔室，其通过层间的微孔滤膜实现细胞分离，废液处理和样本采集在不同的腔室或流路中分别进行，并且腔室环境适宜细胞培养。所述多个功能腔室包括反应及检测腔室，其特征在于，通过层间滑动和液体混合装置使样本与一种或多种反应试剂(依次)的接触、扩散、混合与分割等功能，并通过信号读取装置进行检测。所述集成式滑动芯片的一个具体实施方式是本发明第二方面所述的多层微流控芯片。
本发明第二方面提供一种多层微流控芯片。所述芯片可用于细胞分离、处理、分泌物分析。
在一个或多个实施方案中，所述芯片包含盖片10和底片300，其中盖片10包含盖片上层100和盖片下层200，
盖片上层100的下表面设置有非贯通腔室110和流体混合机构140，
盖片下层200设置有贯通腔室210、220，任选还设置有贯通腔室230，腔室210与盖片上层100的腔室110配合，其横截面区域小于腔室110；腔室220和腔室230中一个或二者位于一个或多个所述流体混合机构140的下方(例如腔室220和腔室230各自覆盖一个流体混合机构140)；盖片下层200的下表面还设置有凹陷通道240，
盖片上层100和盖片下层200相互固定和密封，腔室210与腔室110之间设置有膜400，
底片300设置有凹陷腔室310和320，当滑动底片300使腔室310与腔室210对齐时，腔室310与腔室210配合，腔室310的横截面区域大于腔室210，腔室310超出腔室210的区域能与凹陷通道240流体连通；当滑动底片300使腔室320与腔室210对齐时，腔室320与腔室210配合，腔室320的横截面区域大于腔室210，腔室320超出腔室210的区域能与凹陷通道240流体连通。
在一个或多个实施方案中，腔室110的形状使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布。在一些实施方案中，腔室110中流体流入的流道宽度从流体入口逐渐增大。优选地，腔室110的形状为五边形、六边形、梭形。
在一个或多个实施方案中，盖片上层100的下表面设置有凸台120，任选还设置有凸台130，腔室220和腔室230下方的流体混合机构140分别位于凸台120和凸台130内。
在一个或多个实施方案中，盖片上层100的材料为透气良好、声阻抗较低且有一定硬度的材料，如PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PS(聚苯乙烯)。
在一个或多个实施方案中，盖片100上还设置有通孔111、112、150、121，任选还设置有通孔131。所述通孔的直径至少0.5mm，优选为约1mm。通孔用于在其上下两层之间实现液体流通。
在一个或多个实施方案中，通孔111与腔室110和腔室210流体连通；通孔121与凸台120和腔室220流体连通；通孔131与凸台130和腔室230流体连通。
在一个或多个实施方案中，流体混合机构140是气泡生成机构，其具有一个或多个凹陷，液体流过所述凹陷时能在凹陷处产生气泡。优选地，所述凹陷的深宽比大于0.2，优选大于0.5。所述凹陷包括圆形凹陷、矩形凹陷或三角形凹陷。在一个或多个实施方案中，凹陷是深度0.5mm，直径0.7mm的圆形凹陷结构。
在一个或多个实施方案中，盖片100的上表面设置有压电换能片500，其位于流体混合机构140的上方(例如在垂直方向上覆盖流体混合机构140)，用于激励气泡介导声波混合。在一个或多个实施方案中，所述压电换能片由具有高电声转换效率的材料制成，优选为锆钛酸铅、钛酸钡、偏铌酸铅。在一个或多个实施方案中，凹陷与换能片500之间的距离小于2mm，优选小于1mm。
在一个或多个实施方案中，流体混合机构140是由气泵、蠕动泵产生驱动力进行液体混合的机构。在一个或多个实施方案中，流体混合机构140是通过磁性吸附进行液体混合的机构。在一个或多个实施方案中，流体混合机构140是通过介电泳进行液体混合的机构。
在一个或多个实施方案中，盖片下层200的材料为玻璃、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)、塑料COP/COA(环氧烯烃)等低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料。
在一个或多个实施方案中，盖片下层200厚度至少0.5mm，优选为1mm，
在一个或多个实施方案中，腔室220和腔室230分别与凸台120和凸台130间隙配合。
在一个或多个实施方案中，腔室210的横截面区域不覆盖腔室110中流体流入的通道(例如通孔111)。
在一个或多个实施方案中，腔室210与腔室110的组合构成第一腔室。包含流体混合机构140的腔室220和230分别形成第二腔室和第三腔室。
在一个或多个实施方案中，盖片上层100与盖片下层200通过等离子体处理而相互固定和密封。在一个或多个实施方案中，盖片上层100与盖片下层200通过压力固定和密封，所述压力通过例如磁铁、弹簧、夹子、气动或液压装置或夹紧装置等。
在一个或多个实施方案中，膜400的孔径范围为2-10μm。膜400可以是聚砜膜、聚碳酸酯膜、或其他通过微加工得到的多孔膜。在一个或多个实施方案中，膜400是parylene-C滤膜。
在一个或多个实施方案中，盖片下层200的凹陷通道240的深度至少0.2mm，优选0.5mm。
在一个或多个实施方案中，盖片下层200还设置有通孔221、231、241、250，分别与通孔121、131、112、150流体连通。盖片下层200的通孔直径至少0.5mm，优选约为1mm。通孔用于层间液体的流通。
在一个或多个实施方案中，腔室310和腔室320的深度至少0.1mm。
在一个或多个实施方案中，底片300材料为玻璃、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)、塑料COP/COA(环氧烯烃)等低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料。
在一个或多个实施方案中，底片300厚度至少0.5mm，优选1.5mm。
在一个或多个实施方案中，腔室320的形状使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布。在一些实施方案中，腔室320中流体流入的流道宽度从流体入口逐渐增大。优选地，腔室320的形状为五边形、六边形或梭形。
在一个或多个实施方案中，盖片下层200和底片300的缝隙间设置有不与试剂或样品混溶的流体，以防止盖片下层200和底片300的相对滑动过程中试剂或样品漏出。所述不与试剂或样品混溶的流体包括烃类或氟化物质，例如烷烃、氟烃、氟化铀，优选为选自己烷、十六烷、矿物油和石蜡油中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，腔室110为五边形，分为流体入口111近端的三角形部分和远端的长方形部分。腔室210形状为长方形，与腔室110的长方形部分对齐。
在一个或多个实施方案中，腔室220和/或腔室230为六边形。
在一个或多个实施方案中，凸台120和/或凸台130为六边形。
在一个或多个实施方案中，腔室310形状为五边形，分为流体出口近端的三角形和远端的长方形。腔室310长方形部分与腔室110的长方形部分和腔室210对齐。通过盖片10与底片300之间的相对滑动，流体出口近端的三角形部分能与凹陷通道240流体连通。
在一个或多个实施方案中，凹陷通道240为水平或弯曲流道结构，优选蛇形结构。蛇形结构可增大出口压力，使膜上下压差分布更加均匀。
本发明还提供一种使用本文所述的芯片分离和/或处理细胞的方法，包括步骤：
1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔；优选地，膜400是parylene-C膜，
任选地2)从通孔111加入洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400，
3)待样品滤出液离开腔室110或210后，分离的感兴趣细胞位于膜400上；优选地，步骤3)包括：待洗涤液或细胞培养基充满腔室310并通过流道240(以及通孔241、112)离开芯片后，分离的感兴趣细胞位于膜400上，
或
1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔，优选地，膜400是parylene-C膜，
任选地2)从通孔111加入洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400，
3)从通孔150向腔室320加入处理细胞的试剂(例如，洗涤液或刺激剂或培养基)，
4)待样品滤出液离开腔室210，使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室110、210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞。
在一个或多个实施方案中，步骤4)包括：待洗涤液或细胞培养基充满腔室310并通过流道240，通孔241、112离开芯片后，分离的感兴趣细胞位于膜400上；然后使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室110、210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞。
在一个或多个实施方案中，所述处理包括使用洗涤剂洗涤细胞、使用刺激剂刺激细胞或使用培养基培养细胞。
在一个或多个实施方案中，使用本文所述的芯片分离细胞的方法，包括步骤：
1)使腔室310或腔室320与腔室210对齐，
2)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔，
3)从通孔111加入5-20倍样品体积的洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400以冲洗膜上的细胞，样品滤出液、和洗涤液或细胞培养基的滤出液通过腔室310或腔室320和流道240排出，分离的感兴趣细胞位于膜400上。
在一个或多个实施方案中，使用本文所述的芯片处理细胞的方法，包括步骤：
1)使腔室310与腔室110和210对齐，
2)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔；从通孔150向腔室320加入处理细胞的试剂(例如，洗涤液或刺激剂或培养基)，
3)从通孔111加入5-20倍样品体积的洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400以冲洗膜上的细胞，样品滤出液、和洗涤液或细胞培养基的滤出液通过腔室310和流道240排出，
4)使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞。
本发明还提供一种使用本文所述的芯片检测一种或多种细胞分泌物的方法，包括步骤：
1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，
2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的试剂；优选地，所述试剂包含供体荧光团的捕获抗体和标记有受体荧光团的检测抗体，
3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；所述混合优选持续至少10分钟，例如至少20、30、40、50分钟，更优选1h，
4)检测所述试剂从而检测感兴趣的分泌物，
或
1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，
2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的第一试剂，
3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；优选持续至少10分钟，例如至少20、30、40、50分钟，更优选1h，
4)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室230对齐，所述腔室230中含有能与第一试剂特异性结合的第二试剂，
5)在腔室230中的流体混合机构140的驱动下，腔室230、320中的流体充分混合；优选持续至少10分钟，例如至少20、30、40、50分钟，更优选1h，
6)检测第一试剂和第二试剂的相互作用从而检测感兴趣的分泌物。
在一个或多个实施方案中，第一、第二试剂包括以下一种或多种：带有功能基团的捕获抗体颗粒、带有功能基团的检测抗体颗粒、能与功能基团相互作用的辅助试剂。所述捕获抗体颗粒中，功能基团包括以下一种或多种，小分子(如吖啶酮、链霉亲和素、生物素等)、螯合物、蛋白质(如HRP酶、藻胆蛋白等)、微球(发光微球、感光微球等)；所述检测抗体颗粒中，功能基团包括以下一种或多种，小分子(如吖啶酮、链霉亲和素、生物素等)、螯合物、蛋白质(如HRP酶、藻胆蛋白等)、微球(发光微球、感光微球等)；能与功能基团相互作用的辅助试剂包括以下一种或多种：过氧化氢、增强剂等。
在一个或多个实施方案中，第一试剂包含所述捕获抗体颗粒，第二试剂包含所述检测抗体颗粒和所述辅助试剂；或者，第一试剂包含所述捕获抗体颗粒和所述辅助试剂，第二试剂包含所述检测抗体颗粒；或者第一试剂包含所述检测抗体颗粒，第二试剂包含所述捕获抗体颗粒和所述辅助试剂；或者，第一试剂包含所述检测抗体颗粒和所述辅助试剂，第二试剂包含所述捕获抗体颗粒；或者，第一试剂包含所述辅助试剂，第二试剂包含所述检测抗体颗粒和所述捕获抗体颗粒；或者，第一试剂包含所述检测抗体颗粒和所述捕获抗体颗粒，第二试剂包含所述辅助试剂。
在一个或多个实施方案中，第一和/或第二试剂中抗体均能与待测分泌物特异性结合，通过细胞分泌物与抗体间的特异性结合，捕获抗体颗粒与检测抗体颗粒靠近，经辅助试剂或激光等作用发生能量传递，由此产生可检测的信号。
在一个或多个实施方案中，第一试剂包括抗体包被的受体颗粒和标记物偶联的抗体，所述抗体均能与待测分泌物特异性结合；第二试剂包括由标记物的配体包被的供体颗粒。所述供体颗粒通过与受体颗粒的靠近将能量传递给受体颗粒，由此受体颗粒产生可检测的信号。鉴定所述信号即可检测第一试剂和第二试剂的相互作用从而检测待测分泌物。
在一个或多个实施方案中，第一试剂还包括能偶联多个受体颗粒的微球，例如标记微球。优选地，所述微球是编码微粒，例如荧光编码微粒。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是免疫细胞或肿瘤细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞分泌物是细胞因子或由受检细胞分泌的各种蛋白分子，包括但不限于IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述标记物是生物素，所述标记物的配体是链霉亲和素。
在一个或多个实施方案中，所述供体颗粒是LOCI中的感光微球，所述受体颗粒是LOCI中的发光微球。
在一个或多个实施方案中，步骤6)包括，检测颗粒(例如受体颗粒)的发光，从而检测待测分泌物。
在一个或多个实施方案中，检测一种或多种细胞分泌物的方法包括步骤：
(1)在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液进行封闭，
(2)使用培养基重悬细胞，
(3)从盖片上层100的通孔111加入约106个细胞和刺激剂(biolegend#423301)，通过显微镜拍照对膜上细胞进行计数，
(4)37℃刺激至少12小时，
(5)每种细胞因子对应的含受体颗粒的编码微粒为4000个，稀释不同浓度的检测抗体(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6的检测抗体终浓度分别为0.5、0.1、0.2、0.2μg/mL)，将受体颗粒与生物素标记的检测抗体1:1混合作为多重检测试剂1，链霉亲和素偶联的供体颗粒(稀释至30.2μg/mL)作为多重检测试剂2，
(7)从盖片上层100的通孔121处加入试剂1(40μL)，通孔131处加入试剂2(40μL)，
(8)底片300向右滑动，使腔室320与由腔室220对齐，启动声波混合装置，使腔室320中的样品与试剂1充分混合进行第一步反应(优选反应1h)；随后再次滑动，使腔室320与由腔室230对齐，启动声波混合装置，使腔室320中的流体与试剂2充分混合进行第二步反应(优选反应1h)，
(9)反应结束后再次滑动底片300，使腔室320至盖片下层200的无腔室位置，对焦到编码微粒，对腔室扫图，GFP、TRIC、LOCI通道曝光时间分别为350ms、150ms、3s，识别GFP、TRIC通道内的微球并统计两通道的荧光强度，根据两种编码颜色强度的不同识别编码微粒种类，读取每种微球上LOCI通道的信号强度，得到不同细胞因子的含量。
本发明优点：
1、首次在滑动芯片上集成了细胞分离及刺激培养、滑动及气泡介导声波混合模块、多重免洗蛋白检测模块。在单块芯片上实现了免疫细胞功能分析所涉及的细胞分离计数、刺激孵育、一种或多种细胞分泌物检测的全部流程。人为操作少，步骤简单，为设备自动化提供便利。此外，由于全流程在封闭的芯片内执行，仅需层间滑动即可完成流体的接触、扩散、反应与分割等过程，可避免交叉污染和外界干扰、提高细胞分泌物检测的灵敏度。
2、在传统滑动芯片的基础上，构建了一种新型的三层组装结构。其中上层结构为透气性好且声阻抗较小的PDMS等材料，一方面保证细胞培养过程中所需的气体交换，另一方面易于声波传输从而介导气泡振动混合。上中层用键合或机械压力的方式固定相对位置，并且在上层和中层结构间引入多孔滤膜。中下层为玻璃、PMMA、PC、PS等易于相对滑动的刚性材料，利用层间的滑动和液体混合装置实现多个功能腔室的依次联通，从而完成细胞功能分析的所有步骤。
附图说明
图1，盖片上层100示意图。A：仰视，B：俯视。
图2，盖片下层200仰视示意图。
图3，底片300俯视示意图。
图4A，组装示意图，俯视。
图4B，组装示意图，仰视。
图5，本发明一个实施方式的芯片组装示意图。
图6，滑动示意图。
图7，第一腔室示意图。A：冠状横断面，B：第一腔室流路示意图。
图8，细胞分离效果。A：结构示意图，B：全血分离白细胞效果图。
图9，芯片内气泡介导声波混合效果。A：结构示意图，B：混合前后效果对比图。
图10，芯片内膜上细胞计数及标准曲线的建立。A：不同细胞密度在膜上的显微图像，B：膜上细胞数量与信号值的对应表格；C：根据B中的对应关系拟合建立的膜上计数标准曲线。
图11，芯片上LOCI单因子IL-2标准曲线，EP管为对照。
图12，芯片上LOCI检测细胞刺激分泌的细胞因子IL-2，96孔板为对照。
图13，芯片上multi-LOCI多因子标准曲线。
图14，芯片上multi-LOCI检测细胞刺激分泌的多重细胞因子。A：96孔板，B：芯片。
图15，芯片上分离全血中的白细胞并进行刺激分泌的多重细胞因子检测。
具体实施方式
本发明中的集成式设备能在单个滑动芯片上完成细胞分离计数、刺激孵育、一种或多种分子(例如细胞因子，细胞分泌蛋白，或小分子抗原、核酸等非分泌物)检测，操作简单，集成度高，为设备自动化提供便利条件。在此基础上可用于现场快速诊断、大规模疾病筛选、以及免疫功能的动态监测。
针对目前细胞分泌物检测流程繁琐的问题，本发明基于滑动芯片平台，构建了一个集细胞分离计数、刺激孵育、一种或多种细胞因子检测的集成式微流控装置。该装置包含三个模块：1、细胞分离及培养模块。通过细胞滤膜，依据细胞大小的物理特性进行细胞分离。利用成像装置对膜上的细胞进行计数。采用细胞相容性好的透气材料PDMS为腔室材料，用于分离后的细胞的进一步培养或刺激孵育；2、滑动及气泡介导声波混合模块。通过芯片滑动将细胞分离及培养模块中收集的细胞分泌物依次移动至储存有检测试剂的腔室中。并通过腔室中的气泡生成结构产生微气泡，利用外加声波促进气泡鼓动，进而促进试剂和待测物的混合。3、免洗蛋白检测模块。利用LOCI或multi-LOCI多重免洗蛋白检测技术(专利公开号：WO2021169866A1)对一种或多种细胞分泌物进行检测。利用滑动及气泡介导声波混合模块，将细胞分泌物与试剂进行高效混合，然后通过信号读取装置(例如酶标仪或成像装置)完成检测。最终得到待测样本中目标细胞的一种或多种分泌蛋白的水平，从而实现集成化的免疫细胞功能分析。本发明所构建的集成式滑动芯片装置实现了芯片上的细胞分离、膜上计数、刺激孵育、一种或多种细胞分泌物的检测，集成多个模块，操作简单，全流程封闭进行，为整体自动化带来便利。模块和腔室功能的实现得益于多层芯片结构。
芯片结构
从横断面看，芯片分为上下两层盖片10和底片300，盖片10又分为上层100和下层200，如图4，B所示。
(1)图1显示盖片上层100的一种示例性实施方案。盖片上层100的材料为透气良好、声阻抗较低且有一定硬度的材料，如PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PS(聚苯乙烯)，其下表面有腔室110、流体混合机构140；
腔室110向内凹陷，深度0.5mm，形状为五边形，或六边形、梭形等使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布的形状。该形状的特征为流道宽度从入口逐渐增大。腔室110可用作细胞孵育腔室。
在对应于下述腔室220和230的位置处，盖片上层100的下表面设置有流体混合机构140。在具体实施方案中，流体混合机构140是用于气泡介导声波混合的气泡生成结构，形状为圆形凹陷，也可以是矩形凹陷、三角形凹陷等液体流过可自行在凹陷处产生气泡的形状。且该凹陷结构的特征为具有一定的深宽比(大于0.5)，从而稳定生成气泡。优选深度0.5mm，直径0.7mm的圆形凹陷结构。流体混合机构140与换能片之间的距离越短、声波传输效率越高，一般小于1mm。
流体混合机构140可位于分别对应于腔室220和230的凸台120、130中。凸台120、130形状为六边形，或梭形等使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布的形状。该形状的特征为流道宽度从入口逐渐增大。本发明为方便盖片上下层的对齐配合，设计凸台120、130向外凸起0.3mm以便嵌入下层220、230中。
盖片100上还设置有通孔111、112、150、121、131，直径1mm。通孔用于在其上下两层之间实现液体流通。
盖片100上还设置有压电换能片500，用于激励气泡介导声波混合，所述压电换能片为锆钛酸铅、钛酸钡、偏铌酸铅等具有高电声转换效率的材料。压电换能片500完全覆盖120、130腔室中所有的气泡生成结构，贴于盖片100的上表面。声波混合也可用其他混合方式代替。如：依靠气泵、蠕动泵等驱动力进行混合；若待混合溶液中含有磁性微球也可依靠磁场混合；依靠介电泳混合等方式。
(2)图2显示盖片下层200的一种示例性实施方案。盖片下层200的材料为玻璃，或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)等低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料，厚度1mm，设置有3个与盖片上层的腔室110、120、130配合的贯通腔室210、220、230；
腔室210，形状需与腔室110配合形成第一腔室，二者之间设置有膜400，第一腔室可用作为细胞孵育腔室。
腔室220、230与凸台120、130配合形成第二腔室和第三腔室。本发明为方便盖片上下层的对齐配合，凸台120、130向外凸起0.3mm嵌入下层220、230中。第二和三腔室可用作多重免洗反应腔室。在一个或多个实施方案中，盖片上层100与盖片下层200通过等离子体处理固定相对位置并夹紧膜400，也可用压力密封如磁铁、弹簧、夹子、气动或液压装置或夹紧装置等。
膜400的孔径范围为2-10μm，根据分析细胞种类选择，如分离白细胞可选6μm，CTC(循环肿瘤细胞)可选8-10μm。膜400可以是聚砜膜、聚碳酸酯膜、或其他通过微加工得到的多孔膜。
盖片下层200的下表面还设置有通道240，向内凹陷，深度0.5mm，可作为废液流道。
盖片下层200还设置有通孔221、231、241、250，直径1mm。通孔用于层间液体的流通。
(3)图3显示底片300的一种示例性实施方案。底片300的材料为玻璃，或PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)等低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料，厚度1.5mm，有310、320共2个腔室；
腔室310向内凹陷，形状与需与腔室110、210配合，深度0.3mm，可作为废液储存腔。
腔室320向内凹陷，形状为六边形，或梭形等使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布的形状。该形状的特征为流道宽度从入口逐渐增大。深度0.3mm，可用作样本腔。腔室320在滑动前与通孔150、250配合，滑动后与腔室110、210配合。
腔室320的形状可在初始位置与通孔150、250配合，以便提前装载试剂(例如，洗涤液或刺激剂)。如腔室320未提前装载溶液，其中的空气柱在芯片滑动后会带来气泡，影响在110、210、320腔室中发生的细胞刺激孵育。腔室320在滑动后可以与240联通。
在使用前，盖片下层200和底片300的缝隙间需加入不与检测试剂或样品混溶的流体，防止滑动过程中检测试剂或样品漏出，如烃类或氟化物质，烷烃、氟烃、氟化铀等(实例如己烷、十六烷、矿物油和石蜡油等)。
腔室110、210和310形成的第一腔室具有形状和对齐上的特殊配合用以更好地实现细胞分离功能，如图7所示。腔室110形状为五边形，可分为流体入口111近端的三角形部分和远端的长方形部分。流体入口近端三角形由窄渐宽的设计可让注入的流体逐渐散开并最终形成大致匀速的流体分布。
腔室210形状为长方形，与腔室110的长方形部分对齐。去除三角形的目的是通过改变腔室210的形状，在入口111下方形成一个台阶结构，从而减小样本注入时对下方位置产生的冲力，防止细胞因巨大冲力而变形影响分离效果；同时让膜上压力均匀分布，增加有效过滤面积。
腔室310形状为五边形，可分为流体出口240近端的三角形和远端的长方形。腔室310长方形部分与腔室110的长方形部分、腔室210对齐。流体出口近端的三角形部分与出口流道240连通，由宽渐窄的设计可让流出的流体逐渐汇集，大致保持匀速离开腔室。
流道240为蛇形结构，或其他水平或弯曲流道结构，优选蛇形结构。过滤倾向于发生在膜上下压差的最大处，若出口压力过小，过滤几乎只发生在膜靠近出口的部分，有效过滤面积较小，且腔室310在远离出口部分难以充满液体，容易产生气泡，影响后续实验。
本发明另一实施方式还提供不含凸台130、通道131和腔室230结构的滑动芯片，其结构精简，更适用于一步法反应，如图5所示。该芯片其他结构如上所述，与图1-图4中所示相同。
芯片组装及滑动
图4显示细胞滤膜和芯片组装的示意图。A：俯视，B：仰视。
(1)细胞滤膜组装
膜400夹在盖片上层100和盖片下层200之间，如图7，A所示，盖片上层100和盖片下层200通过plasma处理键合，膜400被夹紧在两层之间，位于腔室110和腔室210之间。
(2)芯片组装
从上至下依次为盖片上层100、盖片下层200、底片300，芯片的初始状态为各层腔室110、210、310对齐。
(3)芯片滑动
滑动发生在盖片10和底片300之间，以底片300滑动为例，如图6。
第一次滑动：底片300向左滑动，弃去废液，底片300的腔室320与腔室110和210对齐。
第二次滑动：底片300向右滑动，腔室320与凸台120和腔室220对齐。
第三次滑动：底片300向右滑动，腔室320与凸台130和腔室230对齐。
第四次滑动：底片300向右滑动，腔室320滑至盖片下层的无腔室区域。
芯片功能
(1)细胞分离及培养模块
细胞分离指从样品(例如血液或培养基)中将感兴趣细胞与其他组分分离。
由腔室110、210、310、320组成的腔室组可用于细胞分离计数、刺激孵育。细胞被生物惰性的膜400(例如parylene-C滤膜)截留后，上层材料为透气性好的PDMS，下层是膜400，通过显微镜拍照后进行图像处理，半定量膜上细胞密度。
因此，本发明提供一种使用本文所述的芯片分离细胞的方法，包括步骤：1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400(例如parylene-C膜)的孔，任选地2)从通孔111加入洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400，和3)待样品滤出液离开腔室110或210后，分离的感兴趣细胞位于膜400上。优选地，步骤3)包括：待洗涤液或细胞培养基充满腔室310并通过流道240(以及通孔241、112)离开芯片后，分离的感兴趣细胞位于膜400上。
在一个或多个实施方案中，使用本文所述的芯片分离细胞的方法包括步骤：1)使腔室310或腔室320与腔室210对齐，2)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔，3)从通孔111加入5-20倍样品体积的洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400以冲洗膜上的细胞，样品滤出液、和洗涤液或细胞培养基的滤出液通过腔室310或腔室320和流道240排出，分离的感兴趣细胞位于膜400上。
本发明还提供一种使用本文所述的芯片处理细胞的方法，所述处理包括使用洗涤剂洗涤细胞、使用刺激剂刺激细胞或使用培养基培养细胞。所述方法包括步骤：1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品(例如全血)，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400(例如parylene-C膜)的孔，任选地2)从通孔111加入洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400，3)从通孔150向腔室320加入处理细胞的试剂(例如，洗涤液或刺激剂或培养基)，4)待样品滤出液离开腔室210，使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室110、210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞。
在一个或多个实施方案中，使用本文所述的芯片处理细胞的方法包括步骤：
1)使腔室310与腔室110和210对齐，2)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品，使其通过膜400，其中所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔；从通孔150向腔室320加入处理细胞的试剂(例如，洗涤液或刺激剂或培养基)，3)从通孔111加入5-20倍样品体积的洗涤液(例如PBS)或细胞培养基，使其通过膜400以冲洗膜上的细胞，样品滤出液、和洗涤液或细胞培养基的滤出液通过腔室310和流道240排出，和4)使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞。
本文中，滤出液表示通过过滤膜(例如膜400)的液体。例如，“样品滤出液”指通过膜400后不含有感兴趣细胞的液体。当样品是全血、感兴趣细胞是白细胞时，白细胞不能通过parylene-C膜，因此样品滤出液中基本不含白细胞，仅含有样品中除白细胞之外的其他物质，例如红细胞。
(2)滑动及液体混合模块
通过滑动结合层间的微孔滤膜，可以快速实现液体混合、废液处理、样本采集等。本文中，废液包括细胞处理过程中产生的非感兴趣细胞、清洗液(如培养基或PBS)。废液处理指将废液排出所述芯片或放置于非反应腔室。样本指可直接与反应试剂反应、含一种或多种细胞分泌物的溶液。样本采集指通过所述芯片得到目标样本。
液体混合模块的示例性功能包括：样本腔320中的待测物与由凸台120和腔室220组成的第二腔室和由凸台130和腔室230组成的第三腔室中的试剂进行依次混合。首先，膜400上的细胞经刺激孵育后产生的分泌物进入腔室210、320。在第二腔室加入试剂组分1，第三腔室中加入试剂组分2。滑动底片300，使样本腔320与第二腔室对齐，利用贴在盖片上层100上表面正对于第二和第三腔室的压电换能器500，激励流体混合机构140(例如气泡生产机构)产生微气泡，进行气泡介导声波混合，使得样本与试剂组分1充分混合，完成第一步反应；随后再次滑动底片300，使腔室320与第三腔室对齐，并如上所述进行气泡介导声波混合，使得腔室320中的混合物与试剂组分2充分混合，完成第二步反应。气泡介导声波混合的效果如图9所示。
液体混合模块可用于均相免疫分析，例如：在第二腔室中加入的试剂组分1；第三腔室中加入的试剂组分2。经过第一次滑动及声波混合后，待测样本中的细胞分泌物与试剂组分1充分混合，完成第一步反应；随后经过第二次滑动及声波混合后，与试剂组分2充分混合，完成第二步反应。反应结束后通过显微成像装置进行检测(所用检测方法参考专利公开号：WO2021169866A1)。所使用的均相免疫分析方法包括但不限于multi-LOCI(WO2021169866A1)、LOCI(10.1007/978-1-4939-3673-1_5)、SPARCL(10.1021/ja312039k)、TR-FRET(10.4155/bio-2020-0258)等方法。
SPARCL(空间邻近分析物试剂捕获发光)是一种邻近依赖性化学发光技术，用于检测两个结合配偶体之间的特定结合相互作用或缔合。在SPARCL分析中，通过化学发光底物(acridan)标记的结合配偶体和通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二种结合配偶体通过特定的结合事件(通常是与目标分析物的结合)彼此接近)。由于吖啶酮与HRP酶非常接近，因此在加入含有过氧化氢和增强剂的触发溶液时会产生化学发光的现象。远离HRP的Acridan偶联抗体不会产生信号。SPARCL可测量分析物及其浓度，其过程在本领域技术人员的常规知识范围内。在一个或多个实施方案中，吖啶酮的捕获抗体和标记有HRP酶的检测抗体作为本文所述的第一试剂，触发溶液溶液作为本文所述的第二试剂)
TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)。TR是时间分辨(Time Resolved)指依靠时间来去除那些寿命较短的荧光，从而分辨目标荧光。FRET是荧光共振能量转移，指在供体和受体相互靠得很近时，光子能从一个受激发的荧光团(供体)转移到另一个荧光团(受体)，并使后者发出荧光。该原理允许开发可快速测量分析物及其浓度的测定法。TR-FRET可测量分析物及其浓度，其过程在本领域技术人员的常规知识范围内。在一个或多个实施方案中，供体荧光团(例如，铕螯合物)的捕获抗体为本文所述的第一试剂，标记有受体荧光团(例如，藻胆蛋白)的检测抗体为本文所述的第二试剂。或者，所述捕获抗体和检测抗体可混合作为第一试剂。
因此，本发明提供一种使用本文所述的芯片检测一种或多种细胞分泌物的一步反应方法，包括步骤：1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的试剂，3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；所述混合优选持续至少30分钟，更优选至少1h，和4)检测所述试剂从而检测感兴趣的分泌物。
本发明还提供一种使用本文所述的芯片检测一种或多种细胞分泌物的多步反应方法，包括步骤：1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的第一试剂，3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；优选持续至少30分钟，更优选至少1h，4)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室230对齐，所述腔室230中含有能与第一试剂特异性结合的第二试剂，5)在腔室230中的流体混合机构140的驱动下，腔室230、320中的流体充分混合；优选持续至少30分钟，更优选至少1h，和6)检测第一试剂和第二试剂的相互作用从而检测感兴趣的分泌物。
示例性实施方式
1、加样
含目标细胞的待测样本通过盖片100的通孔111加入腔室110、210、310。
细胞刺激剂通过盖片100的通孔150加入底片300的腔室320。
偶联有不同捕获抗体的编码微粒-受体珠和检测抗体通过盖片100的通孔121加入腔室220。编码微粒-受体珠是受体颗粒和编码微粒的共组装微球(参见例如专利WO2021169866A1)。
供体珠通过盖片100的通孔131加入凸台130、230。
2、细胞分离计数、刺激孵育
目标细胞被截留在膜400上，废液部分通过240、241排出芯片，部分留在废液腔310中。滑动底片300，使腔室110和210与腔室320与对齐，目标细胞与腔室320中的细胞刺激剂接触，开始刺激孵育。
3、多重免洗细胞因子检测
通过细胞滤膜实现芯片上的血样或其他细胞样本的预处理和刺激孵育，引入多重免洗检测技术，检测过程在均相中发生，无需洗涤，简单两步滑动即可完成反应过程，通过显微成像对编码微粒进行拍照，解码分析，即可得到细胞刺激分泌的一种或多种蛋白的含量。刺激孵育后细胞分泌的细胞因子进入腔室210、320，滑动底片300使腔室320与凸台120和腔室220对齐，开启声波混合装置，发生第一步反应，随后再次滑动使腔室320与凸台130和腔室230对齐，开启声波混合装置进行第二步反应，最后将腔室320滑动至无腔室区域进行显微镜成像。
检测多种细胞分泌物(即多重检测)时，偶联有第一抗体的受体颗粒标记在编码微粒上形成复合微粒，包括两部分，一部分是编码微粒，一部分是抗体偶联的受体颗粒。不同待测分子结合的复合微粒所带有的编码信号(来源于编码微粒)至少有一处不同，使得待测分子种类得以区分；带有的荧光/发光信号(来源于受体颗粒)至少有一处不同，使得待测分子浓度得以区分。其中荧光/发光信号为波长和/或强度。进一步的，编码微粒的编码信号为波长和/或强度，受体颗粒的荧光/发光信号为强度。
在一个或多个实施方案中，检测多种细胞分泌物时，复合微粒包括两种以上发射波长和/或激发波长不同的化学荧光/发光物质。通过带有照相或摄像功能的荧光显微镜观察结果，所述荧光显微镜至少搭载两种激发光源，一种用于编码微粒的信号的激发，另一种用于供体颗粒信号的激发，继而激发受体颗粒荧光/发光。
实施例
实施例1、芯片结构设计及加工
PDMS(聚二甲基硅氧烷)盖片上层100制备方法
使用AutoCAD设计，由CNC加工得到PMMA(聚甲基丙稀酸甲酯)的模具。将PDMS单体和引发剂(道康宁184)以10:1的比例混合，抽真空除气泡后，均匀倒入模具中，70℃烘箱烘2h，随后脱膜，裁剪为合适大小并用打孔器打通孔。
玻璃盖片下层200加工方法
使用AutoCAD设计，通过激光切割加工。
玻璃底片300(德国肖特B270光学玻璃)的加工方法
使用AutoCAD设计掩膜结构并得到掩膜。在万级超净间中采用湿法刻蚀制备底片300。具体步骤如下：
1、掩膜光滑面与光胶(长沙韶光铬版玻璃有限公司SG404WC方形)接触置于玻璃铬板上，放于两块干燥的夹持玻璃块之间。
2、将夹持玻璃置于紫外曝光机中进行曝光12s。
3、在NaOH溶液中浸泡2min以去除已反应的光胶部分，之后取出用流水冲洗；再浸入去铬溶液中约30s，确保去铬完全。
4、用防水胶布贴住玻璃铬板的底面及侧面，置于玻璃刻蚀液(1:0.5:0.75mol/LHF/NH4F/HNO3)中进行玻璃刻蚀，刻蚀温度40℃，摇床频率50rpm。
5、用乙醇清洗刻蚀后的玻璃铬板以完全去除其表面的光胶，再用去铬溶液完全去除玻璃上的铬层，暴露出已刻蚀的玻璃。
实施例2、芯片组装
盖片下层200和底片300疏水化
1、将盖片下层200、底片300芯片放入H2O2/H2SO4(体积比1:2～1:3)的溶液中酸洗约15min。
2、用乙醇清洗芯片，吹干后放入等离子体清洗机(铭恒PDC-MG)2min。
3、准备培养皿和EP管盖，EP管盖中加入二氯二甲基硅烷。
4、将盖片下层和底片放入培养皿，用封口膜封好，硅烷化约1-2h，用氯仿、丙酮、乙醇依次清洗，干燥后保存。
盖片上层100和盖片下层200夹膜键合
1、将膜400(例如parylene-C滤膜)切成合适大小，盖片100、盖片下层200放入plasma 2min。
2、将膜放置在盖片上层100的腔室110的下表面，靠近键合面处，在盖片下层200的上表面键合面滴满超纯水，将盖片100对齐按压到盖片下层200上，用重物压紧，70℃烘箱烘2h。
芯片组装
将盖片10和底片300芯片的腔室110、210、310对齐，上下用夹子/磁铁固定。
实施例3、芯片细胞分离
全血分离白细胞
1、在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液(具体选择见说明书)进行封闭。
2、从盖片上层200的通孔111打入约200μL全血样本并立即用2mL PBS冲洗。膜400是parylene-C滤膜。
3、沉降10min后，大量红细胞沉降在腔室310中。从通孔150打入约15μL PBS。底片300向左滑动，弃用腔室310，将腔室320与110、210对齐，膜400上是从全血中分离出的白细胞，可进行后续实验。
结果如图8所示。
实施例4、膜上Jurkat细胞密度标准曲线建立
1、取约8-9*106个细胞，离心1000rpm 3min，用AIM-V(无血清培养基GIBCO#12055091)清洗2次，重悬为400μL，取20μL细胞加入180μL PBS计数，调整浓度为2*107个/mL。
2、在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液(具体选择见说明书)进行封闭。
3、梯度稀释分别得到4*106个/mL、2*106个/mL、4*105个/mL、2*105个/mL、1*105个/mL不同密度的细胞悬液。
4、打入100μL AIM-V，拍摄背景，每次打入100μL不同密度的细胞悬液并拍照，结果如图10。
实施例5、使用滑动芯片通过一步法TR-FRET建立IL-2标准曲线
所用抗原标准品(huma-IL2即hIL2)、稀释液(Ultra HiBlock Buffer)两种标记抗体(Eu-labeled anti-hIL2 Antibody、ULight labeled anti-hIL2 Antibody)、均来自PerkinElmer#TRF1221。芯片结构如图5所示。
【芯片组】
(1)用1X Ultra HiBlock Buffer稀释Eu-labeled anti-hIL2 Antibody为0.43nM、ULight labeled anti-hIL2 Antibody为4.3nM并等体积混合为反应试剂，将3μg/mL hIL2标准品稀释为不同浓度的抗原溶液。
(2)从通孔111处加入约80μL不同浓度的IL2抗原，通孔121处加入40μL反应试剂(其中Eu-labeled anti-hIL2 Antibody和ULight labeled anti-hIL2 Antibody的终浓度分别为0.3nM和3nM)
(3)初始位置：腔室110、210对齐310或320。(本实施例不涉及细胞分离，不存在废液)底片300向右滑动，使腔室310/320与腔室220组成的第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，室温反应2h。
(4)将反应后液体用移液枪取出35μL到白色384孔板中，使用酶标仪读取TR-FRET信号。
【EP管对照组】
(1)用1X Ultra HiBlock Buffer稀释Eu-labeled anti-hIL2 Antibody为0.43nM、ULight labeled anti-hIL2 Antibody为4.3nM并等体积混合为反应试剂，将3μg/mL hIL2标准品稀释为不同浓度的抗原溶液。
(2)15μL不同浓度的抗原，35μL反应试剂(其中Eu-labeled anti-hIL2 Antibody和ULight labeled anti-hIL2 Antibody的终浓度分别为0.3nM和3nM)枪头吹打(代替声波混合)，室温反应2h。
(3)将反应后液体用移液枪取出35μL到白色384孔板中，使用酶标仪读取TR-FRET信号。
实施例6、使用滑动芯片通过LOCI(发光氧通道免疫分析)检测细胞分泌的细胞因 子
1、LOCI建立单因子标准曲线IL-2
【芯片组】
(1)稀释受体珠-捕获抗体(ABs@IL-2-Ab1)球为100μg/mL，生物素化的检测抗体IL2-Ab2为0.2μg/mL，偶联有SA(链霉亲和素)的供体珠SA-DBs为60μg/mL。稀释IL-2标准抗原，取2μL加入18μL AIM-V，随后梯度稀释得到100/10/1/0.1/0.01的抗原溶液。
(2)从通孔111处加入约80μL不同浓度的抗原，通孔121处加入20μLABs@IL-2-Ab1和20μL的检测抗体IL-2-Ab2，通孔131中加入40μL SA-DBs。
(3)初始位置：腔室110、210对齐310或320。(本实施例不涉及细胞分离，不存在废液)底片300向右滑动，使腔室310/320与腔室220组成的第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，反应时间1h；随后再次滑动，使腔室310/320与凸台130和230组成的第三腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第二步反应，反应时间1h。
(4)将反应后液体用移液枪取出35μL到白色384孔板中，使用酶标仪读取LOCI信号。
【EP管对照组】
(1)稀释受体珠-捕获抗体(ABs@IL-2-Ab1)球为100μg/mL，检测抗体IL-Ab2为0.2μg/mL，偶联有SA的供体珠SA-DBs为60μg/mL。稀释IL-2标准抗原，取2μL加入18μL AIM-V，随后梯度稀释得到100/10/1/0.1/0.01的抗原溶液。
(2)5μL不同浓度的抗原，5μL ABs@IL-2-Ab1，5μL IL-2-Ab2，枪头吹打(代替声波混合)37℃反应1h，随后弃去35μL液体(模拟芯片滑动)，加入35μL SA-DBs，37℃反应1h。
(3)将反应后液体取出35μL到白色384孔板中，使用酶标仪读取LOCI信号。
结果如图11，芯片上IL-2的检测灵敏度和EP相近。
2、LOCI检测细胞分泌的细胞因子IL-2
【芯片组】
(1)在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液(具体选择见说明书)进行封闭。
(2)取1.5mL细胞于15mL离心管离心(1000rpm 3min)后用约4mL AIM-V重悬细胞，再离心2次，最后用1mL AIM-V重悬。
(3)取1.5μL刺激剂(biolegend#423301)，加入373.5μL AIM-V稀释成刺激管。
Control组：300μL细胞+300μL AIM-V
刺激组：300μL细胞+300μL AIM-V-刺激剂
(4)初始位置：腔室110、210对齐310或320。(本实施例不涉及细胞分离，不存在废液)从盖片上层100的通孔111约106个Jurkat control组/刺激组细胞，通过显微镜拍照对膜上细胞进行计数。
(5)37℃刺激16-20h
(6)稀释受体珠-捕获抗体(ABs@IL-2-Ab1)球为100μg/mL，检测抗体IL-2-Ab2为0.2μg/mL，偶联有SA的供体珠SA-DBs为60μg/mL。
(7)从盖片上层121处加入20μL ABs@IL-2-Ab1和20μL的检测抗体IL-2-Ab2，131中加入40μL SA-DBs。
(8)下层310/320向右滑动，与上中层第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，37℃反应1h；随后再次滑动，与上中层第三腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第二步反应，37℃反应1h。
(9)用移液枪将反应后液体取出35μL到白色384孔板中，680nm激发150ms615nm发射，使用酶标仪读取LOCI信号。
【96孔板对照组】
(1)取1.5mL细胞于15mL离心管离心(1000rpm 3min)离心后用约4mL AIM-V(无血清培养基)重悬细胞，再离心2次，最后用AIM-V重悬。
(2)使用细胞计数器制备2.5*106个/mL密度的细胞悬液。
(3)取1.5μL刺激剂(biolegend#423301)，加入373.5μL AIM-V稀释成刺激管。
Control组：300μL细胞+300μL AIM-V
刺激组：300μL细胞+300μL AIM-V-刺激剂
(4)取80μL Jurkat control组/刺激组细胞铺在96孔板中。
(5)37℃刺激16-20h。
(6)稀释受体珠-捕获抗体(ABs@IL-2-Ab1)球为100μg/mL，检测抗体IL-2-Ab2为0.2μg/mL，偶联有SA的供体珠SA-DBs为60μg/mL。
(7)用移液枪将96孔板中液体取出离心400G 3min，取上清液5μL作为检测样本，加入5μL ABs@IL-2-Ab1，5μL IL-2-Ab2，枪头吹打(模拟声波混合)37℃反应1h，随后弃去35μL液体(模拟芯片滑动)，加入35μL SA-DBs，37℃反应1h。
(8)将反应后液体取出35μL到白色384孔板中，680nm激发150ms 615nm发射，使用酶标仪读取LOCI信号。
结果如图12所示，芯片相比96孔板中LOCI信号更高，说明芯片提供了更适宜细胞刺激孵育的环境，细胞活力更高。
实施例7、使用芯片上通过multi-LOCI(多重发光氧通道免疫分析)检测细胞分泌 的细胞因子
1、multi-LOCI的多因子标曲(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6)
(1)每种细胞因子编码微粒-受体珠(MS@ABs@Ab1)为4000个，稀释不同浓度的检测抗体(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6的终浓度分别为0.5、0.1、0.2、0.2μg/mL)，磁球与检测抗体1:1混合得到多重检测试剂1，供体珠稀释至30.2μg/mL得到多重检测试剂2，将四重抗原混合稀释，各取1.5μL加入9μL PBST，随后梯度稀释得到100/10/1/0.1/0.01的多重抗原混合溶液。
(2)初始位置：腔室110、210对齐310或320。(本实施例不涉及细胞分离，不存在废液)从盖片上层100的通孔111处加入约80μL不同浓度的混合抗原，通孔121处加入40μL试剂1，通孔131处加入40μL试剂2。
(3)底片300向右滑动，使腔室310/320与由腔室220组成的第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，反应时间1h；随后再次滑动，使腔室310/320与由凸台130和腔室230组成的第三腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第二步反应，反应时间1h。
(4)反应结束后再次滑动底片300，使腔室310/320至盖片下层的无腔室位置，使用荧光显微镜(搭载了680nm激光器的Olymbus IX83，相机为sCMOS Prime BSI)拍照，对焦到编码微粒，对腔室扫图，GFP、TRIC、LOCI通道曝光时间分别为350ms150ms 3s。使用Matlab对大图进行分割，识别GFP、TRIC通道内的微球并统计两通道的荧光强度，根据两种编码颜色强度的不同识别编码微粒种类，读取每种微球上LOCI通道的信号强度，带入标准曲线，得到不同细胞因子的含量。
结果如图13所示。芯片上四因子的检测限都在1-2pg/mL，灵敏度很高。
2、multi-LOCI检测细胞分泌的多种细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6)
【芯片组】
(1)在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液(具体选择见说明书)进行封闭。
(2)取1.5mL细胞于15mL离心管离心(1000rpm 3min)后用约4mL AIM-V重悬细胞，再离心2次，最后用1mL AIM-V重悬。
(3)取1.5μL刺激剂(biolegend#423301)，加入373.5μL AIM-V稀释成刺激管。
Control组：300μL细胞+300μL AIM-V
刺激组：300μL细胞+300μL AIM-V-刺激剂
(4)初始位置：腔室110、210对齐310或320。(本实施例不涉及细胞分离，不存在废液)从盖片上层100的通孔111约106个Jurkat control组/刺激组细胞，通过显微镜拍照对膜上细胞进行计数。
(5)37℃刺激16-20h
(6)每种细胞因子编码微粒-受体珠为4000个，稀释不同浓度的检测抗体(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6的终浓度分别为0.5、0.1、0.2、0.2μg/mL)，磁球与检测抗体1:1混合得到多重检测试剂1，供体珠稀释至30.2μg/mL得到多重检测试剂2。
(7)从盖片上层121处加入40μL试剂1，131处加入40μL试剂2。
(8)底片300向右滑动，使腔室310/320与由腔室220组成的第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，反应时间1h；随后再次滑动，使腔室310/320与由凸台130和腔室230组成的第三腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第二步反应，反应时间1h。
(9)反应结束后再次滑动底片300，使腔室310/320至盖片下层的无腔室位置，使用荧光显微镜进行拍照，对焦到编码微粒，对腔室扫图，GFP、TRIC、LOCI通道曝光时间分别为350ms 150ms 3s。使用Matlab对大图进行分割，识别GFP、TRIC通道内的微球并统计两通道的荧光强度，根据两种编码颜色强度的不同识别编码微粒种类，读取每种微球上LOCI通道的信号强度，带入标准曲线，得到不同细胞因子的含量。
【96孔板对照组】
(1)取1.5mL细胞于15mL离心管离心(1000rpm 3min)离心后用约4mL AIM-V(无血清培养基)重悬细胞，再离心2次，最后用AIM-V重悬。
(2)使用细胞计数器制备2.5*106个/mL密度的细胞悬液。
(3)取1.5μL刺激剂(biolegend#423301)，加入373.5μL AIM-V稀释成刺激管。
Control组：300μL细胞+300μL AIM-V
刺激组：300μL细胞+300μL AIM-V-刺激剂
(4)取80μL Jurkat control组/刺激组细胞铺在96孔板中。
(5)37℃刺激16-20h。
(6)每种细胞因子编码微粒-受体珠为4000个，稀释不同浓度的检测抗体(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6的终浓度分别为0.5、0.1、0.2、0.2μg/mL)，磁球与检测抗体1:1混合得到多重检测试剂1，供体珠稀释至30.2μg/mL得到多重检测试剂2。
(7)将96孔板中液体取出离心400G 3min，取上清液13μL作为检测样本，加入35μL试剂1，枪头吹打(模拟声波混合装置)，37℃反应1h；随后沉降10min，弃去35μL(模拟芯片滑动)，加入35μL试剂2，37℃反应1h。
(8)反应结束后再次沉降20min，取10μL滴于载玻片上使用荧光显微镜进行拍照，GFP、TRIC、LOCI通道曝光时间分别为350ms 150ms 3s。使用Matlab对大图进行分割，识别GFP、TRIC通道内的微球并统计两通道的荧光强度，根据两种编码颜色强度的不同识别编码微粒种类，读取每种微球上LOCI通道的信号强度，带入标准曲线，得到不同细胞因子的含量。
结果如图14所示，对比96孔板，以IL-2为例，96孔板孵育并通过模拟滑动进行检测其分泌量约为1.5ng/mL，而在芯片中孵育并通过滑动检测分泌量可达10ng/mL，分泌量大大提升，灵敏度提高。芯片中刺激组信号强度整体高于96孔板，说明细胞在芯片中活力更好，得到了更为充分的刺激孵育。
实施例8、在滑动芯片上分离全血中的白细胞并进行刺激分泌的多重细胞因子检 测
1、在盖片下层200和底片300的缝隙间加入油相溶液(具体选择见说明书)进行封闭。
2、初始位置：腔室110、210对齐310(本实施例涉及细胞分离，存在废液)从盖片上层100的通孔111打入约100μL全血样本并用2mL PBS冲洗，静置10min让红细胞充分沉降。
3、从盖片上层100的通孔150打入约15μL AIM-V或15μL PHA/AIM-V使得培养基充满320，底片300向左滑动，110、210对准320。
4、从盖片上层100的通孔111打入约2mL AIM-V清洗截留细胞
5、取PHA加入1mL AIM-V稀释为10μg/mL溶液
6、取100μL PHA/AIM-V置换缓冲溶液(若步骤3时直接打入PHA/AIM-V溶液，滑动后则无需置换步骤)，37℃刺激16-20h
7、每种细胞因子编码微粒-受体珠为4000个，稀释不同浓度的检测抗体(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6的终浓度分别为0.5、0.1、0.2、0.2μg/mL)，磁球与检测抗体1:1混合得到多重检测试剂1，供体珠稀释至30.2μg/mL得到多重检测试剂2。
8、从盖片上层100的通孔121处加入40μL试剂1，通孔131处加入40μL试剂2。
9、底片300向右滑动，使腔室320与由腔室220组成的第二腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第一步反应，反应时间1h；随后再次滑动，使腔室320与由凸台130和腔室230组成的第三腔室对齐，启动声波混合装置，样本与试剂充分混合进行第二步反应，反应时间1h。
10、反应结束后再次滑动底片300，使腔室320至盖片下层的至上中层无腔室位置，使用荧光显微镜进行拍照，对焦到编码微粒，对腔室扫图，GFP、TRIC、LOCI通道曝光时间分别为350ms 150ms 3s。使用Matlab对大图进行分割，识别GFP、TRIC通道内的微球并统计两通道的荧光强度，根据两种编码颜色强度的不同识别编码微粒种类，读取每种微球上LOCI通道的信号强度，带入标准曲线，得到不同细胞因子的含量。
结果如图15所示。

Claims (10)

1.一种集成式滑动芯片，其特征在于，所述芯片通过多层芯片和多个功能腔室将细胞分离培养、一种或多种细胞分泌物的检测等功能集成在一个装置上，大幅减少人为操作、提高检测灵敏度，
优选地，所述多个功能腔室包括细胞分离培养腔室，其通过层间的微孔滤膜实现细胞分离，废液处理和样本采集在不同的腔室或流路中分别进行，并且腔室环境适宜细胞培养，
优选地，所述多个功能腔室包括反应及检测腔室，其通过层间滑动和液体混合装置使样本与一种或多种反应试剂实现相互接触、扩散、反应或隔离等流体控制，并通过信号读取装置进行检测。
2.如权利要求1所述的集成式芯片，其特征在于，所述芯片是多层微流控芯片，所述芯片包含能相对滑动的盖片10和底片300，其中盖片10包含盖片上层100和盖片下层200，
盖片上层100的下表面设置有非贯通腔室110和流体混合机构140，
盖片下层200设置有贯通腔室210、220，腔室210与盖片上层100的腔室110配合，其横截面区域小于腔室110；腔室220位于一个或多个所述流体混合机构140的下方；盖片下层200的下表面还设置有凹陷通道240，
盖片上层100和盖片下层200相互固定和密封，腔室210与腔室110之间设置有膜400，
底片300设置有凹陷腔室310和320，腔室310与腔室210配合，腔室310的横截面区域大于腔室210，腔室310超出腔室210的区域能与凹陷通道240流体连通；腔室320与腔室220配合，腔室320的横截面区域大于腔室220，腔室320超出腔室220的区域能与凹陷通道240流体连通。
3.如权利要求2所述的集成式芯片，其特征在于，
腔室110的形状使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布；优选地，腔室110中流体流入的流道宽度从流体入口逐渐增大；更优选地，腔室110的形状为三角形、喇叭形、五边形、六边形或梭形，和/或
盖片上层100的下表面设置有凸台120，腔室220下方的流体混合机构140位于凸台120内，和/或
盖片上层100的材料选自PDMS(聚二甲基硅氧烷)和PS(聚苯乙烯)，和/或
盖片100上还设置有通孔111、112、150、121，通孔111与腔室110和腔室210流体连通，通孔121与凸台120和腔室220流体连通，
优选地，
盖片下层200还设置有贯通腔室230，腔室220和腔室230中一个或二者位于一个或多个所述流体混合机构140的下方；盖片上层100的下表面设置有凸台130，腔室230下方的流体混合机构140位于凸台130内；盖片100上还设置有通孔131，通孔131与凸台130和腔室230流体连通。
4.如权利要求1-3中任一项所述的集成式芯片，其特征在于，
(1)流体混合机构140是由气泵、蠕动泵产生驱动力进行液体混合的机构，
(2)流体混合机构140是通过磁性吸附进行液体混合的机构，
(3)流体混合机构140是通过介电泳进行液体混合的机构，或
(4)流体混合机构140是气泡生成机构，其具有一个或多个凹陷；
优选地，所述凹陷的深宽比大于0.2，
优选地，所述凹陷包括圆形凹陷、矩形凹陷或三角形凹陷，
更优选地，凹陷是深度约0.5mm，直径约0.7mm的圆形凹陷。
5.如权利要求4所述的集成式芯片，其特征在于，盖片100的上表面设置有压电换能片500，其位于流体混合机构140的上方，用于激励气泡介导声波混合，
优选地，所述压电换能片由锆钛酸铅、钛酸钡、偏铌酸铅制成，
优选地，凹陷与换能片500之间的距离小于2mm，更优选小于1mm。
6.如权利要求1-3中任一项所述的集成式芯片，其特征在于，所述芯片具有选自以下的一项或多项特征：
盖片下层200的材料是低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料，优选地，盖片下层200的材料选自以下的一种或多种：玻璃、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)、塑料COP/COA(环氧烯烃)，
盖片下层200厚度至少0.5mm，优选为1mm，
腔室220和腔室230分别与凸台120和凸台130间隙配合，
腔室210的横截面区域不覆盖腔室110中流体流入的通道，
盖片上层100与盖片下层200通过等离子体处理而相互固定和密封，
盖片上层100与盖片下层200通过压力固定和密封，
膜400的孔径为2-10μm，
膜400可以是聚砜膜、聚碳酸酯膜、或其他通过微加工得到的多孔膜；优选地，膜400是parylene-C滤膜，
盖片下层200的凹陷通道240的深度至少0.2mm，
盖片下层200还设置有通孔221、231、241、250，分别与通孔121、131、112、150流体连通。
7.如权利要求1-3中任一项所述的集成式芯片，其特征在于，所述集成式芯片具有选自以下的一项或多项特征：
腔室310和腔室320的深度至少0.1mm，
底片300的材料是低摩擦系数、表面光滑、透光性好的硬质材料，优选选自以下的一种或多种：玻璃、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PS(聚苯乙烯)、PC(聚碳酸酯)、塑料COP/COA(环氧烯烃)，
底片300厚度至少0.5mm，优选1.5mm，
腔室320的形状使得注入的流体逐渐散开并形成大致匀速的流体分布；优选地，腔室320中流体流入的流道宽度从流体入口逐渐增大；更优选地，腔室320的形状为五边形、六边形或梭形，
盖片下层200和底片300的缝隙间设置有不与试剂或样品混溶的流体，以防止盖片下层200和底片300的相对滑动过程中试剂或样品漏出；优选地，所述不与试剂或样品混溶的流体包括烃类或氟化物质，例如烷烃、氟烃、氟化铀，更优选地，所述不与试剂或样品混溶的流体选自以下的一种或多种：己烷、十六烷、矿物油和石蜡油。
8.如权利要求1-3中任一项所述的集成式芯片，其特征在于，
腔室110为三角形、喇叭形、梭形或五边形，分为流体入口111近端的三角形部分和远端的长方形部分，
腔室210形状为长方形，与腔室110的长方形部分对齐，
腔室220和/或腔室230为六边形，
凸台120和/或凸台130为六边形，
腔室310形状为五边形，分为流体出口近端的三角形和远端的长方形，腔室310长方形部分与腔室110的长方形部分和腔室210对齐，通过盖片100与底片300之间的相对滑动，流体出口近端的三角形部分能与凹陷通道240流体连通，
腔室320形状为六边形，
凹陷通道240为水平或弯曲流道结构，优选蛇形结构。
9.使用权利要求1-8中任一项所述的芯片分离和/或处理细胞的方法，包括步骤：
1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品，所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔，
任选地2)从通孔111加入洗涤液，
3)待样品滤出液离开腔室110或210，分离的感兴趣细胞位于膜400上，
或
1)从盖片上层100的通孔111加入含感兴趣细胞的样品，所述感兴趣细胞无法通过膜400的孔，
任选地2)从通孔111加入洗涤液，
3)从通孔150向腔室320加入处理细胞的试剂，
4)待样品滤出液离开腔室210，使底片300与盖片10相对滑动，从而使得腔室320与腔室110、210对齐，使用腔室320中的试剂处理所述感兴趣细胞，
优选地，所述处理包括使用洗涤液洗涤细胞、使用刺激剂刺激细胞或使用培养基培养细胞。
10.一种使用权利要求1-8中任一项所述的芯片检测一种或多种细胞分泌物的方法，包括步骤：
1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，
2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的试剂；优选地，所述试剂包含供体荧光团的捕获抗体和标记有受体荧光团的检测抗体，
3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；所述混合优选持续至少10分钟，更优选1h，
4)检测所述试剂从而检测感兴趣的分泌物，
或
1)腔室320与腔室210对齐，在腔室320中收集膜400上的细胞的培养液，
2)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室220对齐，所述腔室220中含有能与待测分泌物特异性结合的第一试剂，
3)在腔室220中的流体混合机构140的驱动下，腔室220、320中的流体充分混合；所述混合优选持续至少10分钟，更优选1h，
4)使底片300与盖片10相对滑动，从而使腔室320与腔室230对齐，所述腔室230中含有能与第一试剂特异性结合的第二试剂，
5)在腔室230中的流体混合机构140的驱动下，腔室230、320中的流体充分混合；所述混合优选持续至少10分钟，更优选1h，
6)检测第一试剂和第二试剂的相互作用从而检测感兴趣的分泌物，
第一或第二试剂包括以下一种或多种：带有功能基团的捕获抗体颗粒、带有功能基团的检测抗体颗粒、能与功能基团相互作用的辅助试剂，
优选地，所述捕获抗体颗粒中，所述功能基团包括选自以下的一种或多种：小分子、螯合物、蛋白质、微球；所述检测抗体颗粒中，所述功能基团包括选自以下的一种或多种：小分子、螯合物、蛋白质、微球；所述辅助试剂包括选自以下的一种或多种：过氧化氢、增强剂；
更优选地，所述方法包括选自以下的一项或多项特征：
第一、第二试剂中抗体均能与待测分泌物特异性结合，通过待测分泌物与抗体间的特异性结合，使捕获抗体颗粒与检测抗体颗粒靠近，经辅助试剂或激光作用发生能量传递，由此产生可检测的信号，
所述细胞是免疫细胞或肿瘤细胞，
所述细胞分泌物是细胞因子或由所述细胞分泌的各种蛋白分子，优选包括IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-6中的一种或多种，
步骤6)包括，检测颗粒的发光，从而检测待测分泌物。
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