CN108918500B - 基于免疫磁珠标记的sers分选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，包括：S1.在每种目标细胞均特有的表面受体上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的免疫磁珠；S2.筛选出目标细胞；S3.根据每种目标细胞所特有的表面受体，分别在每种目标细胞上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的SERS‑TAG；S4.分别对标记后的每个目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类，根据目标细胞的种类对目标细胞进行分类。本发明能够在一次检测中完成多种CTC检测，且能大大减少表面增强拉曼检测的数量及SERS‑TAG的用量，减少光学检测时间,并节约成本。
Description
技术领域
本发明属于细胞分选和光学工程的交叉技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠标记的SERS分选方法。
背景技术
免疫磁珠在分子及细胞生物学方面已得到了广泛应用，包括核酸提取、特定蛋白质与细胞的分选和富集等。以基于免疫磁珠的细胞分选为例，该过程共分为四个步骤：(1)用特异性配体或抗体对磁珠进行表面修饰；(2)将经过修饰的磁珠通过抗原—抗体反应或配体—受体结合反应与样品中目标细胞进行结合；(3)通过磁力吸附磁珠—细胞结合体；(4)通过冲洗等手段除去其它细胞。
现有基于免疫磁珠的细胞筛选技术直接通过磁力对磁珠进行吸引，导致其对于与细胞结合的免疫磁珠和未结合的免疫磁珠没有区分能力，在对磁珠进行表面增强拉曼、杂散磁场测量等进一步定性/定量检测时无法除去由未结合的磁珠引起的噪声信号，限制了免疫磁珠的进一步应用。
在实验室研究中，国际顶尖研究单位已通过在磁传感器上表面制备特异性抗体的方式，与目标细胞表面抗原结合，从而将目标细胞成功捕获在磁传感器上方。再通过流体冲洗，就可以实现磁标记细胞的筛选。
但是，现有实验室磁传感器的检测方案中，依靠目标细胞表面抗原和传感器上方抗体的结合来实现目标细胞的捕获，并依靠流体冲刷来除去未结合的磁珠。该方案可以除去其它细胞与未结合的磁珠，但难以保证微量目标细胞被成功捕获。并且，这一方案使用了化学结合的方式，对循环肿瘤细胞等极微量的细胞难以保证成功捕获，这样就会在诊断中引起误诊。另外，这种通过抗体—抗原结合捕获目标细胞的方法需要人工参与，而且必须需要专业的技术人员才能够完成，不利于集成，无法满足大数据时代的信息化需求。
另外，采用免疫磁珠对目标细胞上特有的抗原或受体进行标记，这种方法在特定情况下只能分选出一种目标细胞,无法确认全血样品中是否含有其他种类肿瘤细胞。但是在实际应用中，例如对全血样品进行肿瘤细胞检测时，只分离出一种肿瘤细胞，不足以确认全血样品中是否还含有其他种类的肿瘤细胞，无法进一步为肿瘤细胞的检测(例如DNA测序等)提供准确的检测样品信息。同时，不同的肿瘤细胞上也可能存在相同的抗原或受体，用免疫磁珠标记后可以一次分选出多种肿瘤细胞，此时，难以确定肿瘤细胞的具体种类，无法为后续癌症诊断提供准确的检测样品信息，进而节省后续检测周期及成本。而直接利用SERS检测，需要使用大量SERS-TAG进行标记，造成浪费，且通过光学系统时间非常长，效率极低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，该方法采用物理的方式实现细胞筛选，极大的提高目标细胞的捕获率，且能够在一次检测中完成多种CTC检测，且能大大减少表面增强拉曼检测的数量及SERS-TAG的用量，减少光学检测时间并节约成本。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，包括如下步骤：
一种基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，包括如下步骤：
S1.在每种目标细胞均特有的表面受体上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的免疫磁珠；
S2.筛选出目标细胞；
S3.根据每种目标细胞所特有的表面受体，分别在每种目标细胞上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的SERS-TAG(表面增强拉曼标记)；
S4.分别对标记后的每个目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类，根据目标细胞的种类对目标细胞进行分类。
进一步地，将经过步骤S1标记后的目标细胞通过细胞筛选装置进行筛选，所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体，所述腔体中充满了细胞缓冲液；筛选的具体操作步骤为：
S21.将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中；
S22.对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡，将免疫磁珠吸入上层腔体，目标细胞吸附在细胞筛的下表面；
S23.分别冲洗得到包含游离的免疫磁珠的溶液、包含其他细胞的溶液和包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地，所述步骤S23的具体操作步骤为：
S231.撤销纵向磁场和横向振荡，对上层腔体进行冲洗，得到包含游离的免疫磁珠的溶液；
S232.施加纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含其他细胞的溶液；
S233.撤销纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地，所述步骤S23的具体操作步骤还可以为：
S231.撤销横向振荡，对下层腔体进行冲洗，得到包含其他细胞的溶液；
S232.撤销纵向磁场，对上层腔体进行冲洗，得到包含游离的免疫磁珠的溶液，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
进一步地，所述纵向磁场由永磁体、软磁体或者电磁体产生。
进一步地，所述横向振荡包括横向振荡磁场和/或横向振荡波和/或横向交变水流。
进一步地，所述样品输入以及冲洗的操作是通过注射泵或者微流泵来实现的。
进一步地，在步骤S4中，将步骤S3标记后的目标细胞经过微流系统进行分类，所述微流系统包括输入通道以及与输入通道相连通的若干输出通道，输入通道上设置有拉曼检测点，所述步骤S4的具体操作步骤为：
S41.使目标细胞在输入通道内形成单细胞流；
S42.对经过拉曼检测点的目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类；
S43.根据目标细胞的种类，对目标细胞施加物理场力，将不同种类的目标细胞分离至不同的输出通道内进行收集。
进一步地，所述步骤S43中，对细胞施加的物理场包括电场、磁场、光场和流体场。
进一步地，所述拉曼检测点设置有拉曼光谱仪。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
(1)本发明的方法通过两次在目标细胞表面标记，第一次标记免疫磁珠能够同时对所有目标细胞进行筛选，第二次标记不同的SERS-TAG则能够对目标细胞按种类完成分选。本发明的方法能够在一次检测中检测出多种目标细胞，并将它们按照种类分选出来，能够为疾病诊断提供准确的检测结果，提高了免疫磁珠在临床检测上的应用；
(2)本发明使用物理方式实现细胞筛选，通过对磁场梯度、冲洗流速、腔体尺寸的调整，实现目标细胞的高捕获率，将大大提高了目标细胞的筛选效果。同时，自由免疫磁珠的筛出可实现高信噪比磁性细胞检测；
(3)本发明的方法操作简便，难度小，而且，用于完成本发明方法的装置容易集成传感器，能够满足大数据时代的信息化需求。
附图说明
图1为甲目标细胞和乙目标细胞及其上的表面受体示意图；
图2为细胞筛选装置的一种结构示意图；
图3为筛选步骤操作示意图；其中，(a)为步骤S21的操作示意图；(b)为步骤S22的操作示意图；(c)为步骤S231的操作示意图；(d)为步骤S232的操作示意图；(e)为步骤S233的操作示意图；
图4为基于SERS的细胞微流分选系统示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，包括如下步骤，
S1.在每种目标细胞均特有的表面受体上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的免疫磁珠；
以全血细胞为例，假设需要检测的目标细胞有甲目标细胞和乙目标细胞两种，选择表面受体时，要选择甲目标细胞和乙目标细胞上均所特有的表面受体，即为甲目标细胞和乙目标细胞上均具有的表面受体，而这个表面受体是在其他的细胞上均没有的。如图1所示，不同于其他细胞，甲目标细胞所特有的表面受体为a’、b’和c’，乙目标细胞所特有的表面受体为a’、b’和d’，那么表面受体a’和b’均为甲目标细胞和乙目标细胞均所特有的，可以选择其一当做表面受体，比如选择表面受体a’，表面受体a’配对的抗体为a，则用抗体a修饰免疫磁珠，然后用修饰后的免疫磁珠去标记甲目标细胞和乙目标细胞。
其中，免疫磁珠的材料可为四氧化三铁等磁性材料，磁珠外层设置有包被，包被的材料可为聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、多糖等包被材料，在本实施例中，磁珠采用四氧化三铁制成，直径为20纳米，磁珠外层由聚苯乙烯包被。
S2.筛选出目标细胞；
将经过步骤S1标记后的目标细胞通过细胞筛选装置进行筛选。如图2所示的细胞筛选装置，细胞筛选装置包括内部中空的长方体状壳体，壳体内部水平设置一层细胞筛将壳体分割成上层腔体和下层腔体，腔体内充满了磷酸盐缓冲液PBS。细胞筛选装置的左侧，配对下层腔体设置有进样口；细胞筛选装置的右侧，配对上层腔体和下层腔体分别设置有上层出样口和下层出样口。
在本实施例中，将细胞筛选装置的壳体设置为长方体状，仅为一种优选方式，当然，细胞筛选装置的壳体可是圆柱形、正方体等规则形状，还可以是任何不规则形状，本领域的技术人员可根据需要具体设置。
其中，细胞筛可由硅片制成，也可由聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯等其他可行材料制成。对于细胞筛的材料，网孔的形状、尺寸和排布无硬性要求，只要网孔的尺寸介于目标细胞的直径与免疫磁珠的直径之间即可，网孔的形状一般为圆形或者是狭缝型，网孔可通过纳米压印或者光刻等技术制备而成。在本实施例中，细胞筛选用650微米厚的硅片经光刻技术制备而成。而网孔选用狭缝型，具体采用长为28微米，宽8微米的矩形网孔，网孔间间距为8微米。
筛选的具体步骤如下：
S21.如图3(a)所示，将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中。
S22.如图3(b)所示，对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡，将免疫磁珠吸入上层腔体，目标细胞吸附在细胞筛的下表面。
纵向磁场的作用是通过磁场对免疫磁珠吸引，使得游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞向上运动，纵向磁场一般由永磁体、软磁体或者电磁体产生。横向振荡的作用是使得游离的免疫磁珠轻微晃动，进而使得免疫磁珠在经过细胞筛时，具有高的通过率。横向振荡可以是磁场产生横向振荡磁场，也可以是一种横向振荡波，包括微波、超声波等。在本实施例中，选定纵向磁场由钕铁硼材料制成的永磁铁产生，钕铁硼磁铁具有优异的磁性能，表面剩余磁化强度可达2000Oe。横向振荡由电磁铁产生横向振荡磁场提供，电磁铁结构简单，容易控制，并且可通过调整磁力线圈的匝数和缠绕直径来调整磁场的大小，通常振荡频率设置在1-100HZ。在本实施例中，选用100Oe，100HZ的振荡梯度磁场即可，用于向磁珠施加横向磁力，提高筛出率。
在进行步骤S21之前，在细胞筛选装置的两侧，分别设置磁力线圈，并通电，在细胞筛选装置上层腔体的一侧放置钕铁硼磁铁。
施加磁场后，游离的免疫磁珠和被免疫磁珠标记的目标细胞在磁场的作用力下，均朝向细胞筛运动，游离的免疫磁珠直径通常小于500nm，远小于细胞筛的网孔尺寸，因此可顺利通过网孔进入到上层腔体，而被免疫磁珠标记的目标细胞直径通常在15μm以上(如肿瘤细胞)大于细胞筛的网孔，因此被细胞筛所阻挡。在本实施例中，细胞筛如果选用圆形设计，那么有一部分细胞筛的网孔就会被目标细胞完全所阻挡，可能有一部分游离的磁珠就会滞留在下层腔体中，而选用矩形网孔则不会出现这个问题，被免疫的磁珠标记的目标细胞虽然由于磁场的作用而吸附在细胞筛上，但是因为形状不同，不会将矩形的网孔完全阻塞，由于免疫磁珠的体积相对于被免疫磁珠标记的目标来说要小得多，因此免疫磁珠能够顺利的通过网孔，提高了磁珠的筛出率。
进一步地，所述步骤S23的具体操作步骤为：
S231.如图3(c)所示，撤销磁场纵向磁场和横向振荡，对上层腔体进行冲洗，得到包含有游离的免疫磁珠的溶液，对上层腔体进行冲洗，得到包含有游离的免疫磁珠的溶液。
将磁场纵向磁场和横向振荡撤销，游离的免疫磁珠受到的磁场作用力消失，通过对上层腔体冲洗，能够容易得到只包含有游离的免疫磁珠的溶液。
S232.如图3(d)所示，施加纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含有其他细胞的溶液。
施加纵向磁场，由于磁场的吸附作用，以及细胞筛的阻挡作用，被免疫磁珠标记的目标细胞被牢牢的吸附在细胞筛的下侧面，此时选择合适的流速对下层腔体冲洗，即可得到包含有其他细胞的溶液。
S233.如图3(e)所示，撤销纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
撤销纵向磁场，被免疫磁珠标记的目标细胞受到的磁场作用力消失，通过对下层腔体冲洗，即可得到只包含有被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
上述样品的输入，以及对上、下层腔体的冲洗，一般是通过泵来实现的，例如，当细胞筛选装置是宏观装置时，可以采用注射泵；当细胞筛选装置是微观装置时，可以采用微流泵。本实施例通过注射泵控制液体样品的流动，从而得到包含不同种类的溶液。
S3.根据每种目标细胞所特有的表面受体，分别在每种目标细胞上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的SERS-TAG；
在步骤S3中选择每种目标细胞所特有的表面受体去标记，以区分不同的目标细胞，如图1所示，甲目标细胞所特有的表面受体为b’和c’，分别配对的抗体为b和c；乙目标细胞所特有的表面受体只有b’，表面受体b’配对的抗体为b。用抗体b和c修饰不同的SERS-TAG，形成b-SERS-TAG1和c-SERS-TAG2两种修饰物，然后用修饰后的SERS-TAG去标记目标细胞，此时两种目标细胞的标记是不同的，甲目标细胞带有SERS-TAG1和SERS-TAG2的标记，而乙目标细胞只带有SERS-TAG1标记，这样就可以通过SERS谱图将两种细胞区分开来。
S4.分别对标记后的每个目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类，根据目标细胞的种类对目标细胞进行分类。具体参考图4。
步骤S4的具体操作步骤为：
S41.使目标细胞在输入通道内形成单细胞流；
步骤S41的具体实现方法有，将目标细胞以单细胞流的形态输进输入通道内，或者将输入通道的尺寸设置为只允许单细胞通过。虽然将输入通道的尺寸设置成只允许单细胞通过也能使输入样品在输入通道内形成单细胞流，但是在实际操作中，输入通道的入口处容易被黏连在一起的细胞团阻塞，因此在本实施例中采用将输入样品以单细胞流的形态输进输入通道内。
S42.对经过拉曼检测点的目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类；
在拉曼检测点上设置有拉曼光谱仪，拉曼光谱仪用于发射拉曼光谱，并接收拉曼散射光谱。
输入样品在输入通道内形成单细胞流，当单个目标细胞通过拉曼检测点时，拉曼光谱照射到该目标细胞上，会发生拉曼散射，对检测到的拉曼散射光谱进行分析，通过其中拉曼峰的大小和位置确定细胞的种类。
S43.根据目标细胞的种类，对目标细胞施加物理场力，将不同种类的目标细胞分离至不同的输出通道内进行收集。
为了将不同种类的目标细胞分类收集，因此设置一个输入通道配对若干个输出通道，根据检测到的目标细胞的种类，对目标细胞施加物理场力，驱动不同种类的目标细胞以进入不同的输出通道内。
其中，对细胞施加的物理场包括电场、磁场、光场和流体场，可以通过调节物理场力的大小和方向驱动不同种类的细胞进入到配对的输出通道内。
本实施例通过磁珠先将多种CTC粗分选出来，再通过SERS将CTC的种类细分出来。先利用磁珠，将多种CTC从大量的血细胞中筛选出来，因此与SERS孵育的细胞量大大减少，从而减少SERS用量，也就不需要全部血液细胞都通过光学系统。相对于现有技术的化学筛选方式，该步骤使用物理方式实现细胞筛选，通过对磁场梯度、冲洗流速、腔体尺寸的调整，将大大提高了微量目标细胞的筛选效果。同时，自由免疫磁珠的筛出，可实现高信噪比磁性细胞检测。而且本发明的方法能够在一次检测中检测出多种目标细胞，并将它们按照种类分选出来，能够为疾病诊断提供准确的检测结果，提高了免疫磁珠在临床检测上的应用。同时可以为后续目标细胞检测(例如DNA检测)提供明确分类的测试样本，进而提高后续检测的效率。
实施例2
实施例2与实施例1的不同之处在于，本实施例中横向振荡选用横向振荡微波，由微波发生器产生。免疫磁珠在横向微波的作用力下，轻微晃动，免疫磁珠经过细胞筛的速率和通过率都很高。
实施例3
实施例3与实施例1的不同之处在于，本实施例中横向振荡选用横向交变水流。免疫磁珠在横向交变水流的作用力下，轻微晃动，免疫磁珠经过细胞筛的速率和通过率都很高。
实施例4
实施例4与实施1的不同之处在于，在本实施例中，步骤S23具体为：
步骤S231，撤销横向振荡，对下层腔体进行冲洗，得到包含其他细胞的溶液；
步骤S232，撤销纵向磁场，对上层腔体进行冲洗，得到包含游离的免疫磁珠的溶液，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
实施例4中的操作步骤更加简便。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1.在每种目标细胞均特有的表面受体上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的免疫磁珠；
S2.筛选出目标细胞：
将经过步骤S1标记后的目标细胞通过细胞筛选装置进行筛选，所述细胞筛选装置的主体结构被一层细胞筛分割成上层、下层腔体，所述腔体中充满了细胞缓冲液；筛选的具体操作步骤为：
S21.将包含有游离的免疫磁珠、被免疫磁珠标记的目标细胞和其他细胞的样品输入到细胞筛选装置的下层腔体中；
S22.对细胞筛选装置施加纵向磁场和横向振荡，将免疫磁珠吸入上层腔体，目标细胞吸附在细胞筛的下表面；
S23.分别冲洗得到包含游离的免疫磁珠的溶液、包含其他细胞的溶液和包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液；
S3.根据每种目标细胞所特有的表面受体，分别在每种目标细胞上，标记修饰有与该表面受体配对的抗体的表面增强拉曼标记SERS-TAG；
S4.分别对标记后的每个目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类，根据目标细胞的种类对目标细胞进行分类。
2.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，所述步骤S23的具体操作步骤为：
S231.撤销纵向磁场和横向振荡，对上层腔体进行冲洗，得到包含游离的免疫磁珠的溶液；
S232.施加纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含其他细胞的溶液；
S233.撤销纵向磁场，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
3.根据权利要求2所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，所述步骤S23的具体操作步骤为：
S231.撤销横向振荡，对下层腔体进行冲洗，得到包含其他细胞的溶液；
S232.撤销纵向磁场，对上层腔体进行冲洗，得到包含游离的免疫磁珠的溶液，对下层腔体进行冲洗，得到包含被免疫磁珠标记的目标细胞的溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于：所述纵向磁场由永磁体、软磁体或者电磁体产生。
5.根据权利要求1-3任一项所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于：所述横向振荡包括横向振荡磁场和/或横向振荡波和/或横向交变水流。
6.根据权利要求1-3任一项所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于：所述样品输入以及冲洗的操作是通过注射泵或者微流泵来实现的。
7.根据权利要求1所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，在步骤S4中，将步骤S3标记后的目标细胞经过微流系统进行分类，所述微流系统包括输入通道以及与输入通道相连通的若干输出通道，输入通道上设置有拉曼检测点，所述步骤S4的具体操作步骤为：
S41.使目标细胞在输入通道内形成单细胞流；
S42.对经过拉曼检测点的目标细胞进行表面增强拉曼检测以确定其种类；
S43.根据目标细胞的种类，对目标细胞施加物理场力，将不同种类的目标细胞分离至不同的输出通道内进行收集。
8.根据权利要求7所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，所述步骤S43中，对细胞施加的物理场包括电场、磁场、光场和流体场。
9.根据权利要求7所述的基于免疫磁珠标记的SERS分选方法，其特征在于，所述拉曼检测点设置有拉曼光谱仪。
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