CN105713898A - 超敏微量目标物质自动提取/检测方法 - Google Patents

超敏微量目标物质自动提取/检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超敏微量目标物质自动提取/检测方法，首先使用待检测容器收集待检测样本，并加入包被处理过的磁珠，然后将套置有磁珠吸附膜的搅拌杆插入待检测容器内的待测样本中，通过搅拌杆的旋转，使加入的磁珠与待检测样本中的目标物质增加特异吸附的机会，通过搅拌杆充磁，吸合磁珠，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体特异结合，通过搅拌杆去磁并旋转，脱去吸附膜表面未特异结合的磁珠；将搅拌杆磁珠吸附膜上吸附的磁珠在洗脱液中洗脱，完成提取工作；将洗脱液中磁珠放入磁检测器中进行检测，比较检测线圈及参考线圈上感应信号的差异，可获得检测磁珠顺磁材料介入引起的感应信号变化，从而报告磁珠标记的生物信号的量，产生并报告检测信息。

Description

超敏微量目标物质自动提取/检测方法
技术领域
本发明涉及各种生命体液或生物制品中特定蛋白/细胞/微生物/DNA及RNA等生物信息物的提取、富集及检测方法。
背景技术
生物样本(如血液、尿液、脑脊液、胸腹水及其它动物/植物提取液)、生物制品中特定微量物质的提取及检测是一个即使依赖“高精”设备也未必能够完美实现的技术难点。
为实现生物样本、生物制品中特定微量物质的提取，现有的实验室技术方法及实现装备有离心法、萃取法、薄膜过滤法、手动磁富集法等。这些方法由于其原理或技术上的限制，或多或少存在以下几个方面的缺陷：
⑴仪器体积大；
⑵提取效率低；
⑶提取纯度不够高；
⑷对样本要求高，往往需要复杂的样本预处理；
⑸操作繁琐，速度慢，往往需要较大的实验室人力投入。
以上方法由于其较低的提取效率及纯度、较长的提取时间及繁琐的提取操作过程，在不同的领域都程度不同的限制了提取装置及被提取物质的广泛、深入的应用。
为实现生物样本、生物制品中特定微量物质的富集、检测，现有的实验室技术方法及实现装备有酶联免疫法、化学发光法、纳米金标记法、荧光标记法、磁标记法、比色法、比浊法、层析法等。这些方法由于其原理或技术上的限制，或多或少存在以下几个方面的缺陷：
⑴检测背景高，难以排除干扰物质的影响，很难给出精确的结果；
⑵仪器体积大需要较大的实验室专用空间；
⑶检测结果难以精确定量；
⑷灵敏度不够高，对一些特定的微量物质难以给出检测结果；
⑸对样本要求高，需要复杂的样本预处理；
⑹操作繁琐。
其中灵敏度不够高及检测背景较高的技术门槛限制了生物样本、生物制品中特定微量物质的检出及精准检测，妨碍了这些生物信息物检测技术及装置在各领域的进一步推广应用。
生物样本、生物制品，尤其是成分复杂、体积较大、有污染的生物样本、生物制品中特定物质，尤其是微量物质的检测、分析呼唤高效率、高纯度、快速简便及超敏的提取技术和高灵敏度、零背景、简便快捷的检测技术。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的不足而提供一种能够快速提取及检测各种生命体液或生物制品中特定蛋白/细胞/微生物/DNA及RNA等生物信息物的方法，其中，磁标记并检测后的目标物质没有被破坏其结构或生物活性，可以被计量后用于进一步的培养、分析。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种超敏微量目标物质自动提取/检测方法，包括：
1)样本的准备：使用待检测容器收集待检测样本，并加入包被处理过的磁珠，该磁珠可以与待检测样本中的目标物质发生特异结合。所述的待检测容器可以为试管、离心管、以及其他器皿，待测样本可以为血液；
2)吸附膜的准备：将磁富集仪器的搅拌杆上套置磁珠吸附膜，磁珠吸附膜预先进行过表面修饰，使磁珠吸附膜能与目标物质发生特异吸附、结合；
3)目标物质的提取：将套置有磁珠吸附膜的搅拌杆插入待检测容器内的待测样本中，通过搅拌杆的旋转，使加入的磁珠与待检测样本中的目标物质增加特异吸附的机会；通过搅拌杆充磁，吸合磁珠，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体特异结合，通过搅拌杆去磁并旋转，脱去吸附膜表面未特异结合的磁珠；将搅拌杆磁珠吸附膜上吸附的磁珠在洗脱液中洗脱，完成提取工作；
4)目标物质的检测：将洗脱液中磁珠放入磁检测器中进行检测，比较检测线圈及参考线圈上感应信号的差异，可获得检测磁珠顺磁材料介入引起的感应信号变化，从而报告磁珠标记的生物信号的量，产生并报告检测信息。
作为本发明所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法的一种优选方案，所述的步骤1样本的准备中，使用的磁珠为顺磁磁珠，粒径50纳米至300微米。
作为本发明所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法的一种优选方案，所述的步骤3目标物质的提取过程中，搅拌杆以一定的速度在待检测容器中转动，在转动过程中间隔一段时间交替充磁和去磁。进一步地，步骤3目标物质的提取过程包括：搅拌杆以20-50rpm在待测样本中旋转转动，同时以每分钟2-5个周期的速度上下运动，每隔一分钟，对搅拌杆充磁10-20秒，5-10分钟后，搅拌杆在低位充磁，并保持在低位停滞30秒，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体结合，然后撤去充磁线圈电流，搅拌杆在液体中10-15rpm旋转，脱去未特异结合的磁珠。
作为本发明所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法的一种优选方案，所使用的磁检测器包括激发线圈、检测线圈、参考线圈、磁检测信号装置，所述的检测线圈及参考线圈具有相同的设计参数，激发线圈同时激发检测线圈和参考线圈，在同等条件下，检测线圈及参考线圈能产生相同的磁感应信号；检测时，将洗脱液中洗脱的磁珠置入检测线圈工作范围内，磁检测信号装置接收检测线圈及参考线圈的磁信号，分析检测到的磁信号差异，得出顺磁材料的介入量，从而报告检测目标物质的检测值。
有益效果：
本发明通过对磁珠吸附膜表面化学改进处理，可以对复杂性大体积样本中的目标微量物质予以唯一吸附/提取，吸附效率高、提取物质纯度高、提取物质可以被计量、提取过程简便且速度快。对复杂性大体积样本中特定的微量物质可进行精准的高灵敏度磁检测，且不破坏这些被检测物质的原来结构与生物活性。本方法操作简便、废弃物较少、收集/处理简单，在提取过程中，只对结合目标物质的磁珠予以收集、检测，实现零干扰背景信号检测，检测结果可靠、稳定。本方法对待检测样本无特殊/复杂的预处理要求，除血液等常规检测样本外，尤其适用于对尿液、胸腹水、脑脊液、痰液等复杂样本的检测、分析。
附图说明
图1是本发明提供的磁检测器工作原理示意图。
图2为本发明所述的目标物质的提取过程示意图。
1、激发线圈2、检测线圈3、洗脱试管4、磁珠5、参考线圈6、磁珠吸附膜7、抗体一(Ab1)8、抗原9、包被抗体二(Ab2)的磁珠
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例
本发明专利技术及其装置采用免疫学原理、使用顺磁材料微球、改性吸附膜及试剂对待检测样本中的目标检测物予以定值富集、特异性自动提取；通过对提取出来的目标检测物予以纳米金/荧光/磁等标记物予以标记，并通过相应技术予以检测，可实现对目标物质的快速、定量、超敏检测。其中，磁标记并检测后的目标物质没有被破坏其结构或生物活性，可以被计量后用于进一步的培养、分析。
进一步地，本发明专利技术及其装置旨在对生物样本及生物制品，尤其是成分复杂、体积大、有污染的生物样本及生物制品中微量的、现有方法不能被直接检出/精准检出的特定蛋白、微生物、细胞、DNA/RNA进行快捷简便的、POCT式的高效提取与精准检测；亦可应用于生物技术制成品的提取、含量检测或筛选(纯化)。
具体地，一种超敏微量目标物质自动提取/检测方法，
使用5ml标准试管从待诊断者体内获取样本(如血样)，试管内加入抗凝剂(如需要)及包被对应抗体的磁珠，将标准试管固定在磁富集仪器结构的定位装置上。
将磁富集仪器的搅拌杆上套置磁珠吸附膜，对磁珠吸附膜进行表面修饰，使磁珠吸附膜能与目标物质发生特异结合，揿动启动按钮，控制程序工作将滑块下移，试管内搅拌杆插入样本液体中，开始搅拌，搅拌杆以30rpm在液体中旋转转动，同时以每分钟2个周期的速度上下运动，每隔一分钟，对搅拌杆充磁15秒，10分钟后，搅拌杆在低位充磁，并保持在低位停滞30秒，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体结合，然后撤去充磁线圈电流，搅拌杆在液体中15rpm旋转，脱去未特异结合的磁珠；搅拌杆慢速旋转，并缓慢上升，到达高位后仪器停止运动。样本中的微量目标物质就被特异性地吸附在磁珠吸附膜上。
如图1所示，所使用的磁检测器包括激发线圈1、检测线圈2、参考线圈5、磁检测信号装置，工作原理如下，所述的检测线圈2及参考线圈5具有相同的参数，激发线圈1同时激发检测线圈2和参考线圈5，在同等条件下，检测线圈2及参考线圈5能产生相同的磁感应信号；检测时，将洗脱试管3中磁珠4放入检测线圈2工作范围内，磁检测信号装置接收检测线圈及参考线圈的磁信号，并进行分析，得出顺磁材料的介入量。
撤去5ml取样试管，从试剂盒中取出洗脱试管3，按取样试管同样的方法将洗脱试管固定于磁富集仪器上；
再次揿动启动按钮，仪器搅拌杆下降带动磁珠吸附膜进入洗脱试管中的液面；
搅拌杆慢速转动，使搅拌杆外罩的磁珠吸附膜充分与试剂中的洗脱液接触，洗脱磁珠；
磁检测器上升，使检测线圈与洗脱试管底部接触；
检测线圈加载直流电流，在检测线圈附近含试管底部产生磁场，顺磁材料的磁珠在搅拌杆旋转及磁场引力的共同作用下集中于试管的底部中央；
由于顺磁材料的介入，检测线圈激发产生的磁场受到扰动，产生磁场分布、相位及磁通量的变化；
检测、对比检测线圈激发的磁场及参考线圈激发产生的磁场，得出磁性材料介入程度相关的磁参数变量。
上述实验中使用的磁珠吸附膜，可以选用聚丙烯(PP)膜或聚甲基丙稀酸脂(PMMA)膜作为吸附膜基材，经表面改性、激活、抗体偶联、表面封闭，达到能对抗原捕集/结合的目的。在PP膜的外表面包被相应抗体形成磁珠吸附膜；完成后使用保护膜包裹。装入试剂盒待用。
顺磁磁珠：本发明技术使用顺磁材料磁珠，根据需要，可选择粒径50纳米至300微米的各种尺寸的磁珠。使用前进行磁珠包被，使磁珠活化、固定对应的抗体2(Ab2)。控制反应过程，使每颗磁珠上都定量固定抗体。最后对磁珠其余活性表面予以封闭。
反应过程：
检测要求使用含抗凝剂的试管收集样本；
样本收集后在血样试管中加入抗体包被过的磁珠；
磁珠吸附膜套在搅拌杆上，仪器启动后，吸附膜随搅拌杆的运动，一边旋转一边插入血样中；
血样中的抗原(Ag)大部分直接与磁珠表面的抗体结合，继续游离在血样中，小部分被磁珠吸附膜上的抗体结合；
搅拌杆带动磁珠吸附膜继续转动，游离态的抗原-抗体磁珠结合体继续被磁珠吸附膜上的抗体捕获，固定住磁珠。同时已经结合在吸附膜上的抗原-Ab1结合体也继续捕获未与抗原结合的游离磁珠；间隙启动的搅拌杆磁场，帮助磁珠向吸附膜运动，增加磁珠被捕获的几率；
搅拌杆上的感应磁场帮助磁珠紧靠在吸附膜上，有利抗原与抗体的结合；
撤去磁场，保持搅拌杆慢速转动，使非特异结合的磁珠离开磁珠吸附膜；
取下样本试管，更换洗脱试管；
搅拌杆带动磁珠吸附膜进入洗脱液。磁珠在洗脱液的作用下结合键断裂，磁珠进入洗脱液中并被收集在试管底部。
附图2显示本发明专利技术应用实例的化学原理。预先包被抗体一(Ab1)7的磁珠吸附膜6附着在搅拌杆上，随着搅拌杆的转动在样本中搅动，吸附膜上的抗体捕捉样本中的抗原(Ag)8，抗原上的其它位点继续捕捉试剂中预先包被抗体二(Ab2)的磁珠9；与之同时，试剂中包被抗体二(Ab2)的磁珠9也会随着搅拌杆的转动在样本中捕捉抗原8，捕捉在磁珠上的抗原8随后也被磁珠吸附膜上的抗体一(Ab1)7在相应位点上捕捉，实现对捕获抗原的磁珠的捕捉。反应彻底时，所有抗原8都能捕捉到包被抗体二(Ab2)的磁珠9，并被吸附膜上的抗体捕捉。样本中多余的磁珠随样本试管被撤除。洗脱试管中只洗脱带抗原的磁珠。达到零背景检测。
虽然说明书中对本发明的实施方式进行了说明，但这些实施方式只是作为提示，不应限定本发明的保护范围。在不脱离本发明宗旨的范围内进行各种省略、置换和变更均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种超敏微量目标物质自动提取/检测方法，包括：
1)样本的准备：使用待检测容器收集待检测样本，并加入包被处理过的磁珠，该磁珠可以与待检测样本中的目标物质发生特异结合；
2)吸附膜的准备：将磁富集仪器的搅拌杆上套置磁珠吸附膜，磁珠吸附膜预先进行过表面修饰，使磁珠吸附膜能与目标物质发生特异吸附、结合；
3)目标物质的提取：将套置有磁珠吸附膜的搅拌杆插入待检测容器内的待测样本中，通过搅拌杆的旋转，使加入的磁珠与待检测样本中的目标物质增加特异吸附的机会；通过搅拌杆充磁，吸合磁珠，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体特异结合，通过搅拌杆去磁并旋转，脱去吸附膜表面未特异结合的磁珠；将搅拌杆磁珠吸附膜上吸附的磁珠在洗脱液中洗脱，完成提取工作；
4)目标物质的检测：将洗脱液中磁珠放入磁检测器中进行检测，比较检测线圈及参考线圈上感应信号的差异，可获得检测磁珠顺磁材料介入引起的感应信号变化，从而报告磁珠标记的生物信号的量，产生并报告检测信息。
2.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：步骤a样本的准备中，使用的磁珠为顺磁磁珠，粒径50纳米至300微米。
3.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：步骤c目标物质的提取过程中，搅拌杆以一定的速度在待检测容器中转动，在转动过程中间隔一段时间交替充磁和去磁。
4.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：步骤c目标物质的提取过程中，搅拌杆在待检测容器中转动包括上下运动和圆周转动。
5.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：步骤c目标物质的提取过程包括：搅拌杆以20-50rpm在液体中旋转转动，同时以每分钟2-5个周期的速度上下运动，每隔一分钟，对搅拌杆充磁10-20秒，5-10分钟后，搅拌杆在低位充磁，并保持在低位停滞30秒，使已结合有磁珠的抗原与磁珠吸附膜上的抗体结合，然后撤去充磁线圈电流，搅拌杆在液体中10-15rpm旋转，脱去未特异结合的磁珠。
6.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：在对目标物质进行磁标记并检测后，不破坏目标物质结构或生物活性，可以被计量后用于进一步的培养、分析。
7.根据权利要求1所述的超敏微量目标物质自动提取/检测方法，其特征在于：步骤a样本的准备中，还包括在待检测样本中加入抗凝剂。
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