JP5507092B2 - 永久磁石を用いて生物サンプル中の標的成分を画像化するための方法および装置 - Google Patents
永久磁石を用いて生物サンプル中の標的成分を画像化するための方法および装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5507092B2 JP5507092B2 JP2009032033A JP2009032033A JP5507092B2 JP 5507092 B2 JP5507092 B2 JP 5507092B2 JP 2009032033 A JP2009032033 A JP 2009032033A JP 2009032033 A JP2009032033 A JP 2009032033A JP 5507092 B2 JP5507092 B2 JP 5507092B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- magnet
- target
- floater
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 6
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052779 Neodymium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical group [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 80
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 abstract description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 abstract description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 abstract 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 abstract 1
- 208000034699 Vitreous floaters Diseases 0.000 description 35
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 23
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 15
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 239000011554 ferrofluid Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229910001172 neodymium magnet Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 239000000538 analytical sample Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000005266 circulating tumour cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
- G01N2333/70514—CD4
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Description
〔関連出願の相互参照〕
本願は、2005年3月19日に出願され、現在放棄されている米国仮出願第60/594,198号を、参照により本願に組み入れ、部分的に優先権を主張する本出願であり、2007年8月30日に出願された米国特許出願第11/897,471号の一部継続出願である。
本願は、2005年3月19日に出願され、現在放棄されている米国仮出願第60/594,198号を、参照により本願に組み入れ、部分的に優先権を主張する本出願であり、2007年8月30日に出願された米国特許出願第11/897,471号の一部継続出願である。
〔発明の分野〕
本発明は概して、流体の（生物）サンプル中の標的成分を画像化することに関する。具体的には、血液サンプル中の標的細胞の積極的な選択を提供する方法および装置が説明される。CD4を免疫磁気標識し、アクリジンオレンジ（AO）で蛍光染色した全血を含む血液サンプルに、小型永久磁石を直接加えるものである。
本発明は概して、流体の（生物）サンプル中の標的成分を画像化することに関する。具体的には、血液サンプル中の標的細胞の積極的な選択を提供する方法および装置が説明される。CD4を免疫磁気標識し、アクリジンオレンジ（AO）で蛍光染色した全血を含む血液サンプルに、小型永久磁石を直接加えるものである。
〔背景技術〕
免疫磁気分離技術の使用は、血液中の標的実体（例えば、限定されないが、無傷の循環がん細胞や内皮細胞）の検出において、より高い感度と特異度を提供する。説明されているとおり（米国特許第6,365,362号、同第6,551,843号、同第6,623,982号、同第6,620,627号、同第6,645,731号、国際出願公開第02/077604号、同第03/065042号、および同第03/019141号）、閾値に基づいて個々の患者の統計的生存性を相互に関連付けるために、この簡単で感度の高い診断ツールを本発明において用いることができる。
免疫磁気分離技術の使用は、血液中の標的実体（例えば、限定されないが、無傷の循環がん細胞や内皮細胞）の検出において、より高い感度と特異度を提供する。説明されているとおり（米国特許第6,365,362号、同第6,551,843号、同第6,623,982号、同第6,620,627号、同第6,645,731号、国際出願公開第02/077604号、同第03/065042号、および同第03/019141号）、閾値に基づいて個々の患者の統計的生存性を相互に関連付けるために、この簡単で感度の高い診断ツールを本発明において用いることができる。
従来の診断ツールは、上皮細胞表面抗原（例えば、EpCAM）に対する抗体で被覆した磁気ビーズとともにインキュベーションしたがん患者由来の血液サンプルを利用するものである（国際特許出願第03/018757号）。抗EpCAM被覆の磁気ナノ粒子で標識した後、それから、磁気セパレータを用いて、磁気標識細胞を単離する。下流の免疫細胞化学分析またはイメージサイトメトリーのために、例えば、CellSpotterまたはCellTracks（登録商標）システム（Immunicon Corp.、米国）において、免疫磁気的に濃縮した画分を更に処理する。また、下流の免疫細胞化学分析、RT-PCR、PCR、FISH、フローサイトメトリー、または、他の種類のイメージサイトメトリーのためにも、その磁気画分を用いることができる。
CellSpotterまたはCellTracks（登録商標）システムは、全血サンプル中に存在する任意の上皮細胞を非常に濃縮し凝縮するために、免疫磁気的な選択や分離を利用する。捕集した細胞を、白血球特異的マーカーや１つ以上の腫瘍細胞特異的蛍光モノクローナル抗体で検出可能に標識して、捕集したCTCを同定し数え上げることができ、また、非標的細胞の汚染から機器的または視覚的に区別することができる。この解析は、低腫瘍塊である初期段階においてでさえ、血液7.5 mL当たり上皮細胞１個または２個の感度で、腫瘍細胞の検出を可能にするものである。
EasyCount（登録商標）システム（国際出願第PCT/US03/04468号）は、蛍光画像化システムであり、リンパ球、顆粒球、単球を識別するために設計されている。そのシステムには、磁気的に標識した標的細胞または粒子を検出し数え上げるための、小型電子光学機器、分析方法、画像取得、およびデータ整理アルゴリズムが含まれる。例として全血を用いる場合、１つ以上の標的特異的な蛍光染料（例えば、DNA染色染料）を用いて、血液細胞を蛍光標識する。強磁性粒子と接合したモノクローナル抗体とともにインキュベーションすることにより、血液サンプル中の目的の細胞または標的細胞を標識する。そのサンプルをその後、適切な光学検出チャンバーまたはコベット（covet）の中に入れる。そのチャンバーまたはコベットは、磁気標識細胞をチャンバーの平面な観察用表面の方に選択的に移動させるような傾斜磁場の中に、順番に入れられるものである。チャンバーの光学的に透明な表面上に、標的細胞を実質的に一様に集め、動かないようにする。１つ以上のLED（発光ダイオード）を用いて、この表面部分やその上の標識した標的細胞を照射する。その後、個々の標的細胞により発せられた光をCCD（電荷結合素子）により取り込む。取り込まれた光を発する細胞の数を計測し、データ出力を、チャンバー中の分析サンプルのマイクロリットル当たりの標的細胞と、また最終的には元の試料と関連付けるために、本願で開示する画像取得方法、処理方法、およびアルゴリズムを用いる。
現在利用可能な方法は、フローサイトメトリーまたはイメージサイトメトリーにより、細胞の標的集団を評価するための、迅速で、低コストで、常に信頼性のある手段を提供していない。したがって、血液中の標的成分（例えば、がんまたは内皮細胞）を、急速かつ正確に検出することが、明らかに必要とされている。
〔発明の概要〕
本発明は、標的実体を積極的に選択し、画像化するための方法および手段である。これには、本発明のシステムにおいて磁気的に操作するための、被覆した永久磁石素子が含まれる。そのシステムは、標的実体を免疫磁気的に凝縮し、蛍光標識し、積極的な数え上げにより標的細胞を同定し定量するものである。事後の統計分析により、臨床医は潜在的な診断情報を入手することができる。
本発明は、標的実体を積極的に選択し、画像化するための方法および手段である。これには、本発明のシステムにおいて磁気的に操作するための、被覆した永久磁石素子が含まれる。そのシステムは、標的実体を免疫磁気的に凝縮し、蛍光標識し、積極的な数え上げにより標的細胞を同定し定量するものである。事後の統計分析により、臨床医は潜在的な診断情報を入手することができる。
具体的には、本発明は、免疫磁気的に画像化した後、疾患障害を診断するための装置、方法、および、キットを提供する。患者から全血サンプルを入手した後、その全血サンプルに小型永久磁石を加える。以前に説明されたCellSpotter Magnest配置と異なり、小型のNdFeB磁石を、CD4を免疫磁気的に標識しAOで蛍光染色した全血100 μLとともに、サンプル容器［例えば、CellTracks（登録商標）カートリッジ；米国特許第6,861,259号、同第7,011,794号］に直接加える。10分後、鉄製の棒または別の磁石を用いて、小型永久磁石をサンプルから引き出す。画像分析が可能なように、磁石を容器内に位置付ける。
本発明の更なる実施態様は、反応チャンバー内の浮揚素子（フローター）に固定した磁石を有する。試薬、血液、および、フローターを加えた後、免疫磁気的に標識した標的細胞を、分析のための単一の画像化平面に沿って位置付ける。すべてが反応チャンバー内で行われる。
〔発明の詳細な説明〕
血液の免疫磁気単離、濃縮、および、分析により、免疫磁気濃縮技術および免疫蛍光標識技術が、最初の採血後に、適切な分析プラットフォームと組み合わされる。関連した検査は、全血のサンプル中の希少細胞を検出するような感度と特異度を有し、上皮起源の悪性腫瘍のような疾患の臨床経過におけるそれらの役割を調査するための有用性を有する。
血液の免疫磁気単離、濃縮、および、分析により、免疫磁気濃縮技術および免疫蛍光標識技術が、最初の採血後に、適切な分析プラットフォームと組み合わされる。関連した検査は、全血のサンプル中の希少細胞を検出するような感度と特異度を有し、上皮起源の悪性腫瘍のような疾患の臨床経過におけるそれらの役割を調査するための有用性を有する。
この種類の技術により、循環腫瘍細胞（CTC）が、血液中に検出可能な量で存在することが示されて来た。
免疫磁気的に濃縮されたサンプルを、CellSpotterおよびCellTracks（登録商標）システムにより分析するというような、イメージサイトメトリー分析は、蛍光に基づいた顕微鏡画像分析システムを利用する。それは、フローサイトメトリー分析と比較して、目標物を更に同定するために、事象の視覚化や、形態的特徴の評価を可能にするものである（米国特許第6,365,362号）。
CellSpotterおよびCellTracks（登録商標）システムとは、血液から単離された細胞を自動的に数え上げるための自動化された蛍光顕微鏡システムを言う。そのシステムは、統合されたコンピュータ制御の蛍光顕微鏡と、廃棄可能なサンプルカートリッジを保持するだろう磁気ヨークアッセンブリを有する自動化されたステージとを含む。その磁気ヨークは、サンプルチャンバー内の強磁性流体標識された候補腫瘍細胞が、顕微鏡観察のためのサンプルカートリッジの上方の観察用表面に、磁気的に局在することができるように設計されている。ソフトウェアは、サイトケラチンに対する抗体で標識された、上皮起源の標的細胞を、最終選択のためのオペレーターに提示する。
標的細胞の単離を、本分野で既知の任意の手段により達成することができる。磁気分離後、免疫磁気的に連結した抗体に結合した細胞は、チューブの壁に磁気的に保持される。非結合サンプルをその後吸引し、サンプルを再懸濁するために等張液を加える。核酸染料、サイトケラチン（上皮細胞のマーカー）、およびCD45（広域スペクトルな白血球マーカー）に対するモノクローナル抗体を、サンプルとともにインキュベーションする。磁気分離後、非結合画分を再び吸引し、結合し標識した細胞を、等張液0.2 mLに再懸濁する。細胞提示チャンバー中にサンプルを懸濁し、蛍光顕微鏡試験のために磁気標識細胞を並べる場を有する磁気装置の中に入れる。細胞を自動的に同定して、候補となる標的実体を、チェックリスト数え上げのためのオペレーターに提示する。数え上げチェックリストは、完全細胞から構成される所定の形態基準から成る。
本発明は、血液サンプル中の免疫磁気的に標識した標的実体に直接加えられる、小型磁石を利用する。画像化核酸染料、細胞膜、および／または細胞骨格免疫蛍光標識で、標的を更に標識する。例えば、図１は、全血サンプル中のCD4を発現した標的細胞を画像化するための方法を示している。CD4について免疫磁気的に標識し蛍光標識した後、小型のネオジム（NdFeB）永久磁石を全血サンプルに加える。10分後、観察用表面を通じて観察するためのサンプル容器内で、流体サンプルから小型永久磁石を分離する。
１つの実施態様では、磁石は、直径1.6 mmおよび高さ0.8 mmの平円盤状のものである（図２参照）。本発明には、より小型の磁石が好ましい。この磁石を用いる際に、標的実体（細胞）が、磁石にのみ付着する。その細胞は単一焦点面にはなく、品質のよい画像を入手するのは難しい。PDMSシリコーンゴムでカプセル化された磁石を用いて、同じ方法が達成される。細胞は単一焦点面に沿って付着する。磁石の頂点にあるPDMSの層は、約1 mmである。PDMSの幅は、約3 mmである。
懸濁液から出し入れするよう動かしている間に、磁石を失う機会が大きいため、磁石が細胞懸濁液から出し入れするよう、磁石を動かすための方法を設計する、更なる必要がある。その磁石は、細胞懸濁液から引き出すのに必要とされる力を減らすのに十分なほど小さくなければならない。動きの向きが磁力に対して垂直であるため、チャンバーの壁と磁石との摩擦力が大きすぎて、細胞懸濁液から磁石を引き出すことができないかもしれない。磁石に対する筐体の大きさが大きくなっても、細胞は磁石の極へと動き、検出を阻害するかもしれない。
本発明で説明する更なる実施態様において、これらの問題を考える。図３は、本方法の基本的な工程を示す。図３Ａに示すように、全ての側面が閉じた中空管の１つの面の内側上に、永久磁石が取り付けられている。磁石を取り付けた面は、所定の厚さ（ｄ）を有する。表面は平らであるか、または、目的の目標物の捕集や視覚化を容易にし、流体中の干渉成分（すなわち、遊離している非結合磁気粒子）の影響を制限する構造を含むことができる。
面の厚みは、その外側での細胞の広がりを決める。フローターの高さ／直径の比率は、そのフローターの外側領域における磁場の効果を決める。したがって、その比率は、磁場の影響を、およそ磁石を取り付けたフローターの外側の面に制限すべきである。
平らな表面であり、光学的に透明な窓を有するチューブに、細胞懸濁液を注入する。蛍光標識とともに、免疫磁気粒子を加える。インキュベーション後、チューブの底に面した磁石を有するチューブの中に、永久磁石を含むフローターを挿入し、チューブを閉じる。
あるいは、他の試薬と同時に、フローターを挿入することができる。試験チューブを逆さまにすることにより、フローターは流体の外側まで上昇する。流体の薄い層が、試験チューブとフローターとの間に残っているが、全量に対して無視できる。フローターの干渉または磁場の干渉を受けることなく、懸濁液を試薬とともにインキュベーションする。
インキュベーション後、試験チューブ回転機、または、図３Ｂで示しているように、細胞懸濁液中でフローターを上下に動かせるような同様の装置に、チューブを置く。磁気標識した目標物（細胞）が完全に捕集できるほど十分な時間の後、チューブを回転機からはずしてさかさまに置き、チューブの平らな表面上の光学窓に向かって、フローターを上昇させる。標準的な蛍光顕微鏡を用いて、フローターの面に提示された細胞を、チューブの底を通じて画像化する。
図４Ａは、直径8ミクロンの緑色蛍光磁気ビーズ（Bangsビーズ）を示している。厚さ0.17ミリメートルの面を有する1/32”×1/16”（0.7938 mm×1.588 mm）ネオジム平円盤状永久磁石を用いて、ビーズをフローターの面上に集める。図４Ｂは、浮き上がった面上で画像化した磁気ビーズを示す。
図５Ａは、1/16”×1/4”（1.588 mm×6.350 mm）ネオジム円柱磁石を用いて、外側直径12 mmのフローターの面上に集めた、CD14-FFで選択した細胞のオーバーレイ画像、および、面の厚さカバーガラス2枚分（約0.34 mm）を示している。アクリジンオレンジの強度を、CD45-APC標識についての赤色と区別するために、緑色のシグナルとして示すことができる。図５Ｂは、フローター、チャンバー、およびチャンバーのキャップを示している。
図５Ａに示すとおり、各サンプル調製物について、血液200 μL（CellSave保存チューブ、Immunicon Corporation）を、CD14-FF（0.88 g/mL）10 μL、アクリジンオレンジ（1 mM）10 μL、CD45-APC 10 μLとともに、10分間ガラスチャンバー中でインキュベーションした。所定量までチャンバーを満たすように、リン酸緩衝生理食塩水（PBS；2 mL）を加えた。チャンバーのガラス底に面した、磁石を含む側面を有するチャンバーに、フローターを加えた。確実に完全混合するように、チャンバーを回転させた。10分後、チャンバーを反転し、磁石の面上に集めた細胞を蛍光的に画像化した。
〔実施例１〕
≪CD-Chex、捕集効率≫
捕集効率を決定するために、既知の白血球の絶対数、および、それらの表現型を有するCD-Chexを用いる。
≪CD-Chex、捕集効率≫
捕集効率を決定するために、既知の白血球の絶対数、および、それらの表現型を有するCD-Chexを用いる。
材料と方法：
CD-Chex（ロット番号60650071）
・CD3+：1,859個/μL
・CD3+/CD4+：1,221個/μL
・CD3+/CD8+：576個/μL
CD-Chex（ロット番号60650071）
・CD3+：1,859個/μL
・CD3+/CD4+：1,221個/μL
・CD3+/CD8+：576個/μL
CD-Chex 50 μLに、CD3-FF（クローンCris7）10 μL、CD4-APC 10 μL、CD8-PE 10 μLを加える。25分間のインキュベーション後、この溶液10 μLをチャンバーに注入する。DAPI 100μLとともに、PBS（1.8 mL）を加える。フローターをその後挿入する。ふたをした後、チャンバーをロッカーに置き、一晩（約16時間）回転させる。チャンバーを反転し、フローターの画像を取得する。
結果：
100%の捕集効率には、フローター表面は以下を含む。
・CD3+：10,328個の細胞
・CD3+/CD4+：6,783個の細胞
・CD3+/CD8+：3,200個の細胞
100%の捕集効率には、フローター表面は以下を含む。
・CD3+：10,328個の細胞
・CD3+/CD4+：6,783個の細胞
・CD3+/CD8+：3,200個の細胞
画像を異なる対物レンズにより取得し、結果のオーバーレイ画像が、図６に示すとおり提示される。図６Ａは、5× NA 0.12対物レンズを用いて取得した画像を示している。図６Ｂおよび図６Ｃは、それぞれ10×, NA 0.25、および、40×, NA 0.6の対物レンズを用いて取得される。青色はDAPIを示し、緑色はCD8-PE、赤色はCD4-APCである。期待されるCD8-PE（緑色）標識細胞の数は3,200個であり、実際のCD8-PE標識細胞の数は約500個に相当するため、捕集効率は16%になるだろう。
〔実施例２〕
≪永久磁石を用いる２つの方法間の比較≫
本発明で説明するように、細胞懸濁液に磁石を挿入し取り除く方法（方法１）、および、フローターに固定した永久磁石による方法（方法２）を用いて、CellTracks（登録商標）分析後の対照細胞を画像化することを決定する。
≪永久磁石を用いる２つの方法間の比較≫
本発明で説明するように、細胞懸濁液に磁石を挿入し取り除く方法（方法１）、および、フローターに固定した永久磁石による方法（方法２）を用いて、CellTracks（登録商標）分析後の対照細胞を画像化することを決定する。
材料と方法：
CellTracks（登録商標）システムを用いて分析した後、CellTracks（登録商標）カートリッジ由来の対照細胞を、図５Ｂと同様に、チャンバーへ移した。パスツールピペットを用いて、カートリッジをPBSで数回洗浄し、洗浄で用いたすべての流体（約500マイクロリットル）をチャンバーに移した。全量が2 mLになる容量まで、追加のPBSを加えた。バイアルをチューブ回転機上に置いた。回転速度を、１回の回転で流体全体の中をフローターが動く程度に設定した。完全混合後、Epcam強磁性流体50 μL、およびDAPI試薬［CellSearch（商標）、Veridex LLC］10μLとともに、対照細胞1.5 mLをバイアルに注入した。30分間のインキュベーション後、複数の時点で、画像を取得した。
CellTracks（登録商標）システムを用いて分析した後、CellTracks（登録商標）カートリッジ由来の対照細胞を、図５Ｂと同様に、チャンバーへ移した。パスツールピペットを用いて、カートリッジをPBSで数回洗浄し、洗浄で用いたすべての流体（約500マイクロリットル）をチャンバーに移した。全量が2 mLになる容量まで、追加のPBSを加えた。バイアルをチューブ回転機上に置いた。回転速度を、１回の回転で流体全体の中をフローターが動く程度に設定した。完全混合後、Epcam強磁性流体50 μL、およびDAPI試薬［CellSearch（商標）、Veridex LLC］10μLとともに、対照細胞1.5 mLをバイアルに注入した。30分間のインキュベーション後、複数の時点で、画像を取得した。
結果：
＜方法１＞
図７Ａの画像は、40回転後の結果を示す。画像品質は、細胞を容易に計測するのに適している。緑色の細胞数は、多いもので556個の循環腫瘍細胞（CTC）、少ないもので47個のCTCに相当する。100回転後、大部分の細胞が、強磁性流体の層の下に埋まるようになる。この時点では、細胞は見えなくなり、計測することができない。
＜方法１＞
図７Ａの画像は、40回転後の結果を示す。画像品質は、細胞を容易に計測するのに適している。緑色の細胞数は、多いもので556個の循環腫瘍細胞（CTC）、少ないもので47個のCTCに相当する。100回転後、大部分の細胞が、強磁性流体の層の下に埋まるようになる。この時点では、細胞は見えなくなり、計測することができない。
＜方法２＞
図７Ｂの画像は、500回を超える回転後取得された。強磁性流体のより少ない量にも関わらず、画像品質は、細胞を計測するのになお十分である。細胞数は、以下のとおり：多いもので435個、少ないもので23個が期待されたが、多いもので209個、少ないもので25個である。したがって、回収率は、多いものについては45%、少ないものについては100％である。
図７Ｂの画像は、500回を超える回転後取得された。強磁性流体のより少ない量にも関わらず、画像品質は、細胞を計測するのになお十分である。細胞数は、以下のとおり：多いもので435個、少ないもので23個が期待されたが、多いもので209個、少ないもので25個である。したがって、回収率は、多いものについては45%、少ないものについては100％である。
〔実施例３〕
≪強磁性流体の量≫
強磁性流体が増える場合の画像の品質を決定する。強磁性流体の量が多くなるにつれ、画像品質は低下する。細胞が強磁性流体の層の下に埋まり、検出のために見えなくなる。このために、一部、低い回収率となる。
≪強磁性流体の量≫
強磁性流体が増える場合の画像の品質を決定する。強磁性流体の量が多くなるにつれ、画像品質は低下する。細胞が強磁性流体の層の下に埋まり、検出のために見えなくなる。このために、一部、低い回収率となる。
材料と方法：
COMPEL磁気ミクロスフェア（ドラゴングリーン、2.914×107個/mL、直径8.44ミクロン、ロット番号6548）（Bangs Laboratories Inc、カタログコードUMC4F）を、1:100希釈した。システムバッファー（1.5 mL）をガラスバイアルに加え、EpCam強磁性流体（20 mg/mL）20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、および80マイクロリットルとともに、14570個のビーズを含む50マイクロリットルを加えた。15分および30分の回転後、蛍光画像を取得した。試験チューブ回転機を10 rpmに設定し、結果的に150回転および300回転した。
フローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）磁石である。
COMPEL磁気ミクロスフェア（ドラゴングリーン、2.914×107個/mL、直径8.44ミクロン、ロット番号6548）（Bangs Laboratories Inc、カタログコードUMC4F）を、1:100希釈した。システムバッファー（1.5 mL）をガラスバイアルに加え、EpCam強磁性流体（20 mg/mL）20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、および80マイクロリットルとともに、14570個のビーズを含む50マイクロリットルを加えた。15分および30分の回転後、蛍光画像を取得した。試験チューブ回転機を10 rpmに設定し、結果的に150回転および300回転した。
フローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）磁石である。
結果：
5×および40×対物レンズにより、画像を取得する。図８に示すように、EpCam 20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、および80マイクロリットルを画像化するために、5×および40×対物レンズを用いた。図８に示す消失した画像は、保存中に失われた。
5×および40×対物レンズにより、画像を取得する。図８に示すように、EpCam 20マイクロリットル、40マイクロリットル、60マイクロリットル、および80マイクロリットルを画像化するために、5×および40×対物レンズを用いた。図８に示す消失した画像は、保存中に失われた。
〔実施例４〕
≪捕集効率の評価≫
異なる大きさの磁石の捕集効率を決定する。
≪捕集効率の評価≫
異なる大きさの磁石の捕集効率を決定する。
材料と方法：
＜方法Ａ＞
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。２つのカートリッジの内容物をプールした。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
２．４つのチューブが満たされ、うち２つに、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石のフローターを用い、他の２つに、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）を用いた。
３．チューブ回転機に30分間、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
４．試験チューブからフローターを取り除き、四重極磁石中に10分間置いた。10分後、流体を取り除き、PBS 300マイクロリットルで置換した。チューブを取り除き、ボルテックスした。
５．300マイクロリットルをカートリッジへ移し、流体中に何個の細胞が残っているか調べるために、CellTracks（登録商標）システムで、カートリッジを再調査した。
６．フローター上の細胞数を、残っている流体の再調査で見つかった細胞数で割ることにより、効率を計算した。
＜方法Ａ＞
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。２つのカートリッジの内容物をプールした。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
２．４つのチューブが満たされ、うち２つに、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石のフローターを用い、他の２つに、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）を用いた。
３．チューブ回転機に30分間、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
４．試験チューブからフローターを取り除き、四重極磁石中に10分間置いた。10分後、流体を取り除き、PBS 300マイクロリットルで置換した。チューブを取り除き、ボルテックスした。
５．300マイクロリットルをカートリッジへ移し、流体中に何個の細胞が残っているか調べるために、CellTracks（登録商標）システムで、カートリッジを再調査した。
６．フローター上の細胞数を、残っている流体の再調査で見つかった細胞数で割ることにより、効率を計算した。
結果：
＜方法Ｂ＞
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。多くの細胞数が必要な場合、カートリッジをプールすることができる。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
２．２種類のフローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石、および、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）である。
３．チューブ回転機に15分間、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
４．チューブからフローターを取り除き、四重極磁石の内側に10分間、残っている流体を有するチューブを置いた。10分後、流体を取り除き、PBS 300マイクロリットルで置換した。四重極からチューブを取り除き、ボルテックスした。
５．300マイクロリットルをCellTracksカートリッジへ移し、Magnestの内側へ置き、15分後、CellTracksで再調査した。
６．フローター上の細胞数を、残っている流体の再調査で見つかった細胞数で割ることにより、効率を計算した。
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。多くの細胞数が必要な場合、カートリッジをプールすることができる。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
２．２種類のフローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石、および、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）である。
３．チューブ回転機に15分間、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
４．チューブからフローターを取り除き、四重極磁石の内側に10分間、残っている流体を有するチューブを置いた。10分後、流体を取り除き、PBS 300マイクロリットルで置換した。四重極からチューブを取り除き、ボルテックスした。
５．300マイクロリットルをCellTracksカートリッジへ移し、Magnestの内側へ置き、15分後、CellTracksで再調査した。
６．フローター上の細胞数を、残っている流体の再調査で見つかった細胞数で割ることにより、効率を計算した。
結果：
＜方法Ｃ＞
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。多くの細胞数が必要な場合、カートリッジをプールすることができる。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。
２．装置バッファーで、細胞懸濁液を２倍希釈し、この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
３．２種類のフローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石、および、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）である。
４．チューブ回転機に、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
５．1分、2分、3分、4分、5分、7分、10分、および15分の時点で、収集した細胞数を判定した。
６．細胞をDAPIおよびDIOCで同定した。
１．対照細胞を有するCellTracksカートリッジを分析した後、カートリッジの内容物を空にした。多くの細胞数が必要な場合、カートリッジをプールすることができる。カートリッジから取り除かれた対照細胞の正確な数は、ガラスにくっつくものもあるため、不明である。
２．装置バッファーで、細胞懸濁液を２倍希釈し、この細胞懸濁液100 μLを試験チューブに移し、PBS 1.5 mLを加えた。
３．２種類のフローターは、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/4”（6.350 mm）磁石、および、Corning直径1/16”（1.588 mm）長さ1/2”（12.70 mm）である。
４．チューブ回転機に、チューブを置いた。回転速度は10 rpmである。
５．1分、2分、3分、4分、5分、7分、10分、および15分の時点で、収集した細胞数を判定した。
６．細胞をDAPIおよびDIOCで同定した。
結果：
図９のグラフは、時間の関数として、収集した細胞数を示す。
図９のグラフは、時間の関数として、収集した細胞数を示す。
本発明の好ましい特定の実施態様が上記に示され例示されているが、本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではない。本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよいし、その改良の完全な範囲が、本願の特許請求の範囲に記されている。
Claims (6)
- 生物試料内の標的集団を検出し、数え上げるための方法において、
ａ．チャンバーの中で、前記生物試料内の前記標的集団を、前記標的集団に対して特異的である蛍光マーカーで標識することと、
ｂ．前記標的集団を、磁気粒子と連結させることと、
ｃ．小型永久磁石を含むフローターを、前記試料に直接加えることと、
ｄ．前記フローターを、前記チャンバーの観察窓に沿って安定させることと、
ｅ．前記標的集団の画像を取得することと、
ｆ．標識された前記標的集団を検出し数え上げるために、前記画像を分析することと、
を含む、方法。 - 前記標的集団がCD4発現細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記磁石がネオジムである、請求項１に記載の方法。
- 前記磁石が、直径約1.6 mmおよび高さ0.8 mmの平円盤状のものである、請求項１に記載の方法。
- 前記磁石がPDMSシリコーンで被覆されている、請求項１に記載の方法。
- 生物試料内の標的集団を検出し、数え上げるための装置において、
ａ．平底の試料収集チューブであって、前記チューブの底が蛍光顕微鏡を用いて標的集団を画像化するための光学的な観察用の表面を提供する、試料収集チューブと、
ｂ．前記チューブ内の、永久磁石を含むフローターであって、前記磁石が、磁気標識した標的細胞を捕集して、前記光学的な観察用の表面に向って前記細胞を前記フローターの面に提示することができる、フローターと、
ｃ．前記収集チューブのためのキャップと、
を備える、装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12/031,807 US7828968B2 (en) | 2007-08-30 | 2008-02-15 | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets |
| US12/031,807 | 2008-02-15 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009192539A JP2009192539A (ja) | 2009-08-27 |
| JP2009192539A5 JP2009192539A5 (ja) | 2013-07-04 |
| JP5507092B2 true JP5507092B2 (ja) | 2014-05-28 |
Family
ID=40506419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009032033A Active JP5507092B2 (ja) | 2008-02-15 | 2009-02-13 | 永久磁石を用いて生物サンプル中の標的成分を画像化するための方法および装置 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7828968B2 (ja) |
| EP (1) | EP2090889B1 (ja) |
| JP (1) | JP5507092B2 (ja) |
| CN (1) | CN101533012B (ja) |
| AT (1) | ATE540316T1 (ja) |
| ES (1) | ES2377178T3 (ja) |
| HK (1) | HK1137810A1 (ja) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003069421A2 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Immunivest Corporation | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
| US8189899B2 (en) * | 2004-07-30 | 2012-05-29 | Veridex, Llc | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
| US8110101B2 (en) * | 2007-08-30 | 2012-02-07 | Veridex, Llc | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets |
| US7828968B2 (en) * | 2007-08-30 | 2010-11-09 | Veridex, Llc | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets |
| US8710836B2 (en) | 2008-12-10 | 2014-04-29 | Nanomr, Inc. | NMR, instrumentation, and flow meter/controller continuously detecting MR signals, from continuously flowing sample material |
| US8790916B2 (en) | 2009-05-14 | 2014-07-29 | Genestream, Inc. | Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid |
| US9476812B2 (en) | 2010-04-21 | 2016-10-25 | Dna Electronics, Inc. | Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US9428547B2 (en) | 2010-04-21 | 2016-08-30 | Dna Electronics, Inc. | Compositions for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US20110262989A1 (en) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Nanomr, Inc. | Isolating a target analyte from a body fluid |
| US8841104B2 (en) | 2010-04-21 | 2014-09-23 | Nanomr, Inc. | Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample |
| US10114020B2 (en) | 2010-10-11 | 2018-10-30 | Mbio Diagnostics, Inc. | System and device for analyzing a fluidic sample |
| BR112013024148B1 (pt) * | 2011-04-27 | 2022-01-25 | Becton, Dickinson And Company | Dispositivo, método e sistema para separar partes marcadas magneticamente em uma amostra, método de separar partes marcadas magneticamente em uma amostra |
| CN103492081B (zh) * | 2011-04-29 | 2017-05-31 | 贝克顿·迪金森公司 | 流体管线式粒子固定和收集系统以及其使用方法 |
| WO2014070235A1 (en) | 2012-10-29 | 2014-05-08 | Mbio Diagnostics, Inc. | Biological particle identification system, cartridge and associated methods |
| WO2014097991A1 (ja) * | 2012-12-18 | 2014-06-26 | コニカミノルタ株式会社 | 希少細胞検出装置、希少細胞検出方法、希少細胞観察システム、および細胞展開用デバイス |
| US9804069B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-10-31 | Dnae Group Holdings Limited | Methods for degrading nucleic acid |
| US9551704B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-01-24 | Dna Electronics, Inc. | Target detection |
| US9434940B2 (en) | 2012-12-19 | 2016-09-06 | Dna Electronics, Inc. | Methods for universal target capture |
| US9995742B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-06-12 | Dnae Group Holdings Limited | Sample entry |
| US9599610B2 (en) | 2012-12-19 | 2017-03-21 | Dnae Group Holdings Limited | Target capture system |
| US10000557B2 (en) | 2012-12-19 | 2018-06-19 | Dnae Group Holdings Limited | Methods for raising antibodies |
| DE102013200927A1 (de) * | 2013-01-22 | 2014-07-24 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zum Anreichern und Vereinzeln von Zellen mit Konzentrationen über mehrere logarithmische Stufen |
| US20150233932A1 (en) * | 2013-02-19 | 2015-08-20 | Ching-Ping Tseng | Methods, Systems, and Compositions for Enrichment of Rare Cells |
| WO2015058103A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | The Regents Of The University Of California | Method and device for detecting molecules or particles using fractionalized volumes |
| US10564100B1 (en) * | 2018-10-12 | 2020-02-18 | SageMedic Corporation | Analysis of viable and nonviable cells |
| CN111795919B (zh) * | 2020-05-25 | 2024-03-26 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种骨髓细胞形态学自动检测系统及其工作方法 |
| EP3922991A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-15 | PreOmics GmbH | Dispersion using a moving magnet |
| CN114002195A (zh) * | 2021-10-22 | 2022-02-01 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种辅助悬浮细胞成像的系统及其使用方法和应用 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4166768A (en) * | 1977-11-14 | 1979-09-04 | Monsanto Company | Continuous cell culture system |
| US4498785A (en) * | 1982-06-09 | 1985-02-12 | Techne Corporation | Floating magnetic stirrer for culture medium |
| US4465377A (en) * | 1983-06-07 | 1984-08-14 | Techne Corporation | Magnetic stirrer apparatus with guided, floating stirrer |
| US5374531A (en) * | 1993-03-22 | 1994-12-20 | Zynaxis, Inc. | Immunoassay for determination of cells |
| IL123210A0 (en) * | 1998-02-06 | 1998-09-24 | Gombinsky Moshe | A device and system for the collection of magnetic particles |
| AU760560B2 (en) | 1998-02-12 | 2003-05-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
| US20010018192A1 (en) | 1998-02-12 | 2001-08-30 | Terstappen Leon W.M.M. | Labeled cells for use as an internal functional control in rare cell detection assays |
| JP4121708B2 (ja) * | 1998-10-13 | 2008-07-23 | ガンブロ ルンデイア アクチーボラグ | 生体適合性ポリマーフィルム |
| US6551843B1 (en) | 1999-01-29 | 2003-04-22 | Immunivest Corporation | Methods for enhancing binding interactions between members of specific binding pairs |
| US6623982B1 (en) | 1999-07-12 | 2003-09-23 | Immunivest Corporation | Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles |
| JP3766064B2 (ja) | 2001-02-12 | 2006-04-12 | イムニベスト・コーポレイション | 光学分析用の標本試料を収容するためのカートリッジ |
| BR0207290A (pt) | 2001-02-16 | 2005-06-07 | Immunivest Corp | Método para analisar um paciente quanto à presença de uma malignidade, célula maligna isolada das células cultivadas, vacina de tumor, molécula associada com diátese de tumor alterada, métodos para determinar alterações em moléculas associadas com diátese de tumor como um meio para predizer a eficácia da terapia, como um meio para analisar dosagem apropriada para terapia, como um meio para monitorar eficácia da terapia, como um meio para analisar progressão de câncer, para realizar uma biópsia de corpo inteiro em um paciente, e para identificar alterações em uma célula de tumor circulante relativamente a células presentes numa massa de tumor in situ, e, kit de teste para analisar uma amostra de paciente quanto à presença de uma célula maligna não-hematopoiética |
| KR20040053115A (ko) | 2001-08-23 | 2004-06-23 | 이뮤니베스트 코포레이션 | 분석용 세포 및 생물학적 시험편의 안정화 |
| WO2003069421A2 (en) | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Immunivest Corporation | Methods and algorithms for cell enumeration in a low-cost cytometer |
| US7011794B2 (en) | 2002-11-25 | 2006-03-14 | Immunivest Corporation | Upon a cartridge for containing a specimen sample for optical analysis |
| WO2006102233A2 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Immunivest Corporation | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets |
| US7777885B2 (en) * | 2005-08-17 | 2010-08-17 | Veridex, Llc | Diagnostic imaging device for the analysis of circulating rare cells |
| CN200945454Y (zh) * | 2006-06-16 | 2007-09-12 | 复旦大学 | 一种便携式磁性分离笔 |
| US7828968B2 (en) * | 2007-08-30 | 2010-11-09 | Veridex, Llc | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets |
-
2008
- 2008-02-15 US US12/031,807 patent/US7828968B2/en active Active
-
2009
- 2009-02-13 EP EP09250366A patent/EP2090889B1/en not_active Not-in-force
- 2009-02-13 CN CN200910130777.9A patent/CN101533012B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-02-13 ES ES09250366T patent/ES2377178T3/es active Active
- 2009-02-13 JP JP2009032033A patent/JP5507092B2/ja active Active
- 2009-02-13 AT AT09250366T patent/ATE540316T1/de active
-
2010
- 2010-03-11 HK HK10102561.3A patent/HK1137810A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-09-23 US US12/888,562 patent/US20110014686A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1137810A1 (en) | 2010-08-06 |
| CN101533012B (zh) | 2013-12-25 |
| EP2090889A1 (en) | 2009-08-19 |
| US20110014686A1 (en) | 2011-01-20 |
| JP2009192539A (ja) | 2009-08-27 |
| CN101533012A (zh) | 2009-09-16 |
| ATE540316T1 (de) | 2012-01-15 |
| ES2377178T3 (es) | 2012-03-23 |
| US20090061477A1 (en) | 2009-03-05 |
| US7828968B2 (en) | 2010-11-09 |
| EP2090889B1 (en) | 2012-01-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5507092B2 (ja) | 永久磁石を用いて生物サンプル中の標的成分を画像化するための方法および装置 | |
| US8110101B2 (en) | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets | |
| JP4568499B2 (ja) | 低コストで細胞計数するための方法およびアルゴリズム | |
| JP2009192539A5 (ja) | ||
| CA2711373C (en) | Isolation and enumeration of cells from a complex sample matrix | |
| US7901950B2 (en) | Method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells | |
| US20160146825A1 (en) | Method for detecting low concentrations of specific cell from high concentrations of cell populations, and method for collecting and analyzing detected cell | |
| US8318445B2 (en) | Immunomagnetic capture and imaging of biological targets | |
| JP2005502863A (ja) | 循環腫瘍細胞、断片およびデブリスの分析 | |
| WO2006102233A2 (en) | Method and apparatus for imaging target components in a biological sample using permanent magnets | |
| US20120055854A1 (en) | Filter Method for Separating Unbound Ferrofluid from Target-bound Ferrofluid in a Biological Sample | |
| US11796542B2 (en) | Rapid test for the detecting pathogens and cells and method | |
| WO2006020936A2 (en) | A method for assessing disease states by profile analysis of isolated circulating endothelial cells | |
| US7615358B2 (en) | Method for determining the concentration of vital epithelial tumor cells in a body fluid | |
| US20090305335A1 (en) | Method for analysing a sample | |
| WO2010091304A1 (en) | A filter method for separating ferrofluids in a biological sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20100713 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20111130 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120209 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121120 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20121121 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130220 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130225 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130319 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130325 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130419 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130424 |
|
| A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20130517 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130520 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140218 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140319 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5507092 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |