KR20040053115A - 분석용 세포 및 생물학적 시험편의 안정화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈액 시험편내 희귀 세포의 안정화, 혈액 시험편 품질의 보존 또는 세포 고정제로서 기능하는 조성물 및 방법에 관한 것인데, 이는 표적 세포의 손실과, 표적 세포, 비표적 세포 및 혈장 성분으로부터 파편 및 응집체의 형성을 최소화함으로써 암 환자에서 순환성 종양 세포(CTC), 궁극적으로 종양 부담의 정확한 분석 및 분류를 가능하게 한다. 시험편의 안정화는 암 환자로부터 채혈한 혈액 시험편으로부터 희귀 세포 농후화를 필요로하는 특히 바람직한 n 프로토콜이다. 가능한 스트레스성 조건, 예를 들어 정상 처리, 혈액 수송에 따른 혼합, 진탕, 지연 중에 이러한 시험편을 노출시키면 CTC의 수가 감소할 뿐만 아니라 혈액 시험편 내에서 표적 세포(존재하는 경우)의 정확한 계측을 방해하는 것으로 확인된 파편 및 응집체가 생성된다. 안정화제는 생체내 CTC 붕괴와 시험관내 샘플 분해를 구분하기 위해 필요하다.

Description

분석용 세포 및 생물학적 시험편의 안정화{STABILIZATION OF CELLS AND BIOLOGICAL SPECIMENS FOR ANALYSIS}
종양 세포는 1869년 초기에 혈액에서 검출되었다. 원발성 암은 임상적인 징후가 나타나기 이전의 초기 단계에서 순환계내로 신생물 세포를 발산시키기(shedding) 시작한다. 종양의 맥관 형성시, 순환계내로 발산된 종양 세포는 원거리의 부위에 부착하여 콜로니를 형성함으로써 전이된다. 이들 순환성 종양 세포는 건강한 개체에서는 발견되지 않고, 따라서 특정 암의 진단 및 치료를 위한 기초를 형성할 수 있다. 종양이 1-2 mm의 직경(검출을 위해 약 5 mm의 종양 크기가 필요한 유방 뢴트겐선 조영법(造影法)과 같은 종래 방법으로는 검출될 수 없는 작은 크기임)으로 성장하는 경우, 새로운 맥관형성이 발생한다. 현재의 골드 표준 유방 뢴트겐선 조영법 보다 더 초기 단계에서 소수의 CTC를 검출하는 감도와 특이성을 보유한 테스트 방법은 조기 암 진단 및 질병 관리를 획기적으로 개선시킬 수 있을 것이다. 이러한 테스트는 미국 특허 제6,365,362호 및 Terstappen 등의 문헌(둘 다 본원에 참고 인용함)에 기술되어 있다.
전혈은 생체내(본원에서 환자의 신체 내에서 발생하는 경우를 이름) 및 시험관내(채혈후 발행하는 경우를 이름)에서 특히 6시간 이상 동안 장기 저장시에 발생할 수 있는 다수의 생화학적 반응 및 효소 반응을 수행할 수 있는 가용성 성분 및 다양한 세포 군집을 함유하는 복잡한 체액이다. 이들 반응의 일부는 외래 종으로서 순환성 종양 세포의 파괴와 관련되어 있다. 또한, 환자의 면역 반응은 식세포작용 및 호중구 활성화를 포함하는 정상적인 면역 메카니즘에 의해 종양 세포를 약화시키거나 파괴한다. 유사하게, 화학요법은 네크로시스에 의한 세포 사멸을 유도함으로써 세포 기능 및 증식 둘 다의 감소를 의도한다.
이들 외부 파괴 인자들 이외에, 적대적인 환경에서 손상된 종양 세포는 프로그래밍된 사멸 또는 아폽토시스를 수행할 수 있다. 아폽토시스 또는 네크로시스를 수행하는 세포는 막 투과성이 변경됨으로써 DNA, RNA 및 다른 세포 성분의 배출을 가능하게 하여 세포 파편의 형성 및 CTC의 실질적으로 완전한 분해를 유도한다. 이러한 종양 세포 파편은 완전한 세포의 특성인 에피토프를 보유할 수 있으며, 순환성 종양 세포의 의사 증가를 유도할 수 있다. 건강한 개체로부터 얻은 전혈 시험편 조차 세포 조성에서 실질적인 변화를 겪게되고, 광범위하게 분류되며, 본원에서 24시간 이상의 장기간 저장시 발생할 수 있는 감소된 혈액 품질로 정의된다. 적혈구는 파괴되고 헤모글로빈이 방출되고, 세포 고스트가 생성될 수 있다. 백혈구, 특히과립구는 불안정하게 되고, 저장시 감소된다. 이러한 변화는 정상 혈액 세포 또는 단배질로부터 유래된 세포 파편의 양을 증가시키고, CTC와 같은 희귀 표적 세포의 분리 및 검출을 방해하는 것으로 확인되었다. 이들 파괴 과정의 연합 효과는 예를 들어 유동 세포계측 분석 및 현미경 분석을 이용하여 용이하게 검출할 수 있는 세포 파편의 실질적인 증가를 나타낸다. 이러한 분석 방법은 본원 참고 인용한 공동 소유의 동시계류중인 출원 "순환성 종양 세포, 단편 및 파편의 분석"에 기술되어 있다.
현미경 영상분석에 의한 순환성 종양 세포의 검출은 유사하게 분류가능한 종양 세포의 의사 감소(spurious decreases) 및 염색가능한 방해성 파편의 상응하는 증가에 의해 좋지않은 영향을 받는다. 따라서, 혈액 시험편의 완전성 또는 품질을 유지하는 것은 매우 중요한 일인데, 그 이유는 채혈과 시험편 처리 사이에는 24시간 정도의 시간차가 있을 수 있기 때문이다.
이러한 시간차는 꽤 일반적인 것인데, 그 이유는 이러한 분석을 위한 혈액 처리 기법 및 장비는 모든 실험실에서 일반적으로 용이하게 사용할 수 있는 것은 아니기 때문이다. 샘플을 샘플 처리용 실험실에 전달하기 위해 필요한 시간은 매우 다를 수 있다. 그러므로, 샘플이 처리될 수 있는 시간 창을 확립하는 것이 중요하다. 그러나, 희귀 혈액 샘플의 분석은 매우 중요하기 때문에, 혈액 샘플이 분석될 수 있는 시간 창은 짧아진다. 한 예로는 일반적으로 24 시간내에 수행해야만 하는 혈액 세포의 면역표현형 결정을 들 수 있다. 암 혈액 분석에서, 더 많은 부피의 혈액이 처리되어야 하며, 혈액 샘플의 분해는 더 문제시되는데, 그 이유는 붕괴 세포에 의해 방출된 물질은 백그라운드를 증가시킬 수 있으며, 따라서 종양 세포를 검출할 수 있는 능력을 감소시킨다.
시간 경과에 따른 정상적인 혈액 샘플의 안정성 및 안정화에 관한 상당량의 공개 문헌 및 특허가 존재하며, 몇몇 독점적으로 상업화된 안정화제가 혈액 세포 보존을 위해 사용되고 있는데, 그 예로는 미국 네바다 오마하에 소재하는 스트렉 레보러토리즈에서 시판되는 Cyto-Chex(상표명), 미국 미네소타 세인트폴에 소재하는 바이오에르고노믹스에서 시판되는 StabilCyte(상표명) 및 영국 쉐필드에 소재하는 UKNEQAS에서 시판되는 TRANSfix(상표명)를 들 수 있다.
WO 97/45729에서, TRANSfix(상표명) 안정화제는 병리학적 시험편, 구체적으로 HIV 및 백혈병 혈액 시험편의 분석에 적합한 것으로 청구되어 있다. 그러나, 이들 출원에는 연장된 기간 동안의 저장 중에 CTC를 안정화시거나 보호하기 위해 TRANSfix(상표명) 안정화제를 사용하는 것에 대한 자료는 제시되어 있지 않다. TRANSfix(상표명) 안정화제는 가교 고정제인 파라포름알데히드 및 중금속 이온 내에 함유되어 있는 것으로 청구되어 있다. 이는 유동 세포 계측법에서 측정되는 바와 같이 5일 이상 동안 과립구를 포함하는 백혈구의 완전성을 보존하는 것으로 확인되었다. 그러나, CTC 또는 기타 병원체에 대한 자료는 제시되어 있지 않다.
파라포름알데히드, 또는 파라포름알데히드, 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살을 함유하는 시약의 단점에도 불구하고, 이러한 시약은 종종 혈액 또는 조직학적 시험편내 종양 세포의 고정 및 안정화를 위해 사용된다(참조: 예를 들어, D.B. Tse 등, 미국 특허 제6,004,762호). 효과적인 고정은 CTC가 세공 형성 시약,예를 들어 사포닌 또는 계면활성제(약한 CTC의 막 구조 및 완전성을 추가로 약화시킴)로 투과가능하게 된 후 특히 중요하다. 투과성화는 세포내 요소의 예를 들어 핵 염료 DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐인돌) 및 표지 항체, 예를 들어 사이토케라틴(CTC를 특성화하거나 CTC와 정상 혈액 세포를 구분하는 데 사용함)에 의한 염색 또는 면역염색를 허용하는 데 필요하다.
이기능성 또는 가교용 알데히드에 대한 대안적인 고정제가 사용되어 왔다. 이전 고정제의 일부는 중금속, 예를 들어 크롬 또는 망간을 주성분으로 한 것인데, 이는 가죽의 무두질에서의 작용 모드와 유사하나, 특이성의 부족과 독성으로 인해 그 사용이 제한된다. 다른 고정화 방법은 포름알데히드의 단기능성 유도체, 또는 이종환식 아민 또는 아미드의 메틸올 유도체, 예를 들어 디아졸리디닐 우레아 및 이미다졸리디닐 우레아(화장품업계에서 보존제로 널리 사용됨)를 이용한다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜(분자량이 약 20,000인 것)은 백혈구를 위한 효과적인 안정화제인 것으로 기술되어 있다. 이러한 화합물들은 미국 네바다 오마하에 소재하는 스트렉 레보러토리즈 소유의 몇몇 미국 특허(제5,459,073호, 제5,849,517호, 제6,017,764호, 제6,051,433호, 제6,124,089호, 제6,159,682호 및 제6,200,500호)에 기재되어 있는데, 이들은 주로 혈액학 대조군으로서 사용하기 위한 특이적인 혈액 세포 군집을 안정화시키기 위해 의도된 것이다.
메틸올 유도체의 작용 모드는 알려져 있지 않으나, 과량의 고정제의 제거시 분리될 수 있는 세포성 단백질의 아미노기와의 약한 가역성 결합과 관련되어 있는 것으로 생각된다. 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체는 화학적으로 불안정하며, 단백질과의 짧은 범위 또는 단일 탄소 가교를 형성하는 소량의 포름알데히드를 방출할 수 있다. 이들 소위 포름알데히드 공여체로부터 방출된 포름알데히드는 핵산 염기, 구체적으로 아데닌과 결합하여 가역적으로 히드록시메틸올 유도체 및 메틸렌 브리지를 형성함으로써 핵산을 비가역적으로 가교시킬 수 있는데, 이는 화장품에서작용의 살생 모드(biocidal mode)일 수 있다. 그러나, 유리 포름알데히드는 Cyto-Chex(상표명) 안정화제의 활성 성분은 아닌 것으로 기재되어 있다. 이들 특허는 혈액 또는 기타 생물학적 시험편에서 CTC를 안정화시키거나 고정하기 위한 유용성에 대해서는 기재하고 있지 않다. 혈액 내에서 순환하는 종양 세포는 정상적인 혈액 세포와 유사하게 안정화되는 것으로 추정할 수 없는데, 그 이유는 CTC의 공지된 약함(fragility)때문이며, CTC의 임의의 안정화가 일어난다해도, 이는 처리 기간 시종에 걸쳐 지속될 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명자들이 존재하는 경우 CTC의 정확한 분류 및 수치화에 필요한 농후화 및 검출 과정에 결정적인 것으로 확인된, 저장 및 처리 중에 시험관 내에서 CTC를 안정화시키고 혈액 품질을 보존하기 위해 효과적인 시약에 대한 명백한 요구가 존재한다.
본원은 미국 가출원 60/314,151(2001년 8월 23일 출원) 및 60/369,628(2002년 4월 3일 출원)의 우선권 주장 출원이다.
본 발명은 일반적으로 세포 및 혈액 안정화 분야에 관한 것이며, 구체적으로 혈액 시험편내 희귀 세포의 안정화에 관한 것이며, 최협의로 후속 농후화 및 분석을 위해 전혈내 순환성 종양 세포(CTC)의 안정화에 관한 것이다.
도 1은 실온에서 24 시간 동안 저장한 후 9명의 암 환자로부터 얻은 전혈 시험편내 검출가능한 CTC의 감소를 나타내는 도면이다.
도 2는 0, 6, 18 및 24 시간에서 3명의 암 환자로부터 얻은 전혈 시험편내 검출가능한 CTC를 나타내는 도면이다.
도 3은 표 II의 암 환자(#28162)로부터 얻은 2개의 시험편 튜브를 선적한 후 시험편의 품질에 대한 Cyto-Chex(상표명)의 효과를 나타내는 도면이다: (a) 안정화제 처리하지 않은 시험편, (b) 30% Cyto-Chex(상표명) 안정화제 처리한 시험편. 이미지는 핵산 염료 DAPI를 첨가한 후 농후 샘플내 세포의 DNA의 염색을 나타낸다. 환상 물체의 대다수는 CTC를 포함하는 유핵 세포내의 핵을 의미하는 반면, 불규칙한 응집체는 손상된 세포로부터 방출된 DNA를 포함할 수 있다.
도 4는 24 시간 동안 정치하거나 혼합기(nutator)에서 혼합한 후 시험편 품질에 대한 Cyto-Chex(상표명)의 효과를 나타내는 도면이다: (a) 혼합하지 않고, 안정화제 처리하지 않음, (b) 혼합하였으나 안정화제 처리하지 않음, (c) 혼합하고, 30% Cyto-Chex(상표명) 안정화제 처리함. DAPI 염색후 이미지 분석은 도 3(b)에서 논의된다.
도 5는 3가지 유형의 CTC 분해를 나타내는 도면이다: 원형(intact) CTC(도 5(a), 서스펙트(suspect) CTC(도 5(b)) 및 "비지정(Not Assigned Events)"(도 5(c) 및 5(d)).
도 6은 24 시간 및 72 시간에서 27명의 환자의 안정화된 혈액으로부터 유래한 CTC의 비교 결과를 나타내는데, 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이 현저히 유사한 수치를 나타냈을 뿐만아니라 비교를 위한 통계학적 유의성도 나타냈다.
발명의 상세한 설명
본원에서는 당업자에 의해 용이하게 이해되는 여러가지 용어를 사용하였다. 이들 용어의 의도된 의미는 일반적으로 받아들여지는 의미를 벗어나는 것은 아니다.
시험편, 샘플 또는 혈액 품질은 본원에서 정의하였으며, 하기 매개변수들을 이용하여 실험적으로 결정한 것들이다:
1. CTC 또는 종양 세포와 비교한 백그라운드로서 비특이적으로 선택된 백혈구의 상대적인 수;
2. 핵 염료 DAPI로 검출가능하게 염색된 미립자 물질 및 더 큰 응집체에 의해 측정한 바와 같이 DNA 또는 DNA 단편을 포함하는 세포 파편; 및
3. 피코에리트린(PE) 표지된 항-사이토케라틴 항체 또는 백혈구 상의 CD-45에 대한 알로피코시아닌(APC) 표지된 항체로 비특이적으로 또는 특이적으로 염색한 세포의 세포질 파편 또는 응집체.
본원에서 사용한 용어 "생물학적 시험편" 또는 "생물학적 샘플"은 상호 대체가능하게 사용된 것이며, 소정의 세포를 함유하는 것으로 추정되는 인간 피검체로부터 분석을 위해 취한 소량의 유체 또는 조직을 의미한다. 생물학적 시험편은 유체 부분 및 세포성 부분을 의미할 수도 있고, 또는 가용성 물질을 함유하는 부분을 의미할 수도 있다. 생물학적 시험편 또는 생물학적 샘플은 체액으로 제한되지 않고, 말초 혈액, 조직 균질화물, 유두 흡인물, 결장 세척액, 가래, 기관지 세척액 및 인간 피검체로부터 얻을 수 있는 임의 세포원일 수 있다. 예시적인 조직 균질화물은 유방암 환자내 센티넬 노드(sentinel node)로부터 획득할 수 있다.
본원에 사용한 용어 "희귀 세포"는 보통 생물학적 시험편내에 존재하지 않으나, 비정상적인 상태, 예를 들어 감염성 질병, 만성 질병, 상처 또는 임신의 지표로서 존재할 수 있는 세포를 의미한다. 또한, 희귀 세포는 보통 생물학적 시험편 내에 존재하지 않으나 보통의 생물학적 시험편내에 전형적으로 존재하는 세포 보다 몇배 낮은 빈도로 존재할 수 있는 세포를 의미한다.
본원에 사용한 용어 "항응고제(anti-coagulant 또는 anti-coagulating agent)"는 상호 대체가능하게 사용되는 용어로서, 임의의 바람직하지 않은 자연적인 또는 인공적인 응집(coagulation), 교착(agglutination) 또는 응집(aggregation)을 억제할 목적으로, 총체적으로 "클럼핑(clumping)" 또는 "클럼프 형성"으로 정의되는 현상을 억제할 목적으로 생물학적 시험편에 첨가되는 조성물을 의미한다. 그러나, 이러한 클럼프는, 이들이 원형 CTC에 대한 분류 기준에 충족되는 경우, 원형 CTC로서 개별적으로 계수되는 CTC의 "클러스터" 또는 응집체(aggregates)와는 구분되어야 한다. 그들의 부착성 및 2차 전이성 종양 부위를 확립하는 경향으로 인해 CTC의 클러스터는 단일 CTC에 비해 더 큰 증식 가능성을 보유하는 것으로 생각되며, 따라서 그들의 존재는 진단학적으로 매우 유의적이다. 응집의 예는 혈액 응고이며, 통상적인 항응고제는 킬레이트화제, 예를 들어 에텔렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA), 에틸렌비스(옥시에틸렌트릴로) 테트라아세트산(EGTA) 또는 착화제, 예를 들어 헤파린 및 헤파린 종, 예를 들어 헤파린 설페이트 및 저분자량 헤파린이다.
이상적인 "안정화제" 또는 "보존제"(본원에서 상호 대체가능하게 사용됨)는 표적 세포의 분리, 검출 및 수치화를 임의의 방식으로 방해할 수 있는, 생물학적 시험편내 방해성 응집체 및/또는 세포 파편의 형성 및 비표적 세포로부터 그들의 분화를 최소화하면서, 생물학적 시험편내에 존재하는 소정의 표적 세포를 보호할 수 있는 조성물을 의미한다. 달리 표현하면, 항응고제와 결합하는 경우, 안정화제는 항응고제의 작용을 방해하지 않아야 한다. 또한, 개시된 안정화제는 고정화시키는 제3의 작용을 수행함으로써 투과성화된 세포를 안정화시키는데, 이때 본원에서 사용한 용어 "투과성화된(permeabilized)" 또는 "투과성화" 및 "고정하는(fixing)", "고정된" 또는 "고정"은 세포 생물학에서 통상적으로 사용하는 의미이다. 본원에 기술한 안정화제에 대한 내용은 세포 생물학 분야의 당업자에게 명백한 적합한 농도와 양으로 이들 제제를 사용하는 것을 포함하는 의미인데, 이때 상기 농도 또는 양은 손상을 일으키지 않고 표적 세포를 안정화시키는데 효과적인 농도와 양이다. 희귀 세포를 보존할 목적으로 본 발명의 조성물, 방법 및 장치를 사용하는 경우, 이들 희귀 세포를 손상시키거나 파괴하는 방식으로 사용하는 것은 배제되며, 따라서 적합한 농도와 양이 본질적으로 선택된다. 예를 들어, 포름알데히드 공여체 이미다졸리디닐 우레아는 시험편 부피의 0.1% 내지 10%, 더 바람직하게는 0.5% 내지 5%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 3%의 농도에서 효과적인 것으로 확인되었다. 추가 제제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜도 시험편 부피의 약 0.1% 내지 5%, 더 바람직하게는 약 0.1% 내지 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 0.5%로 첨가되는 경우 효과적인 것으로 확인되었다.
안정화제는 적어도 수 시간 동안 샘플을 보존할 수 있어야만 한다. 그러나, 본원에 제시된 예에서, 샘플은 적어도 72 시간까지 보존될 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 장기간의 안정성은 샘플이 처리 및 분석되는 곳으로부터 멀리 떨어진 곳에서 샘플이 채취되는 경우에 중요하다. 또한, 샘플은 수송중의 기계적인 손상에 대해 안정화되어야 한다.
본원에 사용한 용어 "순환성 종양 세포(circulating tumor cell)" 또는 CTC는 종종 다수의 수로 종양 세포로부터 발산되는 것으로 알려진 세포를 의미한다. CTC의 파괴가 종양 부하의 크기에 의존하는 발산 속도와 동일하게 되는 경우, 정상 상태 레벨이 유지된다(참조: JG Moreno 등, "Change in Circulating Carcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate Cancer Correlates with DiseaseState", Urology 58: 2001). 일반적으로, 더 내성이며 증식성인 세포는 제2 또는 전이 부위를 확립하기 위해 생존한다. 순환성 종양 세포는 본 발명에 의해 안정화시키거나 고정하려는 바람직한 표적 희귀 세포이다.
본원에 사용한 용어 "세포 조성물"은 생물학적 시험편으로부터 유래하는 다수의 상이한 유형의 세포를 의미한다. 이 세포 조성물은 표적 세포 및 비표적 세포 둘 다를 포함할 것이다. 예를 들어, 숙련된 생물학자는 본원에 기술된 바와 같이 다른 생물학적 시험편이 생물학적 시험편의 소스에 따라 상이한 유형의 세포를 함유할 것이라는 것을 인식할 것이다.
농후화 방법, 예를 들어 문헌(Terstappen 등, 미국 특허 제6,365,362(본원에 참고 인용함))에 기술된 것과 같은 방법 중에, 농후화된 세포 분획은 주로 백혈구와 존재하는 경우 훨씬 소수의 CTC를 함유한다. 처리중, 세포는 연성 계면활성제 Immuniperm(상표명)(미국 펜실베니아 헌팅톤 밸리에 소재하는 이뮤니콘 코포레이션에서 시판되는 0.05% 사포닌을 함유하는 PBS)로 투과성화하여 직경 약 8 nm의 소공을 형성시켜 면역염색성 항체, 항-사이토케라틴-PE 및 핵 염료 DAPI의 진입을 허용한다. DAPI는 세포성 DNA 및 세포외 DNA내 아데닌-티민에 선택적으로 결합하는 형광성 삽입 염료이다. 이들 소공은 세포 막의 구조적 완전성을 추가로 약화시키며, 염색후 홀을 "막기(plug)" 위해 세포 고정제 또는 안정화제를 필요로 한다. 이전에 기술한 바와 같이, 당업계의 종래 알데히드 및 중금속을 주성분으로 하는 고정제(투과성화된 막을 강화시킬 의도로 사용됨)은 자기 수집 과정 및 본 발명에서 사용된 염색 프로토콜과 양립할 수 없는 것으로 확인되었다. 대조적으로, 본 발명에서사용된 Cyto-Chex(상표명) 안정화제는 예상밖으로 후염색 단계에서 고정제로서 매우 효과적인 것으로 확인되었으며, 따라서 본원에서 제안된 제제 배합물에 포함된다. 따라서, 본원에서 동시에 또는 순차적으로 기술하고 사용한 안정화제는 다음과 같은 3가지의 결정적인 기능을 수행하기 위해 발명한 것이다:
1. 수송, 저장, 샘플 제조 및 후속 분석을 위한 혈액 시험편내 CTC 및 비표적 세포의 안정화;
2. 파면 및/또는 응집체 형성의 억제에 기인한 혈액 시험편의 품질 보존; 및
3. 투과후 고정제로서의 기능.
이들 기능중 하나 이상은 본 발명에서 사용된 농후화 분석에서 CTC 또는 희귀 세포의 정확한 분석을 위해 필수적인 것으로 확인되었다.
염색가능한(예를 들어, DAPI와 같은 핵 염료에 의해 염색가능한) 핵의 존재는 유핵 세포의 필수적인 형태학적 특성이다. 양성 DAPI 염색은 "원형 CTC"로서 사이토케라틴-양성 세포의 정의 및 분화에서 결정적인 요소인데(도 5a), 이는 항-사이토케라틴 항체에 의해 인식된 세포골격 단백질의 DAPI-양성 또는 DAPI-음성 및/또는 불규칙 또는 반점형 세포질 염색에 의해 특성화되는 "서스펙트 CTC"와는 구별된다. 원형 및 서스펙트 CTC 둘 다 DAPI-양성인 백혈구와는 구별되나, 백혈구 특이성 마커 CD45를 발현한다. "서스펙트 CTC"는 원형 CTC와 회합될 수 있고, "원형 CTC"로부터 유래하는 상피 세포 기원의 네크로시스성 세포, 아폽토시스성 세포 또는 "아폽토시스성 바디"일 수 있거나, 또는 종양 부위로부터 순환계로 발산된 몇몇 형태학적 특징을 보유한다.
표 II 및 도 5c 및 5d에서 "비지정"으로 표기한 입자 또는 검출가능한 현상의 제3 카테고리는 "서스펙트 CTC"와 유사한 염색 특성을 보유할 수 있으나, 세포의 구조 형태학적 특징은 결여되어 있다. 즉, 이들은 안정화된 혈액 시험편에 비해 안정화되지 않은 혈액 시험편에서 통계학적으로 더 우세한 것으로 확인된 거의 불규칙한 응집체 또는 클럼프이다(p=0.0327). 안정화된 혈액 시험편 내에서 "원형 CTC"에 비해 "서스펙트 CTC"의 실질적인 수의 존재는 성장/종양 부하, 면역 상태 및/또는 환자의 치료적 반응과 관련하여 임상의학자에게 중요한 진단 정보를 제공할 수 있다. 표 I은 8명의 암 환자에서 상대적인 수의 원형 CTC, 서스펙트 CTC 및 "비지정"에 대한 상이한 안정화제의 안정화 효과를 나타내고 있다. 표 II는 여러가지 암을 가진 30명의 암 환자에서 안정화제를 처리하지 않은 경우(p=0.0004)와 비교하여 CTC에 대해 Cyto-Chex(상표명) 안정화제의 유의적인 안정화 효과 및 안정화제 처리하지 않은 경우와 비교하여 Cyto-Chex(상표명) 안정화제 처리한 "비지정"의 수의 유의적인 감소(p=0.0327)를 나타낸다. 서스펙트 CTC의 수는 안정화된 혈액과 안정화되지 않은 혈액(p=0.1548) 사이에 통계적으로 상이한 점은 없었다. 안정화되지 않은 혈액에서 백그라운드의 증가 원인은 "진정" 서스펙트 CTC와 구별할 수 없는 인공물 때문이다. 인공물과 생체내에서 형성된 종양 파편 또는 서스펙트 CTC간의 구별은 임상적 유의성을 가질 수 있으며, 채혈과 CTC 분석(즉, 시험관 내에서) 사이에 샘플 분해에 기인한 인공물의 기여 없이 환자의 혈액 내에서 CTC 상태의 평가를 가능하게 하는 혈액/CTC 안정화제에 대한 요구를 강조하는 것이다.
하기 실시예에서 사용된 농후화 과정에서, CTC(특별히 언급하지 않으면, 일반적으로 원형 CTC와 서스펙트 CTC 모두를 포함하는 의미이다), 세포 단편 및 세포 파편은 CTC 상의 특이적인 표면 마커를 인식하는 자기적으로 표지된 항체를 이용하여 포획된다(예를 들어, 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제6,120,856호에 기술된 바와 같이, 직경이 약 0.2 ㎛(200 nm)인 자기 입자에 부착된 항-EpCAM 항체를 이용하여 포힉된다). CTC의 표면 상에 작지만 조밀한 다수의 자기 입자의 존재는 자기 항온처리(자기장내) 및 자기 수집 중에 고 구배 자기 분리기(예를 들어, 이뮤니콘 사중극자 QMS17; 미국 특허 제5,186,827호 및 제5,466,574호) 내에 생성된 강한 자기장 내에서 자기적으로 표지된 세포의 고속 이동 중에 약화되었으며 안정화되지 않은 세포 막을 추가로 압박한다.
본 발명의 안정화제는 원심분리, 볼텍싱 및 피펫팅과 같은 일반적인 시험편 처리과정중에 자기 스트레스 및 비자기 스트레스 둘 다 발생할 수 있는 자기적으로 표지된 세포에 대한 손상을 억제하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 희귀 세포 및 CTC에 대한 실질적으로 더 큰 손상은 미국 뉴욕 레이크 석세스에 소재하는 다이날 인크.에서 시판되는 2.8 ㎛ 및 4.5 ㎛의 더 큰 자기 입자 또는 비드를 이용하는 면역자기 표지화를 사용하는 경우에 관찰된다.
채혈 및 시험편의 후속 처리중, 말초 순환계에 존재하는, 생존하는 손상된 종양 세포는 채혈중 난류에 의해, 및 분석전 혈액 튜브의 수송 및 혼합과 같은 시험편 처리에 의해 추가로 압박을 받거나 손상될 수 있다. 이러한 기계적인 손상은 시험관 내에서 시간에 의존하는 방식으로 발생하는 CTC의 파괴를 유도하는 진행중인 면역학적 과정, 아폽토시스성 과정 및 네크로시스성 과정에 부가적으로 작용한다. 본 발명자들은 시험편을 더 오래 기간 동안 저장할수록 CTC의 손실이 더 많아지며, 더 많은 양의 방해성 단편 및/또는 응집체가 생성되는 것을 확인하였다. 실제로, 본원에 제시된 자료(도 1 및 도 2)로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 24 시간 이상 동안 실온에서 저장한 몇몇 혈액 시험편에서 CTC 수치는 급격히 감소하였으며, 이는 채혈후 시험관 내에서 CTC의 실질적인 파괴를 의미하는 것이다. 저장중 조혈 세포의 손실은 널리 알려진 현상이며, 상기 인용한 스트렉 래버러토리즈 및 기타 특허권자 소유의 특허의 주제이며, 혼합 또는 수송에 기인한 기계적인 손상의 출현은 CTC 또는 희귀 세포의 손실에서 지금까지 그 요인이 확인되지 않고 있다. 유사하게, CTC 또는 다른 희귀 세포의 분석에서 세포 파편의 형성 및 축적되는 파편 및 응집체의 방해 효과는 지금까지 확인되지 않고 있다. 이는 상대적으로 큰 혈액 부피(5 내지 50 ml)의 처리 및 부피 감소후(1 ml 미만) 후 현미경을 이용한 표적 세포의 검출 또는 영상화를 필요로하는 고감도 농후화 분석에서 가장 명백하며 문제가 되는 것으로 생각된다. 이러한 파편은 일반적으로 확인되지 않거나, 또는 종래의 비농후화 분석, 예를 들어 유동 세포계측법 또는 밀도 구배법에 의해 농후화를 방해하지 않는다.
개략적으로, 상기한 요인 전부 또는 일부는 시험관 내에서 본 발명에 개시한 바와 같은 농후화 절차에 의한 CTC의 검출을 방해하는 것으로 관찰된 파편 및/또는 클럼프 형성에 기여하는 것으로 확인될 수 있고, 또 확인되었다. 본원에 개시한 바와 같이, 안정화 조성물 및 이의 용도는 CTC를 보존하고, 검출가능한 세포 파편 및 응집체의 형성을 감소시킴으로써 일차적으로 혈액 시험편의 품질을 현저하게 개선시키며, 농후화 과정에서 안정화제 및 고정제로서 기능할 수 있는 것으로 확인되었는데, 이는 예상하지 못한 것이다. 가장 중요한 점은, 시험관내에서 CTC의 손상 및 혈액 시험편내 품질의 저하를 최소화하는 데 효과적인 안정화제의 발견이 환자에서 CTC의 생체내 상태의 더 완전한 모습을 제공한다는 것이다. 도 5에 예시한 바와 같이, 원형 CTC, 손상된 CTC 또는 서스펙트 CTC의 수 뿐만 아니라 CTC의 손상 정도는 종양 부하, 종양 세포의 증식 가능성 및/또는 치료법의 효율성의 진단학적으로 중요한 지표이다. 대조적으로, 안정화되지 않은 샘플을 사용하는 종래 기술은 설상가상으로 피할수 있는 시험관내 저장 및 처리 손상에 대해 CTC에 대한 피할 수 없는 생체내 손상을 야기시키며, 따라서 환자에서 CTC 및 종양 부하에 대한 잘못된 정보가 생성될 수 있다. 그러므로, 이러한 분석을 수행하기 위한 방법 및 시약은 "순환성 종양 세포, 단편 및 파편의 분석"이라는 명칭으로 동시계류중인 출원에 기술되어 있다. 상기 공유 출원은 본원에 참고 인용한 것이다.
본 발명은 하기하는 비제한적인 실시예에 의해 추가 기술될 것이나, 이는 본 발명의 일반적인 실시 태양을 위한 경우를 제공하는 것이다.
발명의 개요
안정화제는 생체내 종양 세포 붕괴와 시험관내 샘플 분해에 기인한 붕괴를 구별하는 데 필요하다. 본 발명에 따르면, 생물학적 시험편의 품질을 유지하기 위해 안정화제, 고정제 및 보존제로 작용하는 몇몇 조성물이 제공된다. 또한, 생물학적 시험편을 안정화하는 방법 및 장치가 제공된다. 이들 개선점 및 발견들은 종래시스템 및 방법에 비해 크게 개선된 것임을 기술하는 것이며, 전혈 내에서 CTC의 농후화 및 수치화를 위해 사용된다.
생물학적 시험편을 보존하기 위해 다수의 조성물이 개발되었다. 이들 조성물은 항응고제와 안정화제의 배합물이다. 또한, 본 발명은 안정화된 샘플, 항응고제 및 안정화제(들)의 조성물을 교시한다. 또한, 본 발명은 생물학적 시험편과 이들 조성물을 접촉시킴으로써 안정성을 증강시키는 여러가지 방법을 교시한다. 또한, 본 발명은 생물학적 시험편과 이들 조성물을 접촉시킴으로써 안정성을 증강시키는 여러가지 장치를 교시한다. 일반적으로, 이들은 생물학적 시험편을 보존하기 위해 사용될 수 있으며, 구체적으로 혈액 샘플 내에서 CTC를 보존하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 채혈 이전에 혈액 수집 튜브에 안정화제의 첨가를 포함하는 개선된 프로토콜이 제공된다. 또한, 본 발명에 따라 채혈 직후 혈액 튜브에 안정화제를 첨가하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 혈액 튜브내 시험편의 부피를 변경하기 위한 보상 프로토콜을 포함한다.
또한, 본 발명에 따라 생물학적 시험편의 처리에 사용된 하나 이상의 버퍼에 안정화제를 첨가하여 필요에 따라 안정하제 및/또는 고정제로서 작용하게 하는 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명의 일차적인 목적은 분석 이전에 생물학적 시험편을 위한 안정화제를 제공하는 것이다. 본 발명의 특정 용도는 혈액 샘플 내에서 CTC를 안정화시키는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 24 시간 이상, 그러나 기계적인 응력, 예를 들어 수송중의 부적절한 혼합 또는 진탕, 또는 분석 이전 시험편의기계적인 재혼합에 노출되는 경우 72 시간까지 전혈 시험편의 품질을 보존하기 위한 안정제 및 보존제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 이러한 발견들은 당업자에 의해 고려될 수 있는 조성물 및 방법중 다수의 가능한 적용예중 예시적인 것이 그치는 것이며, 이것으로 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 다른 목적 및 잇점은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 특허청구의 범위에 의해 며백하게 될 것이다.
실시예 1
혈액 내에서 순환성 종양 세포의 안정화
Cyto-Chex(상표명), StabilCyte(상표명) 및 TRANSfix(상표명)는 시판되고 있는 3가지 안정화제의 예이며, 연장된 시간 동안 혈액 시험편내 혈액 세포를 안정화시키는 데 유용한 것으로 확인되었다. 이들 안정화제는 (주로 수축을 최소화함으로써) 세포 크기를 유지하고, 주로 유도 세포계측법에 의해 측정되는 바와 같이 세포 표면 상의 항원을 보존하기 위해 최적화된다. 의도된 출원은 일반적으로 직접적인 분석과 관련되어 있으며, 샘플의 광범위한 조작 또는 특정 세포 군집의 농후화를 필요로하진 않는다. 대조적으로, 본 발명에서 분리 및 검출된 순환성 종양 세포 또는 기타 희귀 표적 세포는 매우 낮은 빈도로 병리학적으로 비정상적인 세포 또는 희귀 세포를 포함하며, 따라서 검출 이전에 실질적인 농후화가 필요하다.
CTC는 종종 실온 또는 2℃ 내지 8℃에서 24 시간 동안 저장한 후에도 혈액내에서 검출가능할 수 있으나, 상기 논의한 이유로 인해 매우 약해진다. 임의의 조작 또는 농후화 방법은 이들 약한 세포를 손상시킬 수 있으며, 따라서 분리 과정 중에 가능한 세포 손실 및 파편 또는 응집체 형성이 일어나는 것으로 확인되었다. 도 1 및 도 2는 24 시간 이하의 저장시 몇몇 시험편에서 CTC의 실질적인 손실을 예시한다.
본 실시예에서, 24 시간 이후 시험편으로부터 농후화후 CTC의 회수에 대한 상이한 안정화제의 효과를 조사하였다. 진행된 암을 보유한 환자로부터 혈액 샘플을 채취했으며 채혈 2 시간 내에 다음과 같이 안정화제로 처리하였다. 각각의 환자로부터 EDTA를 함유하는 상이한 튜브내로 채혈한 혈액을 모으고, 동일한 부피를 별개의 튜브에 위치시켰다. Cyto-Chex(상표명) 안정화제, StabilCyte(상표명) 안정화제 및 TRANSfix(상표명) 안정화제로 구성되는 여러가지 첨가제를 각각의 튜브에 혈액 부피의 30% Cyto-Chex(상표명) 안정화제, 혈액 부피의 20% StabilCyte(상표명) 안정화제 및 혈액 부피의 10% TRANSfix(상표명) 안정화제로 첨가하였다. 이어서,상기 샘플들은 혼합하고 실온에서 24 시간 동안 저장하였다. 동일한 부피의 이뮤니콘 시스템 버퍼(0.5% BSA, 0.2% 카제인 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS)를 각각의 샘플에 첨가하였다. 혼합후, 샘플들은 800 xg에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 제거하였다. 이뮤니콘 AB 버퍼(본원에 참고 인용한 미국 출원 제09/351,515호 및 제09/702,188호에 기술된 기법인 조절된 가역 응집의 매개자로서 스트렙타비딘을 함유하는 시스템 버퍼)를 각각의 튜브에 초기 혈액 부피의 1.5배의 최종 부피로 첨가하였다. 샘플을 혼합한 후, CA EpCAM 자성유체(항-EpCAM 항체에 커플링되어 있으며 조절된 가역 응집의 매개자로서 데스티오비오틴을 보유하는 0.2 ㎛ 자기 입자)를 샘플에 첨가하여 CTC를 자기적으로 표지하였다.
샘플은 이뮤니콘 사중극자 고 구배 자기 분리기(QMS17; 둘 다 본원에 참고 인용한 미국 특허 제5,186,827호 및 제5,466,574호) 내에서 CA EpCAM 자성유체와 함께 10분 동안 본원에 참고 인용한 미국 특허 출원 제09/240,939호에 기술된 바와 같이 각각 10분 후에 외부에서 QMS17 자석을 재혼합하면서 항온처리하였다. 이들 자기 항온처리후, 샘플들은 20분 동안 자기적으로 분리하였다. 수집되지않은 분획은 흡인하고, QMS17로부터 튜브를 제거하였다. 자기적으로 수집된 분획은 시스템 버퍼 내에 재현탁시키고, QMS17 내에서 10분 동안 재분리하였다. 수집되지 않은 분획은 다시 흡인하고, 수집된 세포는 Immuniperm(상표명)(0.05% 사포닌을 함유하는 PBS) 200 ㎕ 내에 재현탁시켜 포획된 세포를 투과성화하여 세포내 염색이 가능하도록 하였다.
투과성화된 샘플은 몇몇 형광 마커로 이루어진 칵테일로 15분 동안 염색하였다: 항-사이토케라틴-PE 20 ㎕, 항-CD45-APC 20 ㎕ 및 DAPI 20 ㎕. 항-사이토케라틴은 상피 세포를 염색하며, 항-CD45는 백혈구를 염색하여 임의의 비특이적으로 염색된 백혈구와 표적 CTC를 구분한다. DAPI를 이용하여 모든 유핵 세포를 동정하고, 세포와 비유핵 세포 파편을 구분하였다. 자기 분리를 이용하여 과량의 염색 시약을 세척한 후, 샘플은 이뮤노콘 CellFix(상표명)(0.5% BSA, 10 mg/ml 비오틴 및 25% Cyto-Chex(상표명) 안정화제를 함유하는 시스템 버퍼) 320 ㎕내에 재현탁시켰다.
각각의 샘플은 이뮤니콘 CellSpotter(등록상표) 챔버(본원에 참고 인용한 미국 특허 출원 제10/074,900호에 기술되어 있음)로 이전시켰는데, 이 챔버는 양극성 각 자석 어셈블리(본원에 참고 인용한 미국 특허 제6,136,182호에 기술되어 있음)내로 장착하도록 설계된, 광학적으로 편평한 상부 관찰창이 구비된 큐빗형 인클로저이다. 관찰창의 내면 상에서 자기적으로 표지된 표적 세포의 자기 수집은 형광 현미경에 의한 영상화를 가능하게 한다. 상기 샘플 챔버 표면은 4개의 상이한 필터로 자동 스캐닝하였다. 소프트웨어는 영상을 수집하고 분석하였으나, 후속 재관찰 및 분류를 위해 가능한 CTC 후보로서 사이토케라틴-PE 및 DAPI 둘 다에 대해 양성인 영상만을 나타냈다. 분류된 원형 CTC, 서스펙트 CTC 및 미지정(파편 입자)는 범-백혈구 마커 CD45-APC에 대한 음성 염색을 제외하고 사이토케라틴-PE 및 DAPI에 대한 형태 확인 및 양성 염색후에 카운트하였다. 표 I로부터 분석 이전에 24 시간 동안 여러가지 안정화제에서 8명의 암 환자로부터 취한 시험편의 저장 효과를 확인할 수 있다. 결과는 "원형 CTC", "서스펙트 CTC" 및 "미지정"으로 나타냈다.
임상 샘플 내에서 안정화제의 효과(실온에서 24 시간후)
환자 ID 원형 CTC 서스펙트 CTC 비지정
N T S C N T S C N T S C
D12(유방암) 1 3 6 2 5 4 4 7 72 31 17 34
JM38(전립선암) 23 72 61 72 61 161 169 173 324 160 61 55
19 52 59 61 73 197 191 144 242 135 56 66
JM33(전립선암) 14 20 23 26 25 29 27 33 357 76 93 68
27 -- 25 28 22 -- 32 25 360 -- 98 76
JM40(전립선암) 9 107 101 121 198 358 323 345 1034 1075 500 635
D13(유방암) 1 2 0 3 3 8 4 9 143 180 187 70
D9(유방암) 58 106 81 89 46 41 42 38 421 105 107 135
JDS002(유방암) 0 1 0 0 1 2 1 0 82 48 92 82
JDS009(유방암) 0 0 0 0 0 2 0 0 47 44 12 32
N=안정화제 처리하지 않음T=TRANSfix(상표명) 안정화제S=StabilCyte(상표명) 안정화제C=Cyto-Chex(상표명) 안정화제
안정화제를 첨가하지 않은 혈액 샘플과 비교시 상기 3개의 안정화제로 처리한 이들 혈액 샘플을 24 시간 저장한 후 환자 샘플의 대부분에서 더 많은 수의 원형 CTC 및 서스펙트 CTC가 검출되었다. 원형 CTC의 서스펙트 CTC로의 실질적인 전환은 안정화 처리하지 않은 시험편에서 발생하거나, 또는 상기 세포는 손실될 가능성이 있다. 이들 자료의 통계학적 분석으로부터 안정화제 처리한 시험편과 안정화제 처리하지 않은 시험편 사이에서 검출된 총 CTC의 수의 현저한 차이를 확인할 수 있다(p-값 = 0.02). 이 차이는 유방암 샘플 및 전립선암 샘플 둘 다에서 확인되었다. 그러나, 테스트한 3가지 안정화제 사이의 차이는 없었다(p-값 = 0.18). 안정화제의 존재 하에서 검출된 더 많은 수의 원형 CTC 및 서스펙트 CTC는 비특이적인 염색으로 인해 인공물로 생각되지 않는데, 그 이유는 이러한 효과가 정상적인 공여체로부터 24 시간 지난 샘플에서 관찰되지 않기 때문이다. 이들 자료로부터 명백히 확인할 수 있는 바와 같이, 암 환자로부터 채취한 혈액 샘플에 안정화제를 첨가하면 저장중 및 샘플 처리 단계에서 순환성 종양 세포가 보존되며, 따라서 원형 CTC와 서스펙트 CTC의 생체내 수준의 더 정확한 분류가 가능하게 된다.
실시예 2
분석을 위한 샘플 품질의 보존
CTC는 혈액 내에 낮은 빈도로 존재하며, 검출을 위해 더 많은 샘플 부피 및 효율적인 농후화 방법을 필요로 한다. CTC를 위한 농후화 방법은 몇몇 세척 단계를 포함하는데, 세포를 손상시킬 수 있고 세포로부터 DNA 틈에 기인한 파편 및 클럼프를 생성할 수 있는 자기 분리법을 포함한다. 그러나, 대부분의 혈액학 실험실에서 혈액 세포를 현탁 상태로 유지하기 위해 일상적으로 수행하는 바와 같은 혼합기 상에서의 혈액 튜브의 부드럽고 계속적인 혼합이 CTC의 검출 및 수치화를 방해할 수 있는 세포 파편의 유의적인 형성을 초래하는 것을 확인하였는데, 이는 예상치 못한 것이며 오히려 놀라운 것이었다. 또한, 채혈 튜브 또는 분석 튜브의 불완전한 충전은 이러한 혼합 손상을 더 악화시키나, 정지 튜브에서의 손상은 관찰되지 않음을 확인하였다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 선적 또는 다른 기계적인 응력이 가해지는 중에 환자 샘플의 어떤 혼합은 방해성 단편을 증가시켰는데, 이는 예상치 못한 것이다. CTC의 검출은 큰 샘플 부피를 필요로 할 뿐만 아니라 모든 임상 실험실에서 일상적으로 사용하는 것이 아닌 특별한 기술과 장비를 필요로 한다. 결과적으로, 이들 혈액 샘플은 처리를 위해 중앙 연구소로 선적될 필요가 있다. 이미 기술한 바와 같이, CTC는 섬세하며, 임의의 기계적인 혼합 또는 진탕은 선적중에 상기 세포에 손상을 가할 수 있다. 본 발명자들의 자료로 확인할 수 있는 바와 같이, 혈액 시험편의 수송, 저장 및 처리 이전에 CTC 및 샘플 품질을 보존하기 위해 본 발명에서 기술한 바와 같은 안정화제를 첨가하는 것이 절대적으로 필요하다.
CTC 및 샘플 품질에 대한 이들 유해 효과는 현재까지 검출을 피할 수 있는데, 그 이유는 이러한 응력을 받은 샘플은 대부분의 실험실 또는 임상 분석을 위해 여전히 만족스러울 수 있기 때문이다. 예를 들어, 유동 세포계측법에 의한 면역표현형 결정은 임의의 농후화 방법을 필요로하지 않으며, 이때 파편의 존재는 분석을 방해하지 않는다. 그러나, 본 발명자들의 발견은 현미경 또는 다른 광학적 방법에 의해 농후화된 희귀 표적 세포를 분석하는 경우 혈액 샘플 품질을 보존하는 것이 결정적으로 중요함을 암시하고 있다.
실시예 3
2-3 시간 동안 혼합된 정상 시험편의 샘플 품질에 대한 Cyto-Chex(상표명)의 효과
DAPI를 이용하는 세포 핵의 염색은 일반적으로 핵이 손상되지 않은 경우 투과성화된 생 세포 또는 사 세포내에서 검출할 수 있다. 또한, DNA 염색은 DNA에 틈이 생긴 경우 세포의 외부에서 염색가능한 응집체와 같은 세포 단편 또는 세포 파편 내에서 검출가능할 수 있다. 따라서, DAPI를 이용하는 염색 및 형광 현미경을 이용하는 조사는 샘플 품질을 용이하게 검사할 수 있다.
3개의 튜브내 혈액은 정상적인 공여체로부터 10 ml EDTA 항-응고 튜브내로이전하였다. Cyto-Chex(상표명) 안정화제는 다음과 같이 Cellstabilize(상표명) 주입 장치를 이용하여 캡 플러그를 제거하지 않고 한개의 혈액 튜브내에 첨가하였다. 상기 혈액 튜브는 적당량의 안정화제를 첨가하여 목적하는 최종 농도로 혈액 부피를 산정할 수 있는 눈금이 있는 보정 장치내에 위치시켰다. 제1 바늘(27G, 1/2 인치)를 통기구로서 상기 튜브의 스톱퍼를 통해 삽입하고, 제2 바늘(20G, 1과 1/2 인치) 및 주사기를 이용하여 상기 튜브 내로 삽입하였다. 시험편 튜브를 상기 장치로부터 제거하고, 튜브를 수회 거꾸로 흔들어 혼합하였다. 2개의 혈액 시험편, 즉 안정화제를 함유하지 않은 혈액 시험편과 30% Cyto-Chex(상표명) 안정화제를 함유하는 혈액 시험편을 혼합기 상에서 2 내지 3 시간 동안 혼합하여 선적 조건과 유사한 상황을 조성하였다. 세번째 혈액 튜브는 안정화제를 함유하지 않았고 혼합하지도 않았으며, 이를 대조군으로 사용하였다. 2 내지 3 시간 후, 혈액 7.5 ml를 각각의 "안정화를 함유하지 않은" 튜브로부터 이전한 반면, 혈액 9.75 ml는 "Cyto-Chex(상표명) 안정화제" 튜브로부터 별도의 15 ml 들이 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 이전하여 실시예 1에 기재한 바와 같이 처리하였다.
샘플은 형광 영상화 현미경을 이용하는 CellSporter(등록상표) 분석을 위해 이뮤니콘 CellSpotter(등록상표) 챔버에 이전하였다. 샘플들은 상기 챔버의 관찰창의 내면상에 자기적으로 정렬된 표적 세포에 대해 4개의 상이한 필터에서 스캐닝하였다. 상이한 필터에서 얻은 영상은 저장하였다. 샘플 품질은 검출가능한 유핵 CTC 및 비표적 세포의 수와 비교하여 검출가능한 DAPI 염색된 것(완전 CTC, 서스펙트 CTC 및 염색가능한 "비지정" 또는 단편)의 수를 비교하여 결정하였다. 최적 샘플품질을 위해, 염색가능한 세포 파편 및 응집체는 작게 유지되어 원형 CTC 및 서스펙트 CTC의 정확한 검출 및 수치화를 가능하게 하여야 한다.
도 3의 영상으로부터 30% Cyto-Chex(상표명) 안정화제를 첨가한 튜브(도 3b)와 비교하여 안정화제를 함유하지 않은 혈액 튜브(도 3a)의 수송에 따른 손상 효과를 확인할 수 있다. 유사하게, 도 4a, 4b 및 4c로부터 DAPI를 이용하는 세포 핵의 염색을 확인할 수 있다. 안정화제를 함유하지 않거나 혼합하지 않은 대조군 샘플(도 4a) 및 Cyto-Chex(상표명)를 함유하고 혼합한 샘플(도 4c)과 비교하여 임의의 안정화제가 존재하지 않으나 혼합된 샘플(도 4b)의 경우 다수의 DAPI 염색가능한 세포 클럼프 및 DNA 파편이 존재하였다. 이들 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 혈액 샘플의 혼합은 약한 CTC 뿐만 아니라 정상 조혈 세포를 손상시킴으로써 농후화후 검출할 수 있는 파편 및 응집체를 생성하였는데, 이는 예상치 못한 일이었다. 놀랍게도, 혈액 샘플을 혼합하기 이전에 혈액 샘플에 안정화제를 첨가하면 세포 손상을 최소화하며 샘플 품질이 보존되는 것으로 확인되었다.
실시예 4
선적중 순환성 종양 세포에 대한 Cyto-Chex(상표명) 안정화제의 효과
본 실시예에서, 2개의 EDTA 항-응고된 혈액 튜브에 진행 단계의 질병을 갖고 있는 31명의 암 환자로부터 채혈하였다(3명은 2번의 별도 시간에 반복하여 채혈하였음). Cyto-Chex(상표명) 안정화제는 실시예 3에 기술된 CellStabilize(상표명) 장치를 이용하여 통기시켜 한 세트의 튜브에 직접 주입하여 Cyto-Chex(상표명)의 최종 부피를 전체 부피의 30%로 만들었다. 두번째 세트의 튜브는 처리하지 않은 대조군이었다. 이어서, 양 샘플 세트는 CTC의 농후화 및 CellSpotter(상표명) 분석에 의한 검출에 의해 처리하였다. CTC를 농후화하고 검출하기 위해 본 실시예에 사용된 절차는 실시예 1에서 사용한 절차와 유사하다. 첨가된 Cyto-Chex(상표명) 안정화제를 함유한 혈액 샘플 및 함유하지 않은 혈액 샘플에 대한 결과는 하기 표 II에 나타냈다.
환자 ID 암 유형 원형 CTC 서스펙트 CTC 비지정
무 유 무 유 무 유
20370(1) 유방암 0 1 1 4 44 21
7463*(2) 유방암 9 16 3 4 35 20
23435(3) 유방암 0 0 0 0 55 40
24948(4) 폐암 2 3 2 8 292 307
10520(5) 유방암 0 7 0 12 1939 104
26858(6) 자궁암 0 1 0 0 53 24
25000(7) 전립선암 0 2 0 4 801 242
23549(8) 폐암 1 1 11 1 3194 135
25167(9) 유방암 0 0 0 0 31 28
26041(10) 결장암 0 0 0 4 649 120
24164(11) 자궁내막암 0 0 0 2 628 86
20942(12) 유방암 0 0 1 0 201 115
28217(13) 유방암 1 4 0 7 52 33
19710(14) 결장암 0 0 0 0 110 27
19218(15) 폐암 0 0 1 0 53 25
28162(16) 직장암 0 0 1 0 1544 79
23530(17) 절립선암 21 106 26 42 142 179
24948(18) 폐암 0 6 3 7 283 46
28287(19) 폐암 0 1 0 1 155 32
27851*(20) 신장암 0 0 0 1 12 13
28186*(21) 자궁암 0 0 1 0 33 21
21515*(22) 유방암 0 0 0 0 17 20
25084*(23) 난소암 0 0 0 0 17 63
25000*(24) 전립선암 0 6 2 1 25 63
25254*(25) 폐암 0 0 0 0 20 24
22488(26) 유방암 2 0 2 3 19 28
21688(27) 유방암 0 2 3 3 36 91
16925(28) 유방암 2 10 3 3 76 64
28327*(29) 방광암 62 285 105 72 139 113
19218(30) 폐암 0 0 0 0 19 41
13517(31) 전립선암 8 16 7 5 270 39
무 - 안정화제 첨가하지 않음유 - 30%(최종 부피) Cyto-Chex(상표명) 첨가* = 5 ml 시험편, 다른 것은 모두 7.5 ml
하나 이상의 원형 CTC를 나타내는 임의의 샘플은 양성으로 간주된다. 안정화제를 첨가한 경우 및 첨가하지 않은 경우의 자료에 윌콕슨 사인드 랭크 테스트를 적용하여 다음과 같은 p-값을 얻었다:
- 원형 CTC, p<0.0004(높은 유의성)
- 서스펙트 CTC, p<0.155(유의성 없음) 및
- 비지정, p<0.0327(유의성).
Cyto-Chex(상표명)를 첨가하는 경우, 대부분의 시험편은 양성이거나 원형 CTC에서 증가를 나타냈다. 안정화되지 않은 시험편에서 더 원형의 CTC 또는 서스펙트 CTC가 검출되는 경우는 아마도 인공물이며, 이는 특징적인 세포 형태가 없는 "비지정"으로 분류된 염색가능한 파편 및 응집체를 원형 CTC 또는 서스펙트 CTC와 구별하는 데 있어서의 어려움에 기인한다. 이들 자료는 종양 세포 및 시험편 품질 둘 다를 보존하는에 있어서 전혈 안정화제의 예상치 못한 보존 효과를 잘 나타내고 있다.
실시예 5
24 시간 대 72 시간 안정화
선적 연구(실시예 4)에서, 안정화는 채혈후 24 시간 처리된 샘플에서 세포를 보존하는 것으로 확인되었다. 그러나, 72 시간 이상 동안 세포를 안정하게 하는 것이 바람직하다. 본 실시예에서, 혈액 샘플은 채혈후 24 시간 및 72 시간 동안 처리하고, 다음과 같이 분석하였다: 암환자로부터 최소 10 ml 들이 EDTA Vacutainer(등록상표) 혈액 튜브에 혈액을 채혈하였다(튜브당 혈액 ∼8 ml). 채혈 15분 이내에 적당량의 Cyto-Chex(상표명)를 각각의 EDTA 튜브에 손으로 첨가하여 실시예 3에 기술한 바와 같은 CellStabilize(상표명) 주입 장치를 이용하여 부피를 기준으로 30% Cyto-Chex(상표명)을 형성시켰다.
혈액 시험편을 수용시, 혈액을 수집하고, 안정화된 혈액 7.5 ml를 실시예 1에 기술한 것과 동일한 CellSpotter(등록상표) 시스템 분석을 이용하여 동일하게 분석함으로써 24 시간 및/또는 72 시간에 테스트하였다. CTC는 이들 2개의 시점에서 비교하였다. 90%의 파워로 0.01의 이측(two-sided) p-값을 이용하여 예상된 상관계수 0.95를 검출하기 위해, 쌍을 이룬 값들을 갖는 총 8개의 시험편이 필요하였다. 24 시간 대 72 시간 비교에서, 쌍을 이룬 값들을 갖는 총 28개의 시험편이 존재하였으나, 하나의 샘플은 매우 높은 CTC를 보유하였는데, 이는 도 6에는 나타내지 않았다.
도 6으로부터 24 시간 대 72 시간에서 명백한 CTC 결과를 갖는 27개 시험편의 플롯을 확인할 수 있다. 회귀 방정식, r-자승 값, 상관 계수 및 t 테스트 p-값은 그래프에서 확인할 수 있다. r-자승 값 및 피어슨 상관 계수로부터 24 시간후의 CTC 카운트는 72 시간에서의 CTC 카운트와 높은 상관 관계를 나타냄을 확인할 수 있고, t-테스트로부터 2개의 카운트의 평균은 통계학적으로 유의적인 차이를 나타내는 것은 아님을 확인할 수 있다(24 시간 = 11, 72 시간 = 11). 직선의 기울기(1.0803)는 혈액 안정화제와 함께 배양한 후 24 시간 또는 72 시간이 경과한 후 거의 동일한 수의 명백한 CTC를 나타내는 것이다. 윌콕슨의 비매개변수성 사인랭크 테스트로부터 이들 2개의 시점에서 2개의 CTC 카운트는 유의적인 차이점을 나타내지 않음을 확인할 수 있다(p=0.9105). 상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 안정화제와 함께 항온처리하고 72 시간이 경과한 후에 CTC의 손실은 없었으며, 72 시간에서의 카운트는 24 시간에서의 카운트와 거의 동일하였다.
실시예 6
안정화제의 첨가 모드
이미 기술한 바와 같이, 혈액내의 CTC는 상이한 형태(예를 들어, 원형 CTC, 손상된 CTC 등)로 존재하며, 이들은 일반적으로 약하다. 튜브 내에서 추가적인 세포 손상을 예방하기 위해 튜브내로 채혈하자 마자 안정화제를 투여할 필요가 있다. 그러나, 채혈 장소에 따라 달라지는 첨가 시기를 조절하는 것은 용이한 일이 아니다. 몇몇 채혈 장소는 안정화제를 첨가할 필요가 없을 수 있으며, 따라서 안정화제를 첨가하기 위해 샘플을 다른 곳으로 보내야 할 필요가 있다. 이는 안정화제를 첨가할 수 있는 여러 시간을 확보케 한다. 이들 장소에서도, 안정화제 첨가 시기는 채혈한 튜브의 수에 따라 달라진다. 채혈하는 사혈(瀉血) 전문의는 안정화제를 첨가할 필요가 없으나, 안정화제 첨가를 위해 샘플을 다른 전문가에게 보내야 한다.
따라서, 바람직한 안정화제는 농축액으로서, 또는 물 또는 버퍼중의 용액으로서 희석된 형태로 사용하여 과삼투압성 조건에 대한 일시적인 노출 및 가능한 세포 손상을 최소화할 수 있다. 액체 또는 고체 안정화제는 채혈 이전에 채혈 용기내에 첨가하는 것이 바람직하거나, 또는 채혈 중의 난류에 기인한 손상에 대한 보호 효과를 최대화하기 위해 채혈 직후에 첨가하는 것이 바람직하다.
미리 충전된 혈액 수집 튜브, 예를 들어 10 ml 들이 Vacutainer(등록상표) 튜브(미국 뉴저지 프랭클린 레이크에 소재하는 벡톤 디킨슨) 또는 Vacuette(등록상표) 튜브(미국 플로리다 레이크 마리에 소재하는 그레이너 아메리카)가 시판되고 있으며, 이들은 2 ml의 액체 시약 또는 미립자 코팅 물질로 예비충전하고 진공처리한 것이다. 미리 충전된 튜브를 제조하기 위한 대안적인 방법의 예로는 종래의 동결 액체의 원위치 동결건조를 들 수 있다. 다른 특허된 기법으로는 불연속 동결 건조 비드, 소위 LyoSpheres(미국 특허 제6,106,836호; 네덜란드의 악조 노벨 엔.브이.) 및 Biolyph(미국 미니아폴리스)을 이용하는 것을 들 수 있는데, 이들은 액체 질소에 액체를 250 ㎕까지 적하하고 이어서 용기 내에서 동결 비드를 통상적인 방법으로 동결건조함으로써 불연속 강성 비드를 형성하는 방법으로 제조한 것이다.
요약하면, 실시예 1 내지 6으로부터 혈액 샘플에 안정화제를 첨가하면 샘플 품질이 보존될 뿐만 아니라 본 발명에서 사용한 농후화 분석에서 CTC도 보존된다. 안정화제의 최적량은 다양할 것이며, 안정화제의 유형 및 물리적인 상태, 예를 들어 실시예 6에 기술한 바와 같이 액체, 동결건조된 펠릿, 분말 등에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, Cyto-Chex(상표명) 안정화제의 농도는 1% 내지 50%, 바람직하게는 약 5% 내지 40%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 30% 범위일 수 있는 것으로 확인되었음에도 불구하고, TRANSfix(상표명) 안정화제의 경우는 0.1% 내지 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 25%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 10% 범위일 수 있으며, 다른 유형의 안정화제의 농도 또는 양은 특정 범위 내에서 상이할 수 있으며, 각각의 안정화제 및 용도에 따라서 최적화되어야 한다. 이상적으로, 항응고제 및 안정화제는 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.1% 내지 50%, 더 바람직하게는 약 0.3% 내지 30%, 가장 바람직하게는 약 0.3% 내지 5%로 존재하는데, 이때 안정화제의 동일한 유효 농도는 유지되어야 한다. 더 중요한 것은 덜 희석할수록 더 바람직하다는 것이다.
본 발명에 따라 제공되는 개선점은 상기한 미국 특허 및 바람직한 구체예에따라 당업자라면 용이하게 이해할 것이다. 본 발명의 특히 유익한 관점은 저장중 및 농후화 처리 과정 중에 전혈내의 희귀 표적 세포 및 CTC를 보존하기 위한 안정화제를 개시하고 있다는 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 또 다른 개선점은 채혈 이전 또는 채혈 직후에 안정화제를 첨가하는 것과 액체 형태 또는 고체 형태의 안정화제를 사용할 수 있다는 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 개선점은 기술되어 있으며, 상기 실시예 1 내지 6에 예시되어 있다.
본 발명은 원형 CTC, 서스펙트 CTC 및 비지정의 분석을 개선하는데, 이때 비지정은 채혈시에 존재하거나 처리중에 형성된 파편 및/또는 응집체로 구성되어 있다. 본 발명은 구체적으로 희귀 세포, 특히 CTC의 안정화를 위해 연구된 조성물 및 방법인 본 발명의 개선된 조성물 및 방법을 개발하기 위해 수행된 광범위한 연구 프로젝트의 결과이다. 이들 개선점을 포함하는 본 발명의 바람직한 구체예는 본원에 기술한 바와 같이 암 진단 이외의 분야 및 용도로 사용할 수 있다. 본 발명의 개선된 진단 방법이 전술한 바람직한 구체예로 한정되는 것이 아니라는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 최종적으로, 상기 제시한 특정 구체예가 본 발명을 상세하게 기술하고는 있지만, 후술하는 특허청구의 범위가 상세한 설명에 의해 제한되는 것은 아니다. 실제로, 후술하는 특허청구의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형 실시가 가능하다.

Claims (145)

  1. (a) 항응고제; 및
    (b) 안정화제
    를 포함하는, 생물학적 시험편 보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 조성물.
  16. (a) 항응고제; 및
    (b) 안정화제
    를 포함하는, 순환성 종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액 샘플 보존용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  25. 제16항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  27. 제16항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 조성물.
  31. (a) 생물학적 시험편;
    (b) 항응고제; 및
    (c) 안정화제
    를 포함하는 안정화된 세포 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 생물학적 시험편은 순환성 종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액의 분획인 안정화된 세포 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 순환성 종양 세포는 상기 안정화제에 의해 안정화된것인 안정화된 세포 조성물.
  34. 제31항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 안정화된 세포 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 세포 조성물.
  36. 제31항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 안정화된 세포 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 세포 조성물.
  38. 제31항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 안정화된 세포 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 세포 조성물.
  40. 제31항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 안정화된 세포 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 세포 조성물.
  42. 제31항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 안정화된 세포 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 안정화된 세포 조성물.
  44. 제31항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 안정화된 세포 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 안정화된 세포 조성물.
  46. 제44항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약20000인 안정화된 세포 조성물.
  47. 제44항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 안정화된 세포 조성물.
  48. 제31항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.1% 내지 약 50%의 부피로 존재하는 것인 안정화된 세포 조성물
  49. 제47항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 30% 범위인 안정화된 세포 조성물.
  50. 제47항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 5% 범위인 안정화된 세포 조성물.
  51. (a) 세포를 함유하는 생물학적 시험편을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 생물학적 시험편과 상기 세포를 안정화시킬 수 있는 안정화제를 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 생물학적 시험편의 보존 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  56. 제51항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제51항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 방법.
  62. 제51항에 있어서, 상기 시험편은 항응고제와 추가 접촉시키는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 제62항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 생물학적 시험편과 접촉시키기 이전에 결합되는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  72. 제67항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.1% 내지 약 50%의 부피로 존재하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3%내지 약 30% 범위인 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3% 내지 5% 범위인 방법.
  75. (a) 세포를 함유하는 생물학적 시험편을 얻는 단계: 및
    (b) 상기 세포를 안정화시킬 수 있는 안정화제와 상기 생물학적 시험편을 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 순환성 종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액 샘플의 보존 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  78. 제75항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  80. 제75항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  82. 제75항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 방법.
  86. 제75항에 있어서, 상기 시험편은 항응고제와 추가로 접촉시키는 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  89. 제86항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  91. 제86항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 생물학적 시험편과 접촉하기 이전에 결합되는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  96. 제86항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.1% 내지 약 50%의 부피로 존재하는 것인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 30% 범위인 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 부피는 상기 생물학적 시험편의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 5% 범위인 방법.
  99. (a) 항응고제; 및
    (b) 안정화제
    를 함유하는 진공 채혈 튜브를 포함하는, 생물학적 시험편의 보존 장치.
  100. 제99항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 장치.
  101. 제100항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  102. 제99항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 장치.
  103. 제102항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  104. 제99항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 장치.
  105. 제104항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  106. 제99항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 장치.
  107. 제106항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  108. 제99항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 장치.
  109. 제108항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  110. 제99항에 있어서, 상기 안정화제는 동결건조된 것인 장치.
  111. 제99항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 장치.
  112. 제111항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 장치.
  113. 제112항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 장치.
  114. 제112항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 장치.
  115. 제111항에 있어서, 상기 추가 안정화제는 동결건조된 것인 장치.
  116. 제99항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.1% 내지 약 50%의 부피로 존재하는 것인 장치.
  117. 제116항에 있어서, 상기 부피는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 30% 범위인 장치.
  118. 제116항에 있어서, 상기 부피는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 5% 범위인 장치.
  119. (a) 항응고제; 및
    (b) 안정화제
    를 함유하는 진공 채혈 튜브를 포함하는, 순환성 종양 세포를 함유하는 것으로 의심되는 혈액 샘플의 보존 장치.
  120. 제119항에 있어서, 상기 항응고제는 킬레이트화제인 장치.
  121. 제120항에 있어서, 상기 항응고제는 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(DTPA), 1,2-디아미노시클로헥산 테트라아세트산(DCTA) 및 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  122. 제119항에 있어서, 상기 항응고제는 착화제인 장치.
  123. 제122항에 있어서, 상기 항응고제는 헤파린 및 시트레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  124. 제119항에 있어서, 상기 안정화제는 포름알데히드 공여체인 장치.
  125. 제123항에 있어서, 상기 포름알데히드 공여체는 아민 또는 아미드의 메틸올 또는 히드록시메틸 유도체, 디아졸리니디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 메텐아민 및 파라포름알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  126. 제119항에 있어서, 상기 안정화제는 알데히드인 장치.
  127. 제126항에 있어서, 상기 알데히드는 포름알데히드, 글루타르알데히드 및 글리옥살로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  128. 제119항에 있어서, 상기 안정화제는 1종 이상의 중금속 원소와 결합한 포름알데히드 공여체 또는 알데히드인 장치.
  129. 제128항에 있어서, 상기 중금속 원소는 크롬, 망간 및 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 장치.
  130. 제119항에 있어서, 상기 안정화제는 동결건조된 것인 장치.
  131. 제119항에 있어서, 추가 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜인 장치.
  132. 제131항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 1000 내지 약 35000인 장치.
  133. 제131항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 5000 내지 약 20000인 장치.
  134. 제131항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 범위는 약 8000 내지 약 20000인 장치.
  135. 제131항에 있어서, 상기 추가 안정화제는 동결건조된 것인 장치.
  136. 제119항에 있어서, 상기 항응고제 및 상기 안정화제는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.1% 내지 약 50%의 부피로 존재하는 것인 장치.
  137. 제136항에 있어서, 상기 부피는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 30% 범위인 장치.
  138. 제136항에 있어서, 상기 부피는 상기 채혈 튜브의 총 부피의 약 0.3% 내지 약 5% 범위인 방법.
  139. 제1항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  140. 제16항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  141. 제31항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 안정화된 세포 조성물.
  142. 제51항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  143. 제75항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 방법.
  144. 제99항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 장치.
  145. 제119항에 있어서, 추가 안정화제는 농도가 시험편 부피의 약 0.1% 내지 약 5%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 0.5%인 폴리에틸렌 글리콜인 장치.
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