WO2021010369A1 - ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法 - Google Patents

ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法 Download PDF

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tumor cells
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隆宏 岡部
晋作 十合
和久 高橋
可奈恵 阿部
泰生 浦田
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学校法人順天堂
オンコリスバイオファーマ株式会社
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    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting circulating tumor cells using a virus.
  • Circulating Tumor Cell is a cancer cell that circulates in the body together with blood away from solid tumor lesions, and is a more sensitive cancer than conventional tumor markers. It is expected to be an early diagnostic biomarker. Telomerase is an enzyme responsible for cell immortality and is highly activated in all cancer cells.
  • OBP-401 telomerase scan
  • hTERT human telomerase reverse transcriptase
  • GFP GFP gene
  • This method infects and proliferates cancer cells and expresses GFP in large quantities in a telomerase activity-dependent manner, allowing the capture of all types of "living" CTCs independent of cell surface antigens.
  • CTCs that have undergone Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) and whose expression level or presence or absence of cell surface antigens has changed can be detected by conventional CTC detection methods using epithelial cell markers such as CellSearch TM. was not possible, but even such CTCs can be detected.
  • EMT-CTC is strongly associated with cancer stem cells, is considered to be treatment-resistant and highly malignant (Non-Patent Document 2: Science. 2013 Yu M et al.), And has attracted attention as an important biomarker in recent years. ing.
  • Non-Patent Document 1 CTC is concentrated by dissolving erythrocytes in blood and then removing erythrocyte residues by centrifugation.
  • the cancer cell line added to the blood can be detected with extremely high sensitivity and high specificity, but in reality. Attempts to detect CTC from blood samples (hereinafter referred to as "clinical specimens") collected from cancer patients have left the problem of reduced sensitivity and specificity.
  • Non-Patent Document 3 a plurality of blood pretreatment methods and their problems in a general CTC detection method are disclosed, but the blood pretreatment method using RosetteSep TM has many cells. It has been disclosed that the use of antibody cocktails that target surface proteins results in the removal of CTC as well as blood cells, resulting in reduced CTC recovery.
  • a suitable blood pretreatment method in the CTC detection method using a virus, particularly a suitable blood pretreatment method for detecting CTC from a clinical sample has not been clarified so far.
  • the present inventor in a method for detecting circulating tumor cells using a virus, separates erythrocytes and leukocytes from a blood sample using a predetermined reagent to generate blood cells.
  • a predetermined reagent to generate blood cells.
  • a method for detecting circulating tumor cells wherein the following steps: (A) A test in which blood samples were subjected to density gradient centrifugation in the presence of a reagent that does not bind to circulating tumor cells but binds to cells other than circulating tumor cells (non-circulating tumor cells) to remove the non-circulating tumor cells. The process of preparing the sample, (B) A step of infecting the test sample prepared in step (a) with a virus. (C) The method including a step of labeling a test sample obtained in step (b) and a step of detecting circulating tumor cells from the test sample obtained in step (d) (c).
  • the virus that proliferates specifically in tumor cells is a recombinant virus controlled by the telomerase reverse transcriptase promoter.
  • the virus contains a fluorescent protein gene.
  • the reagent that binds to non-circulating tumor cells is a reagent that binds to leukocytes.
  • a method for concentrating circulating tumor cells from a blood sample for detection of circulating tumor cells which comprises a reagent that does not bind to circulating tumor cells but binds to cells other than circulating tumor cells (non-circulating tumor cells).
  • the method comprising the step of preparing a test sample from which the non-circulating tumor cells have been removed by centrifuging the blood sample in the presence of a cross-linking agent.
  • a method for providing a sample for detecting circulating tumor cells which comprises a step of further infecting a test sample prepared by the method according to [20] with a virus.
  • the method of [21] comprising the step of further labeling the test sample after infection with the virus.
  • the virus is a virus that proliferates specifically in tumor cells.
  • the virus that proliferates specifically in tumor cells is a recombinant virus controlled by the telomerase reverse transcriptase promoter.
  • the virus contains a fluorescent protein gene.
  • the reagent that binds to non-circulating tumor cells is a reagent that binds to leukocytes.
  • the reagent that binds to leukocytes is a cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes.
  • the cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes is a double or more specific antibody.
  • the cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes is a bispecific antibody.
  • the bispecific antibody comprises a tetrameric antibody.
  • TM Rosette Sep
  • the number of CTCs detected is increased while blood cells are removed, and CTCs can be detected with high sensitivity and high specificity even in clinical specimens. It has become possible.
  • the reduction of blood cells shortened the time required for CTC detection, improved throughput, and made it possible to perform detection at low cost without causing cell damage.
  • the present invention relates to a method for detecting circulating tumor cells and includes the following steps.
  • B A step of infecting a test sample prepared in step (a) with a recombinant virus controlled by a telomerase reverse transcriptase promoter.
  • C A step of immunostaining the test sample obtained in step (b), and (d) a step of detecting circulating tumor cells from the test sample obtained in step (c).
  • the present invention is characterized in that, in the pretreatment step of a blood sample until a test sample to be infected with a recombinant virus is prepared, a reagent that binds to cells other than CTC, particularly a cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes, is treated.
  • a reagent that binds to cells other than CTC particularly a cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes
  • CTC should be detected with higher sensitivity and specificity by using a water-soluble encapsulant-containing buffer in the process, or by using a nylon filter with an opening of 50 to 200 ⁇ m after labeling the cells.
  • Blood pretreatment is a CTC concentration step. Efficient blood cell removal is important for the construction of a high-throughput detection system. Therefore, in the present invention, the following treatment is performed for blood cell removal to concentrate CTC.
  • the collected blood sample is mixed with a predetermined buffer, and this mixed sample is layered on a blood cell concentration tube for density gradient centrifugation filled with a specific gravity difference separation solution.
  • the buffer to be used is not particularly limited as long as it has the same osmotic pressure and pH as the body fluid and has non-cytotoxic properties, but a buffer containing FCS and EDTA is preferable.
  • the FCS used is 1% to 5%, preferably 2%.
  • the concentration of EDTA should be 1 to 1.5 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
  • Tbuffer (including at least 2% FCS and 1 mg / ml EDTA) is added and used in that the adsorption of CTC to the blood cell concentrating tube can be reduced and the recovery rate of CTC can be increased. It is preferable to do so.
  • Tbuffer can be purchased from On-chip Biotechnologies.
  • the buffer containing FCS and EDTA is used not only for density gradient centrifugation in step (a), but also for washing cells after density gradient centrifugation, and when or after fixing cells after virus infection in step (b).
  • step of washing cells a step of washing cells during immunostaining in step (c), or a step of washing cells after immunostaining, and reduces CTC adhesion to the tube wall surface to reduce CTC. Recovery rate can be increased.
  • a reagent that does not bind to CTC but binds to cells other than CTC also referred to as "non-circulating tumor cells" or “non-CTC” in the present specification
  • Reagents that do not bind to CTC but bind to cells other than CTC are said to be the same as before the reagent binds when density gradient centrifugation is performed with cells other than CTC and the reagent bound.
  • CTC has cell surface markers specific to CTC such as epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), E-cadherin, and cell-surface vimentin.
  • EpCAM epithelial cell adhesion molecule
  • E-cadherin E-cadherin
  • cell-surface vimentin cell surface markers specific to CTC
  • reagents that do not recognize these cell surface markers can be used.
  • the cells other than CTC to which the reagent binds are preferably blood cells, and examples thereof include erythrocytes and leukocytes.
  • the reagent may bind only to erythrocytes, may bind only to erythrocytes, may bind erythrocytes to erythrocytes, leukocytes to leukocytes, erythrocytes to leukocytes to crosslink, but erythrocytes to leukocytes. It is particularly preferable that it is an agent.
  • Reagents that bind to cells other than CTC include RosetteSep TM , PluriSpin (registered trademark, PluriSelect), Dynabeads (DYNAL), blood cell separator nano (PCRopsis), and the like.
  • PluriSpin (registered trademark, PluriSelect) increases the specific gravity of cells other than CTC such as leukocytes by binding to pluriSpin particles with high affinity, and precipitates at the bottom of the centrifuge tube by the subsequent centrifugation operation.
  • Rosette Sep TM can be used as a cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes.
  • RosetteSep TM includes, for example, RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36, RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56, RosetteSep Human CD45 Depletion Cocktail, RosetteSep TM Human Monocyte Depletion Cocktail, RosetteSep TM Human Granulocyte Depletion Cocktail, etc.
  • RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36 is preferable.
  • RosetteSep TM can be purchased from STEM CELL Technologies.
  • RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36 is a bispecific tetramer selected from antibodies against CD2, CD16, CD19, CD36, CD38, CD45 or CD66b and antibodies against glycophorin A, the surface antigen of red blood cells. Includes antibody complex of (https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd36.html).
  • RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56 is a bispecific antibody selected from antibodies against CD3, CD14, CD16, CD19, CD38, CD45, CD56, CD61 or CD66b and antibodies against the surface antigen of erythrocytes, glycophorin A. Contains the tetramer antibody complex of (https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd56.html).
  • a double or more specific antibody can also be used as a cross-linking agent between leukocytes and erythrocytes. As the double or higher specific antibody, the antibody used in either RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36 or RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56 may be used.
  • the amount of the cross-linking agent added is preferably less than 50 ul per 1 ml of blood, preferably more than 12.5 ul and less than 50 ul per 3 ml of blood, and per 3 ml of blood. 20 to 35 ⁇ L is more preferable, and 25 ⁇ L is particularly preferable with respect to 3 ml of blood.
  • Blood cells are removed when a cross-linking agent is used. "Removal” means removing blood cells from the test system to the extent that CTC detection is not impaired by the presence of blood cells and CTC is not removed with the blood cells. In this case, 90-99%, preferably 99%, of red blood cells are removed. In addition, white blood cells are removed by 80 to 90%, preferably 90%.
  • CTC may also be removed (lost) together with leukocytes. Therefore, it is preferable to keep the leukocyte removal rate up to 90%.
  • Centrifugation is a density gradient centrifugation, and the specific gravity difference separator is not particularly limited as long as it can separate erythrocytes and leukocytes, and for example, Ficoll-Paque TM , Lymphoprep TM and the like can be used.
  • the Ficoll-Paque TM e.g., Ficoll-Paque TM PLUS, Ficoll -Paque TM PREMIUM, Ficoll-Paque TM PREMIUM 1.084, is like Ficoll-Paque TM PREMIUM 1.073, inter alia, Ficoll-Paque TM PREMIUM 1.084 are preferred.
  • Ficoll-Paque TM can be purchased from GE Healthcare.
  • Lymphoprep TM can be purchased from STEM CELL Technologies. Centrifuge and wash cells at 600-900 g at 4-25 ° C for 5-15 minutes. For example, centrifugation conditions of 900 xg at 25 ° C. for 10 minutes are preferred. This centrifugation causes most red blood cells and white blood cells to precipitate. The layer containing CTC and residual leukocytes is then collected by decantation.
  • the recovered CTC-containing liquid sample is infected with a virus.
  • a virus a virus that proliferates specifically in a tumor is preferable, and a recombinant virus controlled by a telomerase reverse transcriptase promoter is more preferable. Further, it is preferable that the virus contains a fluorescent protein gene so that the virus infected with CTC can be easily detected as an index, and it is more preferable that the virus is loaded so that the fluorescent protein gene can be expressed.
  • the type of virus is not particularly limited and may be appropriately selected from adenovirus, herpesvirus, bullous stomatitis virus, leovirus, vaccinia virus, measles virus and the like. Among them, adenovirus is preferable.
  • OBP-401 telomescan
  • WO 2006/036004, Oncolys BioPharma Co., Ltd. can be used.
  • the amount of virus infected is 1.0 ⁇ 10 8 VP / mL, and the infection temperature is 25 to 37 ° C, preferably 37 ° C.
  • the infection time is 23 to 25 hours, preferably 24 hours.
  • cell fixation and virus inactivation may be performed with paraformaldehyde or the like, if necessary.
  • the test sample obtained in the above step (2) is subjected to the labeling step.
  • the labeling step means a step of labeling cells such as CTC and blood cell cells contained in a solution containing a test sample, but components other than cells such as cell residues and eluates from cells may be labeled.
  • Known general methods can be used for labeling cells, and examples thereof include immunostaining and nuclear staining.
  • an antibody conjugated with a fluorescent dye, magnetic beads, biotin, agarose beads, gold colloid or the like can be used.
  • the antibody can be appropriately selected depending on the intended purpose, but an antibody against a protein expressed specifically for cancer cells, a protein expressed specifically for blood cells, a protein expressed specifically for tissues, or the like can be used.
  • antibodies against blood cell-specifically expressed proteins include anti-CD45 antibody, anti-CD16 antibody, anti-CD36 antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD14 antibody, anti-CD19 antibody, anti-CD38 antibody, anti-CD56 antibody, and anti-CD61 antibody.
  • examples thereof include anti-CD66b antibody, and among them, anti-CD45 antibody is preferable.
  • the fluorescent dye for example, APC, PE, Cy5, FITC or the like can be used.
  • nuclear staining for example, DAPI or Hoechst can be used.
  • CTC observation and detection step CTC is observed and detected from the test sample obtained in step (3). Detection is performed using the fluorescent protein gene carried in the virus, the fluorescent signal in immunostaining, nuclear staining, or the like as an index.
  • the test sample Before observing and detecting CTC, the test sample can be subjected to impurity removal treatment with a nylon filter.
  • the nylon filter preferably has an opening of 50 to 200 ⁇ m, and a cell strainer is particularly preferable.
  • a cell strainer with an opening of 100 ⁇ m can be purchased from pluriSelect Life Science as pluriStrainer-Mini 100 ⁇ m.
  • a water-soluble encapsulant when detecting circulating tumor cells, can be added to the solution containing the test sample, or the solution containing the test sample can be replaced with a buffer solution containing the water-soluble encapsulant.
  • the water-soluble mounting medium in the solution containing the test sample it is possible to prevent the fluorescent dye from fading during observation, which will be described later.
  • the water-soluble encapsulant since the water-soluble encapsulant is contained in the solution containing the test sample, the liquid meniscus in the well can be reduced. As a result, the field of view when observing with a microscope is widened and clear.
  • Examples of the buffer solution containing the water-soluble mounting medium include Fluoromount / Plus TM , Mount-Quick ⁇ Aqueous'', ProLong TM Glass Antifade Mountant, etc. Among them, Fluoromount / Plus TM is preferable. Fluoromount / Plus TM can be purchased from Diagnostic BioSystems. Mount-Quick ⁇ Aqueous'' can be purchased from Daido Sangyo Co., Ltd. ProLong TM Glass Antifade Mountant can be purchased from Invitrogen.
  • the test sample is applied to a multi-well glass bottom plate coated with poly-lysine or the like, and a microscope image of the entire well region, for example, a fluorescence image and a bright-field image is acquired.
  • the CTC is counted and detected by the image analysis software.
  • the analysis software is preferably one that can quantitatively analyze fluorescence brightness, area, etc., and one that has an automatic counting function.
  • the observation and detection of CTC is not limited to microscopic observation, and can be appropriately selected depending on the method of labeling the cells.
  • the present invention also relates to a method for concentrating circulating tumor cells from a blood sample for detection of circulating tumor cells, in which blood cells were subjected to density gradient centrifugation in the presence of a cross-linking agent between erythrocytes and leukocytes to remove blood cells.
  • a method for concentrating circulating tumor cells "(1) blood pretreatment step” in the above-mentioned “method for detecting circulating tumor cells” can be applied.
  • the test sample obtained in the above "(1) blood pretreatment step” is further subjected to the step described in the above "(2) virus infection step” to infect the virus, and this is circulated. It can be provided as a sample for detection of tumor cells.
  • the test sample can be further labeled by the step described in the above "(3) Labeling step". These steps may be performed independently or both may be performed continuously.
  • a method for detecting a circulating tumor cell after concentrating the circulating tumor cell by the method for concentrating the circulating tumor cell of the present invention not only a method using a virus infection but also a method not utilizing a virus infection can be applied. Although it can be done, it is more preferable that the method utilizes a virus infection. Regarding the method of utilizing the virus infection, "(2) virus infection step”, “(3) labeling step”, “(4) CTC observation and detection step" in the above-mentioned "method for detecting circulating tumor cells”. The method described in can be applied.
  • a conventionally known method for detecting circulating tumor cells can be applied, for example, a filter, a microchannel, immunostaining, dielectrophoresis, density gradient centrifugation, magnetic beads, or the like. You can use the method you used.
  • ⁇ Procedure> 1. Mix 2% FCS / 1% PS / T buffer 4 mL, 50 mM EDTA / 4Na / T buffer 50 ⁇ L, and blood sample 3 mL in a FALCON 14 mL round tube (PP). 2. Add the entire amount of diluted blood to the prepared SepMate TM- 15 (add slowly so that the level of the specific gravity liquid is not disturbed at the time of addition). 3.2 Add 25 ⁇ L of Rosette Sep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36 to 500 ⁇ L of 2% FCS / 1% PS / T buffer, and add it just before starting the specific gravity difference separation (the liquid level of the specific gravity liquid is not disturbed after the addition). Pipetting and stirring) 4.
  • OBP-401 infection The following steps are performed in the P2 laboratory.
  • ⁇ Procedure> 1. Add OBP-401 1.0 ⁇ 10 8 VP (in 100 ⁇ L 10% FCS / 1% PS / DMEM) to the tube in step 13 of “2. Separation of specific gravity difference” (final liquid volume: 1 mL). 2. Secure the lid of the 2.0 mL tube with parafilm. 3. Attach the tube to the rotator in the incubator and stir overturning at 37 ° C for 24 ( ⁇ 1) hours under shading.
  • Table 2 shows the reagents and instruments used for cell staining using CD45-PE antibody and DAPI.
  • ⁇ Procedure> 1. Add 200 ⁇ L of membrane permeation solution 0.15% Triton X-100 / 10% FCS / T-buffer to cell pellet and suspend by pipetting. 2. RT, incubate for 10 min under shading 3.2 Add 1 mL of 2% FCS / 1% PS / T buffer 4. Transfer the suspension to a new 1.5 mL tube 5. Centrifuge for 5 min at 900 x g and set temperature 25 ° C. 6. Remove the supernatant 7.2 Add 1 mL of 2% FCS / 1% PS / T buffer and suspend by pipetting. 8. Centrifuge for 5 min at 900 x g, set temperature 25 ° C 9. Remove the supernatant 10. Add 200 ⁇ L of immunostaining solution and suspend by pipetting.
  • FIG. 1 shows a plot of the number of CTCs detected in 3 mL of lung cancer patient blood and healthy subject blood when 25 ul of Rosette Sep TM was added.
  • each plot shows the average value obtained by performing the test twice for the same sample.
  • CTC was detected with high sensitivity in the blood of lung cancer patients at all stages.
  • the average number of detected blood in healthy subjects was overwhelmingly lower than that in blood of lung cancer patients, indicating that this method is a highly specific detection method.
  • Table 3 shows a summary of the results of the lung cancer patients in FIG.
  • the sensitivity was calculated as the ratio of CTC> 0 (CTC was detected in at least one of the two tests of the same sample) among the tested samples.
  • Table 3 in Example 1, the sensitivity of all stages of lung cancer was 92.3% and the specificity was 76.2%.
  • Example 2 CTC was detected in the same manner as in Example 1 except that 50 ⁇ L of RosetteSep TM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36 was added instead of 25 ⁇ L in “1. Separation of specific gravity difference” of Example 1. It was.
  • FIG. 2 shows a plot of the number of CTCs detected in 3 mL of lung cancer patient blood and healthy subject blood when 50 ⁇ L of Rosette Sep TM was added.
  • each plot shows the average value obtained by performing the test twice for each sample.
  • Table 5 shows a summary of the results of lung cancer patients in FIG. In Example 2, the sensitivity for all stages of lung cancer was 43.5% and the specificity was 100%.
  • the recovered PBMCs were washed twice using a medium containing 10% serum.
  • the washed PBMCs were suspended in 1 mL of a medium containing 10% serum, 3 ⁇ 10 6 pfu of OBP-401 was added, and the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours and then stained as follows.
  • ⁇ CD45 immunostaining> Completely infected PBMCs were collected by centrifugation, blocked with PBS containing 10% serum for 10 minutes, and subjected to a 30-minute primary antibody reaction with an anti-CD45 antibody (BioLegend, 304002). The primary antibody was removed by washing, and the fluorescently labeled secondary antibody (Invitrogen, A21235) was reacted for 30 minutes and then fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes.
  • sample subjected to the above CD45 immunostaining was dispensed into a 96-well plate and observed with a fluorescence microscope (Olympus, IX71).
  • a fluorescence microscope Olympus, IX71
  • GFP-positive cells derived from OBP-401 were first searched for by FITC filter, and GFP, CD45 stained images and bright-field images were acquired for the detected GFP-positive cells.
  • GFP (+) / CD45 (-) cells were determined to be CTC.
  • FIG. 3 shows a comparison of the number of CTCs detected in 3 mL of lung cancer patient blood in Example 1 and Comparative Example 1. CTC detection can be performed with higher sensitivity in Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the number of CTCs when the lung cancer patients and healthy subjects are roughly classified into Comparative Example 1 (left), and a diagram showing the results of calculating the sensitivity and specificity (right). Table 6 shows a summary of the results of the lung cancer patients of FIGS. 3 and 4. In Comparative Example 1, the sensitivity of all stages of lung cancer was 73.3%, and the specificity was 22.2%.
  • Example 1 Effect of T-buffer on CTC detection rate
  • evaluation was performed using a spike model in which around 100 cancer cell lines with adjusted cell numbers were added to the blood of 3 mL of healthy subjects. It was.
  • the spike model is a model sample in which a live cancer cell line is added (spike) to blood after adjusting the number of cells.
  • a spike model was prepared for the case where A549 was cultured on a 24-hole culture plate.
  • ⁇ Procedure> 1. Incubate the cells to a 60-80% confluent state on the day of the experiment 2. Remove the medium supernatant and wash twice with PBS (-). 3. Add 200 ⁇ L of Accutase TM and react for 5 min at room temperature (under a microscope, confirm that the cells have become rounded and have begun to exfoliate). 4. Add 10% FCS / 1% PS / DMEM 850 ⁇ L and exfoliate cells by pipetting. 5. Collect the cell suspension in a 1.5 mL tube and centrifuge at 300 xg, set temperature 25 ° C, 5 min. 6. Remove the supernatant by suction, add PKH26 solution (Diluent C: 125 ⁇ L + PKH26: 0.5 ⁇ L), and suspend by pipetting. 7. React for 2 min at room temperature
  • the detection rate of cancer cell lines was improved when T buffer was added as compared with the case where PBS was added.

Abstract

【課題】循環腫瘍細胞を検出する方法の提供。 【解決手段】循環腫瘍細胞を検出する方法であって、以下の工程：（ａ）赤血球と白血球との架橋剤存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して血球が除去された被検試料を調製する工程、（ｂ）工程（ａ)で調製された被検試料に、ウイルスを感染させる工程、（ｃ）工程（ｂ）で得られた被検試料を標識する工程、及び（ｄ）工程（ｃ）で得られた被検試料から、循環腫瘍細胞を検出する工程を含む前記方法。

Description

ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法
　本発明は、ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法に関する。
  末梢血中を循環するがん細胞 (Circulating Tumor Cell; CTC) は、固形腫瘍病巣から離れ、血液とともに体内を循環しているがん細胞であり、従来の腫瘍マーカーに比べ、より鋭敏ながん早期診断バイオマーカーになると期待されている。
  テロメラーゼは、細胞の不死化を担う酵素であり、あらゆるがん細胞中で高率に活性化している。OBP-401（テロメスキャン）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）プロモーター及びGFP遺伝子を搭載した遺伝子改変アデノウイルスである（特許文献１: WO 2006/036004）。そして、このOBP-401を用いて、CTCを簡便に検出する方法が開発されている（非特許文献１：Kojima T., et al, J. Clin. Invest., 119; 3172, 2009）。
  この方法では、癌細胞に感染及び増殖しテロメラーゼ活性依存的にGFPを大量発現させるため、細胞表面抗原に依存せずあらゆるタイプの「生きた」CTCの捕捉が可能である。例えば、上皮間葉転換(Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT)を起こし細胞表面抗原の発現の度合いや有無が変化したCTCは、CellSearchTMに代表される上皮細胞マーカーを利用した従来のCTC検出法では検出ができなかったが、そのようなCTCであっても検出することができる。このEMT-CTCはがん幹細胞と関連が強く、治療抵抗性で悪性度が高いと考えられており(非特許文献２：Science. 2013 Yu M et al.)、近年重要なバイオマーカーとして注目されている。
　ところで、OBP-401を用いたCTC検出法における従来の血液前処理方法では、血液中の赤血球を溶解後、遠心分離により赤血球残渣を除去することにより、CTCを濃縮していた（非特許文献１）。
  しかしながら、従来の血液前処理方法でCTCを濃縮した後にOBP-401を利用してCTC検出した場合には、血液中に添加した癌細胞株は極めて高感度、高特異度で検出できるものの、実際に癌患者から採取した血液サンプル（以下、「臨床検体」という。）からCTCを検出しようとすると、感度及び特異度が低下するという課題が残されていた。
　また、非特許文献３の４頁目には、一般的なCTC検出方法における複数の血液前処理方法及びその課題が開示されているが、RosetteSepTMを使用した血液前処理方法は、多くの細胞表面タンパクをターゲットとする抗体のカクテルを使用するために、血球だけでなくCTCも除去されてしまい、CTCの回収率が低下することが開示されている。
  また、ウイルスを使用したCTC検出方法における好適な血液前処理方法、特に、臨床検体からCTCを検出するために好適な血液前処理方法については、今まで明らかになっていなかった。
WO 2006/036004
Kojima T., et al, J. Clin. Invest., 119; 3172, 2009 Science. 2013 Yu M et al. Scientific reports. 2016 07 19; 6; 28929
  上記のことから、ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法において、臨床検体においても、高感度かつ高特異度でCTCを検出する方法の開発が望まれていた。
  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法において、血液サンプルから所定試薬を用いて赤血球及び白血球を分離することにより、血球が除去される一方で検出されるCTCの数が増加された結果、臨床検体においても感度及び特異度の両方が高くなることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
  [１]   循環腫瘍細胞を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）循環腫瘍細胞には結合せず循環腫瘍細胞以外の細胞（非循環腫瘍細胞）と結合する試薬存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して当該非循環腫瘍細胞が除去された被検試料を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ)で調製された被検試料に、ウイルスを感染させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた被検試料を標識する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた被検試料から、循環腫瘍細胞を検出する工程
を含む前記方法。
  [２]   ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである[１]に記載の方法。
  [３]   腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスである[２]に記載の方法。
  [４]   ウイルスが蛍光タンパク遺伝子を含むものである[１]～[３]のいずれか１項に記載の方法。
  [５]   非循環腫瘍細胞と結合する試薬が白血球と結合する試薬である[１]～[4]のいずれか１項に記載の方法。
  [６] 　工程（ａ) において、白血球が80～90％除去される、[１]～[５]のいずれか１項に記載の方法。
  [７] 　白血球と結合する試薬が赤血球と白血球との架橋剤である[５]に記載の方法。
  [８] 　赤血球と白血球との架橋剤が二重以上の特異性抗体である、[７]に記載の方法。
  [９] 　赤血球と白血球との架橋剤が二重特異性抗体である、[７]に記載の方法。
  [１０] 　二重特異性抗体が四量体の抗体からなる、[９]に記載の方法。
  [１１] 　二重以上の特異性抗体がCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、[８]～[10]のいずれか1項に記載の方法。
  [１２] 　 二重以上の特異性抗体がCD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、[８]～[10]のいずれか1項に記載の方法。
  [１３]   赤血球と白血球との架橋剤がRosetteSep（TM）である、[７]～[１２]のいずれか１項に記載の方法。
  [１４]   RosetteSep（TM）の添加量が血液3 ｍLあたり20 ～35 μLである[１３]に記載の方法。
  [１５]   密度勾配遠心が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、[１]～[１４]のいずれか１項に記載の方法。
  [１６]   工程（ａ)、工程（ｂ)及び工程（ｃ)の少なくとも１つにおいて細胞を洗浄する工程が含まれ、少なくとも１回の細胞を洗浄する工程が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、[１]～[１５]のいずれか１項に記載の方法。
  [１７]   工程（ｄ）において、循環腫瘍細胞を検出する前に、被検試料を目開き50～200μmのナイロンフィルターに供する工程を含む、[１]～[１６]のいずれか１項に記載の方法。
  [１８]   工程（ｄ）において、被検試料を含む溶液に水溶性封入剤が含まれる、[１]～[１７]のいずれか１項に記載の方法。
  [１９] 　工程（ｃ）における被検試料の標識が、細胞の免疫染色又は核染色である[１]～[１８]のいずれか１項に記載の方法。
  [２０]   循環腫瘍細胞の検出のために血液サンプルから循環腫瘍細胞を濃縮する方法であって、循環腫瘍細胞には結合せず循環腫瘍細胞以外の細胞（非循環腫瘍細胞）と結合する試薬との架橋剤存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して当該非循環腫瘍細胞が除去された被検試料を調製する工程を含む前記方法。
  [２１]  [２０]に記載の方法により調製された被験試料に、さらにウイルスを感染させる工程を含む、循環腫瘍細胞の検出用試料の提供方法。
  [２２] 　ウイルスを感染させた後、被検試料をさらに標識する工程を含む、[２１]に記載の方法。
  [２３]   循環腫瘍細胞の検出がウイルスの感染を利用したものである[２０]～[２２]のいずれか１項に記載の方法。
  [２４]   ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである[２０]～[２３]のいずれか１項に記載の方法。
  [２５]   腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスである[２４]に記載の方法。
  [２６]   ウイルスが蛍光タンパク遺伝子を含むものである[２０]～[２５]のいずれか１項に記載の方法。
  [２７] 　非循環腫瘍細胞と結合する試薬が白血球と結合する試薬である[２０]～[２６]のいずれか１項に記載の方法。
  [２８] 　白血球が80～90％除去される、[２０]～[２７]のいずれか１項に記載の方法。
  [２９] 　白血球と結合する試薬が赤血球と白血球との架橋剤である[２７]に記載の方法。
  [３０] 　赤血球と白血球との架橋剤が二重以上の特異性抗体である、[２９]に記載の方法。
  [３１] 　赤血球と白血球との架橋剤が二重特異性抗体である、[２９]に記載の方法。
  [３２] 　二重特異性抗体が四量体の抗体からなる、[３１]に記載の方法。
  [３３] 　 二重以上の特異性抗体がCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、[３０]～[３２]のいずれか1項に記載の方法。
  [３４] 　 二重以上の特異性抗体がCD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、[３０]～[３２]のいずれか1項に記載の方法。
  [３５]   赤血球と白血球との架橋剤がRosetteSep（TM）である、[２９]～[３４]のいずれか１項に記載の方法。
  [３６]   RosetteSep（TM）の添加量が血液3 ｍLあたり20 ～35 μLである[３５]に記載の方法。
  [３７]   密度勾配遠心が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、[２０]～[３6]のいずれか１項に記載の方法。
  [３８]   密度勾配遠心後に細胞を洗浄する工程が含まれ、細胞を洗浄する工程が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、[２０]～[３６]のいずれか１項に記載の方法。
 
  本発明により、ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法において、血球が除去される一方で検出されるCTCの数が増加され、臨床検体においても高感度及び高特異度でCTCを検出することが可能となった。また、血球を低減できたことでCTC検出に要する時間が短縮されてスループットが向上し、細胞のダメージを引き起こすことなく、低コストで検出を行うことが可能となった。
本願発明の方法により、RosetteSepTM25ulを添加した場合に、臨床検体からCTCを検出した結果を示す図である。 本願発明の方法により、RosetteSepTM50ulを添加した場合に、臨床検体からCTCを検出した結果を示す図である。 本願発明の方法と従来法との検出結果の比較を示す図である。 従来法で健常者と肺癌患者におけるCTCの検出の比較を行った結果を示す図である。
  本発明は、循環腫瘍細胞を検出する方法に関し、以下の工程を含む。
（ａ）赤血球と白血球との架橋剤存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して血球が除去された被検試料を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ)で調製された被検試料に、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスを感染させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた被検試料を免疫染色する工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）で得られた被検試料から、循環腫瘍細胞を検出する工程。
  本発明においては、組換えウイルスを感染させる被検試料を調製するまでの血液サンプルの前処理工程において、CTC以外の細胞と結合する試薬、特に、赤血球と白血球との架橋剤処理することを特徴とするものであり、この処理により、赤血球及び白血球を除去し、臨床検体でも高感度及び高特異度でCTCを検出することが可能となった。
  また本発明においては、上記架橋剤処理に加え、例えば、工程（ａ)における密度勾配遠心工程や、密度勾配遠心後に細胞を洗浄する工程、工程（ｂ）におけるウイルス感染後に細胞を固定するとき又は固定した後に細胞を洗浄する工程、工程（ｃ）における免疫染色を行うとき又は免疫染色を行った後に細胞を洗浄する工程などにおいてFCSとEDTAを含有するバッファーを使用すること、循環腫瘍細胞を検出する工程で水溶性封入剤含有緩衝液を使用すること、あるいは細胞を標識した後に目開き50～200 μmのナイロンフィルターを使用すること等により、CTCをより高感度及び高特異度で検出することが可能となった。
  以下、本発明の工程について詳述する。
（１）血液前処理工程
  血液前処理は、CTCの濃縮工程である。
  ハイスループットな検出系の構築には、効率的な血球除去が重要であるから、本発明においては、血球除去のために以下の処理を行い、CTCを濃縮する。
  まず、採血された血液サンプルを、所定のバッファーと混合し、この混合サンプルを、比重差分離液を充填しておいた密度勾配遠心用の血球濃縮チューブに重層する。使用するバッファーとしては、浸透圧およびpHが体液と同じで、細胞毒性がない性質を有する限り特に限定されるものではないが、FCSとEDTAを含有するバッファーが好ましい。例えば、FCSは１％～５％のものを使用し、好ましくは２％である。EDTAは、１～1.5 mg/mlとなるようにし、好ましくは1mg/mlの濃度となるようにする。本発明においては、CTCの血球濃縮チューブへの吸着を低減させ、CTCの回収率を上げることができる点で、T buffer（少なくとも、2％ FCS、1mg/ml EDTAを含む）を添加して使用することが好ましい。T bufferは、On-chip Biotechnologiesから購入することができる。なお、FCSとEDTAを含有するバッファーは、工程（ａ)における密度勾配遠心だけでなく、密度勾配遠心後に細胞を洗浄する工程、工程（ｂ）におけるウイルス感染後に細胞を固定するとき又は固定した後に細胞を洗浄する工程、工程（ｃ）における免疫染色を行うとき又は免疫染色を行った後に細胞を洗浄する工程などにも好適に使用することができ、チューブ壁面へのCTC付着を低減してCTCの回収率を上げることができる。
  血液サンプルとバッファーとの混合割合は、血液サンプル：バッファー＝１：１～１：１．５であり、１：１.３であることが好ましい。
  続いてCTCには結合せず、CTC以外の細胞（本明細書において、「非循環腫瘍細胞」又は「非CTC」ともいう）と結合する試薬を添加し、遠心分離する。
CTCには結合せずCTC以外の細胞（非CTC）と結合する試薬は、CTC以外の細胞と試薬とが結合した状態で密度勾配遠心を行ったときに試薬が結合する前と比較して当該CTC以外の細胞が沈殿を形成しやすくなったり、試薬が結合する前と比較して比重を変化させたりすることができればどのようなものでも使用することができる。CTCには、epithelial cell adhesion molecule（EpCAM）やE-cadherin、cell-surface vimentinなどのCTC特有の細胞表面マーカーが存在する。本発明においては、これらの細胞表面マーカーを認識しない試薬を使用することができる。
試薬が結合するCTC以外の細胞としては、血球であることが好ましく、例えば赤血球や白血球が挙げられる。試薬は、赤血球だけに結合してもよく、白血球だけに結合してもよく、赤血球と赤血球、白血球と白血球、赤血球と白血球を架橋するように結合してもよいが、赤血球と白血球との架橋剤であることが特に好ましい。
CTC以外の細胞と結合する試薬としては、RosetteSepTM 、PluriSpin（登録商標、PluriSelect社）、Dynabeads（DYNAL社）、blood cell separator nano（PCRopsis社）などが挙げられる。
　PluriSpin（登録商標、PluriSelect社）は、白血球などのCTC以外の細胞が、高い親和性を有するpluriSpin粒子と結合することで比重が増加し，続く遠心分離の操作で遠沈管の底部に沈殿させる。
　赤血球と白血球との架橋剤としては、RosetteSepTMを使用することができる。RosetteSepTMとしては、例えば、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56、RosetteSep Human CD45 Depletion Cocktail、RosetteSepTMHuman Monocyte Depletion Cocktail、RosetteSepTMHuman Granulocyte Depletion Cocktailなどが挙げられ、中でも、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36が好ましい。RosetteSepTMはSTEMCELL Technologiesから購入することができる。
　RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36は、CD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45又はCD66bに対する抗体と、赤血球の表面抗原であるglycophorin Aに対する抗体から選択される二重特異性の四量体の抗体複合体を含む (https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd36.html）。
RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56は、CD3、CD14、CD16、CD19、CD38、CD45、CD56、CD61又はCD66bに対する抗体と、赤血球の表面抗原であるglycophorin Aに対する抗体から選択される二重特異性の四量体の抗体複合体を含む（https://www.stemcell.com/products/rosettesep-ctc-enrichment-cocktail-containing-anti-cd56.html）。
　白血球と赤血球との架橋剤として、二重以上の特異性抗体を使用することもできる。二重以上の特異性抗体としては、RosetteSepTM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36及びRosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD56のいずれかで使用されている抗体を使用してもよい。
　架橋剤の添加量に関し、RosetteSepTMの販売元は、例えばRosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36の場合、血液1mlに対し50μL添加することを推奨している（STEMCELL Technologies社 Document #28583参照）が、これはウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法を想定した条件ではなく、期待される結果を得ることができなかった。そこで、本発明者らの検討により、ウイルスを用いた循環腫瘍細胞の検出方法における架橋剤の添加量が独自に見直された結果、より高感度及び高特異度でCTCを検出できる条件が見出された。すなわち、架橋剤の添加量は、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36を使用する場合、血液1mlに対して50ul未満が好ましく、血液3mlに対して12.5ul超50ul未満が好ましく、血液3mlに対して20～35μLがより好ましく、特に好ましくは血液3mlに対して25μLである。
  架橋剤を使用すると、血球が除去される。「除去」とは、CTCの検出が血球の存在により障害を受けず、かつ、CTCが血球と一緒に除去されない程度に試験系から血球を除くことを意味する。
  この場合、赤血球は90～99％、好ましくは99％除去される。
  また、白血球は８０～９０％除去されるが、好ましくは90％である。ここで、白血球が９０％以上除去されるとCTCも白血球と一緒に除去される（損失する）可能性があるので注意を要する。従って、白血球の除去率は９０％までに止めておくことが好ましい。
  遠心分離は密度勾配遠心分離であり、比重差分離液としては、赤血球と白血球を分離できる限り特に制限はなく、例えば、Ficoll-PaqueTM、LymphoprepTMなどを使用することができる。Ficoll-PaqueTMとしては、例えば、Ficoll-PaqueTMPLUS、Ficoll-PaqueTMPREMIUM、Ficoll-PaqueTM PREMIUM 1.084、Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.073などが挙げられ、中でも、Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084が好ましい。Ficoll-PaqueTMはGEヘルスケアから購入することができる。LymphoprepTMはSTEMCELL Technologiesから購入することができる。遠心分離及び細胞の洗浄は、600～900ｇ、4～25℃で5～15分行う。例えば、９００×ｇ、２５℃で１０分の遠心分離条件が好ましい。
  この遠心分離により、ほとんどの赤血球と白血球が沈殿する。
  次に、デカンテーションにより、CTC及び残存白血球を含む層を回収する。
（２）ウイルス感染工程
  上記回収されたCTC含有液試料に、ウイルスを感染させる。ウイルスとしては、腫瘍特異的に増殖するウイルスが好ましく、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスであることがより好ましい。また、CTCに感染したウイルスを指標として検出しやすいように、ウイルスには蛍光タンパク遺伝子が含まれていることが好ましく、蛍光タンパク遺伝子が発現可能に搭載されていることがより好ましい。また、ウイルスの種類としては、特に制限はなく、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルスなどから適宜選択することができるが、中でも、アデノウイルスが好ましい。当該組換えウイルスとしては、OBP-401(テロメスキャン)（WO 2006/036004、オンコリスバイオファーマ株式会社）を使用することができる。
  ウイルスの感染量は、OBP-401を使用する場合には、1.0×108VP / mLであり、感染温度は25～37℃、好ましくは37℃である。感染時間は23～25時間、好ましくは24時間である。
  感染後は、必要に応じて、パラホルムアルデヒド等により細胞固定及びウイルスの不活化を行ってもよい。蛍光タンパク遺伝子を搭載したウイルスを使用した場合には、細胞内で発現した蛍光タンパクの溶出及び蛍光低下を抑制するために、細胞を固定化しておくことが好ましい。
（３）標識工程
  上記工程（２）で得られた被検試料を標識工程に付す。
　標識工程は、被検試料を含有する溶液に含まれるCTCや血球細胞などの細胞を標識する工程を意味するが、細胞残渣や細胞からの溶出物など細胞以外の成分を標識してもよい。
  細胞の標識には、公知の一般的手法を用いることができ、例えば、免疫染色や、核染色などが挙げられる。免疫染色としては、例えば、抗体に蛍光色素、磁気ビーズ、ビオチン、アガロースビーズ、金コロイドなどをコンジュゲートしたものを使用することができる。抗体は、目的によって適宜選択することができるが、癌細胞特異的に発現するタンパク、血球特異的に発現するタンパク、組織特異的に発現するタンパクなどに対する抗体を使用することができる。血球特異的に発現するタンパクに対する抗体としては、例えば、抗CD45抗体、抗CD16抗体、抗CD36抗体、抗CD3抗体、抗CD14抗体、抗CD19抗体、抗CD38抗体、抗CD56抗体、抗CD61抗体、抗CD66b抗体などが挙げられ、中でも、抗CD45抗体が好ましい。蛍光色素としては、例えば、APC、PE、Cy5又はFITC等を使用することができる。核染色としては、例えば、DAPIやHoechstなどを使用することができる。
（４）CTCの観察及び検出工程
  次に、工程（３）で得られた被検試料からCTCを観察し、検出を行う。検出は、ウイルスに搭載された蛍光タンパク遺伝子、免疫染色や核染色等における蛍光シグナル又は染色シグナルを指標として行う。
  CTCの観察及び検出の前に、被検試料をナイロンフィルターによる不純物除去処理に付すこともできる。ナイロンフィルターとしては目開き50～200 μmのものが好ましく、セルストレーナーが特に好ましい。例えば、目開き100μmのセルストレーナーは、pluriStrainer-Mini 100μmとしてpluriSelect Life Scienceから購入することができる。
  また、循環腫瘍細胞を検出する際に、被検試料を含む溶液に水溶性封入剤を添加したり、被検試料を含む溶液を水溶性封入剤入りの緩衝液で置換することもできる。被検試料を含む溶液に水溶性封入剤が含有されることにより、後述の観察時の蛍光色素の退色を防止することができる。また、被検試料を含む溶液に水溶性封入剤が含有されるにより、ウェル内の液体のメニスカスを軽減することができる。その結果、顕微鏡観察する際の視野が広がり、かつクリアになる。
水溶性封入剤入りの緩衝液としては、例えばFluoromount/PlusTM、Mount-Quick ''Aqueous''、ProLongTMGlass Antifade Mountantなどが挙げられ、中でもFluoromount/PlusTMが好ましい。Fluoromount/PlusTMはDiagnostic BioSystemsから購入することができる。Mount-Quick ''Aqueous''は大道産業株式会社から購入することができる。ProLongTM Glass Antifade MountantはInvitrogenから購入することができる。
  続いて、poly-lysineなどでコーティング処理を行ったマルチウェルガラスボトムプレートに被検試料をアプライし、ウェル全領域の顕微鏡画像、例えば蛍光画像及び明視野画像等を取得する。その後画像解析ソフトにより、CTCをカウントし、検出する。解析ソフトウエアは、蛍光輝度、面積等の定量的な解析ができるもの、及び自動カウント機能を有するものが好ましい。
　なお、CTCの観察及び検出は、顕微鏡観察に限定されるものではなく、細胞を標識した方法に応じて適宜選択することができる。
　また、本発明は、循環腫瘍細胞の検出のために血液サンプルから循環腫瘍細胞を濃縮する方法に関し、赤血球と白血球との架橋剤存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して血球が除去された被検試料を調製する工程を含む。
循環腫瘍細胞を濃縮する方法としては、上述の「循環腫瘍細胞を検出する方法」における「（１）血液前処理工程」を適用することができる。
　また本発明においては、上記「（１）血液前処理工程」で得られた被検試料をさらに上記「（２）ウイルス感染工程」に記載の工程に付してウイルスを感染させ、これを循環腫瘍細胞の検出のための試料として提供することができる。当該提供の際には、さらに上記「（３）標識工程」に記載の工程に付して被検試料を標識することもできる。これらの工程は独立して行ってもよく、両者を連続して行ってもよい。
本発明の循環腫瘍細胞を濃縮する方法により循環腫瘍細胞を濃縮後、循環腫瘍細胞を検出する方法としては、ウイルスの感染を利用する方法だけなく、ウイルスの感染を利用しない方法も適用することができるが、ウイルスの感染を利用する方法であることがより好ましい。ウイルスの感染を利用する方法については、上述の「循環腫瘍細胞を検出する方法」における「（２）ウイルス感染工程」、「（３）標識工程」、「（４）CTCの観察及び検出工程」で記載した方法を適用することができる。ウイルスの感染を利用しない方法としては、例えば、従来公知の循環腫瘍細胞の検出方法を適用することができ、例えば、フィルター、微小流路、免疫染色、誘電泳動、密度勾配遠心、磁気ビーズなどを利用した方法を利用することができる。
  実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
１－１．CTC濃縮プロトコル
  方法
使用試薬・器具を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
臨床検体としては、特に記載がない限り、生検又は手術により取得された肺組織の病理的標本により、肺癌と確定した患者から採取した血液を使用した。
１．比重差分離
＜準備＞
SepMateTM-15に比重液Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084を5 mL取り、300×g、設定温度25 ℃で5 min遠心する（遠心はすべてスイングローターで行う）
＜手順＞
1. FALCON 14 mLラウンドチューブ(PP)内で2 % FCS/1 % P.S/T buffer 4 mL、50 mM EDTA・4Na/T buffer 50 μL、血液検体3 mLを混合する
2. 準備しておいたSepMateTM-15に希釈した血液全量を添加する
（添加時に比重液の液面が乱れないようにゆっくりと添加する）
3. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 500 μLにRosetteSepTM CTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36を25 μL加え、比重差分離を開始する直前に添加する（添加後に比重液の液面が乱れないようにピペッティングを行い攪拌する）
4. 900×g、設定温度25 ℃で10 min遠心する（BrakeはON）
5. 2 % FCS/1 % P.S/PBS 25 mLと2 % FCS/1 % P.S/ T buffer 5 mLを50 mLチューブ内で混合する
6. デカンテーションで上清(セパレータより上の液)を手順5の50 mLチューブに回収する
7. 200 × g、設定温度25 ℃で10 min遠心する
8. 上清をアスピレーターまたはピペットで残液5 mLまで吸引除去する
9. 1000 μLピペッターで残液1 mLまで吸引除去する
10. 残液でペレットをピペッティングで懸濁し、2.0 mLチューブに回収する
11. 10 % FCS/1 % P.S/DMEM 1 mLで、50 mLチューブ内部を洗い、洗い液を手順10の2.0 mLチューブに加える
12. 300 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
13. 1000 μLピペッターで上清を吸引除去する
14. 10 % FCS/1 % P.S/DMEM 900 μLを加え、ピペッティングで懸濁する
２. OBP-401感染
以下の工程はP2実験室で行う
＜手順＞
1. 「２．比重差分離」の手順13のチューブにOBP-401 1.0×108 VP (in 100 μL 10 % FCS/1 % P.S/DMEM)を添加する（最終液量：1 mL）
2. 2.0 mLチューブの蓋をパラフィルムで固定する
3. インキュベーター内のローテーターにチューブを取り付け、37 ℃、遮光下で24 (±1)時間、転倒撹拌を行う
３. 細胞固定
1. インキュベーター内からチューブを取り出し、300 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
2. 1000 μLピペッターで上清を吸引除去する
3. 500 μLの4%パラフォルムアルデヒド/りん酸緩衝液を加え、ペレットを懸濁する
4. 室温、遮光下で10 minインキュベートする
5. 2 % FCS/1 % P.S/T bufferを500 μL加え、全液を新しい1.5 mLチューブに移す
6. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 500 μLで2 mLチューブ内部を洗い、洗い液を手順5の1.5 mLチューブに加える
7. 900×g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
8. 1000 μLピペッターで上清を吸引除去する
9. 2 % FCS/1 % P.S/T bufferを1 mL加え、ペレットを懸濁する
10. 手順7と8を繰り返す
11. 免疫染色工程へ
４．CD45-PE抗体、DAPIによる細胞染色
使用試薬・器具を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜準備＞　すべて当日準備する
免疫染色液
以下の試薬を1.5 mLチューブ内で混合し、使用時まで4 ℃、遮光下で保存する
(i) CD45-PE Antibody：20 μL
(ii) DAPI：2 μL
(iii) 2 % FCS/1 % P.S/T buffer：176 μL
観察用バッファー
以下の試薬を1.5 mLチューブ内で混合し、使用時まで遮光下で保存する
(i) 封入剤（Fluoromount/Plus） : 40 μL
(ii) 2 % FCS/1 % P.S/T buffer : 360 μL
96ウェルマイクロプレートPoly-L-lysineコート処理
1. 96ウェルマイクロプレート1ウェルあたり0.1% Poly-L-lysine溶液200 μLを導入し、RTで5 min静置する
2. ピペットマンで吸引排出する（Poly-L-lysine溶液は回収し、4回まで再使用する）
3. DDWで200 μLでウェル内を洗い、ピペットマンで吸引排出する
4. 手順3を繰り返す
5. ピペットマンで吸引排出する
6. ベンチ内で風乾させる
＜手順＞
1. 膜透過処理液0.15％ Triton X-100/10% FCS/T-buffer 200 μLを細胞ペレットに添加し、ピペッティングで懸濁する
2. RT、遮光下で10 minインキュベートする
3. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 1 mLを添加する
4. 新しい1.5 mLチューブに懸濁液を移す
5. 900 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
6. 上清を除去する
7. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 1 mLを添加し、ピペッティングで懸濁する
8. 900 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
9. 上清を除去する
10. 免疫染色液 200 μLを加え、ピペッティングで懸濁する
11. RT、遮光下で30 minインキュベートする
12. 2 % FCS/1 % P.S/T bufferを1 mL加える
13. 900 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
14. 上清を除去する
15. ４％ PFAを200μLを加え、ピペッティングで懸濁する
16. RT、遮光下で10 minインキュベートする
17. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer を200 μLを加える
18. 100 μmセルストレーナー（pluriStrainer-Mini 100 μm）を新しい1.5 mLチューブに装着する
19. 細胞液をセルストレーナーに載せ、卓上遠心機でフラッシングする
20. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 200 μL で手順18のチューブを洗う
21. 洗い液を手順19と同様に100 μmセルストレーナーに通す
22. 2 % FCS/1 % P.S/T buffer 900 μL を加える
23. 900 × g、設定温度25 ℃で5 min遠心する
24. 上清を除去する
25. 観察用バッファーを200μLを加え、ピペッティングで懸濁する
26. 96 ウェルガラスボトムプレート上に100 μLずつ2ウェルに分けて移す
27. 手順25のチューブを観察用バッファーを200μLで洗い、洗い液を手順26のウェルに100 μLずつ加える
28. 顕微鏡で観察する
29. DAPI(+) / GFP(+) / CD45(-)細胞をCTCと判定した
＜結果＞
  図１は、RosetteSepTMを25ul添加した場合の、肺がん患者血液および健常者の血液3 mLから検出されたCTC数のプロットを示す。図１において、各プロットは、同一検体につき２回試験を実施した平均値を示している。
肺がん患者血液からはすべてのステージにおいて、高感度にCTCが検出された。一方、健常者血液では平均検出個数は肺がん患者血液に比べて圧倒的に低く、本方法が高特異度な
検出法であることがわかった。
  図１の肺がん患者の結果のまとめを表３に示す。
  以下の実験結果において、感度は検査した検体のうち、CTC＞0個（同一検体の2回の試験のうち少なくとも一方でCTCが検出された）の検体の割合として算出した。特異度は健常者検体のうち、CTC＝0個（同一検体の2回の試験のうちどちらもCTCが検出されなかった）の検体の割合として算出した。  
  表３に示すように、実施例１では、肺がん全ステージの感度が92.3%であり、特異度が76.2%であった。
　なお、CTC≧１.0個をCTC陽性検体とし、CTC＜１.0個を陰性検体と設定した場合、実施例１の肺がん全ステージの感度は88.5%であり、特異度は90.5%となる。
また、CTC≧2.0個をCTC陽性検体とし、CTC＜2.0個を陰性検体と設定した場合、実施例１の肺がん全ステージの感度は78.8%であり、特異度は95.2%となる。
このように、適宜カットオフ値を設定することにより、感度または特異度のいずれか一方を更に向上させたCTC検出方法を提供することもできる。
  また、同一患者検体での血清CEAと本検出法でのCTCの陽性率の比較結果を表４に示す。血清CEAよりもCTCの方が高感度に検出できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例１の「１．比重差分離」において、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36を25 μLを加える代わりに50μL加えたことを除き、実施例１と同様の方法で、CTCの検出を行った。
＜結果＞
  図２は、RosetteSepTMを50μL添加した場合の、肺がん患者血液および健常者の血液3 mLから検出されたCTC数のプロットを示す。図２において、各プロットは、各検体につき２回試験を実施した平均値を示している。
  図２の肺がん患者の結果のまとめを表５に示す。実施例２では、肺がん全ステージの感度が43.5%であり、特異度が100%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例１の「１．比重差分離」において、RosetteSepTMCTC Enrichment Cocktail Containing Anti-CD36を25 μLを加える代わりに12.5μL加えたことを除き、実施例１と同様の方法で、CTCの検出を行った。
＜結果＞
　血球が多いため測定ができなかった。
［比較例１］
＜PBMC分画の回収及びウイルス感染＞
臨床検体としては、特に記載がない限り、生検又は手術により取得された肺組織の病理的標本により、肺癌と確定した患者から採取した血液を使用した。
  被検者の血液7.5 mLをCPD（Citrate Phosphate Dextrose）溶液入りの真空採血管に採取し、15-25℃を保持した。採血後24時間以内に、7.5 mLの血液に対して120 mLのRed blood cell lysis buffer (Sigma-Aldrich)を用いて赤血球の溶血を行い、遠心によりPeripheral blood mononuclear cells (PBMCs, CTCが含まれる白血球分画)を回収した。回収したPBMCsを10%血清入り培地を使用して2回の洗浄を行った。洗浄したPBMCsを1 mLの10%血清入り培地に懸濁し、3×106 pfuのOBP-401を加え、37℃で24時間培養後、下記染色を行った。
＜CD45免疫染色＞
  感染が完了したPBMCsを遠心により回収し、10%血清入りPBSにより10分間のブロッキングを行い、抗CD45抗体 (BioLegend, 304002)により30分間の1次抗体反応を行った。洗浄により1次抗体を取り除き、蛍光標識された2次抗体 (Invitrogen, A21235)を30分間反応させた後、4%パラフォルムアルデヒドにより10分間の固定を行った。
＜検体の解析＞
  上記CD45免疫染色を行った検体を96 well plateに分注し、蛍光顕微鏡 (Olympus, IX71)による観察を行った。効率的に観察するため、まずFITC filterによりOBP-401由来のGFP陽性細胞を探査し、検出されたGFP陽性細胞についてGFP, CD45染色像及び明視野の画像取得を行った。GFP（+）/CD45(-)細胞をCTCと判定した。
＜結果＞
  図３は、実施例１と比較例１で肺がん患者血液3 mLから検出されたCTC数の比較を示す。実施例１の方が高感度にCTC検出ができている。
  図４は、比較例１について、肺がん患者と健常者に大別した場合のCTC数の比較の図（左）、及び感度と特異度を算出した結果を示す図（右）である。
  図３及び図４の肺がん患者の結果のまとめを表６に示す。比較例１では、肺がん全ステージの感度が73.3%であり、特異度が22.2%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
CTC検出率に対するT-bufferの効果
実施例１において、臨床検体の代わりに、細胞数を調整したがん細胞株100個前後を 3mL の健常者の血液に添加したスパイクモデルを用いて評価を行った。
１．スパイクモデル作製　
  スパイクモデルとは、生きたがん細胞株を細胞数を調整したのちに血液に添加（スパイク）したモデルサンプルである。本実施例では、24穴培養用プレートでA549を培養した場合についてスパイクモデルを作製した。
＜手順＞
1. 実験当日に60～80 ％コンフルエント状態になるように細胞を培養する
2. 培地上清を取り除き、PBS(－)で2回洗浄する
3. AccutaseTMを200 μL添加し、室温で5 min反応させる
（顕微鏡下で細胞の形が丸くなり、剥離し始めたことを確認する。）
4. 10 % FCS/1 % P.S/DMEM 850 μLを添加し、ピペッティングで細胞を剥離する
5. 細胞懸濁液を1.5 mLチューブに回収し、300×g、設定温度25 ℃、5 min遠心する
6. 上清を吸引除去し、PKH26溶液(Diluent C：125 μL + PKH26：0.5 μL)を添加し、ピペッティングで懸濁する
7. 室温で2 min反応させる
8. 10 % FCS/1 % P.S/DMEMを1 mL添加し、300 × g、設定温度25 ℃、5 min遠心する
9. 上清を吸引除去し、10 % FCS/1 % P.S/DMEMを1 mL添加し、ピペッティングで懸濁する
10. 10 % FCS/1 % P.S/DMEMで手順9の細胞懸濁液の希釈系列を作製し、100 μLに目的の細胞数が含まれるように調整する
11. 希釈した細胞懸濁液100 μLを96wellプレートに添加し、細胞がプレート底面に落ちるまで、30分静置する
12. 蛍光顕微鏡でPKH26で標識された細胞数をカウントする
13. カウント後、ウェル内の細胞懸濁液全量を、実施例１「１．比重差分離」の手順1のチューブに添加する
14. 蛍光顕微鏡下でウェル内に残存した細胞数をカウントする
（スパイク数 = 手順12でカウントした細胞数 － 手順14でカウントした細胞数）
以下、実施例１と同じ手順で試料を処理し、細胞株を検出した。
  また、実施例１でT bufferを添加した全ての工程において、T bufferの代わりにPBSを添加したものを、比較対象とした。
＜結果＞
  検出率の結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
   PBSを添加した場合に比べ、T bufferを添加した方が癌細胞株の検出率が向上した。

Claims (38)

  1.   循環腫瘍細胞を検出する方法であって、以下の工程：
    （ａ）循環腫瘍細胞には結合せず循環腫瘍細胞以外の細胞（非循環腫瘍細胞）と結合する試薬存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して当該非循環腫瘍細胞が除去された被検試料を調製する工程、
    （ｂ）工程（ａ)で調製された被検試料に、ウイルスを感染させる工程、
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた被検試料を標識する工程、及び
    （ｄ）工程（ｃ）で得られた被検試料から、循環腫瘍細胞を検出する工程
    を含む前記方法。
  2.   ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである請求項１に記載の方法。
  3.   腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスである請求項２に記載の方法。
  4.   ウイルスが蛍光タンパク遺伝子を含むものである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　非循環腫瘍細胞と結合する試薬が白血球と結合する試薬である請求項１～4のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　工程（ａ) において、白血球が80～90％除去される、請求項１～5のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　白血球と結合する試薬が赤血球と白血球との架橋剤である請求項５に記載の方法。
  8. 　赤血球と白血球との架橋剤が二重以上の特異性抗体である、請求項7に記載の方法。
  9. 　赤血球と白血球との架橋剤が二重特異性抗体である、請求項7に記載の方法。
  10. 　二重特異性抗体が四量体の抗体からなる、請求項9に記載の方法。
  11. 　二重以上の特異性抗体がCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、請求項8～10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 　二重以上の特異性抗体がCD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、請求項8～10のいずれか1項に記載の方法。
  13.   赤血球と白血球との架橋剤がRosetteSep（TM）である、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14.   RosetteSep（TM）の添加量が血液3 ｍLあたり20 ～35 μLである請求項１３に記載の方法。
  15.   密度勾配遠心が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16.   工程（ａ)、工程（ｂ)及び工程（ｃ)の少なくとも１つにおいて細胞を洗浄する工程が含まれ、少なくとも１回の細胞を洗浄する工程が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17.   工程（ｄ）において、循環腫瘍細胞を検出する前に、被検試料を目開き50～200μｍのナイロンフィルターに供する工程を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18.   工程（ｄ）において、被検試料を含む溶液に水溶性封入剤が含まれる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　工程（ｃ）における被検試料の標識が、細胞の免疫染色又は核染色である請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20.   循環腫瘍細胞の検出のために血液サンプルから循環腫瘍細胞を濃縮する方法であって、循環腫瘍細胞には結合せず循環腫瘍細胞以外の細胞（非循環腫瘍細胞）と結合する試薬との架橋剤存在下で血液サンプルを密度勾配遠心処理して当該非循環腫瘍細胞が除去された被検試料を調製する工程を含む前記方法。
  21.  請求項２０に記載の方法により調製された被験試料に、さらにウイルスを感染させる工程を含む、循環腫瘍細胞の検出用試料の提供方法。
  22. 　ウイルスを感染させた後、被検試料をさらに標識する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
  23.   循環腫瘍細胞の検出がウイルスの感染を利用したものである請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24.   ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25.   腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御される組換えウイルスである請求項２4に記載の方法。
  26.   ウイルスが蛍光タンパク遺伝子を含むものである請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 　非循環腫瘍細胞と結合する試薬が白血球と結合する試薬である請求項２０～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 　白血球が80～90％除去される、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　白血球と結合する試薬が赤血球と白血球との架橋剤である請求項２７に記載の方法。
  30. 　赤血球と白血球との架橋剤が二重以上の特異性抗体である、請求項２９に記載の方法。
  31. 　赤血球と白血球との架橋剤が二重特異性抗体である、請求項２９に記載の方法。
  32. 　二重特異性抗体が四量体の抗体からなる、請求項３１に記載の方法。
  33. 　二重以上の特異性抗体がCD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD56、CD61、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、請求項３０～３２のいずれか1項に記載の方法。
  34. 　二重以上の特異性抗体がCD2、CD16、CD19、CD36、CD38、CD45、CD66b、またはglycophorin Aに対する抗体である、請求項３０～３２のいずれか1項に記載の方法。
  35.   赤血球と白血球との架橋剤がRosetteSep（TM）である、請求項２９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36.   RosetteSep（TM）の添加量が血液3 ｍLあたり20 ～35 μLである請求項３５に記載の方法。
  37.   密度勾配遠心が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、請求項２０～３6のいずれか１項に記載の方法。
  38.   密度勾配遠心後に細胞を洗浄する工程が含まれ、細胞を洗浄する工程が、FCSとEDTAを含有するバッファーで行われる、請求項２０～３６のいずれか１項に記載の方法。
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