CN110250159A - 一种细胞保护液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞保护液及其制备方法和应用。本发明首先提供一种细胞保护液组合物，其包括EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000。本发明的细胞保护液内含有EDTA二钾10‑100mg/mL、咪唑烷基脲100‑500mg/mL、PEG8000 10‑50mg/mL、PEG2000 10‑50mg/mL。本发明的细胞保护液是针对于循环肿瘤细胞检测技术而提供了一种保护细胞表面抗原生物活性的细胞保护液，对外周血的血红细胞以及白细胞起到很好的保护作用，能有效减少外周血细胞在储存以及运输过程中发生破碎以及细胞表面抗原活性丢失等情况。

Description

一种细胞保护液及其制备方法和应用
技术领域
本发明是关于一种细胞保护液及其制备方法和应用，具体地说，是关于一种可以保护细胞完整性以及细胞表面抗原生物活性的保护液及其制备方法和应用，属于生物制剂技术领域。
背景技术
细胞诊断是生物医学领域发展的热点方向。近年来，随着液体活检技术的应用，细胞标本和工具细胞的稳定保存技术要求日益增加，并且针对不同细胞类型的细化特征保存的目的性越来越显著。本发明提供了一种用于保护完整细胞形态的、能够有效固定细胞蛋白质组分的、可用于外周血细胞和培养细胞的细胞保护液。
液体活检是一种非侵入式的血液测试，能检测肿瘤或转移灶释放到血液中的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤碎片。循环肿瘤细胞的检测有助于肿瘤转移患者的诊断、监测，术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化治疗的策略。由于外周血中的CTC数量非常稀少，通常CTC检测会先用利用细胞的物理性质或者生物特性等对CTC进行富集分离。其中的免疫亲和分离是利用特异性抗体识别细胞特异表达的蛋白标志物将细胞进行分离和富集，故细胞的完整性以及表面蛋白标志物的保护尤为重要。
CTC检测主要有细胞计数法和核酸检测法两大类，细胞计数法分为免疫细胞化学法与流式细胞术(FACS)。其中免疫细胞化学法即以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原-抗体反应和细胞化学呈色反应对相应抗原进行定位、定性和定量测定。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫学的基本反应是抗原-抗体反应，由于抗原-抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原与抗体发生反应时，可以有效地判断未知抗原或抗体的表达情况。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，与其相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
CTC检测技术中，识别肿瘤细胞荧光染色的有细胞角蛋白、常见的白细胞抗原和核染料(DAPI)。细胞角蛋白(cytokeratin，CK)是一种常见的肿瘤免疫组织化学标记物，主要分布于上皮细胞，为细胞骨架的蛋白组分。CD45分子在所有白细胞上表达，称为白细胞共同抗原，在肿瘤细胞上均不表达。在临床检验中，采血后直至检测，保护细胞表面的抗原生物活性尤为重要。本发明以保护细胞为出发点，研发出对于细胞完整性以及细胞表面抗原生物活性具有保护作用的细胞保护液。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种细胞保护液组合物，其所配制的细胞保护液，能较好地保存细胞形态结构的完整性。
本发明的另一目的是提供所述细胞保护液的制备方法。
本发明的另一目的是提供所述细胞保护液在保护细胞中的应用。
一方面，本发明提供了一种细胞保护液组合物，其包括EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液组合物，其由EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液组合物中，EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000的用量比例为：
EDTA二钾10-100mg；
咪唑烷基脲100-500mg；
PEG8000 10-50mg；
PEG2000 10-50mg。
另一方面，本发明还提供了一种细胞保护液，其是由本发明所述的组合物与水配制而成的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液中，含有EDTA二钾10-100mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液中，含有咪唑烷基脲100-500mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液中，含有PEG8000 10-50mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液中，含有PEG2000 10-50mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液，其中具有以下组分及含量：
EDTA二钾10-100mg/mL；
咪唑烷基脲100-500mg/mL；
PEG8000 10-50mg/mL；
PEG2000 10-50mg/mL。
另一方面，本发明还提供了所述的细胞保护液的制备方法，其包括：
将咪唑烷基脲加入纯水中，搅拌溶解后，再加入EDTA二钾使其溶解，然后加入PEG8000搅拌使其溶解，再加入PEG2000，搅拌溶解。
优选地，所述制备方法还包括对混合后的液体进行过滤和/或分装的步骤。所述的过滤例如是通过0.22μm滤膜过滤。
另一方面，本发明还提供了所述的细胞保护液组合物、或所述的细胞保护液在保存细胞中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明所述的细胞保护液组合物、或所述的细胞保护液在保存细胞的应用中，所述细胞可以包括外周血全细胞。在一些更具体的实施方案中，所述细胞包括外周血中的血红细胞和/或白细胞。在另一些更具体的实施方案中，所述细胞包括人工培养的悬浮细胞HL-60。在另一些更具体的实施方案中，所述细胞包括人工培养的贴壁细胞SK-BR-3。
本发明的细胞保护液，对于外周血细胞有良好的保护作用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液可用于保护外周血中的血红细胞和/或白细胞，对外周血中的血红细胞以及白细胞有很好的保护作用，能有效的减少外周血细胞在储存以及运输过程中发生破碎以及细胞表面抗原活性丢失等情况。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液可用于保护人工培养的悬浮细胞HL-60，对于人工培养的悬浮细胞HL-60有很好的保护作用，能有效地保护细胞表面抗原活性，并在保护细胞的完整性上有很好的效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保护液可用于保护人工培养的贴壁细胞SK-BR-3，对于人工培养的贴壁细胞SK-BR-3有很好的保护作用，能有效地保护细胞表面抗原活性，并在保护细胞的完整性上有很好的效果。
本发明的有益效果：
本发明的细胞保护液是针对于循环肿瘤细胞检测技术而提供了一种保护细胞表面抗原生物活性的细胞保护液，本发明的细胞保护液能对外周血细胞起到很好的保护作用，有效地保护细胞的完整性，减少外周血细胞在储存与运输过程中发生破碎以及细胞表面抗原活性丢失等情况。
附图说明
图1所示为FACS法检定人工培养HL-60细胞CD45荧光强度随时间变化图。
图2所示为计数法检定HL-60细胞完整程度以及数量变化。
图3所示为FACS法检定人工培养SK-BR-3细胞CK荧光强度随时间变化图。
图4所示为计数法检定人工培养SK-BR-3细胞完整程度以及数量变化。
图5所示为ELISA法检定外周血血清血红蛋白含量随时间变化图。
图6所示为FACS法检定外周血白细胞CD45荧光强度随时间变化图。
图7所示为FACS法检定外周血白细胞CD45荧光强度时流式细胞仪所检测的细胞分布图。
具体实施方案
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的常规操作或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的血红蛋白试剂盒购自北京华夏远洋科技有限公司。
下述实施例中所用的CK抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。
下述实施例中所用的CD45抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。
下述实施例中所用的人早幼粒急性白血病细胞(HL-60)均购自南京科佰生物科技有限公司。
下述实施例中所用的人乳腺癌细胞(SK-BR-3)均购自南京科佰生物科技有限公司。
实施例1.FACS法检定人工培养HL-60细胞CD45荧光强度：
本实施例的细胞保护液及其制备方法：
EDTA二钾30mg/mL；
咪唑烷基脲100mg/mL；
PEG8000 10mg/mL；
PEG2000 10mg/mL；
按照上述比例，称量一定质量的咪唑烷基脲于烧杯中，加入纯水搅拌使其溶解后再称量一定质量的EDTA二钾使其溶解，然后称量一定质量的PEG8000搅拌使其溶解后再称量一定质量的PEG2000。搅拌使所有药溶解后用纯水定容。混匀后用0.22μm滤膜过滤后常温储存。
本实施例所述细胞保护液对人工培养HL-60细胞有良好的保护效果。细胞保护效能的评估指标是以FACS法检定HL-60细胞CD45荧光强度。将人工培养的HL-60细胞悬在完全培养基内，并在其中加入本发明所述的细胞保护液，试验有3组平行样。分别在储存细胞2h、24h、48h、72h时取出1mL混匀后的细胞悬液清洗过后进行CD45染色操作，FACS法测定其CD45荧光强度，测量结果如图1所示。结果说明，该细胞保护液在96小时内可维持HL60细胞表面CD45荧光强度约75％以上，并且保存24-96小时之间荧光强度稳定。
实施例2.计数法检定人工培养HL-60细胞数量：
本发明所述细胞保护液(配制方法同实施例1)对人工培养HL-60细胞有良好的保护效果。细胞保护效能的评估指标是计数法检定HL-60细胞完整程度以及数量变化。将人工培养的HL-60细胞悬在完全培养基内，并在其中加入本发明所述的细胞保护液，试验有3组平行样。分别在储存细胞2h、24h、48h、72h时取出10uL混匀后的细胞悬液进行血球计数板计数操作，每个样品计数进行3次，计数结果如图2，结果提示，96小时内细胞保护液对细胞完整形态保护良好。
实施例3.FACS法检定人工培养SK-BR-3细胞CK荧光强度：
本实施例的细胞保护液及其制备方法：
EDTA二钾10mg/mL；
咪唑烷基脲400mg/mL；
PEG8000 15mg/mL；
PEG2000 10mg/mL；
按照上述比例，称量一定质量的咪唑烷基脲于烧杯中，加入纯水搅拌使其溶解后再称量一定质量的EDTA二钾使其溶解，然后称量一定质量的PEG8000搅拌使其溶解后再称量一定质量的PEG2000。搅拌使所有药溶解后用纯水定容。混匀后用0.22μm滤膜过滤后常温储存。
本发明所述细胞保护液对人工培养SK-BR-3细胞有良好的保护效果。细胞保护效能的评估指标是以FACS法检定SK-BR-3细胞CK荧光强度。将人工培养的SK-BR-3细胞悬在完全培养基内，并在其中加入本发明所述的细胞保护液，试验有3组平行样。分别在储存细胞2h、24h、48h、72h时取出1mL混匀后的细胞悬液清洗过后进行CK染色操作，FASC法测定其CK荧光强度，测量结果如图3。结果说明，该细胞保护液在96小时内可维持SK-BR-3细胞内CK荧光强度约75％以上，并且保存24-96小时之间荧光强度稳定。
实施例4.计数法检定人工培养SK-BR-3细胞数量：
本发明所述细胞保护液(配制方法同实施例3)对人工培养SK-BR-3细胞有良好的保护效果。细胞保护效能的评估指标是计数法检定SK-BR-3细胞完整程度以及数量变化。将人工培养的SK-BR-3细胞悬在完全培养基内，并在其中加入本发明所述的细胞保护液，试验有3组平行样。分别在储存细胞2h、24h、48h、72h时取出10uL混匀后的细胞悬液进行血球计数板计数操作，每个样品计数进行3次，计数结果如图4。结果提示，96小时内细胞保护液对细胞完整形态保护良好。
实施例5.ELISA法检定血清血红蛋白含量：
本实施例的细胞保护液及其制备方法：
EDTA二钾10mg/mL；
咪唑烷基脲100mg/mL；
PEG8000 50mg/mL；
PEG2000 10mg/mL；
按照上述比例，称量一定质量的咪唑烷基脲于烧杯中，加入纯水搅拌使其溶解后再称量一定质量的EDTA二钾使其溶解，然后称量一定质量的PEG8000搅拌使其溶解后再称量一定质量的PEG2000。搅拌使所有药溶解后用纯水定容。混匀后用0.22μm滤膜过滤后常温储存。
本发明所述细胞保护液对血液中血红细胞有良好的保护效果。血红细胞的保护效能的评估指标是以ELISA法检定血清血红蛋白含量。随机采取5例健康人血液于本发明所述的细胞保护液内，分别在储存血液2h、24h、48h、72h、96h时取出2mL血液进行血液白细胞分离操作，取分离后血清测定其血红蛋白的含量OD405测量值，经标准曲线计算后转化为血清血红蛋白含量(mg/mL)为图5。结果显示，外周血红细胞在保护液中96小时内完整度较好，溶血导致的血红蛋白升高不明显。
实施例6.FACS法检定外周血白细胞CD45荧光强度:
本发明所述细胞保护液(配制方法同实施例5)对有核细胞有良好的保护效果。有核血细胞保护效能的评估指标是以FACS法检定外周血白细胞CD45荧光强度。随机采取5例健康人血液于本发明所述的细胞保护液内，分别在储存血液2h、24h、48h、72h、96h时取出2mL血液进行血液白细胞分离操作，取分离后白细胞测定其CD45荧光强度，测量结果如图6。结果说明，该细胞保护液在96小时内可维持外周血有核细胞表面CD45荧光强度约60％以上，并且保存24-96小时之间荧光强度稳定。
图7所示为FACS法检定外周血白细胞CD45荧光强度时流式细胞仪所检测的细胞分布情况。结果说明，根据CD45荧光强度检测到的有核细胞数量稳定。

Claims (10)

1.一种细胞保护液组合物，其包括EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000。
2.根据权利要求1所述的细胞保护液组合物，其由EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000组成。
3.根据权利要求1所述的细胞保护液组合物，其中，EDTA二钾、咪唑烷基脲、PEG8000和PEG2000的用量比例为：
EDTA二钾10-100mg；
咪唑烷基脲100-500mg；
PEG8000 10-50mg；
PEG2000 10-50mg。
4.一种细胞保护液，其是由权利要求1～3任一项所述的组合物与水配制而成的。
5.根据权利要求4所述的细胞保护液，其中具有以下组分及含量：
EDTA二钾10-100mg/mL；
咪唑烷基脲100-500mg/mL；
PEG8000 10-50mg/mL；
PEG2000 10-50mg/mL。
6.权利要求4或5所述的细胞保护液的制备方法，其包括：
将咪唑烷基脲加入纯水中，搅拌溶解后，再加入EDTA二钾使其溶解，然后加入PEG8000搅拌使其溶解，再加入PEG2000，搅拌溶解；
优选地，所述制备方法还包括对混合后的液体进行过滤和/或分装的步骤。
7.权利要求1～3任一项所述的细胞保护液组合物、或权利要求4或5所述的细胞保护液在保存细胞中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述细胞包括外周血中的血红细胞和/或白细胞。
9.根据权利要求7所述的应用，其中，所述细胞包括人工培养的悬浮细胞HL-60。
10.根据权利要求7所述的应用，其中，所述细胞包括人工培养的贴壁细胞SK-BR-3。
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