CN107603970A - 一种防止尿液中游离dna降解的尿液保存剂及尿液保存管 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂，其为包含以下质量分数的物质的水溶液：4‑8％的核酸抑制剂、10‑18％的防腐剂、5‑10％的淬灭剂和2‑5％的pH缓冲剂。本发明的尿液保存剂可以保证尿液在4℃条件下保存尿液最长达7天，期间游离DNA不会发生明显降解，且尿液中脱落细胞的gDNA不会显著释放至尿液中，影响尿液中游离DNA的含量，故适合用于聚合酶链式反应和DNA测序。

Description

一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂及尿液保存管

技术领域

本发明涉及生物样品保存领域，更特别地，涉及一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂及尿液保存管。

背景技术

正常尿液中的游离DNA主要来源为泌尿系统的器官如肾、膀胱、尿道等脱落下来的上皮细胞及少量白细胞降解而来，当泌尿系统发生病理变化时，尿液中的游离DNA含量也会随之发生改变。目前，关于尿液中游离DNA的研究越来越多，基于尿液的液体活检技术是以尿液中的游离DNA作为检测目标，在检测过程中，初始游离DNA的稳定性至关重要。

然而，相比较外周血，尿液中的核酸酶含量更高、代谢物质更多、PH范围波动较大，故尿液中游离DNA所处的生物环境相对于血液来说会更复杂。如果尿液中有白细胞或者是上皮细胞破裂基因组DNA降解进入尿液中，或者是如果尿液中的核酸酶未被抑制，初始DNA将会在短时间内被降解掉，这些都将会改变初始游离DNA的含量，更多情况是降低了稀有突变的占比，增加了检测的背景噪音，给后续的检测带来假阴性结果。

为了保证检测结果的准确性，尿液收集之后要求在4℃条件下保存并运输，尽快离心分离尿液上清和尿沉淀，若长期保存需转移到-80℃超低温冰箱储存，以便最大限度下保证尿液中游离DNA的原始状态。即便如此，仅仅依靠低温，仍然不能有效地在一定时间内保藏尿液样品中的游离DNA。

因此，需要一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂，其为包含以下质量分数的物质的水溶液：4-8％的核酸抑制剂、10-18％的防腐剂、5-10％的淬灭剂和2-5％的pH缓冲剂。

在一个优选实施方案中，所述核酸酶抑制剂为EDTA、EDTA二钾、EDTA二钠、EDTA三钾、EDTA三钠、硫酸铵中的任一种或多种组合。优选地，所述核酸酶抑制剂为质量分数4-6％的EDTA。核酸酶抑制剂主要是通过螯合Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等金属离子而抑制核酸酶活性，抑制核酸降解。

在一个优选实施方案中，所述防腐剂为二羟甲基脲、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲、多聚甲醛、福尔马林、钠羟甲基甘氨酸中的任一种或多种组合。优选地，所述防腐剂为重氮烷基脲、咪唑烷基脲与多聚甲醛的任意组合。防腐剂的主要作用是抑制尿液中细菌活性，防止尿液变质。

优选地，所述防腐剂的浓度为5-100g/L。更优选地，所述防腐剂的浓度为10-40g/L。

在一个优选实施方案中，所述淬灭剂为精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、尿素、乙二胺中的一种或多种组合。优选地，所述淬灭剂为所述淬灭剂为精氨酸或甘氨酸。淬灭剂的作用为消除防腐剂中产生的自由醛，自由醛会抑制聚合酶链式反应和测序过程中的酶反应。

在一个优选实施方案中，所述PH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钾盐、磷酸钠盐、碳酸氢钠、硼酸盐、乙酸盐中的任一种或多种组合。优选地，所述pH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液的任意组合。pH缓冲剂主要是调整尿液pH保持在一合理的6.0-8.0的范围内。

本发明还提供了一种尿液保存管，其为装有上述的尿液保存剂的样品收集管。优选地，所述样品收集管为真空采集管。真空采集管中保存剂的量足以维持尿液中脱落的上皮细胞和白细胞的形态和防止细胞降解，同时也抑制了核酸酶活性，使得尿液中的游离DNA保持初始化状态。

尿液样本和保护剂接触后，允许尿液样本被分离和核酸检测之前在4℃储存一段时间，尿液样本可以在一个地方(例如医院、家里)被收集，接触所述保存剂后，在低温条件下(4℃或更低)传输至不同地方(例如实验室)进行核酸分离和检测过程。核酸的检测结果可以返回到取样位置。

可以使用以下检测方法来进行检测，包括聚合酶链式反应、实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)、琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳、质谱、DNA杂交、紫外荧光检测、高通量测序(NGS)等检测或它们的任意组合。

附图说明

图1为样本3在4℃储存一端时间后的Labchip GX毛细管凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

以下，通过Qubit3.0来检测尿液中游离DNA的含量变化，在医院收集到3例尿液样本，取样之后1小时内回到实验室分离游离DNA然后提取，分别以0天样本以及未加入保存剂的样本为参照进行对比。

采集尿液样品后，尿液样品与保存剂的初始接触需要一定时长，即需要事先混匀，以抑制细胞裂解，降低核酸酶活性。尿液样本和保护剂初始接触时间至少10秒，可长达1分钟，具体操作可以是上下匀速颠倒10次，使二者充分混合。然后置于4℃条件下保存，取0天、3天和7天的样品用于检测。

1.4℃保存后的游离DNA含量变化

将3例志愿者尿液样本，分别取20ml于采集管中，上下颠倒10次混匀后于低温运输回实验室及时放置于4℃保存，并对0天、3天、7天的尿液样本进行处理。每次平行提取3管2ml尿液，使用Qubit3.0来检测0天、3天、7天的尿液样本游离DNA的含量，并取平均值。结果如表1所示，其中，A组为加有尿液保存剂处理的尿液样品，B组为没有尿液保存剂处理的尿液样品。

表1加有尿液保存剂处理和没有尿液保存剂处理的样品中DNA浓度(ng/μL)

从表1可看出，加入保存剂0天的浓度值为参考，3天和7天的浓度变化无显著差异，而无保护剂的浓度变化差异大，基因组DNA释放和降解明显。

2.4℃保存后的游离DNA片段分布

取样本3之0天、3天、7天的游离DNA进行标准化建库，建库过程中所用接头的长度为两端各60bp，合计120bp。文库经Labchip GX进行毛细管凝胶电泳得到的片段分布如图1所示，游离DNA的文库片段主要在300bp左右(因本标准化建库中使用的接头序列长度为120bp，故本发明实施例采集管中尿液样本提取的游离DNA主要片段长度在180bp左右)，与已有研究报道长度(160-180bp)相差无几，且明显可看出样本3的B组方案中，随着时间的增加，游离DNA的含量逐步减少，相对于A组方案，其条带拖影更宽泛，目标条带(300bp)原来越不集中。

3.4℃保存后的游离DNA突变频率变化

提取4℃保存3天的尿液样本中的游离DNA进行标准化建库后质检，经Nextseq500上机测序以检测基因突变情况，生物信息分析得到基因突变频率。结果如表2所示，其中，A组为加有尿液保存剂处理的尿液样品，B组为没有尿液保存剂处理的尿液样品，C组为肿瘤组织样品。

表2各样品中的基因突变检测情况

从表2可看出，样本1和样本2的3组均检测到了同一突变位点，但是未加入保护剂的B组突变频率降低，有两种原因：一是尿液中的游离DNA降解造成携带该突变位点的DNA减少，而是尿液中基因组DNA的释放及降解造成背景干扰，测到的总DNA片段增加。

样本3中加入保护剂的A组和肿瘤组织样本都检测到相同的突变位点，而未加入保护剂的B组检测到的却是另外的突变位点，与参考标准C组差别明显。综上所述，本发明可以在4℃条件下有效的保护尿液游离DNA不降解及预防基因组DNA的释放，保证检测到的突变位点的准确性和可靠性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种防止尿液中游离DNA降解的尿液保存剂，其特征在于，为包含以下质量分数的物质的水溶液：4-8％的核酸抑制剂、10-18％的防腐剂、5-10％的淬灭剂和2-5％的pH缓冲剂。

2.根据权利要求1所述的尿液保存剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为EDTA、EDTA二钾、EDTA二钠、EDTA三钾、EDTA三钠、硫酸铵中的任一种或多种组合。

3.根据权利要求2所述的尿液保存剂，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为质量分数4-6％的EDTA。

4.根据权利要求1所述的尿液保存剂，其特征在于，所述防腐剂为二羟甲基脲、咪唑烷基脲、重氮烷基脲、二唑烷基脲、多聚甲醛、福尔马林、钠羟甲基甘氨酸中的任一种或多种组合。

5.根据权利要求4所述的尿液保存剂，其特征在于，所述防腐剂为重氮烷基脲、咪唑烷基脲与多聚甲醛的任意组合。

6.根据权利要求1所述的尿液保存剂，其特征在于，所述淬灭剂为精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、尿素、乙二胺中的一种或多种组合。

7.根据权利要求6所述的尿液保存剂，其特征在于，所述淬灭剂为所述淬灭剂为精氨酸或甘氨酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的尿液保存剂，其特征在于，所述PH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸钾盐、磷酸钠盐、碳酸氢钠、硼酸盐、乙酸盐中的任一种或多种组合。

9.根据权利要求8所述的尿液保存剂，其特征在于，所述PH缓冲剂为Tris-HCl、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液的任意组合。

10.一种尿液保存管，其特征在于，为装有权利要求1-9中任一项所述的尿液保存剂的样品收集管。