CN113265443A - 血液游离dna保护试剂、保护方法和采血管 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种血液游离DNA保护试剂、采用保护试剂的保护方法和含有保护试剂的采血管，保护试剂包含20～100mg/ml的抗凝剂、100～600mg/ml的防腐剂、10～50mg/ml的防吸附剂和20～50mg/ml的缓冲剂；抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温‑20的至少一种，缓冲剂包括甘氨酸或Tris‑HCL。本发明血液游离DNA保护试剂降低了保护试剂对游离DNA检验、检测结果的影响，同时对血液游离DNA也具有良好的保存效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种血液游离DNA保护试剂、保护方法和采血管。
背景技术
血液游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是释放到血浆中的降解的DNA片段，存在于人体的各种体液中，浓度随人体状态的变化而变化，是无创分子检测技术的一种新型标志物，具有重要的临床价值。血液游离DNA对疾病的早期诊断具有重要的潜在价值。胎儿的游离DNA可以游离到孕妇的血液中，通过检测孕妇血液中胎儿的游离DNA，可以预知胎儿的男性性别(Y染色体)，以及是否患有21-三体、18-三体、12-三体等染色体疾病。游离DNA在疾病的预后和监控也具有重要的潜在价值。例如，器官移植免疫排斥导致细胞死亡，细胞死亡降解产生的DNA释放到血液中，通过检测血液中的游离DNA，可以对器官移植的状态进行监控。
血液循环中的游离DNA分子容易降解，白细胞的降解也会导致游离DNA受到基因组的污染。为了延长血液游离DNA的保存时间，一些保存试剂中通常会添加酶抑制剂，但是酶抑制剂会影响游离DNA后续的检验、检测。例如在游离DNA的PCR检测中，核酸酶抑制剂可以结合并降低DNA聚合酶的活性，从而降低PCR反应的检测灵敏度，对检验、检测结果产生影响。
上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种血液游离DNA保护试剂，旨在降低对游离DNA检验、检测结果的影响，同时对游离DNA也具有良好的保存效果。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种血液游离DNA保护试剂，包含：
抗凝剂，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；
防腐剂，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；
防吸附剂，所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；
以及
缓冲剂，所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾水合物，所述乙二胺四乙酸三钾水合物的浓度为大于或者等于40mg/ml，且小于或等于80mg/ml。
可选地，所述防腐剂为咪唑烷基脲，所述咪唑烷基脲的浓度为大于或者等于400mg/ml，且小于或等于600mg/ml。
可选地，所述防吸附剂包括聚乙烯醇和海藻糖，所述聚乙烯醇的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于35mg/ml，所述海藻糖的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于60mg/ml。
可选地，所述缓冲剂为甘氨酸，所述甘氨酸的浓度为大于或者等于25mg/ml，且小于或等于47mg/ml。
第二方面，本发明还提出一种血液游离DNA保护方法，包括如下步骤：
(1)配制血液游离DNA保护试剂；
(2)将采集的血液与血液游离DNA保护试剂混合均匀；
其中，所述血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖和吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
可选地，所述血液游离DNA保护试剂与血液的体积比为大于或者等于1：10，且小于或等于1：5。
第三方面，本发明还提出一种采血管，包括管体和存放于所述管体内的血液游离DNA保护试剂，其中，所述血液游离DNA保护试剂包含：
抗凝剂，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；
防腐剂，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；
防吸附剂，所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；
以及
缓冲剂，所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
可选地，所述血液游离DNA保护试剂与所述管体的体积比为大于或者等于1：15，且小于或等于1：7。
本发明血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。如此，所述抗凝剂络合血液中的钙，防止红细胞凝结成团，所述防腐剂防止细胞破裂，保护游离DNA免受基因组DNA的污染，所述防吸附剂防止游离DNA吸附管壁，降低游离DNA的损耗，所述缓冲剂起到缓冲保护作用。上述成分的种类和含量的结合，使得本发明血液游离DNA保护试剂在不添加酶抑制剂的情况下，即可保证血液游离DNA在25℃下存储长达14天，在37℃下存储长达7天，在运输等复杂条件下存储长达5天，上述配方实现了意想不到的技术效果；并且所述血液游离DNA保护试剂不含有酶抑制剂。这样，该血液游离DNA保护试剂不会对游离DNA后续的检验、检测结果产生影响，同时对血液游离DNA也具有良好的保存效果。本发明血液游离DNA保护方法中，血液与上述血液游离DNA保护试剂混合，至少具有上述所有有益效果。本发明采血管中，血液与管体内的上述血液游离DNA保护试剂混合，至少具有上述所有有益效果。
附图说明
图1为实施例1-5和对比例1-5在室温保存下的对比结果图；
图2为实施例1-5和对比例1-5在37℃保存下的对比结果图；
图3为实施例1-5和对比例1-5在模拟运输环境保存下的对比结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
本发明提出一种血液游离DNA保护试剂。
本发明提出的血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物(Ethylene Diamine Tetraacetic AcidTripotassium Salt，EDTA-3K)、乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)、二水合乙二胺四乙酸二钠(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Disodium Salt，EDTA-2Na)的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲(Imidazolidinyl urea，IDU)、重氮咪唑烷基脲(Diazolidiny1 Urea，DU，分子式：C8H14N4O7)、双咪唑烷基脲(Diazolidinyl Urea，DU，分子式：C13H20N8O10)的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，Vinylalcohol polymer，PVA)、海藻糖、吐温-20(TWEEN-20)的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸(Glycine，Gly)或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
在本发明中，当所述抗凝剂、所述防腐剂、所述防吸附剂、所述缓冲剂的浓度处于上述范围内时，对血液中游离DNA的保护效果比较好。其中，所述抗凝剂是一种有机化合物，能够络合血液中的钙而起到抗凝作用，使得红细胞很好的保持形态，不会聚集成团。所述防腐剂可以稳定细胞，防止细胞破裂，从而保护游离DNA免受基因组DNA的污染。所述防腐剂易溶于水，对人体无毒性，无过敏，无刺激性。所述防吸附剂具有较强的亲水性，可防止采血管对游离DNA的吸附，从而降低游离DNA损失。
本发明血液游离DNA保护试剂包括抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂，所述抗凝剂络合血液中的钙，防止红细胞凝结成团，所述防腐剂防止细胞破裂，保护游离DNA免受基因组DNA的污染，所述防吸附剂防止游离DNA吸附管壁，降低游离DNA的损耗，所述缓冲剂起到缓冲保护作用。上述成分的种类和含量的结合，使得本发明血液游离DNA保护试剂在不添加酶抑制剂的情况下，即可保证血液游离DNA在25℃下存储长达14天，在37℃下存储长达7天，在运输等复杂条件下存储长达5天，上述配方实现了意想不到的技术效果；并且所述血液游离DNA保护试剂不含有酶抑制剂。这样，该血液游离DNA保护试剂不会对游离DNA后续的检验、检测结果产生影响，同时对血液游离DNA也具有良好的保存效果。
可选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾水合物，所述乙二胺四乙酸三钾水合物的浓度为大于或者等于40mg/ml，且小于或等于80mg/ml。多次实验验证发现，乙二胺四乙酸三钾水合物对红细胞的抗凝效果更佳，更优地，所述乙二胺四乙酸三钾水合物的浓度可以为70mg/ml。
可选地，所述防腐剂为咪唑烷基脲，所述咪唑烷基脲的浓度为大于或者等于400mg/ml，且小于或等于600mg/ml。所述咪唑烷基脲对细胞的稳定效果更佳。更优地，所述咪唑烷基脲的浓度可以为400mg/ml。
可选地，所述防吸附剂包括聚乙烯醇和海藻糖，所述聚乙烯醇的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于35mg/ml，所述海藻糖的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于60mg/ml。当所述聚乙烯醇的浓度小于1mg/ml，所述海藻糖的浓度小于1mg/ml时，所述防吸附剂的防吸附能力不佳；当所述聚乙烯醇的浓度大于35mg/ml，所述海藻糖的浓度大于60mg/ml时，所述防吸附剂可能会对细胞和游离DNA产生不利影响。进一步地，所述聚乙烯醇的浓度可以为大于或者等于15mg/ml，且小于或等于25mg/ml，所述海藻糖的浓度可以为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。更优地，所述聚乙烯醇的浓度可以为20mg/ml，所述海藻糖的浓度可以为40mg/ml。
可选地，所述缓冲剂为甘氨酸，所述甘氨酸的浓度为大于或者等于25mg/ml，且小于或等于47mg/ml。所述甘氨酸具有氨基和羧基的两性离子，缓冲效果相比Tris-HCL更好。更优地，所述甘氨酸的浓度为30mg/ml。
本发明提出一种血液游离DNA保护方法。
本发明提出的血液游离DNA保护方法包括如下步骤：(1)配制血液游离DNA保护试剂；(2)将采集的血液与血液游离DNA保护试剂混合均匀；其中，所述血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖和吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
本发明血液游离DNA保护方法采用上述血液游离DNA保护试剂，可以提高对血液中游离DNA的保护效果，延长血液游离DNA的存储时间。
可选地，所述血液游离DNA保护试剂与血液的体积比为大于或者等于1：10，且小于或等于1：5。当血液游离DNA保护试剂与血液的体积比小于1：10时，所述血液游离DNA保护试剂的浓度比较低，对血液中游离DNA的保护效果不佳；当血液游离DNA保护试剂与血液的体积大于1：5时，造成所述保护试剂的浪费，且可能会对所述血液游离DNA产生反作用。
本发明还提出一种采血管。
本发明提出的采血管包括管体和存放于所述管体内的血液游离DNA保护试剂，其中，所述血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖和吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
在本发明采血管中，所述管体的规格可以为2ml、5ml、10ml或者15ml的至少一种。本发明采血管包含上述血液游离DNA保护试剂，可以提高对血液中游离DNA的保护效果，延长血液游离DNA的存储时间。
可选地，所述血液游离DNA保护试剂与所述管体的体积比为大于或者等于1：15，且小于或等于1：7。这样，所述血液游离DNA保护试剂可以对所述管体内的血液游离DNA提供有效保护。
实施例1
配制血液游离DNA保护试剂，保护试剂包含70mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、400mg/ml的咪唑烷基脲、10mg/ml的聚乙烯醇、40mg/ml的海藻糖和30mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为B1组。
实施例2
配制血液游离DNA保护试剂，保护试剂包含70mg/ml的二水合乙二胺四乙酸二钠、400mg/ml的重氮咪唑烷基脲、10mg/ml的吐温-20、40mg/ml的聚乙烯醇和30mg/ml的Tris-HCL，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为B2组。
实施例3
配制血液游离DNA保护试剂，保护试剂包含70mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、400mg/ml的咪唑烷基脲、10mg/ml的吐温-20、40mg/ml的海藻糖和30mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：10。标记为B3组。
实施例4
配制血液游离DNA保护试剂，保护试剂包含40mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、200mg/ml的咪唑烷基脲、10mg/ml的吐温-20、10mg/ml的海藻糖和47mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为B4组。
实施例5
配制血液游离DNA保护试剂，保护试剂包含40mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、200mg/ml的咪唑烷基脲、50mg/ml的海藻糖和47mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为B5组。
对比例1
DNA保护试剂，为70mg/ml的EDTA的水溶液。将上述DAN保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1:7。标记为E组。
对比例2
配制DNA保护试剂，保护试剂包含16g/L乙二胺四乙酸三钾二水合物、24g/L已内酰脲、16g/L咪唑烷基脲、33.6g/L衣霉素、101.6g/L金精三羧酸、80g/L聚乙烯醇、120g/L海藻糖、120g/L甘油醛、8×甘氨酸-磷酸缓冲液。保护试剂与血液的体积比为1:7。标记为T组。
对比例3
配制DNA保护试剂，保护试剂包含16g/L乙二胺四乙酸三钾二水合物、24g/L已内酰脲、16g/L咪唑烷基脲、33.6g/L衣霉素、101.6g/L金精三羧酸、80g/L聚乙烯醇、120g/L海藻糖、8×甘氨酸-磷酸缓冲液。保护试剂与血液的体积比为1:7。标记为R组。
对比例4
配制DNA保护试剂，保护试剂包含10mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、50mg/ml的咪唑烷基脲、10mg/ml的吐温-20、40mg/ml的海藻糖和30mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为X1组。
对比例5
配制DNA保护试剂，保护试剂包含150mg/ml的乙二胺四乙酸三钾水合物、800mg/ml的咪唑烷基脲、10mg/ml的吐温-20、40mg/ml的海藻糖和30mg/ml的甘氨酸，将配制的保护试剂保存到真空采血管中。保护试剂与血液的体积比为1：7。标记为X2组。
上述实施例和对比例，按照下述方式检测其对血液游离DNA的保存效果。
1)采血：采用标准的采血方式，用十种采血管分别收集三十名健康志愿者的血，每种采血管取三管，每管血量为10ml，轻轻地上下颠倒混匀10次，五等份分装到普通玻璃采血管中。
2)血浆制备：将血液放于离心管中，1,600rmp离心10min，吸取上清液并转移至新的离心管中1,6000rmp、4℃离心10min，吸取上清。
3)cfDNA的提取：按照试剂盒说明书提取cfDNA。
4)qPCR检测cfDNA含量的变化：取2ml游离DNA样本作为模板进行qPCR测试，检测基因是β-actin基因，qPCR反应体系请参阅表1，反应程序请参阅表2。采用的引物序列为Primer-F：CTGGGAAGGTTACAGGAAGA；Primer-R：AATTGGCTCAAACAACGTGAAT。
表1、qPCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 血浆游离DNA样本 | 2μl |
| PowerUp<sup>TM</sup>SYBR<sup>TM</sup>Green Master Mix | 10μl |
| Primer-F(10μmol/L) | 0.4μl |
| Primer-R(10μmol/L) | 0.4μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 补足至20μl |
表2、qPCR反应程序
将采集的样本置于室温(25℃)下保存，分别在第0天、第3天、第7天、第10天、第14天进行cfDNA含量的检测。将采集的样本置于37℃，分别于在第0天、第3天、第5天、第7天进行cfDNA含量的检测。将采集的样本置于模拟运输环境(200rpm，37℃)下保存，分别于第0天、第1天、第3天、第5天进行cfDNA含量的检测。每个实施例和对比例进行5次重复试验，取平均值。三种保存环境下的检测结果请参阅表3至表5。
表3、常温保存的血液中β-actin的CT值
请参阅表3，常温(25℃)保存下，实施例1-5(B1-B5)和对比例2(T)的CT值在14天内相对稳定(最大CT值与最小CT值的差值＜4)，但是由于对比例2(T)添加了酶抑制剂，CT值高于实施例1-5(B1-B5)的数值。对比例3(R)的D0天的CT值低于对比例2(T)，这是因为对比例2(T)添加了酶抑制剂，影响了其PCR反应。实施例1(B1)的数据较为稳定(最大CT值与最小CT值的差值＜2)，这是因为其采用了聚乙烯醇和海藻糖的配合作为防吸附剂，吸附于管壁的DNA较少。说明对比例1(E)、对比例3(R)、对比例4(X1)和对比例5(X2)的CT值在14天内均出现明显下降(最大CT值与最小CT值的差值≥4)的情况。根据表3中的数据(实施例1和全部对比例，即B1、E、T、R、X1、X2)，采用CT值比较法计算DNA的浓度，结果请参阅图1。图1中，实施例1(B1)的游离DNA的浓度在14天内无明显上升，始终保持在比较低的水平；对比例1(E)的游离DNA的浓度第7天开始上升；对比例2(T)的游离DNA的浓度在14天内无明显上升，始终保持比较低的水平，但是其D0天的数值低于实施例1-5(B1-B5)；对比例3(R)的游离DNA的浓度在第10天后开始下降，这说明常规的不含酶抑制剂的DNA保存液无法保证cfDNA在14天内不降解；对比例4(X1)和对比例5(X2)的游离DNA浓度在第10天后开始下降，说明抗凝剂和防腐剂的含量过高或过低都会不能很好抑制dfDNA的降解。
以上结果表明，室温保存下，实施例1-5(B1-B5)的样本在14天内没有出现基因组DNA的污染和dfDNA降解，本发明保护试剂对游离DNA的保护可长达14天；对比例1(E)的样本从第7天开始表现出现基因组DNA的污染，对比例1(E)的保护时间为3天；对比例3(R)的样本从第10天开始表现出dfDNA的降解，对比例3(R)的保护时间为7天；对比例2(T)的样本虽然在14天内没有出现基因组DNA的污染和dfDNA的降解，但是对比例2(T)内的酶抑制剂会干扰PCR反应，降低PCR反应检测的灵敏度。
表4、37℃保存的血液中β-actin的CT值
请参阅表4，37℃保存下，实施例1-5(B1-B5)和对比例2(T)的CT值在7天内相对稳定(最大CT值与最小CT值的差值＜4)，但是由于对比例2(T)添加了酶抑制剂，CT值高于实施例1-5(B1-B5)的数值。对比例3(R)的D0天的CT值低于对比例2(T)，这是因为对比例2(T)添加了酶抑制剂，影响了其PCR反应。实施例1(B1)的数据较为稳定，这是因为其采用了聚乙烯醇和海藻糖的配合作为防吸附剂，吸附于管壁的DNA较少。对比例1(E)、对比例3(R)、对比例4(X1)和对比例5(X2)的CT值在7天内均出现明显下降的情况(最大CT值与最小CT值的差值≥4)。根据表4中的数据(实施例1和全部对比例，即B1、E、T、R、X1、X2)，采用CT值比较法计算DNA的浓度，结果请参阅图2。图2中，实施例1(B1)的游离DNA的浓度在7天内无明显上升，始终保持在比较低的水平(最大CT值与最小CT值的差值＜2)；对比例1(E)的游离DNA的浓度第5天开始上升；对比例2(T)的游离DNA的浓度在7天内无明显上升，始终保持比较低的水平，但是其D0天的数值低于实施例1-5(B1-B5)；对比例3(R)的游离DNA的浓度在第7天后开始下降，这说明常规的不含酶抑制剂的DNA保存液无法防止cfDNA在7天内降解；对比例4(X1)和对比例5(X2)的游离DNA浓度在第7天后开始下降，说明抗凝剂和防腐剂的含量过高或过低都会不能很好抑制dfDNA的降解。
以上结果表明，37保存下，实施例1-5(B1-B5)的样本在7天内没有出现基因组DNA的污染和降解，本发明保护试剂对游离DNA的保护可长达7天；对比例1(E)的样本从第5天开始表现出现基因组DNA的污染，对比例1(E)的保护时间为3天；对比例3(R)的样本从第5天开始表现出dfDNA的降解，对比例3(R)的保护时间为3天；对比例2(T)的样本虽然在7天内没有出现基因组DNA的污染和降解，但是对比例2(T)内的酶抑制剂会干扰PCR反应，降低PCR反应检测的灵敏度。
表5、运输保存的血液中β-actin的CT值
请参阅表5，模拟运输条件下，实施例1-5(B1-B5)和对比例2(T)的CT值在5天内相对稳定(最大CT值与最小CT值的差值＜4)，但是由于对比例2(T)添加了酶抑制剂，CT值高于实施例1-5(B1-B5)的数值。对比例3(R)的D0天的CT值低于对比例2(T)，这是因为对比例2(T)添加了酶抑制剂，影响了其PCR反应。实施例1(B1)的数据较为稳定，这是因为其采用了聚乙烯醇和海藻糖的配合作为防吸附剂，吸附于管壁的DNA较少。对比例1(E)、对比例3(R)、对比例4(X1)和对比例5(X2)的CT值在5天内均出现明显下降的情况(最大CT值与最小CT值的差值≥4)。根据表5中的数据(实施例1和全部对比例，即B1、E、T、R、X1、X2)，采用CT值比较法计算DNA的浓度，结果请参阅图3。图3中，实施例1(B1)的游离DNA的浓度在5天内无明显上升，始终保持在比较低的水平(最大CT值与最小CT值的差值＜2)；对比例1(E)的游离DNA的浓度第5天开始上升；对比例2(T)的游离DNA的浓度在5天内无明显上升，始终保持比较低的水平，但是其D0天的数值低于实施例1-5(B1-B5)；对比例3(R)的游离DNA的浓度在第5天后开始下降，这说明常规的不含酶抑制剂的DNA保存液无法保证cfDNA在5天内不降解；对比例4(X1)和对比例5(X2)的游离DNA浓度在第5天后开始下降，说明抗凝剂和防腐剂的含量过高或过低都会不能很好抑制dfDNA的降解。
以上结果表明，模拟运输保存下，实施例1-5(B1-B5)的样本在5天内没有出现基因组DNA的污染和dfDNA降解，本发明保护试剂对游离DNA的保护可长达5天；对比例1(E)的样本从第5天开始表现出现基因组DNA的污染，对比例1(E)保护时间为3天；对比例3(R)的样本从第5天开始表现出dfDNA的降解，对比例3(R)的保护时间为3天；对比例2(T)的样本虽然在5天内没有出现基因组DNA的污染和dfDNA的降解，但是对比例2(T)内的酶抑制剂会干扰PCR反应，降低PCR反应检测的灵敏度。
Claims (9)
1.一种血液游离DNA保护试剂，其特征在于，包含：
抗凝剂，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；
防腐剂，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；
防吸附剂，所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；以及
缓冲剂，所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
2.如权利要求1所述的血液游离DNA保护试剂，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸三钾水合物，所述乙二胺四乙酸三钾水合物的浓度为大于或者等于40mg/ml，且小于或等于80mg/ml。
3.如权利要求1所述的血液游离DNA保护试剂，其特征在于，所述防腐剂为咪唑烷基脲，所述咪唑烷基脲的浓度为大于或者等于400mg/ml，且小于或等于600mg/ml。
4.如权利要求1所述的血液游离DNA保护试剂，其特征在于，所述防吸附剂包含聚乙烯醇和海藻糖，所述聚乙烯醇的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于35mg/ml，所述海藻糖的浓度为大于或者等于1mg/ml，且小于或等于60mg/ml。
5.如权利要求1所述的血液游离DNA保护试剂，其特征在于，所述缓冲剂为甘氨酸，所述甘氨酸的浓度为大于或者等于25mg/ml，且小于或等于47mg/ml。
6.一种血液游离DNA保护方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制血液游离DNA保护试剂；
(2)将采集的血液与血液游离DNA保护试剂混合均匀；
其中，所述血液游离DNA保护试剂包含抗凝剂、防腐剂、防吸附剂以及缓冲剂；所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖和吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
7.如权利要求6所述的血液游离DNA保护方法，其特征在于，所述血液游离DNA保护试剂与血液的体积比为大于或者等于1：10，且小于或等于1：5。
8.一种采血管，其特征在于，包括管体和存放于所述管体内的血液游离DNA保护试剂，其中，所述血液游离DNA保护试剂包含：
抗凝剂，所述抗凝剂包括乙二胺四乙酸三钾水合物、乙二胺四乙酸、二水合乙二胺四乙酸二钠的至少一种，所述抗凝剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于100mg/ml；
防腐剂，所述防腐剂包括咪唑烷基脲、重氮咪唑烷基脲、双咪唑烷基脲的至少一种，所述防腐剂的浓度为大于或者等于100mg/ml，且小于或等于600mg/ml；
防吸附剂，所述防吸附剂包括聚乙烯醇、海藻糖、吐温-20的至少一种，所述防吸附剂的浓度为大于或者等于10mg/ml，且小于或等于50mg/ml；
以及
缓冲剂，所述缓冲剂包括甘氨酸或Tris-HCL，所述缓冲剂的浓度为大于或者等于20mg/ml，且小于或等于50mg/ml。
9.如权利要求8所述的采血管，其特征在于，所述血液游离DNA保护试剂与所述管体的体积比为大于或者等于1：15，且小于或等于1：7。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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