CN115141875A - 一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其应用 - Google Patents

一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其应用，具体公开了一种样本保存液，包括以下成分：硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂。本发明通过在保存液中加入硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂，使保存液可以对微生物样本中的微生物进行常温保存，确保可以在室温条件下14天内有效保持微生物群结构及多样性，降低微生物保存的要求条件及成本，满足长途运输的需求，实现在外出采样、样品运输等特殊条件下对微生物样本中各微生物的有效保存。

Description

一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其 应用
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其应用。
背景技术
为了降低生物样本在保存和运输过程中的成本，解决核酸分子在常温下不稳定的问题，很多研究机构都报道了各种类型的样本保存液。主要集中在体液、粪便样本的保存，每种保存液适用的生物样本十分有限，如有的保存液只适用于脑脊液、血液、肺泡灌洗液、粪便、拭子样本中的一种或几种，且不同种保存液要求的采样量各不相同。面对临床生物样本种类的多样性而言，这无形中增加临床收样的复杂程度。另外很大一部分保存液在不破坏细胞/微生物结构的前提下，通过抑制各类核酸酶活性来保护胞内核酸的完整性，对病原微生物的灭活效果不佳。也有保存液通过裂解细胞/微生物结构来达到灭活的目的，但此时核酸暴露，极易降解，样本保存时间十分有限。在抑制微生物繁殖、避免微生物核酸降解的同时优化样本采集和预处理方法，从而减少采样方法、采样量对检测结果的影响，进一步提高样本处理效率，减轻检验人员感染风险，为此提供一种可用于临床多种样本类型其病原微生物核酸保存的保存液十分必要。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种样本保存液。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的样本保存液的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供一种核酸提取试剂。
本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的样本保存液、本发明第三方面的核酸提取试剂或本发明第四方面的试剂盒在微生物样本保存中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种微生物样本保存方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种样本保存液，包括以下成分：硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂。
优选地，所述样本保存液包括以下成分：硫代氰酸盐1～10M、缓冲液50～300mM、络合剂200～400mM、表面活性剂5v/v％～30v/v％、防腐剂0.01v/v％-0.1v/v％、无机盐50～250mM、蛋白物质0.05v/v％～0.3v/v％、DNA稳定剂1v/v％～10v/v％。
进一步优选地，所述样本保存液包括以下成分：硫代氰酸盐2～6M、缓冲液100～200mM、络合剂200～300mM、表面活性剂5v/v％～20v/v％、防腐剂0.01v/v％-0.05v/v％、无机盐100～250mM、蛋白物质0.05v/v％～0.2v/v％、DNA稳定剂1v/v％～8v/v％。
更进一步优选地，所述样本保存液包括以下成分：硫代氰酸盐2～5M、缓冲液100～200mM、络合剂200～250mM、表面活性剂5v/v％～15v/v％、防腐剂0.01v/v％-0.05v/v％、无机盐50～200mM、蛋白物质0.05v/v％～0.1v/v％、DNA稳定剂1v/v％～5v/v％。
优选地，所述硫代氰酸盐为硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾中的一种或多种；进一步为硫氰酸胍。
优选地，所述络合剂为EDTA、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠盐)、DTPA(二乙基三胺五乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)中的一种或多种；进一步为EDTA-2Na。
优选地，所述无机盐为氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、碳酸钾、磷酸铵、氯化锂、乙酸钠、碳酸锂、高氯酸钠、碘化钠中的一种或多种；进一步为氯化钠。
优选地，所述缓冲液为三氨基甲烷盐酸、三羟基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或多种；进一步为三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)。
优选地，所述表面活性剂为非离子性表面活性剂和阴离子性表面活性剂中的任一种或多种。
优选地，所述非离子性表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温80、曲拉通X-100、Brij35中的任一种或多种。
优选地，所述阴离子性表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。
优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温80中的任一种与曲拉通X-100的组合。
优选地，所述表面活性剂为吐温20与曲拉通X-100的组合。
进一步优选地，所述表面活性剂为2v/v％～20v/v％吐温20与3v/v％～10v/v％曲拉通X-100的组合。
优选地，所述防腐剂为叠氮钠、氯霉素、庆大霉素、ProClin 300、硫酸新霉素中的任一种或多种；进一步为ProClin 300。
优选地，所述蛋白物质为酪蛋白、明胶、水解酪蛋白、牛血清白蛋白、羊血清、马血清中的一种或多种；进一步为牛血清白蛋白。
优选地，所述样本保存液的pH值为5～9；进一步为5～8；更进一步为8。
本发明提供的样本保存液通过破坏微生物结构，抑制微生物生长繁殖，释放其核酸，病原微生物被快速灭活，降低检验人员被感染风险。保护液内含有抑制核酸酶活性成分，避免核酸降解，同时溶液中含有的盐离子提供了长期保持核酸稳定性的缓冲体系。其中含有的DNA稳定剂，来源于一种化合嗜极生物，该化合物通过再水合作用，在核酸表面形成可溶的保护屏障，一种类似耐热玻璃一样的外壳，保证样本核酸在常温下稳定保存长达14天，微生物组成不发生明显变化，能够满足长途运输的需求。
使用时，将采集的样本放入含有保存液的保存管内，固体样本体积，如粪便、组织、拭子样本等，不超过保存液总体积的10％，固体样本需在液面下；液体样本与保存液按体积比1:(0.5～4)混合，盖紧盖子，上下颠倒混匀成均质的悬液即可。
本发明第二方面，提供本发明第一方面的样本保存液的制备方法，包括以下步骤：将硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂溶于水中，调节pH，即得到样本保存液。
优选地，所述制备方法还包括过滤步骤。
进一步优选地，所述过滤为采用0.1～0.5μm聚醚砜膜进行过滤。
本发明第三方面，提供一种核酸提取试剂，包括本发明第一方面的样本保存液。
本发明第四方面，提供一种试剂盒，包括本发明第一方面的样本保存液。
本发明第五方面，提供本发明第一方面的样本保存液、本发明第三方面的核酸提取试剂或本发明第四方面的试剂盒(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)微生物样本保存；
(2)微生物核酸提取；
(3)微生物检测。
优选地，(1)中所述的微生物样本包括拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、脑脊液样本、脓液样本、腹水样本、血液样本、组织样本、粪便样本、阴道分泌物样本和尿液样本。
优选地，所述微生物样本中含有细菌、真菌、病毒、原虫、支原体和/或衣原体。
优选地，(1)中所述保存包括运输过程，所述保存为常温保存。
优选地，(3)为非疾病诊断目的的应用。
本发明第六方面，提供一种微生物样本保存方法，所述方法采用本发明第一方面的样本保存液或本发明第三方面的试剂盒将微生物样本进行保存。
优选地，所述微生物样本包括拭子采集样本、痰液样本、肺泡灌洗液样本、脑脊液样本、脓液样本、腹水样本、血液样本、组织样本、粪便样本、阴道分泌物样本和尿液样本。
当所述微生物样本为固体样本，如拭子采集样本、组织样本、粪便样本等，微生物样本与样本保存液的质量体积比为1:(30～1)，优选为1:(30～5)，更优选为1:(20～5)；当所述微生物样本为液体样本，如痰液样本、肺泡灌洗液样本、脑脊液样本、脓液样本、腹水样本、血液样本等，微生物样本与样本保存液的体积比为1:(0.5～4)，优选为1:(1～2)。
本发明的有益效果是：
本发明通过在样本保存液中加入硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂，使保存液可以对微生物样本中的微生物进行常温保存，确保可以在室温条件下14天内有效保持微生物群结构及多样性，降低微生物保存的要求条件及成本，满足长途运输的需求，实现在外出采样、样品运输等特殊条件下对微生物样本中各微生物的有效保存。
本发明提供的样本保存液相比于现有技术中的样本保存液，在实现病原微生物样本常温保存的基础上，简化了样本采集和预处理方式，降低对采样人员要求和后续检测人员感染风险的同时极大提高了病原微生物检测结果的准确性和时效性。
本发明提供的样本保存液适用于多种类型临床样本的病原微生物保存，保证了病原微生物检测前期采样，包括采样方法、采样量的标准化，减少前期采样对检测结果的影响。同时本发明提供的保存液可以灭活病原体，且采用该保存液保存的样本在后续核酸提取过程中无需进行裂解，直接进入核酸的沉淀、富集、漂洗，减少样本处理步骤，有效提高了病原微生物检测时效性。
本发明提供的微生物样本保存方法，操作简单，不需要对样本进行复杂的预处理，仅需要将待测微生物样本放入保存液中，上下颠倒混匀成均质的悬液即可，保证前期采样量的标准化，极大降低了采样人员的要求，进一步提高样本处理效率，减轻检验人员感染风险。同时标椎化前期的采样，可以减少采样方法对结果的影响，提高了病原微生物检测结果的准确性。
附图说明
图1为标准品样本的核酸提取平均总量结果统计图，图中，D1为标准品样本-20℃保存，D2为标准品样本室温放置，S1为标准品样本使用对比例1的保存液室温保存，S2为标准品样本使用实施例1的保存液室温保存。
图2为临床样本的核酸提取平均总量结果统计图，图中，D1为临床样本-20℃保存，D2为临床样本室温放置，S1为临床样本使用对比例1的保存液室温保存，S2为临床样本使用实施例1的保存液室温保存。
图3为标准品样本的平均菌群构成比例结果统计图，图中，M为标准品的初始比例，D1为标准品样本-20℃保存，D2为标准品样本室温放置，S1为标准品样本使用对比例1的保存液室温保存，S2为标准品样本使用实施例1的保存液室温保存。
图4为临床样本的病原菌检出量结果统计图，图中，D1为-20℃保存，D2为室温放置，S1为使用对比例1的保存液室温保存，S2为使用实施例1的保存液室温保存。
图5为粪便样本的核酸提取平均总量结果统计图，图中，B0为粪便样本-20℃放置，B1为粪便样本室温放置，B2为粪便样本与实施例1的保存液1:10混合室温放置，B3为粪便样本与实施例1的保存液1:2混合室温放置，B4为粪便样本与实施例1的保存液1:1混合室温放置。
图6为粪便样本的平均菌群构成比例结果统计图，图中，B0为粪便样本-20℃放置，B1为粪便样本室温放置，B2为粪便样本与实施例1的保存液1:10混合室温放置，B3为粪便样本与实施例1的保存液1:2混合室温放置，B4为粪便样本与实施例1的保存液1:1混合室温放置。
图7为肺泡灌洗液样本的核酸提取平均总量结果统计图，图中，L0为肺泡灌洗液样本-20℃放置，L1为肺泡灌洗液样本室温放置，L2为肺泡灌洗液样本与实施例1的保存液1:2混合室温放置，L3为肺泡灌洗液样本与实施例1的保存液1:1混合室温放置，L4为肺泡灌洗液样本与实施例1的保存液2:1混合室温放置。
图8为肺泡灌洗液样本的病原菌检出量结果统计图，图中，L0为肺泡灌洗液样本-20℃放置，L1为肺泡灌洗液样本室温放置，L2为肺泡灌洗液样本与实施例1的保存液1:2混合室温放置，L3为粪便样本与实施例1的保存液1:1混合室温放置，L4为粪便样本与实施例1的保存液2:1混合室温放置。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。其中，DNA稳定剂购买自Biomatric DNAstable Plus，货号为：AAA0034A。
实施例1
一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存的保存液，包括以下成分：硫氰酸胍2M、三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)100mM、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)250mM、曲拉通X-100 5v/v％、吐温20 10v/v％、proclin 300 0.01v/v％、氯化钠150mM、牛血清白蛋白0.1v/v％和DNA稳定剂5v/v％；
上述保存液的制备方法包括以下步骤：将硫氰酸胍、三氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸二钠盐、曲拉通X-100、吐温20、proclin 300、氯化钠、牛血清白蛋白和DNA稳定剂溶解在无菌去离子水中，搅拌均匀，调节溶液pH值为8；溶液用0.22μm聚醚砜膜进行过滤除菌，分装，即得到保存液。
实施例2
一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存的保存液，包括以下成分：硫氰酸胍10M、三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)300mM、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)400mM、曲拉通X-100 3v/v％、吐温20 2v/v％、proclin 300 0.1v/v％、氯化钠250mM、牛血清白蛋白0.3v/v％和DNA稳定剂10v/v％；
上述保存液的制备方法包括以下步骤：将硫氰酸胍、三氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸二钠盐、曲拉通X-100、吐温20、proclin 300、氯化钠、牛血清白蛋白和DNA稳定剂溶解在无菌去离子水中，搅拌均匀，调节溶液pH值为8；溶液用0.22μm聚醚砜膜进行过滤除菌，分装，即得到保存液。
实施例3
一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存的保存液，包括以下成分：硫氰酸胍6M、三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)200mM、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)300mM、曲拉通X-100 5v/v％、吐温20 10v/v％、proclin 300 0.05v/v％、氯化钠200mM、牛血清白蛋白0.2v/v％和DNA稳定剂8v/v％；
上述保存液的制备方法包括以下步骤：将硫氰酸胍、三氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸二钠盐、曲拉通X-100、吐温20、proclin 300、氯化钠、牛血清白蛋白和DNA稳定剂溶解在无菌去离子水中，搅拌均匀，调节溶液pH值为8；溶液用0.22μm聚醚砜膜进行过滤除菌，分装，即得到保存液。
实施例4
一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存的保存液，包括以下成分：硫氰酸胍2M、三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)100mM、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)200mM、曲拉通X-100 5v/v％、吐温20 10v/v％、proclin 300 0.01v/v％、氯化钠100mM、牛血清白蛋白0.05v/v％和DNA稳定剂1v/v％；
上述保存液的制备方法包括以下步骤：将硫氰酸胍、三氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸二钠盐、曲拉通X-100、吐温20、proclin 300、氯化钠、牛血清白蛋白和DNA稳定剂溶解在无菌去离子水中，搅拌均匀，调节溶液pH值为8；溶液用0.22μm聚醚砜膜进行过滤除菌，分装，即得到保存液。
对比例1
一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存的保存液，包括以下成分：硫氰酸胍2M、三氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)100mM、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)250mM、曲拉通X-100 5％、吐温20 10％、proclin 300 0.01％、氯化钠150mM和牛血清白蛋白0.1％；
上述保存液的制备方法包括以下步骤：将硫氰酸胍、三氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸二钠盐、曲拉通X-100、吐温20、proclin 300、氯化钠和牛血清白蛋白溶解在无菌去离子水中，搅拌均匀，调节溶液pH值为8；溶液用0.22μm聚醚砜膜进行过滤除菌，分装，即得到保存液。
效果实施例
1.实施例1和对比例1的保存液对生物样本的保存效果验证
本实验采用标准品样本和临床样本对实施例1和对比例1的保存液的保存效果进行评价，其中，每份标椎品样本按照表1比例混合，临床样本为取不同重症感染患者的肺泡灌洗液10例(临床样本取自深圳龙华人民医院)。
表1标准品
Figure BDA0003717506450000081
将标准品样本以12000rpm离心5min，弃去上清，得到菌泥；重复上述操作12次，得到12份菌泥。
取3份菌泥于-20℃保存作为D1组；取3份菌泥室温放置，作为D2组；取3份菌泥分别转移到含180μL对比文件1的保存液的保存管中，吹打混匀，作为S1组；取3份菌泥分别转移到含180μL实施例1的保存液的保存管中，吹打混匀，作为S2组。
取1mL每例肺泡灌洗液-20℃保存，作为D1组；取1mL每例肺泡灌洗液室温放置，作为D2组；取1mL每例肺泡灌洗液取与1mL对比例1的保存液混匀，作为S1组；取1mL每例肺泡灌洗液取与1mL实施例1的保存液混匀，作为S2组；上述处理均平行3次。
将上述所有样本分别放置3天、7天和14天后，采用QIAamp DNA Micro Kit(56304，Qiagen)提取核酸，其中，D1组和D2组的样本直接按照说明书步骤操作，S1组和S2组的样本不需要加Buffer ATL(即不需要进行裂解步骤)，跳过该步骤进入下一步操作，统一50μL洗脱液洗脱。提取的核酸用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。用qPCR法检测标准品样本中10种微生物含量，采用宏基因组测序检测各样本的病原微生物含量。
qPCR检测过程中所用的引物序列如表2所示，反应体系按照
Figure BDA0003717506450000091
Green qPCRMix(P2092，GDSBio)说明书配制。qPCR仪检测Ct值结果，用ΔΔCt法计算相对表达量。
表2 qPCR检测所用的引物序列
Figure BDA0003717506450000092
Figure BDA0003717506450000101
通过利用实施例1和对比例1的保存液对样本(标准品样本和临床样本)进行保存，结果表明，样本在含有DNA稳定剂的保存液(实施例1的保存液)中保存14天后与-20℃保存的样本的核酸含量基本一致；而样本在不含DNA稳定剂的保存液(对比例1的保存液)中存放3天，其样本中的核酸即出现较为严重的降解，且随着时间的延长，其样本中的核酸几乎完全降解，与样本置于室温条件下保存无明显差异(图1和图2)。标准品样本在含有DNA稳定剂的保存液(实施例1的保存液)中保存14天，其微生物构成与-20℃保存的样本一致，接近标准品样本内各组分的初始混合比例；标准品样本在不含DNA稳定剂的保存液(对比例1的保存液)中保存3天，其菌群构成开始发生变化，保存14天后，标准样本中已检测不到鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、白色念珠菌、新型隐球菌(图3)。
通过宏基因组测序检测各临床样本的病原微生物含量，结果表明，临床样本在含有DNA稳定剂的保存液中保存14天，其病原微生物检出量与-20℃保存的样本一致；临床样本在室温放置和在不含DNA稳定剂的保存液中保存3天，其病原微生物能检出，但检出量降低，放置7天后存在多种微生物已不能检出，放置14天，其病原微生物基本上已完全不能检出(图4)。
2.不同含量的样本在保存液中的保存的效果比较
1.样本预处理及分组
收集5例健康人粪便样本，取0.5g样本-20℃保存，作为B0组；0.5g样本室温放置，作为B1组，样本与实施例1的保存液按照1:10、1:2、1:1的质量体积比混合，分别作为B2、B3、B4组。
收集5例重症感染患者的肺泡灌洗液样本，取1mL肺泡灌洗液样本-20℃保存，作为L0组；1mL肺泡灌洗液样本室温放置，作为L1组；肺泡灌洗液样本与实施例1的保存液按照1:2、1:1、2:1的体积比混合，室温放置，分别作为L2、L3、L4组。
将上述所有处理组的样本分别放置5天后，12000rpm离心5min，弃去上清，采用QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen，56304)进行DNA提取(其中，B0、B1、L0、L1组的样本按照说明书步骤操作，其余组样本不需要加Buffer ATL(即不需要经过裂解步骤)，跳过该步骤进入下一步操作；统一50μL洗脱液洗脱)，用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用qPCR法检测粪便样本中5类病原微生物(丁酸梭菌属、粪杆菌属、韦荣球菌属、拟杆菌属和消化链球菌属的微生物)的含量，使用的引物序列如表3，反应体系按照
Figure BDA0003717506450000111
Green qPCR Mix(GDSBio，P2092)说明书配制，qPCR仪检测Ct值结果，用ΔΔCt法计算相对表达量。采用宏基因组测序检测肺泡灌洗液样本的5类病原微生物(丁酸梭菌属、粪杆菌属、韦荣球菌属、拟杆菌属和消化链球菌属的微生物)含量。
表3 5类病原微生物qPCR检测所用引物序列
Figure BDA0003717506450000112
当粪便样本与保存液以1:10的体积比混合放置5天后，其核酸提取得率与-20℃保存的粪便样本的核酸提取得率基本一致，且其粪便样本中微生物的检出量也与-20℃保存的粪便样本中微生物的检出量无明显差异；当粪便样本与保存液以1:2和1:1的体积比混合放置5天后，其粪便样本中的核酸均发生不同程度降解，且粪便样本中的微生物检出量出现不同程度的降低，其中粪便样本与保存液以1:1的体积混合的核酸降解程度最为严重，微生物的检出量最低(图5和图6)。
当肺泡灌洗液与保存液以1:2、1:1的体积比混合放置5天后，其核酸提取得率与-20℃保存的肺泡灌洗液的核酸提取得率基本一致，无明显区别，而当样本与保存液以2:1的体积比混合放置5天后，其核酸发生严重降解(图7)。进一步通过宏基因组测序检测肺泡灌洗液样本的5类病原微生物(丁酸梭菌属、粪杆菌属、韦荣球菌属、拟杆菌属和消化链球菌属的微生物)含量，结果表明，肺泡灌洗液与保存液以1:2、1:1的体积比混合放置5天后，与-20℃保存的肺泡灌洗液中的病原微生物的含量基本一致；当肺泡灌洗液与保存液以2:1的体积比混合放置5天后，其病原微生物能检出，但检出量降低(图8)。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州盘古医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于多种类型临床样本的病原微生物核酸保存液及其应用
<130>
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtcaccgtg gtccagttta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgacaagacc atcaccaatg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgacgaca gccatgca 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggaagtttt cagagatgag aatg 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctcaataat agggaacaca gc 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cataaatcac cagcaaggtt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accacctacg cctactagac ca 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggtagttcg caacctcact t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attagaacac aacgaccgca t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccactcttgc gtgttccttt c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaagctgcc gaaatgcaac 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acctgtgatc tctgtccgtt tac 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccaagccccc aaacctccca taca 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacgcgtacc attcatcaaa gccc 24
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gacaatatta ctaaagaagg tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gatatgtttt atcggcataa at 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agrgtttgat ymtggctcag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggytaccttg ttacgactt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaagccacg gctaactacg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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tctctacgca tttcaccgct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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agtgacggct aactacgtgc 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<400> 22
tctacgcatt ccaccgctac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggctaactac gtgccagcag 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tctacgcatt tcaccgctac a 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
atccaacctg ccgataactc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggaagccccg gctaactac 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tccactttcc tctcctgcac 20

Claims (10)

1.一种样本保存液，包括以下成分：硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂。
2.根据权利要求1所述的样本保存液，其特征在于，所述样本保存液包括以下成分：硫代氰酸盐1～10M、缓冲液50～300mM、络合剂200～400mM、表面活性剂5v/v％～30v/v％、防腐剂0.01v/v％-0.1v/v％、无机盐50～250mM、蛋白物质0.05v/v％～0.3v/v％、DNA稳定剂1v/v％～10v/v％。
3.根据权利要求2所述的样本保存液，其特征在于，所述硫代氰酸盐为硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾中的一种或多种；所述络合剂优选为EDTA、EDTA-2Na、DTPA、NTA中的一种或多种；所述无机盐优选为氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钾、碳酸钾、磷酸铵、氯化锂、乙酸钠、碳酸锂、高氯酸钠、碘化钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的样本保存液，其特征在于，所述缓冲液为三氨基甲烷盐酸、三羟基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙磺酸钠、乙酸钠、柠檬酸、邻苯二甲酸氢钾、硼酸、磷酸二氢钾、碳酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢铵、二乙醇胺、丙磺酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、乙酸铵、亮氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、3-吗啉丙磺酸、酒石酸钠、酒石酸中的一种或多种；所述表面活性剂优选为非离子性表面活性剂和阴离子性表面活性剂中的任一种或多种；所述防腐剂优选为叠氮钠、氯霉素、庆大霉素、ProClin 300、硫酸新霉素中的任一种或多种。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的样本保存液，其特征在于，所述样本保存液的pH值为5～9。
6.权利要求1～5中任一项所述的样本保存液的制备方法，包括以下步骤：将硫代氰酸盐、缓冲液、络合剂、表面活性剂、防腐剂、无机盐、蛋白物质和DNA稳定剂混合，调节pH，即得到样本保存液。
7.一种核酸提取试剂，包括权利要求1～5中任一项所述的样本保存液。
8.一种试剂盒，包括权利要求1～5中任一项所述的样本保存液。
9.权利要求1～5任一项所述的样本保存液、权利要求7所述的核酸提取试剂或权利要求8所述的试剂盒在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)微生物样本保存；
(2)微生物核酸提取；
(3)微生物检测。
10.一种微生物样本保存方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1～5中任一项所述的样本保存液或权利要求7所述的试剂盒将微生物样本进行保存。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114096668A (zh) * 2019-09-18 2022-02-25 株式会社骏河生物技术研究所 样本保存液以及使用它的分析用装置和分析方法
CN115553287A (zh) * 2022-10-27 2023-01-03 北京标驰泽惠生物科技有限公司 一种蜱虫保存液及其制备方法和应用

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