CN111165469A - 一种液基薄层细胞保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液基薄层细胞保存液,其组成成分按质量百分比计包括:pH缓冲液5%‑15%、粘液溶解剂0.1%‑5%、抗凝剂0.3%‑5%、渗透压调节剂5%‑15%、灭菌剂0.1%‑5%、细胞固定剂10%‑46%、防腐剂0.1%‑1.5%、无毒溶血剂0.5%‑10%、粘合剂1%‑4%、超纯水20%‑60%。本发明降低了应用成本,能够更好的保存和处理细胞;通过本发明的保存液,即能够较好的保持细胞结构的稳定性、保持pH值稳定、细胞不易成团结块、不产生腐败变质、有效降解血液炎症黏液,易于染色,有利于病理医生阅片,保证病理检验的准确性。同时兼窜性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种液基薄层细胞保存液及其制备方法,属于病理检验技术领域,具体涉及人体的子宫颈脱落细胞、痰液、胸腹水等细胞病理检验时使用的液基细胞保存液。
背景技术
液基细胞保存液是液基薄层细胞学检测(Th i nprep cyto l ogi c test,简称TCT)技术主要耗材。TCT技术克服了传统巴氏涂片的毛病,采集到的细胞几乎全部保存到保存液里,涂片细胞重叠少、无退变或退变轻微,背景干净清晰,液基细胞学检查的敏感性和特异性均优于传统巴氏涂片,已成为筛检宫颈癌的最好推荐方法之一,为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据,作为宫颈病变的筛查方法,采用液基薄层细胞学检测技术对异常细胞的诊断正确率提高了13%,对鳞状上皮以上病变的检出率提高了65%。TCT技术中最为关键的试剂是细胞保存液,以美国FDA1996年批准的新柏氏(Cytye公司,Boxborough,MA,现称为Ho l ogi c公司)和1999年批准的Autocyte Prep(现称为SurePath,Tr i pPath Imagi ng,Bur l i ngton,NC,现属于BD诊断公司)为代表,现有技术常用40%-50%醇类作为保存液,如中国专利CN201610466138.X,专利名称为一种液基薄层细胞保存液及其制备方法,通过乙二醇和异丙醇组成的渗透性防冻剂,在细胞低温保存时防止液基细胞保存液内的水分结冰;醇类浓度大于50%可以固定流动性高的蛋白质,但随即蛋白质就形成沉积物,不能很好的转移到载玻片,这给细胞学检查带来困扰,同时会导致细胞表面变形。若小于20%细胞不能长时间固定保存,易导致细胞退化。
市场上出现了多种用于脱落细胞保存的溶液,如美国新柏氏生产的保存液(该保存液是与其机器配套使用的试剂),或是如中国专利CN201010608951.9,专利名称为一种脱落细胞保存液及其制备方法,但是无一例外临床价格昂贵,并且存在血细胞处理不到位、阳性细胞堆叠和细胞核缩小等缺陷。为降低应用成本,更好的获得并保存细胞。因此开发出合适的子宫颈脱落细胞、痰液、胸腹水等细胞病理检验用的细胞保存液已迫在眉睫。
发明内容
本发明提供一种由多种成分组成的保存液,解决现有技术中的细胞保存液不能很好地保持细胞结构的稳定性,涂片细胞形态易退变失真,存放时保存液pH值不稳定,细胞易成团结块,阳性细胞处理发生堆叠与丢失,不易于染色的问题。
一种液基薄层细胞保存液,其组成成分按质量百分比计包括:pH缓冲液5%-15%、粘液溶解剂0.1%-5%、抗凝剂0.3%-5%、渗透压调节剂5%-15%、灭菌剂0.1%-5%、细胞固定剂10%-46%、防腐剂0.1%-1.5%、无毒溶血剂0.5-10%、粘合剂1%-4%、超纯水20-60%。
进一步的,pH缓冲液为磷酸盐缓冲液,磷酸钠缓冲液是由磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合后加超纯水溶解而成。
进一步的,pH缓冲液的pH值为7.0-7.4。
优选的,粘液溶解剂为乙酰半胱氨酸或DL-1,4-二硫代苏糖醇中的一种或多种的组合。
优选的,抗凝剂为Na2EDTA。
优选的,渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾中的一种或多种的组合。
优选的,灭菌剂为甲醛、戊二醛、环氧乙烷或无水乙醇中的一种或多种的组合。
优选的,细胞固定剂为乙二醇、壳聚糖季铵盐或异丙醇中的一种或多种的组合。
优选的,防腐剂为吐温、山梨酸钾或甲醛中的一种或多种的组合。
优选的,无毒溶血剂为表面活性剂、丙三醇和硫酸钠。
优选的,粘合剂为聚乙二醇或羧甲基纤维素钠中的一种或组合。
优选的,液基薄层细胞保存液其组成成分按质量百分比计如下:
本发明提供了一种液基薄层细胞保存液的制备方法,其步骤如下:
1)将配方量的pH缓冲液、抗凝集剂、渗透压调节剂溶解于超纯水中形成溶液A,其中,超纯水的用量为配方量超纯水质量的30%;
2)向溶液A中依次加入配方量的粘液溶解剂、灭菌剂和细胞固定剂,搅拌均匀,再加入配方量超纯水质量的20%得到溶液B;
3)向溶液B中依次加入配方量的无毒溶血剂、防腐剂,搅拌均匀得到溶液c;
4)向溶液C中依次加入配方量质量20%的超纯水和防腐剂,搅拌均匀,再加入粘合剂,搅拌均匀得到溶液C;
5)向溶液D中加入剩余量的超纯水搅拌均匀。按上述顺序分别配制依次加入可以避免试剂产生沉淀、螯合反应。
进一步的,步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)和步骤5)均在常温、湿度<90%RH的条件下进行。配制好的细胞保存液pH为7.25-7.40,渗透浓度为290±20mOsm/kgH2O;各试剂均为分析纯试剂。
在本发明的组成成分中,pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统,可用于调节液基细胞保存液的pH及渗透压,提供稳定的平衡细胞内、外的渗透压,保持细胞形态及稳定性;缓冲系统的调节机理为:当液基细胞保存液固定细胞时,若有多余的碱欲改变体系pH及渗透压时,就会与磷酸二氢根离子形成磷酸氢根离子;若有多余的酸欲改变体系pH及渗透压时,磷酸氢根离子就会与酸中的氢离子形成磷酸二氢根离子,有助于保持溶液恒定的pH值;游离的钠离子或钾离子使细胞不会在细胞固定中因渗透压变化而破裂。
在本发明的组成成分中,粘液溶解剂具有较强的黏液溶解作用。其分子中所含的巯基能使黏液中糖蛋白多肽链中的二硫键断裂,从而降低黏液的黏滞性,还能使脓性黏液中的DNA纤维断裂,因此不仅能溶解白色黏液,也能溶解脓性黏液。充分分解粘液,释放有诊断价值的细胞,防止堵塞膜孔。
在本发明的组成成分中,溶血剂具有破坏血细胞结构能力,能够避免由于血液、炎症等因素使样本模糊带来的检测误差,现有技术中通常采用氰化物,但氰化物有剧毒,对操作者有很大程度的健康危害,本发明采用具有无毒且能够达到溶血目的的无毒溶血剂。红细胞处理能力强,无需另加裂解液,既可将全部红细胞彻底清除,同时完美保存有诊断价值的各种有核细胞形态。
在本发明的组成成分中,防腐剂、细胞固定剂和灭菌剂共同作用,可使微生物中的蛋白质变性,促使细菌死亡,也可使微生物的细胞遗传基因发生变异或干扰细胞内部酶的活性来保证标本细胞在保藏过程中不产生腐败变质。同时固定目的细胞。且迅速杀灭所有微生物,确保医护人员健康。
综上,通过pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗组合作用,将细胞置于液基细胞保存液后,细胞处于合理的渗透性状态,能避免渗透压造成细胞膜、细胞质膜和细胞核膜的破裂,从而避免细胞破裂,保持细胞的正常形态;通过粘液溶解剂、无毒溶血剂进一步处理样本,能够避免由于血液、炎症等因素使样本模糊带来的检测误差;通过防腐剂、细胞固定剂和灭菌剂共同作用,能够固定并保证标本细胞在保藏过程中不产生腐败变质,检测结果更为可靠;本发明还能适用多种标本保存,便于病理检验的液基细胞保存液及其制备方法,具有很强的实用性和便利性。
本发明的有益效果为:
本发明降低了应用成本,能够更好的保存和处理细胞;通过本发明的保存液,即能够较好的保持细胞结构的稳定性、保持pH值稳定、细胞不易成团结块、不产生腐败变质、有效降解血液炎症黏液,易于染色,有利于病理医生阅片,保证病理检验的准确性。同时兼窜性强:保存的细胞可做免疫细胞化学、HPV-DNA和衣原体等病原体等检测。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清晰明确,下面对本发明进行进一步描述,任何对本发明技术方案的技术特征进行等价替换和常规推理得出的方案均落入本发明保护范围。
细胞保存液的组成成分按下述实施例一、实施例二、实施例三的质量百分比计称量,各试剂均为分析纯试剂:
实施例一:pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统(a)20%,表面活性剂、丙三醇和硫酸钠组成的溶血剂(b)6.2%,Na2EDTA组成的抗凝剂(c)3.4%,壳聚糖季铵盐、乙二醇、异丙醇组成的细胞固定剂(d)28%,戊二醛、环氧乙烷组成的灭菌剂(e)1.5%,山梨酸钾、甲醛组成的防腐剂(f)1.5%,DL-1,4-二硫代苏糖醇组成的粘液溶解剂(g)2.5%,聚乙二醇、羧甲基纤维素钠组成的粘合剂(h)3.8%、超纯水33.1%。
实施例二:pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统(a)15%,表面活性剂、丙三醇和硫酸钠组成的溶血剂(b)6.2%,Na2EDTA组成的抗凝剂(c)3.4%,壳聚糖季铵盐、乙二醇、异丙醇组成的细胞固定剂(d)30.8%,甲醛、戊二醛、环氧乙烷组成的灭菌剂(e)2.5%,吐温组成的防腐剂(f)0.5%,乙酰半胱氨酸组成的粘液溶解剂(g)2.5%,羧甲基纤维素钠组成的粘合剂(h)2%、超纯水37.1%。
实施例三:pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统(a)15.3%,表面活性剂、丙三醇和硫酸钠组成的溶血剂(b)6.2%,Na2EDTA组成的抗凝剂(c)3.1%,壳聚糖季铵盐、乙二醇、异丙醇组成的细胞固定剂(d)20%,甲醛、戊二醛、环氧乙烷组成的灭菌剂(e)2.5%,吐温组成的防腐剂(f)0.5%,DL-1,4-二硫代苏糖醇、乙酰半胱氨酸组成的粘液溶解剂(g)2.5%,聚乙二醇组成的粘合剂(h)3.8%、超纯水46.1%。
上述pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合后加超纯水溶解而成,本实施例的细胞保存液的制备方法为:
S1)将配方量的pH缓冲液、抗凝剂、渗透压调节剂溶解于超纯水中形成溶液A,其中,超纯水的用量为配方量超纯水质量的30%;
S2)向溶液A中依次加入配方量的粘液溶解剂、灭菌剂和细胞固定剂,搅拌均匀,再加入配方量超纯水质量的20%得到溶液B;
S3)向溶液B中依次加入配方量的无毒溶血剂、防腐剂,搅拌均匀得到溶液c;
S4)向溶液C中依次加入配方量质量20%的超纯水和防腐剂,搅拌均匀,再加入粘合剂,搅拌均匀得到溶液C;
S5)向溶液D中加入剩余量的超纯水搅拌均匀。
步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)和步骤5)均在常温、湿度<90%RH的条件下进行。
配制好的细胞保存液pH为7.25-7.45,渗透浓度为290±10mOsm/kgH2O;各试剂均为分析纯试剂。
将上述配制好的细胞保存液进行试验,试验结果见表1。
表1
基于上述方法制备得到的细胞保存液,可用于人体的子宫颈脱落细胞、痰液、胸腹水等细胞病理检验,制片方法为离心沉降法。
为了更进一步说明本发明的积极效果,提供如下的比较试验:
对比例一:
为确定某种成分的增益效果,设计了如下对比试验,pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统(a),表面活性剂、丙三醇和硫酸钠组成的溶血剂(b),Na2EDTA组成的抗凝剂(c),壳聚糖季铵盐、乙二醇、异丙醇组成的细胞固定剂(d),甲醛、戊二醛、环氧乙烷组成的灭菌剂(e),吐温组成的防腐剂(f),乙酰半胱氨酸组成的粘液溶解剂(g),羧甲基纤维素钠组成的粘合剂(h)、超纯水补足余量。见下表2。
表2
本对比例一所述的细胞保存液的制备方法为:
1)将配方量的a、c溶解于超纯水中形成溶液A,其中,超纯水的用量为配方量超纯水质量的30%;
2)向溶液A中依次加入配方量的d、e、g,搅拌均匀,再加入配方量超纯水质量的20%得到溶液B;
3)向溶液B中依次加入配方量的b、f,搅拌均匀得到溶液c;
4)向溶液C中依次加入配方量质量20%的超纯水,搅拌均匀,再加入h,搅拌均匀得到溶液C;
5)向溶液D中加入剩余量的超纯水搅拌均匀。
步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)和步骤5)均在常温、湿度<90%RH的条件下进行。配制好的细胞保存液pH为7.25-7.40,渗透浓度为290士20mOsm/kgH2O;各试剂均为分析纯试剂,实验效果见下表3。
表3
对比例二:
为了确定某步骤的增益效果,设计了以下实验。pH缓冲液和渗透压调节剂组成的缓冲等渗系统(a)15%,表面活性剂、丙三醇和硫酸钠组成的溶血剂(b)6.2%,Na2EDTA组成的抗凝剂(c)3.4%,壳聚糖季铵盐、乙二醇、异丙醇组成的细胞固定剂(d)30.8%,甲醛、戊二醛、环氧乙烷组成的灭菌剂(e)2.5%,吐温组成的防腐剂(f)0.5%,乙酰半胱氨酸组成的粘液溶解剂(g)2.5%,羧甲基纤维素钠组成的粘合剂(h)2%、超纯水37.1%。
本对比例二所述的细胞保存液的制备方法见下表4:
表4
效果见下表5。
表5
本发明的细胞保存液中各个组分合理配比,红细胞处理能力强,无需另加裂解液,既可将全部红细胞彻底清除,同时完美保存有诊断价值的各种有核细胞形态;能充分溶解粘液释放有诊断价值的细胞,防止堵塞膜孔;兼窜性强,保存的细胞同时可做免疫细胞化学、HPV-DNA和衣原体等病原体等检测;迅速灭菌确保医护人员健康;常温下有效期二年,细胞在保存液中保存30天形态不变。制片效果具有细胞分布非常均匀,细胞形态完好,胞浆与细胞核分界清楚、层次分明,胞浆与细胞核透亮性非常好,可提供用于其他部位细胞学检查的专用液基保存液,充分保留了有诊断意义的细胞成分;配置成本较低,易于推广。
综上所述,以上事例仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种液基薄层细胞保存液,其特征在于:其组成成分按质量百分比计包括:pH缓冲液5%-15%、粘液溶解剂0.1%-5%、抗凝剂0.3%-5%、渗透压调节剂5%-15%、灭菌剂0.1%-5%、细胞固定剂10%-46%、防腐剂0.1%-1.5%、无毒溶血剂0.5%-10%、粘合剂1%-4%、超纯水20%-60%。
2.根据权利要求1所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:pH缓冲液为磷酸盐缓冲液,磷酸钠缓冲液是由磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合后加超纯水溶解而成,渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾中的一种或多种的组合,pH缓冲液、渗透压调节剂组成缓冲等渗系统;pH缓冲液的pH值为7.0-7.4。
3.根据权利要求2所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:粘液溶解剂为乙酰半胱氨酸或DL-1,4-二硫代苏糖醇中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求3所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:抗凝剂为Na2EDTA。
5.根据权利要求4所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钾中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求5所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:灭菌剂为甲醛、戊二醛、环氧乙烷或无水乙醇中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求6所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:细胞固定剂为乙二醇、壳聚糖季铵盐或异丙醇中的一种或多种的组合。
8.根据权利要求7所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:防腐剂为吐温、山梨酸钾或甲醛中的一种或多种的组合。
9.根据权利要求8所述的液基薄层细胞保存液,其特征在于:无毒溶血剂为表面活性剂、丙三醇和硫酸钠;粘合剂为聚乙二醇或羧甲基纤维素钠中的一种或混合。
10.一种液基薄层细胞保存液的制备方法,其步骤如下:
1)将配方量的pH缓冲液、抗凝集剂、渗透压调节剂溶解于超纯水中形成溶液A,其中,超纯水的用量为配方量超纯水质量的30%;
2)向溶液A中依次加入配方量的粘液溶解剂、灭菌剂和细胞固定剂,搅拌均匀,再加入配方量超纯水质量的20%得到溶液B;
3)向溶液B中依次加入配方量的无毒溶血剂、防腐剂,搅拌均匀得到溶液c;
4)向溶液C中依次加入配方量质量20%的超纯水和防腐剂,搅拌均匀,再加入粘合剂,搅拌均匀得到溶液C;
5)向溶液D中加入剩余量的超纯水搅拌均匀;
步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)和步骤5)均在常温、湿度<90%RH的条件下进行。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20200519 |